DE60028575T2

DE60028575T2 - Peptiden reich an Cystein und/oder Glycin

Info

Publication number: DE60028575T2
Application number: DE60028575T
Authority: DE
Inventors: Leon Franciscus Mallee; Ram 13820 Oneonta Nimmagudda; Johannes Wilhelmus Leonardus Boumans
Original assignee: Campina Melkune BV
Current assignee: Campina Melkune BV
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2020-10-25
Also published as: EP1201137A1; DE60028575D1; US6620778B2; AU8156701A; AU783732B2; EP1201137B1; CA2359606A1; JP2003033197A; JP4348402B2; NZ515005A; DK1201137T3; JP2009112312A; ATE328491T1; US20020090670A1; JP4293745B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung einer Mischung aus Peptiden mit einem Cystein- oder Cystein/Glycingehalt zwischen 7 und 20 G/G%, Präparationen, umfassend die Peptide und die Verwendung solcher Präparationen als aktive Verbindung in einem Medikament.
Peptide sind als Aminosäureketten definiert, abgeleitet von einem Protein; das Molekulargewicht der Peptide liegt vorzugsweise zwischen 200 D und 8000 D, noch bevorzugter zwischen 1000 D und 5000 D.
Auf dem Gebiet gibt es einen großen Bedarf an Cystein und Cystein/Glycin umfassenden Verbindungen für eine effektive Verabreichung der Aminosäuren an den menschlichen und tierischen Körper. Die Verfügbarkeit von insbesondere Cystein und in geringerem Ausmaß auch Glycin ist ein limitierender Faktor bei der Synthese von Glutathion. Eine geeignete Verabreichung von Cystein, jedoch auch von Glycin, wird daher in solchen Fällen verlangt, bei denen eine Erhöhung der zellulären Glutathionniveaus im menschlichen oder tierischen Körper notwendig ist.
Glutathion (GSH) ist ein Tripeptid-Thiol (L-γ-Glutamyl-L-Cysteinylglycin) mit einem breiten Bereich vitaler Funktionen, einschließlich einem Schutz von Zellen gegen Sauerstoffintermediate, freie Radikale, Nebenprodukte des Sauerstoff benötigenden Stoffwechsels und einer Enttoxifizierung von Xenobiotika. Weiterhin scheint Glutathion eine Rolle bei der Verhinderung von Katarakt und einer oxidativen DNA-Verletzung zu spielen. Glutathion wird daher als eine wichtige Verbindung gegen oxidative stressbezogene Erkrankungen, wie Myocardischämie, Krebs und Katarakt angesehen.
Im Hinblick auf die Schlüsselrolle, die Glutathion entweder bei der Bekämpfung der Angriffe von freien Radikalverletzungen oder einer Enttoxifizierung von Xenobiotika spielt, einschließlich Arzneimittelmetaboliten (wie z.B. Cyclophosphamid, Paraquat und Acetaminophen) wie auch bei der Verhinderung einer Peroxidation von Zellkomponenten, ist ein Verfahren zum Erhalt von Leberlagern an Glutathion, insbesondere während Zeiten von Stress für den Körper, einschließlich einer Chemotherapie, notwendig.
Auf dem Gebiet sind verschiedene Verfahren zur Erhöhung der zellulären Niveaus an Glutathion bekannt. Die Verabreichung der Glutathion-Aminosäurevorläufer Glutaminsäure, Cystein und Glycin an Tiere kann zu einem Anstieg des zellulären Glutathions führen, es gibt jedoch Grenzen für die Effektivität dieses Verfahrens.
Zelluläre Konzentrationen von GSH hängen von der Zufuhr an Cystein ab, wobei es sich häufig um die limitierende Aminosäure handelt, wobei sie aus Diätproteinen und auch Transschwefeln von Methionin in der Leber abstammt. Die Verabreichung von Cystein als freie Aminosäure ist jedoch nicht der ideale Weg um die GSH-Konzentrationen anzuheben, da Cystein schnell verstoffwechselt wird und weiterhin in höheren Konzentrationen für Zellen toxisch zu sein scheint. Die Verabreichung von Verbindungen an Tiere, die in Zellen transportiert werden und intrazellulär zu Cystein umgewandelt werden ist manchmal für ein Anheben der zellulären Glutathionniveaus nützlich.
Ein anderer Weg, auf dem die Gewebs-GSH-Konzentration abgehoben werden kann ist die Verabreichung von Gamma-Glutamylcystein oder Gamma-Glutamylcystin. Die verabreichte Gamma-Glutamylaminosäure wird intakt transportiert und dient als Substrat der GSH-Synthetase. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von N-Acetyl-L-Cystein häufig die Gewebskonzentrationen von GSH anheben kann. Andere Berichte im Hinblick auf die Verwendung von N-Mercaptopropionylglycin für eine Anhebung des intrazellulären Glutathions sind bekannt. Einige klinische Versuche wurden unter Verwendung von Mercaptopropionylglycin zur Erhöhung des intrazellulären Glutathions durchgeführt.
Dass die Verabreichung von Glutathion selbst zu erhöhten Glutathionniveaus führen könnte, wurde auch mit in die Betrachtung einbezogen. Es gibt jedoch keine veröffentlichen Beweise, die zeigen, dass intaktes Glutathion in die Zellen eintritt. Tatsächlich gibt es etliche Berichte im Hinblick auf bestimmte biologische System, die anzeigen, dass Glutathion selbst nicht in die Zellen transportiert wird. Der Anstieg an zellulärem Glutathion, der manchmal nach einer Verabreichung von Glutathion angetroffen wird, ist auf einen (a) extrazellulären Abbau des Glutathions, (b) einen Transport in Zellen von freien Aminosäuren oder Dipeptiden, die von Glutathion extrazellulär abstammen und (c) eine intrazelluläre Resynthese von Glutathion zurückzuführen.
Abgesehen von diesen konventionellen Verfahren für eine Erhöhung des Glutathionniveaus gab es etliche Versuche um zu demonstrieren, wie Glutathion intrazellulär erhöht werden kann. Alle diese betreffen synthetische Derivate oder intakte nicht-denaturierte Proteine, die hitzelabil sind und keine betreffen natürlich abgeleitete Peptidmischungen. Einige der relevanten sind unten zusammengefasst:
Das US-Patent Nr. 5,869,456 betrifft die Präparation von reinen Alkylestern von Glutathion (95% rein) und ein Verfahren zur Anhebung der intrazellulären Glutathionniveaus durch Verabreichung eines solchen Alkyldiesters von Glutathion.
Das US-Patent 5,464,825 beschreibt das Verfahren zur Präparation und Verwendung von N-Acylglutathionmonoalkylestern um erhöhte intrazelluläre Niveaus von Glutathion oder Glutathionäquivalenten bereitzustellen, z.B. N-Acylglutathion oder Glutathionmonoalkylestern.
Das US-Patent 5,248,697 beschreibt ein Verfahren zum Erhalt und/oder einer Erhöhung der Gewebs- oder Plasmaniveaus von Glutathion. Das Patent lehrt den Fachmann die Behandlung eines Säugers mit einer supranormalen Menge von Glutamin oder einem Glutaminäquivalent zur Verhinderung der Reduktion der Gewebsglutathionniveaus, die mit einem Aussetzen des Säugers gegenüber einer Verbindung assoziiert sind, die dem Gewebe oxidative Verletzungen zufügen kann.
Das US-Patent 4,665,082 diskutiert die Rolle von L-2-Oxothiazolidin-4-carboxylat, einem Schwefelanalog von 5-Oxoprolin, gespalten durch das Enzym 5-oxo-L-Prolinase zur Bildung von Cystein und stellt so die Basis für ein Cysteinzufuhrsystem durch Zugabe von L-2-Oxothiazolidin-4-carboxylat zu basischen Aminosäurelösungen oder durch direkte Injektion in in vivo Zellen bereit.
WO 98/44807 offenbart Sojaproteinisolate, die an Beta-Conglycinin angereichert sind, um die Methionin- und Cysteinniveaus auf ungefähr 2,4 G/G% anzuheben, wie auch ein Verfahren um dieselben zu erzeugen.
Das DE-Patent Nr. 4,329,857 lehr die Verwendung von Thiolverbindungen (Cystein und seine Derivate oder Analoge, wie N-Acetylcystein, Homocystein, Glutathion, 2-Oxothiazolidin-4-carbonsäure) als Mittel für die Stärkung des Immunsystems und Immunreaktionen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren für die Präparation einer Mischung von Peptiden mit einem Cysteingehalt zwischen 7 und 20 G/G% aus einer Proteinquelle, umfassend cysteinhaltige Proteine, bereitgestellt. Die Proteinquelle ist vorzugsweise eine natürliche Proteinquelle. Die gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hergestellte Peptidmischung weist den Vorteil auf, dass sie von natürlichen Proteinquellen abstammt und keine nachteiligen Nebenwirkungen zeigen wird, während chemisch erzeugte Cysteinderivate, wie im Stand der Technik erwähnt, nachteilige Nebenwirkungen gezeigt haben. Es wurde festgestellt, dass eine solche Präparation einer Peptidmischung sehr vorteilhaft als Cysteinquelle bei Diätzusätzen oder in Medikamenten verwendet werden kann, wie unten erklärt werden wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst:

a) Spaltung der Proteine der Proteinquelle in Peptide;
b) Verdau der im Schritt a) erhaltenen Peptide durch mindestens eine Exopeptidase, deren Wirkung an der Position eines Cysteins in dem Peptid zumindest abgeschwächt wird, dadurch Bildung verdauter Peptide mit einem terminalen Cystein;
c) Reinigung der verdauten Peptide.

In dem ersten Schritt a) werden Proteine der Proteinquelle in kleinere Peptide gespalten. Diese Spaltung kann durch Spaltungsreaktionen durchgeführt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind; vorzugsweise wird die Spaltung durch enzymatische Hydrolyse der Peptidbindungen des Proteins, z.B. durch eine Endopeptidase durchgeführt, was zu Peptiden von ungefähr der gewünschten Länge führt und dadurch Anheben der Menge des Substrats für die Exopeptidase. In einem zweiten Schritt werden die durch die Spaltungsreaktion erhaltenen Peptide durch mindestens eine Exopeptidase verdaut. Unter "mindestens einer Exopeptidase" wird verstanden, dass die Verdaureaktion durch ein oder mehr unterschiedliche Exopeptidasen durchgeführt werden kann. Exopeptidasen setzen Aminosäuren von den terminalen Enden der Peptide eine nach der anderen frei. Die Exopeptidase und die Verdaureaktionsbedingungen werden so gewählt, dass die Exopeptidasewirkung mindestens an der Position eines Cysteins im Peptid abgeschwächt ist. Unter "mindestens abgeschwächt" wird verstanden, dass die Exopeptidase das Cystein von dem Peptid unter den gewählten Reaktionsbedingungen nicht entfernt oder eine sehr geringe Präferenz für die Spaltung von Cystein aufweist und dadurch die Spaltungsreaktion sehr langsam macht, verglichen mit einer Spaltung anderer Aminosäuren vom Peptid. Durch die Verwendung einer solchen Exopeptidase und Bedingungen werden Peptide erzeugt, deren terminale Aminosäuren bis zum Cysteinrest, der sich besonders nah am Terminus befindet, entfernt wurden. Der Fachmann wird in der Lage sein Bedingungen zu finden, unter denen kommerziell erhältliche Enzyme mit einer Exopeptidasefunktion eine abgeschwächte Wirkung am Cystein aufweisen. Es sollte verstanden werden, dass die Peptide ein oder mehr Aminosäureketten aufweisen können, die miteinander durch Disulfidbrücken von Cysteinresten gekoppelt sind, die in den Aminosäureketten vorliegen. "Ein verdautes Peptid mit einem terminalen Cystein" reflektiert daher die Tatsache, dass mindestens einer der Termini eines solchen vielkettigen Peptids ein terminales Cystein aufweist. Natürlich kann ein solches Peptid mehr als ein terminales Cystein enthalten. Vorzugsweise ist die enzymatische Aktivität vor dem Reinigungsschritt inaktiviert, z.B. durch eine pH-Verlagerung oder eine thermische Wärmeinaktivierungsbehandlung.
Vorzugsweise umfasst die Expopeptidase Carboxypeptidase Y (E.C.3.4.16.1.), da festgestellt wurde, dass dieses Enzym sehr effektiv an den Cysteinresten abgeschwächt werden kann und dadurch Peptide mit terminalen Cysteinresten erzeugt.
Der Spaltungsschritt a) und der Verdauschritt b) können simultan durchgeführt werden, z.B. durch Verwendung einer Endopeptidase und einer Exopeptidase, die beide unter denselben Reaktionsbedingungen wirken. Es können Enzympräparationen verwendet werden, die sowohl Endopeptidase- als auch Exopeptidaseaktivität aufweisen.
Schließlich werden diese verdauten Peptide gereinigt. Geeignete Verfahren zur Reinigung der verdauten Peptide von freien Aminosäuren, freigesetzt durch die Exopeptidase, sind auf dem Gebiet bekannt. Da ein Unterschied im Molekulargewicht zwischen den cystin- und glycinhaltigen Peptiden und den anderen freien Aminosäuren erzeugt wird, können die Cystin- und Glycinpeptide unter Verwendung dieses Unterschieds gereinigt werden. Es können etliche Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Vorzugsweise werden die freien Aminosäuren unter Verwendung eines Membranverfahrens, vorzugsweise einer Ultra- oder Nanofiltration, abgetrennt. Der Reinigungsschritt kann auch vorteilhaft die Verwendung eines immobilisierten Metallaffinitätschromatografieschritts verwenden (IMAC), gemäß Kronina et al., Journal of Chromatography A, 852 (1999), S. 261–272. Die cystein- und glycinreichen Peptide können danach getrocknet werden.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform werden die Exopeptidase in Schritt b) und die Spaltungsreaktion so gewählt, dass die Exopeptidase mindestens sowohl an der Position eines Cysteins als auch der eines Glycins im Pep tid abgeschwächt ist. Dies wird zu verdauten Peptiden führen, die im wesentlichen terminales Cystein oder Glycin aufweisen.
Die gereinigten Peptide, entweder angereichert im Hinblick auf die Cysteinreste oder angereicht auf sowohl Cystein- als auch Glycinreste haben sich als sehr geeignete Quellen für diese limitierenden Aminosäuren für eine gute Verabreichung erwiesen, um die Cystein- und die Glycinraten im menschlichen oder tierischen Körper anzuheben und können daher die intrazellulären Glutathionenniveaus anheben.
Die Proteinquelle kann jede Quelle sein, so lange sie cysteinhaltige Proteine umfasst. In dem Fall, dass eine cystein- und glycinreiche Peptidpräparation erzeugt werden soll, sollte die Proteinquelle Proteine enthalten, die Glycin und Cystein enthalten.
Vorzugsweise umfasst die Proteinquelle mindestens zwei unterschiedliche Proteine, die beide zum Glycin- und/oder Cysteingehalt der Peptide beitragen. Eines der Proteine kann glycinreich sein, während das zweite Protein cysteinreich sein kann. Die Proteinquelle kann auch hergestellt werden, bevor sie dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wird, z.B. zwei oder mehr Proteinquellen vor oder während des Spaltungsschritts.
Vorzugsweise besteht die Proteinquelle aus essbaren Proteinen, so dass die verdauten Peptide als Nahrungsmittelzusatz verwendet werden können. In einer sehr speziellen Ausführungsform umfasst die Proteinquelle Molkeproteinisolate (WPI) und/oder Molkeproteinkonzentrate (WPC). Die Bezeichnungen "Molkeproteinisolate" und "Molkeproteinkonzentrate" sind auf dem Gebiet bekannt. Molkeproteinkonzentrat ist ein Molkeproteinprodukt mit 35 bis 80 G/G% Protein, während Molkeproteinisolat einen Proteinhalt von 90 G/G% oder höher aufweist. Ein Beispiel für WPC ist Esprion 580 von DMV International; ein Beispiel für WPI ist Bipro von Bio-Isolates Ltd. Molkeprotein ist eine wichtige Cysteinquelle und es wird angenommen, dass das Molkeproteinkonzentrat eine Glutathionproduktion in tierischen Organen induziert, siehe z.B. US 5 451 412 . Molkeproteinkonzentrate als solche sind im Vergleich mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch nicht geeignet um die intrazellulären Glutathionniveaus anzuheben. Die Konzentration an Cystein und Glycin ist in intaktem Molkeprotein sehr viel niedriger als die in Peptiden der Erfindung und benötigt daher sehr viel höhere Dosierungen des intakten Molkeproteins um ein akzeptables Niveau an Cystein bei der Anwendung zu erreichen.
Ein weiterer Nachteil der US 5 451 412 ist derjenige, dass die Verwendung von vollständig nicht-denaturierten Molkeproteinprodukten sehr teuer sein kann, das dieses sehr delikate Verarbeitungsbedingungen benötigt. Molkeproteinisolat umfasst sehr geeignete cystein- und glycinreiche Proteine, wie z.B. Albumin, insbesondere α-Lactalbumin und Rinderserumalbumin. Diese Proteine werden vorteilhaft in der oder als Startproteinquelle für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Proteinquelle ein oder mehr aus der Gruppe, bestehend aus Albumin, insbesondere α-Lactalbumin, Rinderserumalbumin, Eiproteinen (z.B. Ovalbumin, Cystatin), Weizengluten, Maisproteinisolat.
Vorzugsweise werden die Schritte a) und b) unter Bedingungen durchgeführt, unter denen Schwefelbrücken zwischen Cysteinresten, die in den Proteinen in der Proteinquelle vorliegen, soweit wie möglich in der oxidierten Form erhalten bleiben. Auf diese Weise werden cysteinreiche Peptidmischungen erhalten, in denen die meisten Cysteinreste oxidiert und an andere Peptide durch Disulfidbrücken gekoppelt sind. Obwohl die korrekte Nomenklatur für Cysteine in oxidierter Form (d.h. gekoppelt an einen anderen Cysteinrest durch eine Schwefelbrücke) "Cystin" ist, ist in dieser Anmeldung "Cystein" sowohl als Cystein in reduzierter Form (mit freien SH-Gruppen) als auch in oxidierter (Cystin) Form definiert. Peptide, worin die Schwefelbrücken zwischen Cysteinresten intakt sind, können Teile der nativen Ursprungsproteine, von denen die Peptide abgeleitet sind, nachahmen und dadurch möglicherweise eine verbesserte biologische Wirkung verleihen, im Vergleich mit der der separaten Peptide in reduzierter Form. Weiterhin ist die oxidierte Form weniger reaktiv und daher stabiler bei Anwendungen, die eine Wärmebehandlung, wie eine Pasteurisierung oder Sterilisierung durchlaufen.
Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache, dass viele Enzyme mit einer Exopeptidaseaktivität oxidierte Cysteine nicht spalten, während Cysteine in reduzierter Form durch diese Enzyme von den Peptiden gespalten werden können, obwohl mit relativ niedriger Aktivität. Um Peptidmischungen in nativer, d.h. in nicht-denaturierter Form zu erzeugen, werden die Schritte a) und b) vorzugsweise bei einem pH zwischen 2 und 8 durchgeführt.
Es wird bevorzugt die hydrolytischen Verfahren in sauren Umgebungen durchzuführen. Bei einem sauren pH sind die Disulfidbrücken im Cystin stabiler als bei basischem pH. [Creighton, T. E., 1993, Proteins: structures and Molecular Properties. 2^nd Ed.; Freeman and Company, New York]
Es wird bevorzugt die Proteine der Proteinquelle in Schritt a) durch ein Enzym mit Endopeptidasefunktion abzuspalten. Unter Verwendung eines solchen Enzyms wird es möglich die Proteine unter nicht-denaturierenden (d.h. nativen) Bedingungen zu spalten, was zu nicht-denaturierten Spaltungsprodukten führt. Ein physikalische oder chemische Spaltung impliziert meistens die Anwendung von denaturierenden Bedingungen, die nicht verwendet werden können, wenn intakte native Peptidmischungen erhalten werden sollen. Hierfür sollte der Exopeptidaseverdau ebenfalls vorzugsweise unter nicht-denaturierenden Bedingungen stattfinden. Der Fachmann wird die geeigneten Bedingungen zum Erhalt von intakten nativen Peptidmischungen kennen. "Intaktes natives Peptid" bedeutet in diesem Zusammenhang ein Peptid mit derselben Konformation wie das Peptid in dem nativen funktionellen Protein.
In einer sehr attraktiven Ausführungsform weist das Enzym mit Endopeptidasefunktion auch eine Exopeptidasefunktion auf, wobei die Exopeptidasefunktion an der Position von Cystein oder sowohl Glycin als auch Cystein abgeschwächt ist. Solche Enzyme sind auf dem Gebiet bekannt und ihr Vorteil ist derjenige, dass die Schritte a) und b) simultan durchgeführt werden können. Beispiele für bevorzugte Enzyme mit sowohl Endopeptidase- als auch Exopeptidasefunktionen sind Flavourzym, saure Protease A, Protease M, Protease 2A, Protease B, Corolase PN-L, saure Protease oder eine Kombination von ein oder mehr davon.
Die Erfindung betrifft weiter Präparationen, umfassend cysteinreiche Peptide, umfassend 7 bis 20 G/G% Cystein und eine solche Präparation, umfassend 7 bis 20 G/G% Cystein/Glycin. Wie oben angegeben können diese Präparationen vorteilhaft für die Verabreichung an Tiere oder Menschen verwendet werden, um effektiv die Cysteinaufnahme von Cystein oder eine Kombination von Cystein und Glycin z.B. zur Erhöhung des intrazellulären Glutathionniveaus zu verbessern. Vorzugsweise umfassen mindestens 80% der Peptide der Präparation terminale Cysteine und/oder Glycine, die dann für den menschlichen oder tierischen Körper direkt zu Verfügung stehen. Diese terminalen Cysteine und/oder Glycine werden durch die Verwendung der wie oben diskutierten Exopeptidase erhalten.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Präparation gemäß der Erfindung als aktive Verbindung in einem Medikament, insbesondere in einem Medikament für die Behandlung von Zuständen, die durch einen oxidativen Schaden vermittelt werden und in einem Medikament für die Anhebung der zellulären Glutathionniveaus im menschlichen oder tierischen Körper. Hierfür kann die Präparation mit jedem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvans usw. kombiniert werden, um das Medikament in der gewünschten Verabreichungsform zu erhalten. Die Präparation kann auch vorteilhafterweise in einer Kleinkindformel, z.B. in einem Muttermilchersatz verwendet werden.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen und Figuren illustriert, die nur illustrativ sein sollen und den Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
1a zeigt ein Absorptionssektrum bei 214 nm eines Hydrolysats gemäß der Erfindung,
1b zeigt ein Fluoreszenzspektrum mit einer Anregungswellenlänge von 386 nm und einer Emissionswellenlänge von 514 nm des Hydrolysats gemäß 1a.
BEISPIEL 1
Eine 10%ige Molkeproteinisolat (WPI)-Lösung wird hergestellt und dann unter Verwendung von Enzymen hydrolysiert. Verschiedene Kombinationen von Enzymen wurden verwendet (Tabelle 1).
TABELLE 1: Enzym (Enzyme) wie verwendet
Die Lösungen 1 bis 3 wurden zunächst mit Pepsin für 6 Stunden mit pH 2,0 hydrolysiert. Danach wurde der pH auf 7,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid angehoben. Das zweite Enzym wurde zugefügt und die Lösungen 20 Stunden inkubiert. Die Lösungen, die ein einzelnes Enzym enthielten, wurden 20 Stunden bei 50°C bei pH 7 bzw. 3 für Flavourzym und saure Protease hydrolysiert. Die hydrolytische Reaktion wurde durch Erwärmung der Lösungen auf 85°C für 15 Minuten beendet. Darauf folgend wurden die freien Aminosäuren aus den Peptiden, enthaltend Cystein unter Verwendung von Ultrafiltration entfernt. Eine Membran mit einem nominalen Molekulargewicht (NMW) cut off von 1000 Dalton wurde verwendet. Die Lösungen wurden durch eine 500% Diafiltration ultrafiltriert.
Das Protein wurde unter Verwendung des Kjeldahl-Verfahrens gemessen. Die Cysteinkonzentration wurde unter Verwendung der Ellmann's-Reagenzien gemessen. [Beveridge et al. (1974) Journal of Food Science, Band 39, S. 49–51] Die Peptide wurden dann gefriergetrocknet.
Die Tabelle unten listet die Konzentrationen von sowohl Cystin als auch Glycin in dem Molkeproteinisolat und den Peptiden auf.
BEISPIEL 2
Ein 10%iges Molkeproteinkonzentrat, enthaltend eine 80%ige Proteinlösung wird hergestellt und dann unter Verwendung von 1% saurer Protease von der Enzyme Development Corporation hydrolysiert. Die Lösung wurde 20 Stunden bei pH 3,0 hydrolysiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmung der Lösung auf 90°C für 10 Minuten beendet. Daraufhin wurde die Lösung unter Verwendung einer Membran mit einem NMW cut off von 1000 Dalton ultrafiltriert.
Die Cysteinkonzentration wurde als Funktion der %-Diafiltration gemessen (Tabelle 2).
TABELLE 2: Cysteinkonzentration als Funktion als %-Diafiltration
BEISPIEL 3
100 l einer 5%igen Molkeproteinisolatlösung werden hergestellt und dann unter Verwendung von 2% saure Protease von der Enzyme Development Corporation hydrolysiert. Die Lösung wurde 12 Stunden bei pH 3,0 hydrolysiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmung der Lösung auf 80°C für 30 Minuten beendet. Darauf folgend wurde die Lösung auf einer Pilot-UF-Einheit unter Verwendung einer Koch-HFK 328-Membran mit einem NMW cut off von 5000 Dalton ultrafiltriert. Das Hydrolysat wurde in zwei Teile gespalten, ein Teil wurde bei einem pH wie er war (3,8) filtriert. Der pH des anderen Teils wurde zunächst auf 7,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid angehoben, woraufhin ultrafiltriert wurde.
Die Cysteinkonzentration wurde als Funktion des pHs während der Ultrafiltration gemessen (Tabelle 3).
TABELLE 3: Cysteinkonzentration als Funktion des pHs während der Ultrafiltration
Das Hydrolysat wie in Beispiel 5 wurde unter Verwendung der Celgard-NF-PES-10-Membran mit einem NMW cut off von Dalton nanofiltriert.
Die NF-Bedingungen waren:

Druck: 30 bar

Temperatur: 50 bis 55°C

Anfänglicher Flux: 58 l/m²/h

Endflux: 23 l/m²/h

Prozess: Konzentriert auf 30 l und dann 20%ige Diafiltration
Die resultierenden Peptide im Retentat enthielten 12,9% Cystein und 3,1% Glycin.
BEISPIEL 5 HPLC-spezifisch für Cys-Peptide
Ein Umkehrphasen-HPLC-Verfahren (RPC) wurde aufgebaut, um die cysteinhaltigen Peptide in einer Mischung von Peptiden zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Cysteinreste wurden zunächst mit einer fluoreszierenden Markierung (SBD-F; 7-Fluorbenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonsäure; Sigma F-4383) markiert. Diese Markierung bindet spezifisch Cysteinreste. Insgesamt wurden 300 μl Probe (100 μg Protein pro ml), 600 μl Inkubationspuffer (250 mM Boratpuffer, pH 8, 5 mM EDTA), 300 μl fluoreszierende Sonde (0,1%, G/V) in Wasser), 297 μl H₂O und 3 μl TBP (Tributylphosphin, Fluka) in ein Gefäß pipettiert. Das Gefäß wird mit einer Kappe versehen, die Mischung wurde gut gemischt und 10 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Endkonzentration der Probe beträgt 0,02 mg/ml.
Hiernach wird die Mischung auf Raumtemperatur durch Stellen auf Eis abgekühlt. Die Lösung wird unter Verwendung eines 0,45 μm-PVDF-Filters (Millipore, Millex-HV) gefiltert.
Die gefilterten Lösungen werden durch Umkehrphasenchromatografie unter Verwendung einer Widepore C18 5 μm RPC-Säule (Baker) analysiert. Der Bindungspuffer bestand aus entmineralisiertem Wasser/0,1% TFA (Trifluoressigsäure) und die Peptide wurden unter Verwendung eines Acetonitril/0,083% TFA-Puffers (Puffer B) eluiert. Das Niveau an Puffer B wurde in 90 Minuten auf 60% angehoben, woraufhin festgebundenes Material durch Lauf von 100% Puffer für 20 Minuten entfernt wurde. Das Injektionsvolumen betrug 150 μl Probe.
Die Peptide werden durch Messung der Absorption bei 214 nm und der Fluoreszenz (Anregungs- und Emissionswellenlängen jeweils 386 nm und 514 nm), siehe 1, nachgewiesen.
Das obere Panel von 1 zeigt das Hydrolysat von Beispiel 1 vor der Abtrennung, wobei die Peptide durch Messung der Absorption bei 214 nm nachgewiesen werden. Das untere Panel zeigt dasselbe Hydrolysat, wobei spezifische cysteinhaltige Peptide unter Messung der Fluoreszenz nachgewiesen werden.
BEISPIEL 6

Die cystein- und glycinreichen Peptide können klinischen enterischen Ernährungsformeln verwendet werden. Ein Rezept für eine solche Formel ist das folgende:

Cys und Gly-reiche Peptide	5,00%
Calciumcaseinat (DMV International)	1,96%
Maltodextrin DE-20	14,0%
Emulgator (Sternphil E60; Stern)	0,30%
Ölmischung (50% Sonnenblumenöl; 20% MCT; 30% Sojaöl)	4,90%
Natriumchlorid	0,09%
Tri-Calcium-Phosphat	0,95%
Magnesiumchlorid	0,15%
Calcium-di-Hydrogen-Phosphat	0,13%
Tri-Natrium-Citrat	0,086%
Wasser	77,99%
Gesamt	100%

Caseinat wird in einem Teil des entmineralisierten Wassers bei 60°C gelöst; Emulgator wird in der Ölmischung gelöst; die Salze werden in 75 ml Wasser gelöst. Hierauf folgend werden die Ölmischung, das Salz, die Maltodextrinlösung und das Restwasser in die Caseinatlösung eingemischt. Diese Mischung wird zweimal bei 350 bar und 70°C homogenisiert.
Die cystein- und glycinreichen Peptide werden dann in der Emulsion gelöst. Der pH wird auf 7,0 bis 7,1 unter Verwendung von Natriumhydroxid eingestellt und dann wird das Produkt für 10 Minuten bei 121°C retortensterilisiert.
BEISPIEL 7

Die Peptide können in einer Kleinkindformel verwendet werden. Ein beispielhaftes Rezept ist das folgende:

Bestandteil	Konzentration (g/l)
Cys- und Gly-reiche Peptide	10,0
WE80BG (Molkeproteinhydralysat DMV International)	10,0
Essbare Lactose (DMV International)	30,0
Maltodextrin DE-20	23,0
Maissirupfeststoffe	25,0
Emulgator (Sternphil E60; Stern)	5,0
Ölmischung (45% Sonnblumenöl; 25% MCT; 30% Sojaöl)	40,0
Calciumorthoposhphat	1,8
Calciumcarbonat	1,3
Magnesiumchlorid	0,3
Kaliumchlorid	0,4
Tri-Natriumcitrat	0,5
Wasser	852,7
Gesamt	1000

Der Emulgator wird in der Ölfraktion gelöst. Die Peptide und Kohlenhydrate werden in einem Teil des Wassers bei 70°C gelöst. Die Mineralien werden separat gelöst. Die Ölmischung wird dann zu der Peptid/Kohlenhydratlösung zu gefügt und unter Verwendung einer Vorrichtung mit hohen Scherkräften 3 Minuten gemischt.
Die Präemulsion wird zweimal bei 250 bar homogenisiert. Die Formel kann entweder durch Erwärmen auf 80°C für 15 Minuten pasteurisiert werden und sprühgetrocknet werden (pulverförmige Formel) oder in Flaschen bei 120°C für 10 Minuten sterilisiert werden (flüssige Formel).
BEISPIEL 8

Die Peptide können in eine Instant-Drink-Mischung inkorporiert werden. Das Rezept enthält:

Cys- und Gly-reiche Peptide	15,00%
Molkeproteinkonzentrat 80 (Esprion 580; DMV International)	65,00%
Glutaminpeptide (WGE80GPU; DMV International)	10,00%
Vitaminmischung (Roche)	4,90%
Kakaopulver (D-11-S, ADM Cocoa, Niederlande)	3,00%
Geschmack; Vanille JSH00712F, McCormick&Co.	1,15%
Geschmack; Schokoladen-Fudge (FF22034, McCormick&Co.)	0,95%
Süßmittel (Aspartam, Nutrasweet)	0,20%
Gesamt	100%

Der trockene Bestandteil wird gemischt und dann zu 118 ml Wasser zugefügt. Die Lösung wird gemischt, so dass sich die Komponenten lösen. Eine Portion enthält 35 g Pulvermischung, die ungefähr 500 mg Cystein und 150 mg Glycin zuführt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus Peptiden mit einem Gesamtcystein- und -glycingehalt von 7 bis 20 G/G% aus einer Proteinquelle, umfassend cystein- und glycinhaltige Proteine, umfassend die folgenden Schritte: a) Spaltung der Proteine in Peptide; b) Verdau der im Schritt a) erhaltenen Peptide durch mindestens eine Exopeptidase, deren Wirkung an der Stellung von Cysteinen und Glycinen in dem Peptid zumindest abgeschwächt ist, dadurch Bildung verdauter Peptide mit einem terminalen Cystein oder Glycin; c) Reinigung der verdauten Peptide.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Mischung aus Peptiden mit einem Cysteingehalt von 7 bis 20 G/G%.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte a) und b) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Exopeptidase Carboxypeptidase Y umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle mindestens zwei unterschiedliche cysteinhaltige Proteine umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle mindestens zwei unterschiedliche Proteine umfasst, wobei mindestens eins davon Cysteinreste und mindestens eins Glycinreste enthält.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle aus essbaren Proteinen besteht.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle Molkeproteinisolat und/oder Molkeproteinkonzentrat umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle ein oder mehr aus der Gruppe, bestehend aus Albumin, insbesondere α-Lactalbumin, Rinderserumalbumin, Weizengluten, Maisproteinisolat, Eiproteine, insbesondere Ovalbumin, Cystatin umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schritte a) und b) unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen die Schwefelbrücken zwischen den Cysteinresten, wie sie in den Proteinen der Proteinquelle vorliegen, intakt bleiben.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Schritte a) und b) bei einem pH von 2 bis 8 durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt a) die Spaltung der Proteine durch ein Enzym mit Endopeptidasefunktion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Enzym mit Endopeptidasefunktion auch eine Exopeptidasefunktion aufweist, wobei die Exopeptidasefunktion an der Position des Cysteins abgeschwächt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die Exopeptidasefunktion des Enzyms an der Position von sowohl Glycin als auch Cystein abgeschwächt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das Enzym gewählt ist aus Flavourzym, saure Protease A, Protease M, Protease 2A, Protease B, Corolase PN-L, saure Protease oder einer Kombination von einem oder mehreren davon.
Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus Peptiden mit einem Cysteingehalt von 7 bis 20 G/G% aus einer Proteinquelle, umfassend cysteinhaltige Proteine, umfassend die folgenden Schritte: a) Spaltung der Proteine aus der Proteinquelle in Peptide; b) darauffolgend oder simultan Verdau der Peptide, die in Schritt (a) erhalten wurden, durch mindestens ein Enzym mit Endopeptidase- und Exopeptidasefunktionen, gewählt aus Flavourzym, saurer Protease A, Protease M, Protease 2A, Protease B, Corolase PN-L und saurer Protease, wodurch verdaute Peptide mit einem terminalen Cystein gebildet werden; c) Reinigung der verdauten Peptide.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Wirkung der Exopeptidase an der Stellung von Cysteinen und Glycinen in dem Peptid zumindest abgeschwächt ist.
Präparation, umfassend eine Mischung cystein- und glycinreicher Peptide, umfassend 7 bis 20 G/G% Cystein und Glycin.
Präparation gemäß Anspruch 18, wobei die Mischung cystein- und glycinreicher Peptide 7 bis 20 G/G% Cystein umfasst.
Präparation gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei mindestens 80% der Peptide terminale Cysteine und/oder Glycine umfassen.
Verwendung einer Präparation gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 als aktive Verbindung in einem Medikament.
Verwendung einer Präparation gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 als aktive Verbindung in einem Medikament zur Behandlung von Zuständen, die durch einen oxidativen Schaden vermittelt werden.
Verwendung einer Präparation gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 als aktive Verbindung in einem Medikament für die Anhebung von zellulären Glutathionniveaus im menschlichen oder tierischen Körper.
Verwendung einer Präparation gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 bei Kleinkindformeln.