JP4293745B2 - システイン／グリシンリッチペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、システイン−またはシステイン／グリシン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物の調製方法、該ペプチドを含む調製物、および薬物における活性化合物としてのかかる調製物の使用に関する。
【０００２】
本明細書において、ペプチドは、タンパク質から誘導されたアミノ酸鎖と定義し；該ペプチドの分子量は、好ましくは、２００Ｄ〜８０００Ｄ、より好ましくは、１０００Ｄ〜５０００Ｄである。
【０００３】
【従来の技術】
当該技術分野において、人体または動物体へのシステインおよびグリシンの有効な投与のためにシステインおよびシステイン／グリシンを含む化合物の需要が大きい。特にシステインの利用能およびそれよりも低いがグリシンの利用能は、グルタチオンの合成における限定要因である。したがって、人体または動物体における細胞内グルタチオンレベルの上昇が必要とされる場合、システインの適当な投与およびグリシンの適当な投与が要求される。
【０００４】
グルタチオン（ＧＳＨ）は、酸素要求性代謝の酸素中間体、フリーラジカルおよび副産物からの細胞の保護、ならびに生体異物の解毒を包含する広範囲にわたる生活機能を有するトリペプチド−チオール（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）である。また、グルタチオンは、白内障および酸化的ＤＮＡ損傷の予防において役割を果たすと考えられる。したがって、グルタチオンは、心筋虚血、癌および白内障のような酸化的ストレス関連疾患に対して重要な化合物と考えられる。
【０００５】
フリーラジカル損傷の攻撃との戦いまたは薬物代謝産物（例えば、シクロホスファミド、パラコートおよびアセトアミノフェン）を包含する生体異物の解毒、および細胞成分の過酸化を予防することのいずれにおいてもグルタチオンにより果たされるきわめて重大な役割に関して、グルタチオンの肝臓貯蔵を、特に、化学療法を包含する体へのストレスの間じゅう、維持する方法が必要とされている。
【０００６】
当該技術分野において、グルタチオンの細胞内レベルを増加させる種々の方法が知られている。グルタチオンのアミノ酸前駆体であるグルタミン酸、システインおよびグリシンの動物への投与は、細胞内グルタチオンの増加を引き起こし得るが、この方法の有効性には限界がある。
【０００７】
ＧＳＨの細胞内濃度は、しばしば制限アミノ酸であり、食物タンパク質からおよび肝臓におけるメチオニンからの硫黄転位により誘導されるシステインの供給に依存している。しかしながら、システインは、迅速に代謝され、その上、高濃度では細胞に対して有毒であると考えられるので、システインの遊離アミノ酸としての投与は、ＧＳＨ濃度を増加させるための理想的な方法ではない。細胞へ輸送され、細胞内でシステインに転換される化合物の動物への投与は、しばしば、細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有用である。
【０００８】
組織内ＧＳＨ濃度を増加させ得る別の方法は、ガンマ−グルタミルシステインまたはガンマ−グルタミルシスチンの投与によるものである。投与されたガンマ−グルタミルアミノ酸は、無傷で輸送され、ＧＳＨシンセターゼの基質として役立つ。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与がしばしばＧＳＨの組織内濃度を増加させ得ることもまた知られている。細胞内グルタチオンを増加させるためにＮ−メルカプトプロピオニルグリシンを使用することについての他の報告が知られている。メルカプトプロピオニルグリシンを使用して細胞内グルタチオンを上昇させる臨床試験が多少行なわれた。
【０００９】
グルタチオン自体の投与がグルタチオンレベルを増加させ得るということもまた検討された。しかしながら、無傷のグルタチオンが細胞内に入ることを証明する証拠は公表されていない。実際、グルタチオン自体が細胞へ輸送されないということを証明している特定の生物学的な系についてのいくつかの報告はある。グルタチオンの投与後にしばしば見られる細胞内グルタチオンの増加は、（ａ）グルタチオンの細胞外分解、（ｂ）細胞外でグルタチオンから誘導された遊離アミノ酸またはジペプチドの細胞への輸送、および（ｃ）グルタチオンの細胞内再合成によるものである。
【００１０】
グルタチオンレベルを増加させるこれらの慣用的な方法に加えて、グルタチオンを細胞内で増強させることができる方法を示す試みがいくつかあった。これらは、全て、合成誘導体または熱不安定であるほぼ無傷の未変性タンパク質に関するものであり、いずれも天然由来のペプチド混合物に関するものではない。
【００１１】
米国特許第5,869,456号は、純粋なグルタチオンのアルキルエステル（純度９５％）の調製物、およびかかるグルタチオンのアルキルジエステルを投与することにより細胞内グルタチオンレベルを増加させる方法に関する。
【００１２】
米国特許第5,464,825号には、グルタチオンまたはグルタチオン等価物、例えば、Ｎ−アシルグルタチオンまたはグルタチオンモノアルキルエステルの増加した細胞内レベルを提供するためのＮ−アシルグルタチオンモノアルキルエステルの調製方法および使用が開示されている。
【００１３】
米国特許第5,248,697号には、グルタチオンの組織内または血漿内レベルを維持および／または増強する方法が開示されている。該特許は、組織に酸化的損傷を与える能力のある化合物への哺乳動物の曝露に伴う組織グルタチオンレベルの減少を予防するための超正常量のグルタチオンまたはグルタチオン等価物での哺乳動物の治療技術を開示している。
【００１４】
米国特許第4,665,082号は、酵素−５−オキソ−Ｌ−プロリナーゼにより開裂してシステインを形成する５−オキソプロリンの硫黄アナログであるＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレートの役割を検討して、塩基性アミノ酸溶液にＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレートを添加することによる、または、それをインビボ細胞中に直接注入することによる、システインデリバリーシステムの基礎を提供する。
【００１５】
ドイツ特許第4,329,857号は、免疫系および免疫反応を強化する薬剤としてのチオール化合物（システインおよびその誘導体またはアナログ、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸）の使用を開示している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、システイン含有タンパク質を含むタンパク質源からシステイン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する新規方法を提供する。該タンパク質源は、好ましくは、天然タンパク質源である。本発明のこの実施態様に従って調製されたペプチド混合物は、それが天然タンパク質源から誘導化され、いずれもの副作用を示さないであろうという長所を有するが、従来技術に記載されている化学的に生成されたシステイン誘導体は、副作用を示した。以下に記載するとおり、ペプチド混合物のかかる調製物は、食餌サプリメントまたは薬物におけるシステイン源として非常に有利に使用されることが見出された。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
当該方法は、
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに開裂する工程；
ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少なくとも、該ペプチド中のシステインの位置で弱められる）、末端システインを有する消化されたペプチドを形成する工程；
ｃ）消化されたペプチドを精製する工程
を含むことを特徴としている。
【００１８】
第１の工程ａ）において、タンパク質源のタンパク質をより小さいペプチドに開裂する。この開裂は、当該技術分野で知られている開裂反応により行なわれ得る；好ましくは、該開裂は、例えば、エンドペプチダーゼによるタンパク質のペプチド結合の酵素加水分解により行なわれ、その結果、ほぼ所望の長さのペプチドが得られて、エキソペプチダーゼに対する基質の量が増加する。第２の工程において、開裂反応により得られたペプチドを、少なくとも１種類のエキソペプチダーゼにより消化する。「少なくとも１種類のエキソペプチダーゼ」とは、１種類またはそれ以上のエキソペプチダーゼにより消化反応を行なうことができることを意味する。エキソペプチダーゼは、ペプチドの末端から１個ずつアミノ酸を遊離する。エキソペプチダーゼおよび消化反応条件は、エキソペプチダーゼ作用が少なくともペプチドにおけるシステインの位置で弱められるように選択される。「少なくとも弱められる」とは、エキソペプチダーゼが選択された反応条件下ではシステインをペプチドから除去しないか、または、非常に低いシステインの開裂優先度を有していて、該ペプチドからの他のアミノ酸の開裂と比較して該開裂反応が非常に遅くなることを意味する。かかるエキソペプチダーゼおよび条件の使用により、末端アミノ酸が該末端に最も近いシステイン残基まで除去されたペプチドが生成される。当業者は、エキソペプチダーゼを有する市販の酵素の作用がシステインの位置で弱められて機能する条件を見出すことができるであろう。ペプチドは、アミノ酸鎖に存在するシステイン残基のジスルフィド架橋によりお互いに結合し合う１つまたはそれ以上のアミノ酸鎖を有していてもよいことが理解できる。したがって、「末端システインを有する消化されたペプチド」とは、かかる多鎖ペプチドの両端の少なくとも１つが末端システインを有することを表している。もちろん、かかるペプチドは、１個より多い末端システインを含有していてもよい。好ましくは、酵素活性は、例えば、ｐＨシフトまたは熱失活処理などにより、精製工程の前に不活性化される。
【００１９】
カルボキシペプチダーゼＹ（Ｅ.Ｃ.３.４.１６.１）は、システイン残基で非常に有効に弱めることができて、末端システイン残基を有するペプチドを生成することが見出されたので、好ましくは、エキソペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼＹを含む。
【００２０】
開裂工程ａ）および消化工程ｂ）は、例えば、共に同一反応条件で機能するエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを使用することにより同時に行なうことができる。また、エンドペプチダーゼ活性およびエキソペプチダーゼ活性の両方の活性を有する酵素調製物を使用することもできる。
【００２１】
最後に、これらの消化されたペプチドを精製する。エキソペプチダーゼにより遊離された遊離アミノ酸から消化されたペプチドを精製する適当な方法は当該技術分野で知られている。システインおよびグリシン含有ペプチドと他の遊離アミノ酸との間で分子量の差異が生じるので、システインおよびグリシン含有ペプチドは、この差異を利用して精製することができる。当該技術分野で知られているいくつかの技法を使用することができる。好ましくは、遊離アミノ酸は、膜プロセス、好ましくは、限外濾過またはナノ濾過を使用して分離される。該精製工程は、また、有利には、Kronina et al., Journal of Chromatography A, 852 (1999) pp 261-272 に従う固定化金属アフィニティークロマトグラフィー工程（ＩＭＡＣ）の使用を含む。その後、システインおよびグリシンリッチペプチドを乾燥させることができる。
【００２２】
特定の実施態様において、工程ｂ）におけるエキソペプチダーゼおよび開裂反応は、エキソペプチダーゼが少なくともペプチドにおけるシステインおよびグリシンの両方の位置で弱められるように選択される。この結果、主に末端システインまたはグリシンを有する消化されたペプチドが得られるであろう。
【００２３】
システイン残基に富むかまたはシステイン残基およびグリシン残基の両方に富む精製されたペプチドは、人体または動物体におけるシステインおよびグリシン率を上昇させるために、これらの制限アミノ酸を容易に投与するのに非常に適した源であることを示し、したがって、細胞内グルタチオンレベルを上昇させ得る。
【００２４】
タンパク質源は、システイン含有タンパク質を含む限りいずれの源であってもよい。システインおよびグリシンリッチペプチド調製物が生成されるべきである場合、該タンパク質源は、グリシンおよびシステインを含有するタンパク質を含有すべきである。
【００２５】
好ましくは、該タンパク質源は、共にペプチドのグリシンおよび／またはシステイン含有量に関与する少なくとも２種類のタンパク質を含む。該タンパク質のうちの一は、グリシンリッチであってよく、第２のタンパク質は、システインリッチであってよい。該タンパク質源は、また、本発明の方法に付される前に、例えば、開裂工程の前または間に２種類またはそれ以上のタンパク質源により、調製することができる。
【００２６】
好ましくは、タンパク質源は、食物タンパク質からなっていて、消化されたペプチドは、食物添加物として使用することができる。非常に特定の実施態様例において、該タンパク質源は、乳漿タンパク質単離体（ＷＰＩ）および／または乳漿タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）を含む。「乳漿タンパク質単離体」および「乳漿タンパク質濃縮物」なる用語は、当該技術分野で知られている。乳漿タンパク質濃縮物は、タンパク質を３５〜８０ｗ／ｗ％有する乳漿タンパク質生成物であり、乳漿タンパク質単離体は、９０ｗ／ｗ％またはそれより高いタンパク質含有量を有する。ＷＰＣの例は、ディエムブイ・インターナショナル（DMV Internatonal）からのＥｓｐｒｉｏｎ ５８０である；ＷＰＩの例は、バイオ−アイソレーツ・リミテッド（Bio-isolates Ltd.）からのＢｉｐｒｏである。乳漿タンパク質は、重要なシステイン源であり、乳漿タンパク質濃縮物は、動物の臓器中でグルタチオン生成を誘発すると考えられる。例えば、米国特許第5,451,412号を参照のこと。しかしながら、乳漿タンパク質濃縮物自体は、本発明のペプチドと比較して細胞内グルタチオンレベルの上昇に適していない。無傷乳漿タンパク質におけるシステインおよびグリシンの濃度は、本発明のペプチドにおけるよりも非常に低く、したがって、該用途において許容できるレベルのシステインに達するために無傷の乳漿タンパク質の非常に高い投与量を必要とする。
【００２７】
米国特許第5,451,412号のさらなる短所は、全体的に未変性の乳漿タンパク質生成物の使用が非常に繊細なプロセス条件を必要とするので、非常に高価となり得る点である。乳漿タンパク質単離体は、非常に適当なシステインおよびグリシンリッチタンパク質、例えば、アルブミン、特に、αラクトアルブミンおよびウシ血清アルブミンを含む。該タンパク質は、有利には、本発明の方法においてまたは該方法の出発タンパク質源として使用される。
【００２８】
他の好ましい実施態様において、タンパク質源は、アルブミン、特に、α−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、卵タンパク質（例えば、オボアルブミン、シスタチン）、小麦グルテン、トウモロコシタンパク質単離体からなる群から選択される１またはそれ以上を含む。
【００２９】
好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、タンパク質源中のタンパク質に存在するシステイン残基間の硫黄架橋ができる限り酸化形態で保持される条件で行われる。このようにして、システイン残基のほとんどが酸化されており、ジスルフィド架橋を介して他のペプチドに結合されているシステインリッチペプチド混合物が得られる。酸化形態の（すなわち、硫黄架橋により別のシステイン残基に結合している）システインの正しい名称は、「シスチン」であるが、本明細書において、「システイン」は、還元形態の（遊離ＳＨ基を有する）システインおよび酸化形態のシステイン（シスチン）の両方であると定義する。システイン残基間の硫黄架橋が無傷であるペプチドは、該ペプチドが誘導される元の天然たんぱく質の一部を模倣していることがあり、還元形態の別々のペプチドのものと比較して改良された生物学的作用を与える可能性がある。また、酸化形態は、反応性があまりなくて、低温殺菌または無菌化のような熱処理を受ける用途においてより安定である。
【００３０】
さらなる長所は、エキソペプチダーゼ活性を有する多くの酵素は酸化システインを開裂しないが、還元形態のシステインは該酵素により相対的に低い活性ではあるが該ペプチドから開裂され得る点である。天然の、すなわち、未変性形態のペプチド混合物を生成するために、工程ａ）およびｂ）は、好ましくは、ｐＨ２〜８で行なわれる。
【００３１】
酸性環境において加水分解工程を行なうのが好ましい。酸性ｐＨでのシスチンにおけるジスルフィド架橋は塩基性ｐＨの場合よりも安定である。［Creighton, T.E., 1993, Proteins: structures and Molecular Properties. 2nd Ed.; Freeman and Company, New York］。
【００３２】
工程ａ）においてエンドペプチダーゼ機能を有する酵素によりタンパク質源のタンパク質を開裂するのが好ましい。かかる酵素の使用により、未変性（天然）条件下でタンパク質を開裂して未変性開裂生成物を得るのが可能になる。物理的または化学的開裂は、多くの場合、無傷の天然ペプチド混合物を得ようとする場合には使用できない変性条件の適用を含む。これに対して、エキソペプチダーゼ消化は、未変性条件でも好適に起こる。当業者は、無傷の天然ペプチド混合物を得るのに適した条件を理解するであろう。「無傷の天然ペプチド」とは、この趣意において、該ペプチドが天然の機能的タンパク質において有すると同様のコンフォメーションを有するペプチドであると理解されるべきである。
【００３３】
非常に関心のある実施態様において、エンドペプチダーゼ機能を有する酵素は、また、エキソペプチダーゼ機能をも有し、このエキソペプチダーゼ機能は、システインの位置またはグリシンおよびシステインの両方の位置で弱められる。かかる酵素は、当該技術分野で知られており、その長所は、工程ａ）およびｂ）を同時に行なうことができる点である。エンドペプチダーゼ機能およびエキソペプチダーゼ機能の両方を有する好ましい酵素の例は、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、酸性プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼＢ、Ｃｏｒｏｌａｓｅ ＰＮ−Ｌ、酸性プロテアーゼまたはそれらのうちの１つまたはそれ以上の組合せである。
【００３４】
本発明は、また、システインを７〜２０ｗ／ｗ％含むシステインリッチペプチドを含む調製物およびシステイン／グリシンを７〜２０ｗ／ｗ％含むかかる調製物に関する。上記のとおり、該調製物は、有利には、例えば、細胞内グルタチオンレベルの上昇のためにシステインまたはシステインおよびグリシンの組合せのシステイン取り込み量を有効に改善するために動物またはヒトへの投与に使用できる。好ましくは、調製物のペプチドの少なくとも８０％は、末端システインおよび／またはグリシンを含んでおり、人体または動物体用に容易に利用可能である。これらの末端システインおよび／またはグリシンは、上記したエキソペプチダーゼの使用により得られる。
【００３５】
また、本発明は、薬物、特に、酸化的障害により媒介される症状の治療用の薬物、および人体または動物体において細胞内グルタチオンレベルを上昇させるための薬物における活性な化合物としての本発明の調製物の使用に関する。これに関して、該調製物は、所望の投与剤形の薬物を得るために、適当な担体、希釈剤、アジュバントなどと配合することができる。該調製物は、有利には、乳児用処方において、例えば、母乳代用品において使用することができる。
【００３６】
ここで、本発明を以下の実施例および図において例示するが、単なる例示であり、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
１０％乳漿タンパク質単離体（ＷＰＩ）溶液を調製し、次いで、酵素を使用して加水分解した。酵素のいくつかの組合せを使用した（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
溶液１〜３は、まず、ｐＨ２.０で６時間、ペプシンで加水分解させた。次いで、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを７.０に上昇させた。第２の酵素を添加し、溶液を２０時間インキュベートした。酵素を１種類だけ含有する溶液は、ＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅについてはｐＨ７で、および酸性プロテアーゼについてｐＨ３で、５０℃で２０時間加水分解させた。
【００４０】
該溶液を８５℃に１５分間加熱することにより加水分解反応を停止させた。次いで、限外濾過を使用してシステインを含有するペプチドから遊離アミノ酸を除去した。１０００ダルトンの呼称分子量（ＮＭＷ）カットオフを有する膜を使用した。該溶液を５００％ダイアフィルトレーションまで限外濾過した。
【００４１】
タンパク質は、ケルダール法を用いて測定した。システイン濃度は、エルマン試薬を用いて測定した。［Beveridge et al., (1974) Journal of Food Science Volume 39, p. 49-51］。次いで、ペプチドを凍結乾燥させた。
【００４２】
乳漿タンパク質単離体およびペプチド中のシスチンおよびグリシンの両方の濃度を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
実施例２
１０％乳漿タンパク質濃縮物を含有する８０％タンパク質溶液を調製し、次いで、エンザイム・ディベロープメント・コーポレーション（Enzyme Development Corporation）からの１％酸性プロテアーゼを使用して加水分解した。該溶液をｐＨ３.０で２０時間加水分解した。該溶液を９０℃に１０分間加熱することにより反応を停止させた。次いで、１０００ダルトンのＮＭＷカットオフを有する膜を使用して該溶液を限外濾過に付した。システイン濃度は、ダイアフィルトレーション％の関数として測定した（表３）。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例３
５％乳漿タンパク質単離体溶液１００リットルを調製し、次いで、エンザイム・ディベロープメント・コーポレーションからの２％酸性プロテアーゼを使用して加水分解した。該溶液をｐＨ３.０で１２時間加水分解した。該溶液を８０℃に３０分間加熱することにより反応を停止した。次いで、該溶液を、５０００ダルトンのＮＭＷカットオフを有するＫｏｃｈ ＨＦＫ ３２８膜を使用してパイロットＵＦユニットで限外濾過した。該加水分解産物を２つに分けた。１つはそのままのｐＨ（３.８）で濾過した。もう１つは、まず、そのｐＨを、水酸化ナトリウムを使用して７.０に上昇させ、その後、限外濾過した。
【００４７】
システイン濃度を限外濾過の間のｐＨの関数として測定した（表４）。
【００４８】
【表４】
【００４９】
実施例４
実施例３における加水分解産物を、約５００ダルトンのＮＭＷカットオフを有するＣｅｌｇａｒｄ ＮＦ−ＰＥＳ−１０膜を使用してナノ濾過した。ＮＦ条件は、以下のとおりであった：
圧力： ３０バール
温度： ５０〜５５℃
初期流速： ５８リットル／ｍ２／時
最終流速： ２３リットル／ｍ２／時
プロセス： ３０リットルまで濃縮、次いで、２００％ダイアフィルトレーション
【００５０】
保持物中の得られたペプチドは、システイン１２.９％およびグリシン３.１％を含有していた。
【００５１】
実施例５
Ｃｙｓペプチドに対して特異的なＨＰＬＣ
逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰＣ）を、ペプチド混合物中のシステイン含有ペプチドを同定および定量化できるように設定した。まず、システイン残基を蛍光標識（ＳＢＤ−Ｆ；７−フルオロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−スルホン酸；Ｓｉｇｍａ Ｆ−４３８３）で標識化した。この標識は、システイン残基に特異的に結合する。
【００５２】
合計３００μｌの試料（タンパク質１００μｇ／ｍｌ）、インキュベーション緩衝液（２５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ）６００μｌ、蛍光プローブ（水中０.１％（ｗ／ｖ））３００μｌ、Ｈ２Ｏ ２９７μｌおよびＴＢＰ（トリブチルホスフィン、Ｆｌｕｋａ）３μｌをバイアル中にピペットにて加えた。該バイアルに蓋をし、該混合物を十分に混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。試料の最終濃度は、０.０２ｍｇ／ｍｌであった。
【００５３】
次いで、該混合物を、氷上に置いて室温に冷却した。溶液を、０.４５μｍ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ）を使用して濾過した。
【００５４】
濾過した溶液を、Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ１８ ５μｍ ＲＰＣカラム（ベイカー（Baker））を使用して逆相クロマトグラフィーにより分析した。結合緩衝液は、脱イオン水／０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）からなっており、ペプチドを、アセトニトリル／０.０８３％ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ｂ）を使用して溶離した。緩衝液Ｂのレベルを９０分の間に６０％まで上昇させ、次いで、１００％緩衝液を２０分間流して、きつく結合した物質を除去した。試料の注入量は、１５０μｌであった。
【００５５】
２１４ｎｍでの吸光度および蛍光（励起波長および発光波長：各々、３８６ｎｍおよび５１４ｎｍ）を測定してペプチドを検出した。図１および図２を参照のこと。
【００５６】
図１は、２１４ｎｍでの吸光度を測定することによる分離前の実施例１の加水分解産物からのペプチドの検出を示す。
図２は、蛍光を測定することによる同加水分解産物からの特異的システイン含有ペプチドの検出を示す。
【００５７】
実施例６
システインおよびグリシンリッチペプチドは、臨床経腸栄養処方において使用することができた。かかる処方の調製法は、以下のとおりであった。
【００５８】
６０℃で、脱イオン水の一部にカゼイン塩を溶解した；乳化剤を混合油に溶解した；塩を水７５ｍｌに溶解した。次いで、混合油、塩、マルトデキストリン溶液および残りの水をカゼイン塩溶液中で混合した。この混合物を７０℃で、３５０バールで２回ホモジナイズした。
【００５９】
次いで、システインおよびグリシンリッチペプチドをエマルションに溶解した。水酸化ナトリウムを使用してｐＨを７.０〜７.１に調節し、次いで、生成物を１２１℃で１０分間、レトルト滅菌した。
【００６０】
実施例７
当該ペプチドは、乳児用処方にて使用することができた。処方例を以下に示す。
【００６１】
乳化剤を油フラクションに溶解した。７０℃の水の一部にペプチドおよび炭水化物を溶解した。無機物を別々に溶解した。次いで、該ペプチド／炭水化物溶液に混合油を添加し、高速剪断ミキサーを使用して３分間混合した。
【００６２】
次いで、プレエマルションを２５０バールで２回ホモジナイズした。該処方物は、８０℃で１５分間加熱することにより低温殺菌し、噴霧乾燥させることができる（粉末処方物）か、または、ビンの中で、１２０℃で１０分間滅菌することができる（液体処方物）。
【００６３】
実施例８
当該ペプチドは、即席飲料混合液に配合することができた。処方は、以下のとおりであった。
【００６４】
乾燥成分を混合し、次いで、水１１８ｍｌに添加した。該溶液を混合して成分を溶解した。飲料液１杯は、粉末混合物３５ｇを含有しており、システイン約５００ｍｇおよびグリシン約１５０ｍｇを供給した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の加水分解産物の２１４ｎｍでの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図１の加水分解産物の、励起波長３８６ｎｍおよび発光波長５１４ｎｍを用いた蛍光スペクトルを示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、システイン−またはシステイン／グリシン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物の調製方法、該ペプチドを含む調製物、および薬物における活性化合物としてのかかる調製物の使用に関する。
【０００２】
本明細書において、ペプチドは、タンパク質から誘導されたアミノ酸鎖と定義し；該ペプチドの分子量は、好ましくは、２００Ｄ〜８０００Ｄ、より好ましくは、１０００Ｄ〜５０００Ｄである。
【０００３】
【従来の技術】
当該技術分野において、人体または動物体へのシステインおよびグリシンの有効な投与のためにシステインおよびシステイン／グリシンを含む化合物の需要が大きい。特にシステインの利用能およびそれよりも低いがグリシンの利用能は、グルタチオンの合成における限定要因である。したがって、人体または動物体における細胞内グルタチオンレベルの上昇が必要とされる場合、システインの適当な投与およびグリシンの適当な投与が要求される。
【０００４】
グルタチオン（ＧＳＨ）は、酸素要求性代謝の酸素中間体、フリーラジカルおよび副産物からの細胞の保護、ならびに生体異物の解毒を包含する広範囲にわたる生活機能を有するトリペプチド−チオール（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）である。また、グルタチオンは、白内障および酸化的ＤＮＡ損傷の予防において役割を果たすと考えられる。したがって、グルタチオンは、心筋虚血、癌および白内障のような酸化的ストレス関連疾患に対して重要な化合物と考えられる。
【０００５】
フリーラジカル損傷の攻撃との戦いまたは薬物代謝産物（例えば、シクロホスファミド、パラコートおよびアセトアミノフェン）を包含する生体異物の解毒、および細胞成分の過酸化を予防することのいずれにおいてもグルタチオンにより果たされるきわめて重大な役割に関して、グルタチオンの肝臓貯蔵を、特に、化学療法を包含する体へのストレスの間じゅう、維持する方法が必要とされている。
【０００６】
当該技術分野において、グルタチオンの細胞内レベルを増加させる種々の方法が知られている。グルタチオンのアミノ酸前駆体であるグルタミン酸、システインおよびグリシンの動物への投与は、細胞内グルタチオンの増加を引き起こし得るが、この方法の有効性には限界がある。
【０００７】
ＧＳＨの細胞内濃度は、しばしば制限アミノ酸であり、食物タンパク質からおよび肝臓におけるメチオニンからの硫黄転位により誘導されるシステインの供給に依存している。しかしながら、システインは、迅速に代謝され、その上、高濃度では細胞に対して有毒であると考えられるので、システインの遊離アミノ酸としての投与は、ＧＳＨ濃度を増加させるための理想的な方法ではない。細胞へ輸送され、細胞内でシステインに転換される化合物の動物への投与は、しばしば、細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有用である。
【０００８】
組織内ＧＳＨ濃度を増加させ得る別の方法は、ガンマ−グルタミルシステインまたはガンマ−グルタミルシスチンの投与によるものである。投与されたガンマ−グルタミルアミノ酸は、無傷で輸送され、ＧＳＨシンセターゼの基質として役立つ。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与がしばしばＧＳＨの組織内濃度を増加させ得ることもまた知られている。細胞内グルタチオンを増加させるためにＮ−メルカプトプロピオニルグリシンを使用することについての他の報告が知られている。メルカプトプロピオニルグリシンを使用して細胞内グルタチオンを上昇させる臨床試験が多少行なわれた。
【０００９】
グルタチオン自体の投与がグルタチオンレベルを増加させ得るということもまた検討された。しかしながら、無傷のグルタチオンが細胞内に入ることを証明する証拠は公表されていない。実際、グルタチオン自体が細胞へ輸送されないということを証明している特定の生物学的な系についてのいくつかの報告はある。グルタチオンの投与後にしばしば見られる細胞内グルタチオンの増加は、（ａ）グルタチオンの細胞外分解、（ｂ）細胞外でグルタチオンから誘導された遊離アミノ酸またはジペプチドの細胞への輸送、および（ｃ）グルタチオンの細胞内再合成によるものである。
【００１０】
グルタチオンレベルを増加させるこれらの慣用的な方法に加えて、グルタチオンを細胞内で増強させることができる方法を示す試みがいくつかあった。これらは、全て、合成誘導体または熱不安定であるほぼ無傷の未変性タンパク質に関するものであり、いずれも天然由来のペプチド混合物に関するものではない。
【００１１】
米国特許第5,869,456号は、純粋なグルタチオンのアルキルエステル（純度９５％）の調製物、およびかかるグルタチオンのアルキルジエステルを投与することにより細胞内グルタチオンレベルを増加させる方法に関する。
【００１２】
米国特許第5,464,825号には、グルタチオンまたはグルタチオン等価物、例えば、Ｎ−アシルグルタチオンまたはグルタチオンモノアルキルエステルの増加した細胞内レベルを提供するためのＮ−アシルグルタチオンモノアルキルエステルの調製方法および使用が開示されている。
【００１３】
米国特許第5,248,697号には、グルタチオンの組織内または血漿内レベルを維持および／または増強する方法が開示されている。該特許は、組織に酸化的損傷を与える能力のある化合物への哺乳動物の曝露に伴う組織グルタチオンレベルの減少を予防するための超正常量のグルタチオンまたはグルタチオン等価物での哺乳動物の治療技術を開示している。
【００１４】
米国特許第4,665,082号は、酵素−５−オキソ−Ｌ−プロリナーゼにより開裂してシステインを形成する５−オキソプロリンの硫黄アナログであるＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレートの役割を検討して、塩基性アミノ酸溶液にＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレートを添加することによる、または、それをインビボ細胞中に直接注入することによる、システインデリバリーシステムの基礎を提供する。
【００１５】
ドイツ特許第4,329,857号は、免疫系および免疫反応を強化する薬剤としてのチオール化合物（システインおよびその誘導体またはアナログ、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸）の使用を開示している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、システイン含有タンパク質を含むタンパク質源からシステイン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する新規方法を提供する。該タンパク質源は、好ましくは、天然タンパク質源である。本発明のこの実施態様に従って調製されたペプチド混合物は、それが天然タンパク質源から誘導化され、いずれもの副作用を示さないであろうという長所を有するが、従来技術に記載されている化学的に生成されたシステイン誘導体は、副作用を示した。以下に記載するとおり、ペプチド混合物のかかる調製物は、食餌サプリメントまたは薬物におけるシステイン源として非常に有利に使用されることが見出された。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
当該方法は、
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに開裂する工程；
ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少なくとも、該ペプチド中のシステインの位置で弱められる）、末端システインを有する消化されたペプチドを形成する工程；
ｃ）消化されたペプチドを精製する工程
を含むことを特徴としている。
【００１８】
第１の工程ａ）において、タンパク質源のタンパク質をより小さいペプチドに開裂する。この開裂は、当該技術分野で知られている開裂反応により行なわれ得る；好ましくは、該開裂は、例えば、エンドペプチダーゼによるタンパク質のペプチド結合の酵素加水分解により行なわれ、その結果、ほぼ所望の長さのペプチドが得られて、エキソペプチダーゼに対する基質の量が増加する。第２の工程において、開裂反応により得られたペプチドを、少なくとも１種類のエキソペプチダーゼにより消化する。「少なくとも１種類のエキソペプチダーゼ」とは、１種類またはそれ以上のエキソペプチダーゼにより消化反応を行なうことができることを意味する。エキソペプチダーゼは、ペプチドの末端から１個ずつアミノ酸を遊離する。エキソペプチダーゼおよび消化反応条件は、エキソペプチダーゼ作用が少なくともペプチドにおけるシステインの位置で弱められるように選択される。「少なくとも弱められる」とは、エキソペプチダーゼが選択された反応条件下ではシステインをペプチドから除去しないか、または、非常に低いシステインの開裂優先度を有していて、該ペプチドからの他のアミノ酸の開裂と比較して該開裂反応が非常に遅くなることを意味する。かかるエキソペプチダーゼおよび条件の使用により、末端アミノ酸が該末端に最も近いシステイン残基まで除去されたペプチドが生成される。当業者は、エキソペプチダーゼを有する市販の酵素の作用がシステインの位置で弱められて機能する条件を見出すことができるであろう。ペプチドは、アミノ酸鎖に存在するシステイン残基のジスルフィド架橋によりお互いに結合し合う１つまたはそれ以上のアミノ酸鎖を有していてもよいことが理解できる。したがって、「末端システインを有する消化されたペプチド」とは、かかる多鎖ペプチドの両端の少なくとも１つが末端システインを有することを表している。もちろん、かかるペプチドは、１個より多い末端システインを含有していてもよい。好ましくは、酵素活性は、例えば、ｐＨシフトまたは熱失活処理などにより、精製工程の前に不活性化される。
【００１９】
カルボキシペプチダーゼＹ（Ｅ.Ｃ.３.４.１６.１）は、システイン残基で非常に有効に弱めることができて、末端システイン残基を有するペプチドを生成することが見出されたので、好ましくは、エキソペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼＹを含む。
【００２０】
開裂工程ａ）および消化工程ｂ）は、例えば、共に同一反応条件で機能するエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを使用することにより同時に行なうことができる。また、エンドペプチダーゼ活性およびエキソペプチダーゼ活性の両方の活性を有する酵素調製物を使用することもできる。
【００２１】
最後に、これらの消化されたペプチドを精製する。エキソペプチダーゼにより遊離された遊離アミノ酸から消化されたペプチドを精製する適当な方法は当該技術分野で知られている。システインおよびグリシン含有ペプチドと他の遊離アミノ酸との間で分子量の差異が生じるので、システインおよびグリシン含有ペプチドは、この差異を利用して精製することができる。当該技術分野で知られているいくつかの技法を使用することができる。好ましくは、遊離アミノ酸は、膜プロセス、好ましくは、限外濾過またはナノ濾過を使用して分離される。該精製工程は、また、有利には、Kronina et al., Journal of Chromatography A, 852 (1999) pp 261-272 に従う固定化金属アフィニティークロマトグラフィー工程（ＩＭＡＣ）の使用を含む。その後、システインおよびグリシンリッチペプチドを乾燥させることができる。
【００２２】
特定の実施態様において、工程ｂ）におけるエキソペプチダーゼおよび開裂反応は、エキソペプチダーゼが少なくともペプチドにおけるシステインおよびグリシンの両方の位置で弱められるように選択される。この結果、主に末端システインまたはグリシンを有する消化されたペプチドが得られるであろう。
【００２３】
システイン残基に富むかまたはシステイン残基およびグリシン残基の両方に富む精製されたペプチドは、人体または動物体におけるシステインおよびグリシン率を上昇させるために、これらの制限アミノ酸を容易に投与するのに非常に適した源であることを示し、したがって、細胞内グルタチオンレベルを上昇させ得る。
【００２４】
タンパク質源は、システイン含有タンパク質を含む限りいずれの源であってもよい。システインおよびグリシンリッチペプチド調製物が生成されるべきである場合、該タンパク質源は、グリシンおよびシステインを含有するタンパク質を含有すべきである。
【００２５】
好ましくは、該タンパク質源は、共にペプチドのグリシンおよび／またはシステイン含有量に関与する少なくとも２種類のタンパク質を含む。該タンパク質のうちの一は、グリシンリッチであってよく、第２のタンパク質は、システインリッチであってよい。該タンパク質源は、また、本発明の方法に付される前に、例えば、開裂工程の前または間に２種類またはそれ以上のタンパク質源により、調製することができる。
【００２６】
好ましくは、タンパク質源は、食物タンパク質からなっていて、消化されたペプチドは、食物添加物として使用することができる。非常に特定の実施態様例において、該タンパク質源は、乳漿タンパク質単離体（ＷＰＩ）および／または乳漿タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）を含む。「乳漿タンパク質単離体」および「乳漿タンパク質濃縮物」なる用語は、当該技術分野で知られている。乳漿タンパク質濃縮物は、タンパク質を３５〜８０ｗ／ｗ％有する乳漿タンパク質生成物であり、乳漿タンパク質単離体は、９０ｗ／ｗ％またはそれより高いタンパク質含有量を有する。ＷＰＣの例は、ディエムブイ・インターナショナル（DMV Internatonal）からのＥｓｐｒｉｏｎ ５８０である；ＷＰＩの例は、バイオ−アイソレーツ・リミテッド（Bio-isolates Ltd.）からのＢｉｐｒｏである。乳漿タンパク質は、重要なシステイン源であり、乳漿タンパク質濃縮物は、動物の臓器中でグルタチオン生成を誘発すると考えられる。例えば、米国特許第5,451,412号を参照のこと。しかしながら、乳漿タンパク質濃縮物自体は、本発明のペプチドと比較して細胞内グルタチオンレベルの上昇に適していない。無傷乳漿タンパク質におけるシステインおよびグリシンの濃度は、本発明のペプチドにおけるよりも非常に低く、したがって、該用途において許容できるレベルのシステインに達するために無傷の乳漿タンパク質の非常に高い投与量を必要とする。
【００２７】
米国特許第5,451,412号のさらなる短所は、全体的に未変性の乳漿タンパク質生成物の使用が非常に繊細なプロセス条件を必要とするので、非常に高価となり得る点である。乳漿タンパク質単離体は、非常に適当なシステインおよびグリシンリッチタンパク質、例えば、アルブミン、特に、αラクトアルブミンおよびウシ血清アルブミンを含む。該タンパク質は、有利には、本発明の方法においてまたは該方法の出発タンパク質源として使用される。
【００２８】
他の好ましい実施態様において、タンパク質源は、アルブミン、特に、α−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、卵タンパク質（例えば、オボアルブミン、シスタチン）、小麦グルテン、トウモロコシタンパク質単離体からなる群から選択される１またはそれ以上を含む。
【００２９】
好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、タンパク質源中のタンパク質に存在するシステイン残基間の硫黄架橋ができる限り酸化形態で保持される条件で行われる。このようにして、システイン残基のほとんどが酸化されており、ジスルフィド架橋を介して他のペプチドに結合されているシステインリッチペプチド混合物が得られる。酸化形態の（すなわち、硫黄架橋により別のシステイン残基に結合している）システインの正しい名称は、「シスチン」であるが、本明細書において、「システイン」は、還元形態の（遊離ＳＨ基を有する）システインおよび酸化形態のシステイン（シスチン）の両方であると定義する。システイン残基間の硫黄架橋が無傷であるペプチドは、該ペプチドが誘導される元の天然たんぱく質の一部を模倣していることがあり、還元形態の別々のペプチドのものと比較して改良された生物学的作用を与える可能性がある。また、酸化形態は、反応性があまりなくて、低温殺菌または無菌化のような熱処理を受ける用途においてより安定である。
【００３０】
さらなる長所は、エキソペプチダーゼ活性を有する多くの酵素は酸化システインを開裂しないが、還元形態のシステインは該酵素により相対的に低い活性ではあるが該ペプチドから開裂され得る点である。天然の、すなわち、未変性形態のペプチド混合物を生成するために、工程ａ）およびｂ）は、好ましくは、ｐＨ２〜８で行なわれる。
【００３１】
酸性環境において加水分解工程を行なうのが好ましい。酸性ｐＨでのシスチンにおけるジスルフィド架橋は塩基性ｐＨの場合よりも安定である。［Creighton, T.E., 1993, Proteins: structures and Molecular Properties. 2nd Ed.; Freeman and Company, New York］。
【００３２】
工程ａ）においてエンドペプチダーゼ機能を有する酵素によりタンパク質源のタンパク質を開裂するのが好ましい。かかる酵素の使用により、未変性（天然）条件下でタンパク質を開裂して未変性開裂生成物を得るのが可能になる。物理的または化学的開裂は、多くの場合、無傷の天然ペプチド混合物を得ようとする場合には使用できない変性条件の適用を含む。これに対して、エキソペプチダーゼ消化は、未変性条件でも好適に起こる。当業者は、無傷の天然ペプチド混合物を得るのに適した条件を理解するであろう。「無傷の天然ペプチド」とは、この趣意において、該ペプチドが天然の機能的タンパク質において有すると同様のコンフォメーションを有するペプチドであると理解されるべきである。
【００３３】
非常に関心のある実施態様において、エンドペプチダーゼ機能を有する酵素は、また、エキソペプチダーゼ機能をも有し、このエキソペプチダーゼ機能は、システインの位置またはグリシンおよびシステインの両方の位置で弱められる。かかる酵素は、当該技術分野で知られており、その長所は、工程ａ）およびｂ）を同時に行なうことができる点である。エンドペプチダーゼ機能およびエキソペプチダーゼ機能の両方を有する好ましい酵素の例は、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、酸性プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼＢ、Ｃｏｒｏｌａｓｅ ＰＮ−Ｌ、酸性プロテアーゼまたはそれらのうちの１つまたはそれ以上の組合せである。
【００３４】
本発明は、また、システインを７〜２０ｗ／ｗ％含むシステインリッチペプチドを含む調製物およびシステイン／グリシンを７〜２０ｗ／ｗ％含むかかる調製物に関する。上記のとおり、該調製物は、有利には、例えば、細胞内グルタチオンレベルの上昇のためにシステインまたはシステインおよびグリシンの組合せのシステイン取り込み量を有効に改善するために動物またはヒトへの投与に使用できる。好ましくは、調製物のペプチドの少なくとも８０％は、末端システインおよび／またはグリシンを含んでおり、人体または動物体用に容易に利用可能である。これらの末端システインおよび／またはグリシンは、上記したエキソペプチダーゼの使用により得られる。
【００３５】
また、本発明は、薬物、特に、酸化的障害により媒介される症状の治療用の薬物、および人体または動物体において細胞内グルタチオンレベルを上昇させるための薬物における活性な化合物としての本発明の調製物の使用に関する。これに関して、該調製物は、所望の投与剤形の薬物を得るために、適当な担体、希釈剤、アジュバントなどと配合することができる。該調製物は、有利には、乳児用処方において、例えば、母乳代用品において使用することができる。
【００３６】
ここで、本発明を以下の実施例および図において例示するが、単なる例示であり、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
１０％乳漿タンパク質単離体（ＷＰＩ）溶液を調製し、次いで、酵素を使用して加水分解した。酵素のいくつかの組合せを使用した（表１）。
【００３８】
【表１】
溶液１〜３は、まず、ｐＨ２.０で６時間、ペプシンで加水分解させた。次いで、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを７.０に上昇させた。第２の酵素を添加し、溶液を２０時間インキュベートした。酵素を１種類だけ含有する溶液は、ＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅについてはｐＨ７で、および酸性プロテアーゼについてｐＨ３で、５０℃で２０時間加水分解させた。
【００４０】
該溶液を８５℃に１５分間加熱することにより加水分解反応を停止させた。次いで、限外濾過を使用してシステインを含有するペプチドから遊離アミノ酸を除去した。１０００ダルトンの呼称分子量（ＮＭＷ）カットオフを有する膜を使用した。該溶液を５００％ダイアフィルトレーションまで限外濾過した。
【００４１】
タンパク質は、ケルダール法を用いて測定した。システイン濃度は、エルマン試薬を用いて測定した。［Beveridge et al., (1974) Journal of Food Science Volume 39, p. 49-51］。次いで、ペプチドを凍結乾燥させた。
【００４２】
乳漿タンパク質単離体およびペプチド中のシスチンおよびグリシンの両方の濃度を表２に示す。
【００４３】
【表２】
実施例２
１０％乳漿タンパク質濃縮物を含有する８０％タンパク質溶液を調製し、次いで、エンザイム・ディベロープメント・コーポレーション（Enzyme Development Corporation）からの１％酸性プロテアーゼを使用して加水分解した。該溶液をｐＨ３.０で２０時間加水分解した。該溶液を９０℃に１０分間加熱することにより反応を停止させた。次いで、１０００ダルトンのＮＭＷカットオフを有する膜を使用して該溶液を限外濾過に付した。システイン濃度は、ダイアフィルトレーション％の関数として測定した（表３）。
【００４５】
【表３】
実施例３
５％乳漿タンパク質単離体溶液１００リットルを調製し、次いで、エンザイム・ディベロープメント・コーポレーションからの２％酸性プロテアーゼを使用して加水分解した。該溶液をｐＨ３.０で１２時間加水分解した。該溶液を８０℃に３０分間加熱することにより反応を停止した。次いで、該溶液を、５０００ダルトンのＮＭＷカットオフを有するＫｏｃｈ ＨＦＫ ３２８膜を使用してパイロットＵＦユニットで限外濾過した。該加水分解産物を２つに分けた。１つはそのままのｐＨ（３.８）で濾過した。もう１つは、まず、そのｐＨを、水酸化ナトリウムを使用して７.０に上昇させ、その後、限外濾過した。
【００４７】
システイン濃度を限外濾過の間のｐＨの関数として測定した（表４）。
【００４８】
【表４】
実施例４
実施例３における加水分解産物を、約５００ダルトンのＮＭＷカットオフを有するＣｅｌｇａｒｄ ＮＦ−ＰＥＳ−１０膜を使用してナノ濾過した。ＮＦ条件は、以下のとおりであった：
圧力： ３０バール
温度： ５０〜５５℃
初期流速： ５８リットル／ｍ２／時
最終流速： ２３リットル／ｍ２／時
プロセス： ３０リットルまで濃縮、次いで、２００％ダイアフィルトレーション
【００５０】
保持物中の得られたペプチドは、システイン１２.９％およびグリシン３.１％を含有していた。
【００５１】
実施例５
Ｃｙｓペプチドに対して特異的なＨＰＬＣ
逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰＣ）を、ペプチド混合物中のシステイン含有ペプチドを同定および定量化できるように設定した。まず、システイン残基を蛍光標識（ＳＢＤ−Ｆ；７−フルオロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−スルホン酸；Ｓｉｇｍａ Ｆ−４３８３）で標識化した。この標識は、システイン残基に特異的に結合する。
【００５２】
合計３００μｌの試料（タンパク質１００μｇ／ｍｌ）、インキュベーション緩衝液（２５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ）６００μｌ、蛍光プローブ（水中０.１％（ｗ／ｖ））３００μｌ、Ｈ２Ｏ ２９７μｌおよびＴＢＰ（トリブチルホスフィン、Ｆｌｕｋａ）３μｌをバイアル中にピペットにて加えた。該バイアルに蓋をし、該混合物を十分に混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。試料の最終濃度は、０.０２ｍｇ／ｍｌであった。
【００５３】
次いで、該混合物を、氷上に置いて室温に冷却した。溶液を、０.４５μｍ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ）を使用して濾過した。
【００５４】
濾過した溶液を、Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ１８ ５μｍ ＲＰＣカラム（ベイカー（Baker））を使用して逆相クロマトグラフィーにより分析した。結合緩衝液は、脱イオン水／０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）からなっており、ペプチドを、アセトニトリル／０.０８３％ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ｂ）を使用して溶離した。緩衝液Ｂのレベルを９０分の間に６０％まで上昇させ、次いで、１００％緩衝液を２０分間流して、きつく結合した物質を除去した。試料の注入量は、１５０μｌであった。
【００５５】
２１４ｎｍでの吸光度および蛍光（励起波長および発光波長：各々、３８６ｎｍおよび５１４ｎｍ）を測定してペプチドを検出した。図１および図２を参照のこと。
【００５６】
図１は、２１４ｎｍでの吸光度を測定することによる分離前の実施例１の加水分解産物からのペプチドの検出を示す。
図２は、蛍光を測定することによる同加水分解産物からの特異的システイン含有ペプチドの検出を示す。
【００５７】
実施例６
システインおよびグリシンリッチペプチドは、臨床経腸栄養処方において使用することができた。かかる処方の調製法は、以下のとおりであった。
６０℃で、脱イオン水の一部にカゼイン塩を溶解した；乳化剤を混合油に溶解した；塩を水７５ｍｌに溶解した。次いで、混合油、塩、マルトデキストリン溶液および残りの水をカゼイン塩溶液中で混合した。この混合物を７０℃で、３５０バールで２回ホモジナイズした。
【００５９】
次いで、システインおよびグリシンリッチペプチドをエマルションに溶解した。水酸化ナトリウムを使用してｐＨを７.０〜７.１に調節し、次いで、生成物を１２１℃で１０分間、レトルト滅菌した。
【００６０】
実施例７
当該ペプチドは、乳児用処方にて使用することができた。処方例を以下に示す。
乳化剤を油フラクションに溶解した。７０℃の水の一部にペプチドおよび炭水化物を溶解した。無機物を別々に溶解した。次いで、該ペプチド／炭水化物溶液に混合油を添加し、高速剪断ミキサーを使用して３分間混合した。
【００６２】
次いで、プレエマルションを２５０バールで２回ホモジナイズした。該処方物は、８０℃で１５分間加熱することにより低温殺菌し、噴霧乾燥させることができる（粉末処方物）か、または、ビンの中で、１２０℃で１０分間滅菌することができる（液体処方物）。
【００６３】
実施例８
当該ペプチドは、即席飲料混合液に配合することができた。処方は、以下のとおりであった。
乾燥成分を混合し、次いで、水１１８ｍｌに添加した。該溶液を混合して成分を溶解した。飲料液１杯は、粉末混合物３５ｇを含有しており、システイン約５００ｍｇおよびグリシン約１５０ｍｇを供給した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の加水分解産物の２１４ｎｍでの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図１の加水分解産物の、励起波長３８６ｎｍおよび発光波長５１４ｎｍを用いた蛍光スペクトルを示すグラフである。
Claims (14)
- システイン含有タンパク質を含むタンパク質源からシステイン含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する方法であって、
ａ）該タンパク質源のタンパク質をペプチドに開裂する工程；
ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少なくとも、該ペプチド中のシステインの位置で弱められる）、末端システインを有する消化されたペプチドを形成する工程；
ｃ）消化されたペプチドを精製する工程
を含む方法。 - システインおよびグリシン含有タンパク質を含むタンパク質源からシステインおよびグリシン総含有率７〜２０ｗ／ｗ％のペプチド混合物を調製する方法であって、
ａ）該タンパク質をペプチドに開裂する工程；
ｂ）工程ａ）で得たペプチドを少なくとも１種類のエキソペプチダーゼで消化して（ここで、この作用は、少なくとも、該ペプチド中のシステインおよびグリシンの位置で弱められる）、末端システインまたはグリシンを有する消化されたペプチドを形成する工程；
ｃ）消化されたペプチドを精製する工程
を含む方法。 - 工程ａ）およびｂ）が同時に行なわれる請求項１または２記載の方法。
- 少なくとも１種類のエキソペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼＹを含む請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
- タンパク質源が少なくとも２種類のシステイン含有タンパク質を含む請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
- タンパク質源が、少なくとも１つがシステイン残基を含有し、少なくとも１つがグリシン残基を含有する、少なくとも２種類のタンパク質を含む請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
- タンパク質源が食物タンパク質からなる請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
- タンパク質源が乳漿タンパク質単離体および／または乳漿タンパク質濃縮物を含む請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
- タンパク質源が、アルブミン、小麦グルテン、トウモロコシタンパク質単離体、卵タンパク質、およびシスタチンからなる群から選択される１種類またはそれ以上を含む請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
- 工程ａ）および工程ｂ）が、タンパク質源のタンパク質中に存在するシステイン残基間の硫黄架橋が無傷のままである条件下で行なわれる請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
- 工程ａ）および工程ｂ）がｐＨ２〜８で行なわれる請求項１０記載の方法。
- 工程ａ）がエンドペプチダーゼ機能を有する酵素によるタンパク質の開裂を含む請求項１〜１１いずれか１項記載の方法。
- エンドペプチダーゼ機能を有する酵素がエキソペプチダーゼ機能（ここで、該エキソペプチダーゼ機能はシステインの位置で弱められる）も有する請求項１２記載の方法。
- 酵素のエキソペプチダーゼ機能がグリシンおよびシステインの両方の位置で弱められる請求項１２または１３記載の方法。
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