JP2003033197A - システイン／グリシンリッチペプチド - Google Patents

システイン／グリシンリッチペプチド

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 システインまたはシステイン／グリシン含有
率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物の提供。 【解決手段】 タンパク質源のタンパク質をペプチドに
開裂する工程；上記工程で得たペプチドを少なくとも１
種類のエキソペプチダーゼで消化して（この作用は、少
なくとも、該ペプチド中のシステインまたはシステイン
およびグリシンの位置で弱められる）、末端システイン
またはシステインおよびグリシンを有する消化されたペ
プチドを形成する工程；消化されたペプチドを精製する
工程を含むことを特徴とする、システインまたはシステ
インおよびグリシン含有タンパク質を含むタンパク質源
からシステイン含有率またはシステインおよびグリシン
総含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、システイン−また
はシステイン／グリシン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプ
チド混合物の調製方法、該ペプチドを含む調製物、およ
び薬物における活性化合物としてのかかる調製物の使用
に関する。
【０００２】本明細書において、ペプチドは、タンパク
質から誘導されたアミノ酸鎖と定義し；該ペプチドの分
子量は、好ましくは、２００Ｄ〜８０００Ｄ、より好ま
しくは、１０００Ｄ〜５０００Ｄである。
【０００３】
【従来の技術】当該技術分野において、人体または動物
体へのシステインおよびグリシンの有効な投与のために
システインおよびシステイン／グリシンを含む化合物の
需要が大きい。特にシステインの利用能およびそれより
も低いがグリシンの利用能は、グルタチオンの合成にお
ける限定要因である。したがって、人体または動物体に
おける細胞内グルタチオンレベルの上昇が必要とされる
場合、システインの適当な投与およびグリシンの適当な
投与が要求される。
【０００４】グルタチオン（ＧＳＨ）は、酸素要求性代
謝の酸素中間体、フリーラジカルおよび副産物からの細
胞の保護、ならびに生体異物の解毒を包含する広範囲に
わたる生活機能を有するトリペプチド−チオール（Ｌ−
γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）である。
また、グルタチオンは、白内障および酸化的ＤＮＡ損傷
の予防において役割を果たすと考えられる。したがっ
て、グルタチオンは、心筋虚血、癌および白内障のよう
な酸化的ストレス関連疾患に対して重要な化合物と考え
られる。
【０００５】フリーラジカル損傷の攻撃との戦いまたは
薬物代謝産物（例えば、シクロホスファミド、パラコー
トおよびアセトアミノフェン）を包含する生体異物の解
毒、および細胞成分の過酸化を予防することのいずれに
おいてもグルタチオンにより果たされるきわめて重大な
役割に関して、グルタチオンの肝臓貯蔵を、特に、化学
療法を包含する体へのストレスの間じゅう、維持する方
法が必要とされている。
【０００６】当該技術分野において、グルタチオンの細
胞内レベルを増加させる種々の方法が知られている。グ
ルタチオンのアミノ酸前駆体であるグルタミン酸、シス
テインおよびグリシンの動物への投与は、細胞内グルタ
チオンの増加を引き起こし得るが、この方法の有効性に
は限界がある。
【０００７】ＧＳＨの細胞内濃度は、しばしば制限アミ
ノ酸であり、食物タンパク質からおよび肝臓におけるメ
チオニンからの硫黄転位により誘導されるシステインの
供給に依存している。しかしながら、システインは、迅
速に代謝され、その上、高濃度では細胞に対して有毒で
あると考えられるので、システインの遊離アミノ酸とし
ての投与は、ＧＳＨ濃度を増加させるための理想的な方
法ではない。細胞へ輸送され、細胞内でシステインに転
換される化合物の動物への投与は、しばしば、細胞内グ
ルタチオンレベルを増加させるのに有用である。
【０００８】組織内ＧＳＨ濃度を増加させ得る別の方法
は、ガンマ−グルタミルシステインまたはガンマ−グル
タミルシスチンの投与によるものである。投与されたガ
ンマ−グルタミルアミノ酸は、無傷で輸送され、ＧＳＨ
シンセターゼの基質として役立つ。Ｎ−アセチル−Ｌ−
システインの投与がしばしばＧＳＨの組織内濃度を増加
させ得ることもまた知られている。細胞内グルタチオン
を増加させるためにＮ−メルカプトプロピオニルグリシ
ンを使用することについての他の報告が知られている。
メルカプトプロピオニルグリシンを使用して細胞内グル
タチオンを上昇させる臨床試験が多少行なわれた。
【０００９】グルタチオン自体の投与がグルタチオンレ
ベルを増加させ得るということもまた検討された。しか
しながら、無傷のグルタチオンが細胞内に入ることを証
明する証拠は公表されていない。実際、グルタチオン自
体が細胞へ輸送されないということを証明している特定
の生物学的な系についてのいくつかの報告はある。グル
タチオンの投与後にしばしば見られる細胞内グルタチオ
ンの増加は、（ａ）グルタチオンの細胞外分解、（ｂ）
細胞外でグルタチオンから誘導された遊離アミノ酸また
はジペプチドの細胞への輸送、および（ｃ）グルタチオ
ンの細胞内再合成によるものである。
【００１０】グルタチオンレベルを増加させるこれらの
慣用的な方法に加えて、グルタチオンを細胞内で増強さ
せることができる方法を示す試みがいくつかあった。こ
れらは、全て、合成誘導体または熱不安定であるほぼ無
傷の未変性タンパク質に関するものであり、いずれも天
然由来のペプチド混合物に関するものではない。
【００１１】米国特許第5,869,456号は、純粋なグルタ
チオンのアルキルエステル（純度９５％）の調製物、お
よびかかるグルタチオンのアルキルジエステルを投与す
ることにより細胞内グルタチオンレベルを増加させる方
法に関する。
【００１２】米国特許第5,464,825号には、グルタチオ
ンまたはグルタチオン等価物、例えば、Ｎ−アシルグル
タチオンまたはグルタチオンモノアルキルエステルの増
加した細胞内レベルを提供するためのＮ−アシルグルタ
チオンモノアルキルエステルの調製方法および使用が開
示されている。
【００１３】米国特許第5,248,697号には、グルタチオ
ンの組織内または血漿内レベルを維持および／または増
強する方法が開示されている。該特許は、組織に酸化的
損傷を与える能力のある化合物への哺乳動物の曝露に伴
う組織グルタチオンレベルの減少を予防するための超正
常量のグルタチオンまたはグルタチオン等価物での哺乳
動物の治療技術を開示している。
【００１４】米国特許第4,665,082号は、酵素−５−オ
キソ−Ｌ−プロリナーゼにより開裂してシステインを形
成する５−オキソプロリンの硫黄アナログであるＬ−２
−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレートの役割を
検討して、塩基性アミノ酸溶液にＬ−２−オキソチアゾ
リジン−４−カルボキシレートを添加することによる、
または、それをインビボ細胞中に直接注入することによ
る、システインデリバリーシステムの基礎を提供する。
【００１５】ドイツ特許第4,329,857号は、免疫系およ
び免疫反応を強化する薬剤としてのチオール化合物（シ
ステインおよびその誘導体またはアナログ、例えば、Ｎ
−アセチルシステイン、ホモシステイン、グルタチオ
ン、２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸）の使用
を開示している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、システイン
含有タンパク質を含むタンパク質源からシステイン含有
率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する新規方
法を提供する。該タンパク質源は、好ましくは、天然タ
ンパク質源である。本発明のこの実施態様に従って調製
されたペプチド混合物は、それが天然タンパク質源から
誘導化され、いずれもの副作用を示さないであろうとい
う長所を有するが、従来技術に記載されている化学的に
生成されたシステイン誘導体は、副作用を示した。以下
に記載するとおり、ペプチド混合物のかかる調製物は、
食餌サプリメントまたは薬物におけるシステイン源とし
て非常に有利に使用されることが見出された。
【００１７】
【課題を解決するための手段】当該方法は、 ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに開裂する工
程； ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキ
ソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少な
くとも、該ペプチド中のシステインの位置で弱められ
る）、末端システインを有する消化されたペプチドを形
成する工程； ｃ）消化されたペプチドを精製する工程を含むことを特
徴としている。
【００１８】第１の工程ａ）において、タンパク質源の
タンパク質をより小さいペプチドに開裂する。この開裂
は、当該技術分野で知られている開裂反応により行なわ
れ得る；好ましくは、該開裂は、例えば、エンドペプチ
ダーゼによるタンパク質のペプチド結合の酵素加水分解
により行なわれ、その結果、ほぼ所望の長さのペプチド
が得られて、エキソペプチダーゼに対する基質の量が増
加する。第２の工程において、開裂反応により得られた
ペプチドを、少なくとも１種類のエキソペプチダーゼに
より消化する。「少なくとも１種類のエキソペプチダー
ゼ」とは、１種類またはそれ以上のエキソペプチダーゼ
により消化反応を行なうことができることを意味する。
エキソペプチダーゼは、ペプチドの末端から１個ずつア
ミノ酸を遊離する。エキソペプチダーゼおよび消化反応
条件は、エキソペプチダーゼ作用が少なくともペプチド
におけるシステインの位置で弱められるように選択され
る。「少なくとも弱められる」とは、エキソペプチダー
ゼが選択された反応条件下ではシステインをペプチドか
ら除去しないか、または、非常に低いシステインの開裂
優先度を有していて、該ペプチドからの他のアミノ酸の
開裂と比較して該開裂反応が非常に遅くなることを意味
する。かかるエキソペプチダーゼおよび条件の使用によ
り、末端アミノ酸が該末端に最も近いシステイン残基ま
で除去されたペプチドが生成される。当業者は、エキソ
ペプチダーゼを有する市販の酵素の作用がシステインの
位置で弱められて機能する条件を見出すことができるで
あろう。ペプチドは、アミノ酸鎖に存在するシステイン
残基のジスルフィド架橋によりお互いに結合し合う１つ
またはそれ以上のアミノ酸鎖を有していてもよいことが
理解できる。したがって、「末端システインを有する消
化されたペプチド」とは、かかる多鎖ペプチドの両端の
少なくとも１つが末端システインを有することを表して
いる。もちろん、かかるペプチドは、１個より多い末端
システインを含有していてもよい。好ましくは、酵素活
性は、例えば、ｐＨシフトまたは熱失活処理などによ
り、精製工程の前に不活性化される。
【００１９】カルボキシペプチダーゼＹ（Ｅ.Ｃ.３.４.
１６.１）は、システイン残基で非常に有効に弱めるこ
とができて、末端システイン残基を有するペプチドを生
成することが見出されたので、好ましくは、エキソペプ
チダーゼは、カルボキシペプチダーゼＹを含む。
【００２０】開裂工程ａ）および消化工程ｂ）は、例え
ば、共に同一反応条件で機能するエンドペプチダーゼお
よびエキソペプチダーゼを使用することにより同時に行
なうことができる。また、エンドペプチダーゼ活性およ
びエキソペプチダーゼ活性の両方の活性を有する酵素調
製物を使用することもできる。
【００２１】最後に、これらの消化されたペプチドを精
製する。エキソペプチダーゼにより遊離された遊離アミ
ノ酸から消化されたペプチドを精製する適当な方法は当
該技術分野で知られている。システインおよびグリシン
含有ペプチドと他の遊離アミノ酸との間で分子量の差異
が生じるので、システインおよびグリシン含有ペプチド
は、この差異を利用して精製することができる。当該技
術分野で知られているいくつかの技法を使用することが
できる。好ましくは、遊離アミノ酸は、膜プロセス、好
ましくは、限外濾過またはナノ濾過を使用して分離され
る。該精製工程は、また、有利には、Kronina et al.,
Journal of Chromatography A, 852 (1999) pp 261-272
に従う固定化金属アフィニティークロマトグラフィー
工程（ＩＭＡＣ）の使用を含む。その後、システインお
よびグリシンリッチペプチドを乾燥させることができ
る。
【００２２】特定の実施態様において、工程ｂ）におけ
るエキソペプチダーゼおよび開裂反応は、エキソペプチ
ダーゼが少なくともペプチドにおけるシステインおよび
グリシンの両方の位置で弱められるように選択される。
この結果、主に末端システインまたはグリシンを有する
消化されたペプチドが得られるであろう。
【００２３】システイン残基に富むかまたはシステイン
残基およびグリシン残基の両方に富む精製されたペプチ
ドは、人体または動物体におけるシステインおよびグリ
シン率を上昇させるために、これらの制限アミノ酸を容
易に投与するのに非常に適した源であることを示し、し
たがって、細胞内グルタチオンレベルを上昇させ得る。
【００２４】タンパク質源は、システイン含有タンパク
質を含む限りいずれの源であってもよい。システインお
よびグリシンリッチペプチド調製物が生成されるべきで
ある場合、該タンパク質源は、グリシンおよびシステイ
ンを含有するタンパク質を含有すべきである。
【００２５】好ましくは、該タンパク質源は、共にペプ
チドのグリシンおよび／またはシステイン含有量に関与
する少なくとも２種類のタンパク質を含む。該タンパク
質のうちの一は、グリシンリッチであってよく、第２の
タンパク質は、システインリッチであってよい。該タン
パク質源は、また、本発明の方法に付される前に、例え
ば、開裂工程の前または間に２種類またはそれ以上のタ
ンパク質源により、調製することができる。
【００２６】好ましくは、タンパク質源は、食物タンパ
ク質からなっていて、消化されたペプチドは、食物添加
物として使用することができる。非常に特定の実施態様
例において、該タンパク質源は、乳漿タンパク質単離体
（ＷＰＩ）および／または乳漿タンパク質濃縮物（ＷＰ
Ｃ）を含む。「乳漿タンパク質単離体」および「乳漿タ
ンパク質濃縮物」なる用語は、当該技術分野で知られて
いる。乳漿タンパク質濃縮物は、タンパク質を３５〜８
０ｗ／ｗ％有する乳漿タンパク質生成物であり、乳漿タ
ンパク質単離体は、９０ｗ／ｗ％またはそれより高いタ
ンパク質含有量を有する。ＷＰＣの例は、ディエムブイ
・インターナショナル（DMV Internatonal）からのＥｓ
ｐｒｉｏｎ ５８０である；ＷＰＩの例は、バイオ−ア
イソレーツ・リミテッド（Bio-isolates Ltd.）からの
Ｂｉｐｒｏである。乳漿タンパク質は、重要なシステイ
ン源であり、乳漿タンパク質濃縮物は、動物の臓器中で
グルタチオン生成を誘発すると考えられる。例えば、米
国特許第5,451,412号を参照のこと。しかしながら、乳
漿タンパク質濃縮物自体は、本発明のペプチドと比較し
て細胞内グルタチオンレベルの上昇に適していない。無
傷乳漿タンパク質におけるシステインおよびグリシンの
濃度は、本発明のペプチドにおけるよりも非常に低く、
したがって、該用途において許容できるレベルのシステ
インに達するために無傷の乳漿タンパク質の非常に高い
投与量を必要とする。
【００２７】米国特許第5,451,412号のさらなる短所
は、全体的に未変性の乳漿タンパク質生成物の使用が非
常に繊細なプロセス条件を必要とするので、非常に高価
となり得る点である。乳漿タンパク質単離体は、非常に
適当なシステインおよびグリシンリッチタンパク質、例
えば、アルブミン、特に、αラクトアルブミンおよびウ
シ血清アルブミンを含む。該タンパク質は、有利には、
本発明の方法においてまたは該方法の出発タンパク質源
として使用される。
【００２８】他の好ましい実施態様において、タンパク
質源は、アルブミン、特に、α−ラクトアルブミン、ウ
シ血清アルブミン、卵タンパク質（例えば、オボアルブ
ミン、シスタチン）、小麦グルテン、トウモロコシタン
パク質単離体からなる群から選択される１またはそれ以
上を含む。
【００２９】好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、タン
パク質源中のタンパク質に存在するシステイン残基間の
硫黄架橋ができる限り酸化形態で保持される条件で行わ
れる。このようにして、システイン残基のほとんどが酸
化されており、ジスルフィド架橋を介して他のペプチド
に結合されているシステインリッチペプチド混合物が得
られる。酸化形態の（すなわち、硫黄架橋により別のシ
ステイン残基に結合している）システインの正しい名称
は、「シスチン」であるが、本明細書において、「シス
テイン」は、還元形態の（遊離ＳＨ基を有する）システ
インおよび酸化形態のシステイン（シスチン）の両方で
あると定義する。システイン残基間の硫黄架橋が無傷で
あるペプチドは、該ペプチドが誘導される元の天然たん
ぱく質の一部を模倣していることがあり、還元形態の別
々のペプチドのものと比較して改良された生物学的作用
を与える可能性がある。また、酸化形態は、反応性があ
まりなくて、低温殺菌または無菌化のような熱処理を受
ける用途においてより安定である。
【００３０】さらなる長所は、エキソペプチダーゼ活性
を有する多くの酵素は酸化システインを開裂しないが、
還元形態のシステインは該酵素により相対的に低い活性
ではあるが該ペプチドから開裂され得る点である。天然
の、すなわち、未変性形態のペプチド混合物を生成する
ために、工程ａ）およびｂ）は、好ましくは、ｐＨ２〜
８で行なわれる。
【００３１】酸性環境において加水分解工程を行なうの
が好ましい。酸性ｐＨでのシスチンにおけるジスルフィ
ド架橋は塩基性ｐＨの場合よりも安定である。［Creigh
ton,T.E., 1993, Proteins: structures and Molecular
Properties. 2nd Ed.; Freeman and Company, New Yor
k］。
【００３２】工程ａ）においてエンドペプチダーゼ機能
を有する酵素によりタンパク質源のタンパク質を開裂す
るのが好ましい。かかる酵素の使用により、未変性（天
然）条件下でタンパク質を開裂して未変性開裂生成物を
得るのが可能になる。物理的または化学的開裂は、多く
の場合、無傷の天然ペプチド混合物を得ようとする場合
には使用できない変性条件の適用を含む。これに対し
て、エキソペプチダーゼ消化は、未変性条件でも好適に
起こる。当業者は、無傷の天然ペプチド混合物を得るの
に適した条件を理解するであろう。「無傷の天然ペプチ
ド」とは、この趣意において、該ペプチドが天然の機能
的タンパク質において有すると同様のコンフォメーショ
ンを有するペプチドであると理解されるべきである。
【００３３】非常に関心のある実施態様において、エン
ドペプチダーゼ機能を有する酵素は、また、エキソペプ
チダーゼ機能をも有し、このエキソペプチダーゼ機能
は、システインの位置またはグリシンおよびシステイン
の両方の位置で弱められる。かかる酵素は、当該技術分
野で知られており、その長所は、工程ａ）およびｂ）を
同時に行なうことができる点である。エンドペプチダー
ゼ機能およびエキソペプチダーゼ機能の両方を有する好
ましい酵素の例は、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、酸性プロ
テアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼ２Ａ、プロ
テアーゼＢ、Ｃｏｒｏｌａｓｅ ＰＮ−Ｌ、酸性プロテ
アーゼまたはそれらのうちの１つまたはそれ以上の組合
せである。
【００３４】本発明は、また、システインを７〜２０ｗ
／ｗ％含むシステインリッチペプチドを含む調製物およ
びシステイン／グリシンを７〜２０ｗ／ｗ％含むかかる
調製物に関する。上記のとおり、該調製物は、有利に
は、例えば、細胞内グルタチオンレベルの上昇のために
システインまたはシステインおよびグリシンの組合せの
システイン取り込み量を有効に改善するために動物また
はヒトへの投与に使用できる。好ましくは、調製物のペ
プチドの少なくとも８０％は、末端システインおよび／
またはグリシンを含んでおり、人体または動物体用に容
易に利用可能である。これらの末端システインおよび／
またはグリシンは、上記したエキソペプチダーゼの使用
により得られる。
【００３５】また、本発明は、薬物、特に、酸化的障害
により媒介される症状の治療用の薬物、および人体また
は動物体において細胞内グルタチオンレベルを上昇させ
るための薬物における活性な化合物としての本発明の調
製物の使用に関する。これに関して、該調製物は、所望
の投与剤形の薬物を得るために、適当な担体、希釈剤、
アジュバントなどと配合することができる。該調製物
は、有利には、乳児用処方において、例えば、母乳代用
品において使用することができる。
【００３６】ここで、本発明を以下の実施例および図に
おいて例示するが、単なる例示であり、本発明の範囲を
限定することを意味するものではない。
【００３７】
【実施例】実施例１ １０％乳漿タンパク質単離体（ＷＰＩ）溶液を調製し、
次いで、酵素を使用して加水分解した。酵素のいくつか
の組合せを使用した（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】溶液１〜３は、まず、ｐＨ２.０で６時
間、ペプシンで加水分解させた。次いで、水酸化ナトリ
ウムを使用してｐＨを７.０に上昇させた。第２の酵素
を添加し、溶液を２０時間インキュベートした。酵素を
１種類だけ含有する溶液は、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅに
ついてはｐＨ７で、および酸性プロテアーゼについてｐ
Ｈ３で、５０℃で２０時間加水分解させた。
【００４０】該溶液を８５℃に１５分間加熱することに
より加水分解反応を停止させた。次いで、限外濾過を使
用してシステインを含有するペプチドから遊離アミノ酸
を除去した。１０００ダルトンの呼称分子量（ＮＭＷ）
カットオフを有する膜を使用した。該溶液を５００％ダ
イアフィルトレーションまで限外濾過した。
【００４１】タンパク質は、ケルダール法を用いて測定
した。システイン濃度は、エルマン試薬を用いて測定し
た。［Beveridge et al., (1974) Journal of Food Sci
enceVolume 39, p. 49-51］。次いで、ペプチドを凍結
乾燥させた。
【００４２】乳漿タンパク質単離体およびペプチド中の
シスチンおよびグリシンの両方の濃度を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】実施例２ １０％乳漿タンパク質濃縮物を含有する８０％タンパク
質溶液を調製し、次いで、エンザイム・ディベロープメ
ント・コーポレーション（Enzyme DevelopmentCorporat
ion）からの１％酸性プロテアーゼを使用して加水分解
した。該溶液をｐＨ３.０で２０時間加水分解した。該
溶液を９０℃に１０分間加熱することにより反応を停止
させた。次いで、１０００ダルトンのＮＭＷカットオフ
を有する膜を使用して該溶液を限外濾過に付した。シス
テイン濃度は、ダイアフィルトレーション％の関数とし
て測定した（表３）。
【００４５】
【表３】
【００４６】実施例３ ５％乳漿タンパク質単離体溶液１００リットルを調製
し、次いで、エンザイム・ディベロープメント・コーポ
レーションからの２％酸性プロテアーゼを使用して加水
分解した。該溶液をｐＨ３.０で１２時間加水分解し
た。該溶液を８０℃に３０分間加熱することにより反応
を停止した。次いで、該溶液を、５０００ダルトンのＮ
ＭＷカットオフを有するＫｏｃｈ ＨＦＫ ３２８膜を使
用してパイロットＵＦユニットで限外濾過した。該加水
分解産物を２つに分けた。１つはそのままのｐＨ（３.
８）で濾過した。もう１つは、まず、そのｐＨを、水酸
化ナトリウムを使用して７.０に上昇させ、その後、限
外濾過した。
【００４７】システイン濃度を限外濾過の間のｐＨの関
数として測定した（表４）。
【００４８】
【表４】
【００４９】実施例４ 実施例３における加水分解産物を、約５００ダルトンの
ＮＭＷカットオフを有するＣｅｌｇａｒｄ ＮＦ−ＰＥ
Ｓ−１０膜を使用してナノ濾過した。ＮＦ条件は、以下
のとおりであった： 圧力： ３０バール 温度： ５０〜５５℃ 初期流速： ５８リットル／ｍ２／時 最終流速： ２３リットル／ｍ２／時 プロセス： ３０リットルまで濃縮、次いで、２００％
ダイアフィルトレーション
【００５０】保持物中の得られたペプチドは、システイ
ン１２.９％およびグリシン３.１％を含有していた。
【００５１】実施例５ Ｃｙｓペプチドに対して特異的なＨＰＬＣ 逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰＣ）を、ペプチド混合物中のシス
テイン含有ペプチドを同定および定量化できるように設
定した。まず、システイン残基を蛍光標識（ＳＢＤ−
Ｆ；７−フルオロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾ
ール−４−スルホン酸；Ｓｉｇｍａ Ｆ−４３８３）で
標識化した。この標識は、システイン残基に特異的に結
合する。
【００５２】合計３００μｌの試料（タンパク質１００
μｇ／ｍｌ）、インキュベーション緩衝液（２５０ｍＭ
ホウ酸緩衝液、ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ）６００μ
ｌ、蛍光プローブ（水中０.１％（ｗ／ｖ））３００μ
ｌ、Ｈ２Ｏ ２９７μｌおよびＴＢＰ（トリブチルホス
フィン、Ｆｌｕｋａ）３μｌをバイアル中にピペットに
て加えた。該バイアルに蓋をし、該混合物を十分に混合
し、６０℃で１０分間インキュベートした。試料の最終
濃度は、０.０２ｍｇ／ｍｌであった。
【００５３】次いで、該混合物を、氷上に置いて室温に
冷却した。溶液を、０.４５μｍ ＰＶＤＦフィルター
（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ）を使用して濾過し
た。
【００５４】濾過した溶液を、Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ１
８ ５μｍ ＲＰＣカラム（ベイカー（Baker））を使用
して逆相クロマトグラフィーにより分析した。結合緩衝
液は、脱イオン水／０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢
酸）からなっており、ペプチドを、アセトニトリル／
０.０８３％ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ｂ）を使用して溶離
した。緩衝液Ｂのレベルを９０分の間に６０％まで上昇
させ、次いで、１００％緩衝液を２０分間流して、きつ
く結合した物質を除去した。試料の注入量は、１５０μ
ｌであった。
【００５５】２１４ｎｍでの吸光度および蛍光（励起波
長および発光波長：各々、３８６ｎｍおよび５１４ｎ
ｍ）を測定してペプチドを検出した。図１および図２を
参照のこと。
【００５６】図１は、２１４ｎｍでの吸光度を測定する
ことによる分離前の実施例１の加水分解産物からのペプ
チドの検出を示す。図２は、蛍光を測定することによる
同加水分解産物からの特異的システイン含有ペプチドの
検出を示す。
【００５７】実施例６ システインおよびグリシンリッチペプチドは、臨床経腸
栄養処方において使用することができた。かかる処方の
調製法は、以下のとおりであった。 ＣｙｓおよびＧｌｙリッチペプチド ５.００％ カゼインカルシウム（ディエムブイ・インターナショナル） １.９６％ マルトデキストリン ＤＥ−２０ １４.０％ 乳化剤（Ｓｔｅｒｎｐｈｉｌ Ｅ６０；スターン（Stern）） ０.３０％ 混合油（ヒマワリ油５０％；ＭＣＴ ２０％；大豆油３０％） ４.９０％ 塩化ナトリウム ０.０９％ リン酸三カルシウム ０.９５％ 塩化マグネシウム ０.１５％ リン酸二水素カルシウム ０.１３％ クエン酸三ナトリウム ０.０８６％ 水 ７７.９９％ 合計 １００％
【００５８】６０℃で、脱イオン水の一部にカゼイン塩
を溶解した；乳化剤を混合油に溶解した；塩を水７５ｍ
ｌに溶解した。次いで、混合油、塩、マルトデキストリ
ン溶液および残りの水をカゼイン塩溶液中で混合した。
この混合物を７０℃で、３５０バールで２回ホモジナイ
ズした。
【００５９】次いで、システインおよびグリシンリッチ
ペプチドをエマルションに溶解した。水酸化ナトリウム
を使用してｐＨを７.０〜７.１に調節し、次いで、生成
物を１２１℃で１０分間、レトルト滅菌した。
【００６０】実施例７当該ペプチドは、乳児用処方にて
使用することができた。処方例を以下に示す。 濃度 成分 （ｇ／リットル） ＣｙｓおよびＧｌｙリッチペプチド １０.０ ＷＥ８０ＢＧ（乳漿タンパク質加水分解産物； １０.０ ディエムブイ・インターナショナル） 食物ラクトース（ディエムブイ・インターナショナル） ３０.０ マルトデキスリンＤＥ−２０ ２３.０ 固形コーンシロップ ２５.０ 乳化剤（Ｓｔｅｒｎｐｈｉｌ Ｅ６０；スターン） ５.０ 混合油（ヒマワリ油４５％；ＭＣＴ ２５％；大豆油３０％） ４０.０ オルトリン酸カルシウム １.８ 炭酸カルシウム １.３ 塩化マグネシウム ０.３ 塩化カリウム ０.４ クエン酸三ナトリウム ０.５ 水 ８５２.７ 合計 １０００
【００６１】乳化剤を油フラクションに溶解した。７０
℃の水の一部にペプチドおよび炭水化物を溶解した。無
機物を別々に溶解した。次いで、該ペプチド／炭水化物
溶液に混合油を添加し、高速剪断ミキサーを使用して３
分間混合した。
【００６２】次いで、プレエマルションを２５０バール
で２回ホモジナイズした。該処方物は、８０℃で１５分
間加熱することにより低温殺菌し、噴霧乾燥させること
ができる（粉末処方物）か、または、ビンの中で、１２
０℃で１０分間滅菌することができる（液体処方物）。
【００６３】実施例８ 当該ペプチドは、即席飲料混合液に配合することができ
た。処方は、以下のとおりであった。 ＣｙｓおよびＧｌｙリッチペプチド １５.００％ 乳漿タンパク質濃縮物８０（Ｅｓｐｒｉｏｎ ５８０； ６５.００％ ディエムブイ・インターナショナル） グルタミンペプチド（ＷＧＥ８０ＧＰＵ； １０.００％ ディエムブイ・インターナショナル） ビタミン混合物（Roche（ロッシュ）） ４.９０％ ココア粉末（Ｄ−１１−Ｓ、エイディーエム・ココア ３.００％ （ADM Cocoa）、オランダ） フレーバー；バニラＪＳＨ００７１２Ｆ（マコーミック・ １.１５％ アンド・カンパニー（McCormick&Co.）） フレーバー；チョコレートファッジＦＦ２２０３４ ０.９５％ （マコーミック・アンド・カンパニー） 甘味料（Ａｓｐａｒｔａｍｅ、Ｎｕｔｒａｓｗｅｅｔ） ０.２０％ 合計 １００％
【００６４】乾燥成分を混合し、次いで、水１１８ｍｌ
に添加した。該溶液を混合して成分を溶解した。飲料液
１杯は、粉末混合物３５ｇを含有しており、システイン
約５００ｍｇおよびグリシン約１５０ｍｇを供給した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の加水分解産物の２１４ｎｍでの吸収
スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図１の加水分解産物の、励起波長３８６ｎｍ
および発光波長５１４ｎｍを用いた蛍光スペクトルを示
すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ２３Ｌ 1/305 // Ａ２３Ｌ 1/305 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ラム・ニマグッダ アメリカ合衆国13820ニューヨーク州オネ オンタ、リッジ・ドライブ123番 (72)発明者 ヨハネス・ウィルヘルムス・レオナルドゥ ス・ブーマンス オランダ1191エルハー・オウデルケルク・ アーン・デ・アムステル、ヨンヘ・リンデ 23番 Ｆターム(参考） 4B018 LB08 LE03 MD49 MD71 MD72 ME14 MF12 4B064 AG01 CA21 CD20 CE06 DA01 4C084 AA02 AA06 BA02 CA59 DC50 NA14 ZA332 ZA362 ZB262 ZC022

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 システイン含有タンパク質を含むタンパ
    ク質源からシステイン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチ
    ド混合物を調製する方法であって、 ａ）該タンパク質源のタンパク質をペプチドに開裂する
    工程； ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキ
    ソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少な
    くとも、該ペプチド中のシステインの位置で弱められ
    る）、末端システインを有する消化されたペプチドを形
    成する工程； ｃ）消化されたペプチドを精製する工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 システインおよびグリシン含有タンパク
    質を含むタンパク質源からシステインおよびグリシン総
    含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する方
    法であって、 ａ）該タンパク質をペプチドに開裂する工程； ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキ
    ソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少な
    くとも、該ペプチド中のシステインおよびグリシンの位
    置で弱められる）、末端システインまたはグリシンを有
    する消化されたペプチドを形成する工程； ｃ）消化されたペプチドを精製する工程を含む方法。
  3. 【請求項３】 工程ａ）およびｂ）が同時に行なわれる
    請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 少なくとも１種類のエキソペプチダーゼ
    がカルボキシペプチダーゼＹを含む請求項１〜３いずれ
    か１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 タンパク質源が少なくとも２種類のシス
    テイン含有タンパク質を含む請求項１〜４いずれか１項
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 タンパク質源が、少なくとも１つがシス
    テイン残基を含有し、少なくとも１つがグリシン残基を
    含有する、少なくとも２種類のタンパク質を含む請求項
    １〜５いずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 タンパク質源が食物タンパク質からなる
    請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 タンパク質源が乳漿タンパク質単離体お
    よび／または乳漿タンパク質濃縮物を含む請求項１〜７
    いずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 タンパク質源が、アルブミン、特に、α
    −ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、小麦グルテ
    ン、トウモロコシタンパク質単離体、卵タンパク質、特
    に、オバルブミン、シスタチンからなる群から選択され
    る１種類またはそれ以上を含む請求項１〜８いずれか１
    項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 工程ａ）および工程ｂ）が、タンパク
    質源のタンパク質中に存在するシステイン残基間の硫黄
    架橋が無傷のままである条件下で行なわれる請求項１〜
    ９いずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 工程ａ）および工程ｂ）がｐＨ２〜８
    で行なわれる請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 工程ａ）がエンドペプチダーゼ機能を
    有する酵素によるタンパク質の開裂を含む請求項１〜１
    １いずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 エンドペプチダーゼ機能を有する酵素
    がエキソペプチダーゼ機能（ここで、該エキソペプチダ
    ーゼ機能はシステインの位置で弱められる）も有する請
    求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 酵素のエキソペプチダーゼ機能がグリ
    シンおよびシステインの両方の位置で弱められる請求項
    １２または１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 酵素がＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、酸性
    プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼ２Ａ、
    プロテアーゼＢ、Ｃｏｒｏｌａｓｅ ＰＮ−Ｌ、酸性プ
    ロテアーゼ、またはそれらの１つまたはそれ以上の組合
    せである請求項１３または１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 システイン含有率が７〜２０ｗ／ｗ％
    であるシステインリッチペプチドを含む調製物。
  17. 【請求項１７】 システインおよびグリシン総含有率が
    ７〜２０ｗ／ｗ％であるシステインおよびグリシンリッ
    チペプチドを含む調製物。
  18. 【請求項１８】 ペプチドの少なくとも８０％が末端シ
    ステインおよび／またはグリシンを含む請求項１６また
    は１７記載の調製物。
  19. 【請求項１９】 薬物における活性化合物としての請求
    項１６〜１８いずれか１項記載の調製物の使用。
  20. 【請求項２０】 酸化的障害により媒介される症状の治
    療用の薬物における活性化合物としての請求項１６〜１
    ８いずれか１項記載の調製物の使用。
  21. 【請求項２１】 人体または動物体において細胞内グル
    タチオンレベルを上昇させるための薬物における活性化
    合物としての請求項１６〜１８いずれか１項記載の調製
    物の使用。
  22. 【請求項２２】 乳児用処方における請求項１６〜１８
    いずれか１項記載の調製物の使用。
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