NO153202B - Fremgangsmaate for fremstilling av et enzymatisk totalhydrolysat fra myseproteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for frem-

stilling av et enzymatisk totalhydrolysat fra myseproteiner

ved hjelp av en enzymatisk hydrolyseprosess som benytter et enzym i stand til å proteolysere alle proteiner i mysen, fortrinnsvis pankreatin.

Myse er et velkjent biprodukt fra meieriindustrien. Sammensetningen er omtrent den samme som for skummet melk uten

kasein. Sur myse oppnås ved surgjøring av melk enten ved tilsetning av en uorganisk syre eller ved å produsere melke-

syre (pode melken med melkesyreferment) med en pH-verdi nær

det isoelektriske punkt for kasein. Mysen gjenvinnes etter separering av dravle. Tilsetning av løype til melken forår-

saker også flokkulering eller koagulering av kaseinet.

Mysen som oppnås etter synerese er kalt løypemyse. Hvis flokkuleringen inntrer ved melkens pH-verdi eller noe lavere,

men allikevel over 5,8 til 6,0, kalles mysen søtmyse.

Myse er derfor definert i henhold til koaguleringstypen for melken. I osteindustrien er mesteparten av mysen blandet myse der en av koaguleringsprosessene er fremherskende i

forhold til en annen. Søtmyser kommer fra kokt eller ukokt presset dravle (Emmental, Gruyere, Cheddar, Cantal, Saint-Paulin). Sur myse stammer hovedsakelig fra fremstilling av

fersk dravle eller fra kaseinanlegg. Det er også en stor variasjon i blandede myser som stammer fra fremstilling av de fleste myke dravler og marmorerte slike (blåost). Sammensetningen i mysen kan derfor variere innen heller vide områder avhengig av utgangsmelken og den osteprosess som er benyttet.

Alle myser inneholder mineralfett, en mengde melkesyre, koa-gulerende enzymer, og den mest interessante fraksjon er åpenbart den nitrogenholdige fraksjon. Således er det den nitrogenholdige fraksjon som i det vesentlige omfatter de oppløselige melkeproteiner som har høy biologisk verdi.

De tre tradisjonelle måter for disponering av myse har til nå

vært å spre den ut på åker og eng, å dumpe den i vannveier eller å bruke den som dyrefor. Industriell behandling av myse

har allerede vært foreslått slik som f.eks. konsentrasjon og tørking for å redusere omkostninger i forbindelse med transport, lagring og bevaring. Nye teknologier tillater selektiv separering, konsentrasjon og rensing av bestanddeler i mysen og modifikasjon av deres fysikalske og kjemiske egenskaper mens man samtidig har kunnet beholde eller forbedre deres næringsmessige kvaliteter. Slike teknikker reduserer i fremstilling av nye og varierte produkter både fra nærings-messig som fra teknologisk synspunkt. Blant slike teknikker er "avmineralisering" og molekylfiltrering spesielt å nevne. Molekylstørirelsesforskjellen mellom protein og fett på den ene side og laktoser og mineralsalter på den annen, gjør dem separerbare ved filtrering, spesielt ultrafiltrering. En proteinanriket oppløsning som utgjør den verdifulle myse-fraksjon oppnås således sammen med en oppløsning som inneholder laktose og mineralsalter, kjent som "laktosesaft"

Selv om proteinene rent relativt sett representerer en liten andel av faststoffinnholdet i mysen (mindre enn 12%), ligger deres hovedattraksjon i å øke verdien av dette biprodukt.

Den proteinholdige fraksjon som i det vesentlige inneholder oppløselige melkeproteiner, 6-laktoglobulin, a-laktoalbumin og serumalbumin og immunoglubuliner, er interessant på

grunn av næringsverdien og de funksjonelle egenskaper.

Interessante informasjoner hva angår melkeproteiner finnes i arbeidet av H.A. McKenzie i "Milk Proteins", Vol. 1 og 2, Academic Press, New York, 1971. Proteinkonsentrater fra myser har en høy næringsverdi, se f.eks. artikler av E. Forsum i "Nutritional Evaluation of Whey Protein Concentrates and their Fractions", J. Dairy Sc. 57 (6) 665-670 1974, E. Forsum i "Whey Proteins for Food and Feed Supplement, Protein Nutritional Quality of Foods and Feeds", Part II, Marcel Dekker Ed., I.N.C. New York, 433-470, 1975, E. Forsum i "Effekt of Dietary Lactose on Nitrogen Utilization of Whey Protein Concentrate and its Corresponding Amino Acid Mixture", Nutrition Reports International, 11 (5), 419-428, 1975, E. Forsum i "Use of Whey Protein Concentrate as a Supplement to Maize, Rice and Potatoes. A chemical and Biological Evaluation Using Growing Rats", J. Nutrition, 105(2), 147-153, 1977.

For å anslå næringsverdien for et protein eller et proteinholdig, nitrogenholdig næringsmiddel, blir den vesentlige aminosyresammensetning sammenlignet med et referanseprotein. Uansett det valgte referanseprotein, er sammensetningen av myseproteinet godt avbalansert. Man finner spesielt ved et forhøyet innhold av lysin, tryptofan og treonin, et øket systeininnhold med henblikk på melk og et lavt fenylalanin og metionininnhold. Videre er det kjent at kun nærvær av en aminosyre i et næringsmiddel ikke nødvendigvis betyr at dets bruk er åpenbar for organismen. Den behandling produktet er underkastet før fordamping av det kan gjør enkelte aminosyrer i det minste delvis utilgjengelige. Dette ble funnet av C. Cheftel og H. Cheftel i "Brunissement non Enzymatique", "Biochimie et Technologie des Aliments", Vol. 1 (3), 3 Technique de Documentation Ed., Paris, 1976.

Den eldste teknikk for ekstrahering av proteiner fra myse består i å gjør dem uoppløselige ved en denaturerende varmebehandling ved en pH-verdi nær det isoelektriske punkt.

Den åpenbare mangel ved en slik teknikk er at proteinene dena-tureres. Andre prosesser er derfor foreslått for å isolere proteinene ved utfelling og/eller "kompleksdannelse". Som eksempel skal nevnes adsorbsjon av proteinet i en ionebytter eller tilsetning av kjemiske reagenser med henblikk på kompleksdannelse eller utfelling av proteiner. Disse forskjellige teknikker har hovedsakelig forblitt på laboratorie-nivå. Videre er det foreslått kromatografiske ionebytte-prosesser. Se i dette henseende B. Mirabel i "Nouveau Procédé d'Extraction des Protéines du Lactoserum". "Ann. de la Nutrition et de 1'Alimentation", 32 (2-3), 243-253, 1978.

Filtrering gjennom en gel er også foreslått for myse. En

slik filtreringsprosess har mangler. Det krever en for-konsentrasjon av proteiner som ikke denaturerer disse med derav følgende risiko for å forandre gjenoppløsningen mellom

de forskjellige fraksjoner. Disse fraksjoner må deretter konsentreres og tørkes. Vanskeligheten ved å utføre denne prosess er grunnen til hvorfor denne teknikk kun har funnet begrenset bruk.

Ultrafiltrering gjennom en membran og i lys av det frem-

skritt som har skjedd ut fra utstyr og forståelse av de observerte fenomener, har fått en utstrakt bruk i meieriindustrien for behandling av melk [N.L. Maubois og G. Mocquot, "Preparation de Fromage a partir de "Préfromage Liquide", obtenu par ultrafiltration du lait", Le Lait, 51 (508), 495-533, 1970] og også for behandling av myse (R.I. Fenton-May, C.G. Hill og C.H. Amundson, "Use of Ultrafiltration-Reverse Osmosis Systems for the Concentration and Fractionation of Whey", "J. Food Sc", 36(14) 1971). Ved gjennomgang for

mysen gjennom ultrafiltreringsmembranet går vann, de oppløse-lige mineraler, laktose, nitrogenforbindelser med lav molekylvekt (peptider, frie aminosyrer) og de vannoppløselige vitaminer, gjennom membranet som ultrafiltrat eller permeat;

på den annen side blir proteiner og assosierte komponenter (kalsium, fosfor), fettpartikler og lipofile elementer holdt tilbake etter hvert som den vanndige fase elimineres. Disse utgjør "retentatet" eller proteinkonsentratet. Oppnåelsen av et proteinkonsentrat med høy renhet krever bruk av ultrafiltrering så vel som diafiltrering. Ved diafiltrering blir vann eller en vanndig oppløsning inneholdende salter kontinuerlig eller satsvis tilsatt til ultrafiltreringsretentatet. Samtidig eller etter at en ekvivalent mengde av permeat fjernes. En slik drift bevirker svekning av retentatet hva angår filtrerbare elementer. Bortsett fra sikre næringskvaliteter, har myseproteiner i konsentratform interessante funksjonelle egenskaper. Det foreligger tallrike publikasjoner på dette område, se f.eks. J.E. Kinsella, "Functional Properties of Proteins in Foods: a Survey. Critical Reviews" i "Food

Science and Nutrition", 1976.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør en ny bruk av myseproteiner, spesielt for humannæring. Hurtige fremskritt i medisin og kirurgi tillater at tallrike pasienter overlever, men representerer et betraktelig problem med henblikk på foring og gjentilpassing til normal næring(fremskritt ikke bare i kirurgisk teknikk, men også ved intensivbehandling). På

hvert trinn av intensivbehandlingen fra metabolsk terapi til vanlig næring, må næringsblandingen være nøyaktig tilpasset pasientens krav.

De nye matingsteknikker slik som kontinuerlig lavhastighets-enteralmating (se E. Levy, "Alimentation Entérale Continue, Principe-Technique. Indications, Résultats.", 64 (4),

235-256, 1976) tillater optimal bruk av næringsstoffer ved deres direkte transport til ferdig tilstand til bruks- eller virkningsstedet. Etter således å ha bestemt en mangelfull fordøyelsesfunksjon, er det et spørsmål om tilførsel og eventuell stimulering for å komme tilbake til nær normal virkning. Den industrielle fremstilling av slike erstatnings-produkter består således i in vitro å reprodusere den mangel-fulle funksjon som kan variere fra umulig inntak, tygging,

til visse enzymatiske mangler og uregelmessigheter.

Videre er det kjent at den virkelige proteolyse av oppløselige melkeproteiner skjer i innvollene under virkningen av pankreatiske proteaser. Se når det gjelder dette B. Blanc, "Dige-stibility of Proteins", "Int. Dairy Federation Commission F, Final Report", Doc. 57, 1976; G.M. Gray og H.L. Copper, "Protein Digestion and Adsorption", "Gastroenterology", 61

(535) 1971. På det nærværende tidspunkt gjøres det store forsøk på å utvikle enzymatiske hydrolysater som er i stand til lett å kunne adsorberes av det menneskelige legeme.

Til slutt er det kjent et antall prosesser for hydrolyse av proteiner, f.eks. melkeproteiner. Sur hydrolyse gir således oppløsninger av frie aminosyrer. Sur hydrolyse ødelegger noen aminosyrer. Alkalisk hydrolyse bevarer tryptofan, men forårsaker uoppløseliggjøring, noe som markert reduserer næringsverdien for det opprinnelige proteinkonsentrat.

Enzymatisk proteolyse er kjent og har vært gjennomført i lang tid for analytiske formål og næringsmiddeltormål, der hoved-gjenstanden var å gjøre proteinene oppløselige. Litteraturen legger betydelig vekt på de tallrike anvendelser av nærings-middelkvaliteter av soyaproteinhydrolysater (se D. Arai, M. Noguchi, S. Kurosawa, H. Kato, M. Fujimaki, "Applying Proteolytic Enzymes on Soyabeans, 6-Deodorization Effeet",

1970; når det gjelder fiskeproteiner se P. Hevia, J.R. Whitaker og H.S. Olcott i "Solubilization of a Fish Protein Concentrate with Proteolytic Enzymes", "J. Agri. Food Chem.", 24 (2), 383-385, 1976 eller med colza ved vegetabilsk, mikrobiell eller animalsk protease.

Anvendelse av disse teknikker på melkeproteiner i industriell skala har imidlertid til nå vært meget begrenset. Den enzymatiske proteolyse har ikke manglene ved de kjemiske metoder. Hydrolysebetingelsene er moderate og bevarer derved nærings-kvalitetene for produktene.

Generelt gir hydrolyse peptider med en utpreget bitter smak. Dette trekk begrenser bruken av hydrolysater som humannæring. Bitterhetsgraden for hydrolysatet avhenger hovedsakelig av

arten av proteinsubstrat og den spesielle natur for enzymene. For å eliminere bitterheten har det vært foreslått å benytte eksopeptidase, se f.eks. S. Arai, M. Yamashita, H. Kato,

M. Fujimaki i "Agri. Biol. Chem.", 34 (729), 1970 og K.M.

Clegg, G. Smith og A.L. Walker i "Production of Enzymatic Hydrolysate of Casein on a Kilogram Scale", "J. Food Technol.", 9 425-431, 1974. Det har også vært foreslått å modifisere peptidene ved tilsetning av glutaminsyrer før en plastein-reaksjon. Det er også mulig å eliminere de hydrofobe aminosyrer .

Ikke desto mindre er alle de kjente teknikker utilfredsstillende og kan ikke tilfredsstille oppfinnelsens krav. Således øker en grundig oppløseliggjøring fra anvendelse av eksopeptidase innholdet av frie aminosyrer og mer spesielt arginin, lysin, tyrosin, valin, fenylalanin, metionin og leusin, noe som har den direkte virkning at transportsystemet i innvollene overbelastes med frie aminosyrer, noe som igjen forårsaker en mindre næringseffektivitet i hydrolysatene. Videre forandres hydrolysatenes iboende kvalitet fordi aminosyre-balansen selv forandres, noe som nødvendiggjør supplering av frie aminosyrer.

Som et eksempel på en henvisning som illustrerer den kjente teknikk skal nevnes US-PS 2.180.637. Dette patent beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av rensede aminosyrer fra visse proteinfraksjoner der melkekasein er foretrukket. Prosessen kan omfatte en enzymatisk hydrolyse i et basisk medium og gir en blanding av ikke-denaturerte, rene aminosyrer. Blant de enzymer som kan benyttes, nevnes pankreatiske enzymer. Slike hydrolyser gir frie aminosyrer slik det uttrykkelig nevnes i beskrivelsen i US-PS 2.180.637. Gjenstanden for den fremgangsmåte som beskrives i dette patent er å gi protein-hydrolysater som inneholder en maksimal andel av frie aminosyrer på grunn av en total hydrolyse som må gjennomføres i løpet av en lang kontakttid mellom enzymet og substratet.

Det resulterende produkt er derfor ikke nødvendigvis enzymfritt. Videre er sammensetningen av produktet som oppnås ifølge

US-PS 2.180.637 på grunn av sin frie aminosyresammensetning ikke egnet for visse anvendelsesområder slik som intensivbehandling og terapeutisk næring for mennesker. Nylige studier har således gjort det klart at det er bedre å bruke blandinger av peptider heller enn frie aminosyrer (se f.eks. D.B.A. Silk in Peptide Transport and Hydrolysis, CIBA Foundation Symposium, Elsevier Excerpts Medica North. Holland, 50, 1977). Det rådes derfor mot inngivelse av produkter som i det vesentlige inneholder frie aminosyrer på grunn av mangler et slikt preparat kan ha under klinisk anvendelse på grunn av det faktum at de frie aminosyrer ikke umiddelbart er assimilerbare og uten fare for det menneskelige legeme (se f.eks. D.M. Matthews i "Intestinal Adsorption of Peptides", "Physiological Review",

55 (4), oktober 1975). Moderne studier antyder at "osmolaliteten" for produktet må tas med i betraktning og det er kjent at osmolaliteten for peptidiske produkter er meget mindre enn for de tilsvarende produkter som inneholder frie aminosyrer. Jo lavere osmolalitet, jo større den umiddelbare assimilerbar-het i kroppen. Det er derfor et behov for produkter som er umiddelbart assimilerbare, uten fare for det menneskelige legeme, og som f.eks. kan være egnet for terapeutisk eller intensivbehandlingsnæring.

Så langt foreliggende søker vet, har det ennå ikke vært foreslått å frembringe totalenzymatiske hydrolysater ved å bruke myseproteiner og å bruke disse direkte for de spesifikke krav i humannæring.

Fra det teknologiske standpunkt benyttes ved enzymatisk hydrolyse oftest et reaktorsystem av satstypen. Enzymet tilsettes til en proteinholdig oppløsning som skal behandles. Etter en kortere eller lengre oppholdstid under betingelser som begunstiger enzymatisk aktivitet og angrep på substratet, blir pH-verdien modifisert og en mild varmebehandling inaktiverer enzymet. Sentrifugering kan benyttes for å eliminere det ikke-fermenterte uoppløselige fraksjon. Imidlertid er det ved satstypen av enzymatiske hydrolyseaksjoner vanskelig å bruke et forhøyet forhold mellom enzym og substratet. Ifølge R.C. Robins, "Effeet of Ratio of Enzymes og Substrate on Amino

Acid Patterns Released from Proteins in Vitro", "Internat. J. Vit. Nutri, Res.", 48, 44-52, 1978, er imidlertid den avgjørende innflytelse for forholdet mellom enzym og substrat på arten av de frie aminosyrer og de frie peptider under proteolyse kjent. Ved en diskontinuerlig eller satsprosess må enzymene ødelegges ved slutten av hydrolysen når de befinner seg i over-skudd, noe som vil gjøre det absolutt nødvendig med de ovenfor nevnte forhøyede forhold.

Det har også vært foreslått å benytte reaktorer med fiksert enzym. Disse har imidlertid betydelige mangler ut fra et praktisk synspunkt. Faktum er at optimale enzymaktivitets-betingelser under spesielle pH-betingelser varierer med tiden slik at driften av reaktoren ikke er tilfredsstillende hele tiden. Bakteriologiske problemer er også funnet, tilstopping av de fikserte sjikt og absorbsjon av proteiner på bæreren når det gjelder behandling av myse. Videre har den enzymatiske reaksjon en tendens til inhibering med tiden på grunn av dannelse av et enzym-proteinfragmentkompleks. Inhibering kan også skyldes arten av substratet. Videre er det meget vanskelig å benytte multienzymsystemer på grunn av konkurrerende fenomener i enzymet med henblikk på substratet og videre de forskjellige stabiliteter for enzymene med tiden.

Foreliggende oppfinnelse trekker fordel av allerede kjente innretninger fra visse andre teknikker som består i å gjøre bruk av membranenzymreaktorer. det skal henvises til en artikkel av C. Cheftel, "Solubilisation Enzymatique Continue du Concentré Protéique de poisson. Essai de recyclage des enzymes", "Ann. Technol. Agri.", 21 (3), 423-433, 1972, som beskriver en memebranreaktor anvendt for proteolyse av fiske-proteinkonsentrater. Ultrafiltreringsmembranen holder tilbake enzymet i oppløsningen i reaktoren som vel som det proteinholdige substrat. Kun hydrolyseproduktet, peptidene, elimineres etter hvert som de dannes. I praksis er imidlertid driften av en slik reaktor ikke så lett som Cheftel antyder.

Substratet må kunne gjøres helt oppløselig av enzymet og den proteinholdige oppløsning må være av feilfri bakteriologisk kvalitet.

Slik er teknikkens stand med henblikk på å øke verdien av myseproteiner, spesielt ved enzymatisk hydrolyse. Som en konklusjon kan man si at ingen av de referanser som søkeren kjenner har foreslått et totalenzymatisk hydrolysat på basis av myseprotein, i stand til å kunne benyttes for spesifikke krav med henblikk på humannæring.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å forbedre den kjente teknikk og angår således en fremgangsmåte for fremstilling av enzymatisk totalhydrolysat fra myseprotein, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at mysens ultrafiltreringsretentat bringes i kontakt med proteolytiske enzymer som helt er i stand til å spalte myseprotein i menneskekroppens fordøyelseskanal, hvilket enzym er pankreatin, i form av pankreasekstrakt eller syntetblanding, inneholdende trypsin og kymotrypsin og andre sekundære naturlige, i pankreasekstrakt forekommende enzymer, hvilket enzym i forhold til substratet anvendes i en mengde av 8 til 15 vekt-%, fortrinnsvis 12 vekt-%, hvorved hydrolysen fortsettes inntil produktet ikke inneholder restprotein, d.v.s. ikke inneholder nitrogen som faller ut med 12 vekt-%-ig trikloreddiksyre, og inntil det oppnås et peptidhydrolysat av hvis peptider minst 50% inneholder 2 til 5 aminosyrer og der mengden frie aminosyrer er under 15%, hvoretter det oppnådde hydrolysat gjenvinnes.

Som nevnt ovenfor blir en slik prosess fordelaktig gjennomført

i en apparatur som kombinerer ultrafiltreringsutstyr med en membranenzymreaktor for derved å tillate kontinuerlig drift.

På grunn av en slik kombinasjon og på grunn av valget av parametere ved reaksjonen, hvilket tilpasses behandlingen av myseproteiner, gir foreliggende oppfinnelse et totalt enzymatisk hydrolysat av proteinene. Til nå har hydrolysen kun vært partiell og på grunn av dette har de resulterende produkter ikke tilfredsstilt de krav som tilfredsstilles ifølge foreliggende oppfinnelse.

Nær alle de resulterende peptider inneholder 2 til 5 aminosyrer hvorved produktet ifølge oppfinnelsen oppfyller spesifikke næringsmiddelkrav. De frie aminosyrer representerer 10 til 15% av nitrogenfraksjonen rent generelt. De basiske aminosyrer (arginin og lysin) og aromatiske aminosyrer (tryptofan, fenylalanin, tyrosin) og leucin utgjør den vesentlige del av de frie aminosyrer. Eksemplene nedenfor viser sammensetningen av visse kategorier av hydrolysater, gitt ved hjelp av eksempler.

Likheten mellom aminosyresammensetningen i flokkulerings-fraksjonen og i den flytende fraksjon som oppnås under konsentrasjonen ved fordamping av 100 g/liter av hydrolysatet som forlater reaktoren antyder en enhetlig fordeling av de hydrofobe og hydrofile egenskaper mellom de forskjellige peptide klasser. Konsentrasjonstrinnet kan fortsettes inntil man har nådd et forhøyet faststoffinnhold som kan gå opp til 25% før det hele spraytørkes.

Hydrolysater som oppnås fra melkeproteiner er ansett å ha utmerkede biologiske egenskaper. De oppfyller derfor . næringsmiddelkrav for pasienter som lider under pankreatiske mangler eller for metabolske pasienter.

Som utgangsmateriale for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen

kan en hvilken som helst myse benyttes. F.eks. kan det benyttes en myse av industriell opprinnelse, spesielt blandede myser fra blanding av myser fra prosesser for fremstilling av forskjellige ostetyper. Det kan benyttes myser som er fremstilt fra råmelk eller varmebehandlet melk med melkesyre- eller løypeutfelling. Videre kan som en variant en rekonstituert myse benyttes. Originalmyse kan varmebehandles etter skumming, f.eks. ved en temperatur i størrelsesorden 58-60°C. Den kan deretter konsentreres ved fordamping. Forkonsentrat fortynnes deretter eventuelt for å forhindre overdreven krystallisering av laktosen og holdes ved en temperatur i størrelsesorden 4°C. Det er hensiktsmessig å benytte myseproteinkonsentrater rekonstituert fra et pulver.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen angår myseproteiner uansett den måte hvorpå disse er fremstilt. Således kan myseproteiner isoleres på en hvilken som helst kjent måte før de underkastes enzymatisk hydrolyse. Proteinene kan f.eks. bringes til koagulering ved oppvarming. Fortrinnsvis oppnås proteinene ved ultrafiltrering av myse fordi denne arbeidsmåte ikke medfører denaturering. Av forskjellige grunner, f.eks. økonomiske,

kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med hell anvendes på proteiner som er utfelt i varme fra myse.

Mysen eller forkonsentratet blir fordelaktig renset ved ultrafiltrering og ved diafiltrering. De forskjellige retentater tørkes, f.eks. spraytørkes.

Blant ultrafiltreringsteknikker som er kjent for fagmannen

er slike som er illustrert i de innledningsvis i beskrivelsen angitte referanser. Oppnåelse av et meget rent proteinkonsentrat blir generelt oppnådd i to trinn, enkel ultrafiltrering fulgt av diafiltrering. Ultrafiltreringsmembranene er konvensjonelle: De er kjent for å tilbakeholde alle oppløselige myseproteiner. Deres sperregrense er vanligvis mellom 500 og 50 000.

Membranene kan være av en hvilken som helst type. De kan være uorganiske membraner så vel som organiske membraner. Når det gjelder organiske membraner, kan slike av følgende stoffer benyttes: Polyolefin, polyakrylnitril, polyvinylklorid, celluloseacetat, polykarbonat eller andre tilsvarende stoffer. Når det gjelder uorganiske membraner, kan et hvilket som helst porøst substrat som tilfredsstiller de foregående definisjoner benyttes. Alle disse konsepter er godt kjent for fagmannen når det gjelder melke- eller myseultrafiltrering og derfor skal dette ikke forklares nærmere.

De beste resultater er oppnådd med membraner som er tilgjengelig på markedet under betegnelsen "Nudlepore". Slike membraner er beskrevet i en brosjyre med tittelen "Basics of Filtration and Separation" av H.W. Ballew, Nuclepore Corporation, 1978. Disse membraner består av en film av polykarbonat som er bestrålet ved ionebombardement. Porene er godt definerte sylindriske hull med en diameter nøyaktighet på + 15%. Disse mikrofil-treringsmembraner har ikke bare evnen til å eliminere uoppløselige proteinholdige lipidiske eller lipoproteinprodukter, men kan også holde tilbake mikroorganismer og utgjør en ytterligere steriliseringsfunksjon.

For i praksis å oppnå optimale betingelser ved ultrafiltrering

av myse, blir pH-verdien justert til den verdi som generelt ligger mellom 6 og 7, alt etter mysens opprinnelse (sur koagulering eller løypekoagulering). Justeringen av pH-verdien kan generelt forbedre apparaturens ytelse. Denne forbedring økes når justeringen av pH-verdien skjer etter en forvarming av mysen til 80°C i 15 sekunder (se J.F. Hayes, J.A. Dunkerly, L.L. Muller, A.T. Griffin i "Studies on Whey Processing by

Ultrafiltration II. Improving Permeation Rates by Preventing Fouling", "The Australian L. of Dairy Tech.", 38 (3), 132-140, 1974). Videre forbedrer eliminering av visse mineraler gjennomtrengningshastighetene. På samme måte eliminerer passasje av myse over en ultrafiltreringsmembran hvis sperregrense er over molekylvekten for native proteiner, mikroorganismer, fint kasein, oppløselige proteiner i aggregatform. Denne forfiltrering av myse øker gjennomtrengningshastigheten, se D.N. Lee og R.L. Merson i "chemical Treatments of Cottage Cheese whey to Reduce Fouling of Ultrafiltration Membrane",

"J. of Food Sc", 41, 778-786, 1976 og D.N. Lee og R.L. Merson i "Prefiltration of Cottage Cheese whey to Reduse Fouling of Ultraf iltration Membranes", "J. of Food Sc", 41, 403-410,

1976. Disse forfattere har funnet at tilsetning av et organisk salt slik som kalsiumklorid eller natriumklorid forbedrer ultra-filtreringshastigheten. Denne behandling kan benyttes under diafiltreringstrinnet med henblikk på å oppnå et meget rent proteinkonsentrat under optimale betingelser.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, blir ultrafiltreringsretentatet hydrolysert kontinuerlig med enzymer ved å føre det til reaksjonssonen i den hensikt å bringe det i effektiv kontakt med enzymet, at reaksjonsproduktet fjernes kontinuerlig og føres fra reaksjonssonen til ultrafiltreringssonen, hvorfra permeat også fjernes kontinuerlig og som danner det ønskede produkt, og at reaksjonen får fortsette inntil permeatet er et enzymatisk totalhydrolysat, hvilket permeat resirkuleres fra ultrafiltreringssonen til reaksjonssonen.

Av grunner som har både med god drift av reaktoren å gjøre og også bestemmelsen for sluttproduktene, må elimineringen av ikke-proteinforbindelser i mysen være så høy som mulig. Det er således ønskelig at ultrafiltreringsretentatet har et proteinfaststoffinnhold så høy som mulig. Av denne grunn er spesielt diafiltrering foreslått etter ultrafiltrering. I dette tilfelle der imidlertid påvirkning av en liten mengde gjenværende laktose kan være tilstede, kan dette forårsake diverse mangler med henblikk på sammensetningen i sluttproduktet og det kan skje hydrolyse av dette sukker. Prøver har vist at en preliminær enzymatisk hydrolyse av myseproteinkonsentratet ikke har noen ugunstig konsekvens for resten av proteinhydro-lyseprosessen. Det skal nedenfor gis indikasjoner hva angår parametrene for den enzymatiske reaksjon som har meget stor betydning for oppnåelse av et totalt enzymatisk hydrolysat.

For det første må pH-verdien i reaksjonen justeres til mellom

7 og 9 alt etter arten av de benyttede enzymer som må være i stand til total fermentering av myseproteinene under de samme betingelser som fermentering i et menneskelig legeme. Hva angår enzymene, benyttes fortrinnsvis pankreatin som er en kompleks blanding inneholdende trypsin, kymotrypsin og andre proteolytiske enzymer. I praksis vil en kommersielt lett tilgjengelig pankreatisk ekstrakt bli benyttet. Hvis nødvendig, kan dog enzymer fra en syntetisk blanding benyttes der sammensetningen omtrent tilsvarer den til pankreatin. Slike blandinger vil derfor nødvendigvis inneholde trypsin og kymotrypsin, hvis nødvendig med andre sekundære enzymer tilstede i det naturlige pankreatiske ekstrakt. Det er ifølge oppfinnelsen funnet at med en pH-verdi mellom 7 og 9 og fortrinnsvis mellom 7 og 8,5 hadde pankreatin og de andre tilsvarende enzymer som tilfreds-stilte kravet ifølge oppfinnelsen maksimal stabilitet.

Det er her fornuftig å iaktta heller strenge temperaturbeting-elser i den enzymatiske reaksjonssone. Således er det funnet at aktiviteten av enzymene ble mer påvirket av temperaturen enn av pH-verdien. Prøver har ifølge oppfinnelsen vist at med trypsin må den maksimale temperatur i reaksjonssonen ikke være over 54°C og med kymotrypsin må temperaturen ikke overskride 45°C. Når i praksis pankreatin benyttes, må man derfor finne et kompromiss og ta med i betraktningen de optimale betingelser i den intestinale proteolyse (temperatur mellom 37 og 40°C)

og det faktum at en høyere temperatur er mindre gunstig på utvikling av germer og tillater større ultrafiltreringshastig-heter. For behovet ifølge oppfinnelsen er temperaturer i størrelsesorden 40°C funnet gunstige.

Åpenbart er pH-verdi og temperatur beslaktede reaksjons-parametere. Således er pH-områder på 7,5 til 8,5 egnet for temperaturer i størrelsesorden 40-45°C.

En annen viktig parameter i reaksjonssonen er forholdet mellom enzymkonsentrasjon og proteinkonsentrasjon. Forholdet må

være høyt som når det gjelder in vivo proteinfermentering.

I forbindelse med pankreatin har pankreatinsubstratforhold i størrelsesorden 8-15% og spesielt i størrelsesorden 12% gitt gode resultater.

Alle de ovenfor angitte parametere ble valgt slik at alle proteiner ble proteolysert. Derved unngås en økning av konsentrasjonen som en funksjon av tiden i reaksjonen. Videre må proteinoppløsningen til den enzymatiske hydrolysereaktor ikke inneholde ikke-proteinbestanddeler som kan holdes tilbake på mem branen. Enzymet må også effektivt holdes tilbake.

Da videre produktene er ment for konsum, må driftsbetingelsene ikke fremme mikrobiell vekst.

For å oppnå optimal enzymatisk hydrolyse, er det hensiktsmessig meget omhyggelig å velge ultrafiltreringsmembranet som skal benyttes i forbindelse med enzymreaktoren. Membranene som brukes kan være av en hvilken som helst type, organisk eller uorganisk. De kan være i form av moduler slik de er best kjent fra denne type apparatur. En membrankonstruksjon som har gitt gode resultater er en hulfibermodul. Som eksempel skal nevnes membraner som er kommersielt tilgjengelige under betegnelsen "H10 P 5" (sperregrense 5000) og "H10P10"

(sperregrense 10 000) så vel som membraner som er kommersielt tilgjengelige under betegnelsen "PM 2" med sperregrense 2000 eller "PM 50" med sperregrense 50 000.

Det er viktig å velge en membran som i drift kan tilfredsstille kravene ifølge oppfinnelsen og spesielt effektivt holde tilbake enzymet, og videre ha tilfredsstillende ytelse spesielt hva angår levetid i bruk. Således kan råmateriale som behandles, d.v.s. proteinoppløsningen som man oppnår fra mysen, inneholde bestanddeler som kan være skadelige for god drift på membranen. Under prosessen for å oppnå myse kan en uoppløselig proteinfraksjon være tilstede på grunn av den vanlige varmebehandling ved 72°C i 15 sekunder. Dette er grunnen til at det er foretrukket å fjerne denne proteinfraksjon på forhånd ved høyhastig-hetssentrifugering. Mysen kan også inneholde en fraksjon som i det vesentlige består av lipider og lipoproteinkomplekser. Disse bestanddeler er, selv om de har en større molekylstørrelse, ikke sentrifugerbare. Akkumuleringen foran membranen i forhold til enzymreaktoren kan begrense reaktorens drift.

Fortrinnsvis benyttes det membraner hvis hullkonturer er godt definert.

I en annen henseende krever den endelige bruk av proteinhydro-lysatene at produktene som går inn i reaktoren har en god biologisk helsekvalitet. Den hyppige tilsetning av kalium-nitrat til melk som benyttes ved fremstilling av pressost kan bety at mysen som er et biprodukt fra denne prosess avvises eller må underkastes en supplementær avmineraliseringsbehandling ved elektrodialyse eller i en ionebyttereaktor hvis rest-nitratinnholdet er ansett uakseptabelt.

Nærværet av hydrogenperoksyd som er det antiseptikum som hyppigst benyttes ved bakteriologisk stabilisering av myse,

er heller ikke aksepterbart.

Alt etter fremstillingsmåten og sammensetningen (lavt fettinn-hold og liten bakteriepopulasjon) er myse som er et biprodukt fra fremstilling av kasein ved bruk av mineralsyrer et foretrukket utgangsmateriale for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Som nevnt ovenfor, er det viktig i reaksjonen å holde en basisk pH-verdi i størrelse 7-9 med henblikk på å tillate total fermentering av proteinkonsentratet. For dette formål blir det kontinuerlig eller intermittent til reaksjonen tilført en basisk forbindelse som kan være natriumhydroksyd eller -karbonat, kaliumhydroksyd eller -karbonat, kalsiumhydroksyd,

ammoniumhydroksyd eller en blanding av disse forbindelser. Valget av den spesielle basiske forbindelse vil avhenge av

den endelige bruk av sluttproduktet, natrium-, kalium, kalsium-eller ammoniumioneinnholdet i produktet er det bestemmende kriterium for valget.

Fagmannen vil derfor ha til disposisjon diverse parametere

for å oppnå de beste resultater og å fullføre total enzymatisk hydrolyse av myseproteinene. Det skal også påpekes at de spesielle verdier som velges kan være avhengig av størrelsen av enzymreaktoren så vel som arten av det benyttede utstyr.

Det er hensiktsmessig å gjennomføre hydrolysen av myseproteinet inntil det oppnås et enzymatisk hydrolysat som ikke inneholder påvisbare proteiner. Deretter bringes hydrolysatet i kontakt med membranet i ultrafiltreringsenzymreaktormodulen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres i to separate trinn: Et første trinn bestående av enzymatisk hydrolyse og et andre trinn bestående av ultrafiltreringen. Utstyret for å utføre hvert av disse trinn kan være separat eller integrert. Dog kan som en variant prosessen også gjennomføres kontinuerlig i det de to ovenfor angitte trinn utføres i en enkel apparatur. Under de første driftsøyeblikk, f.eks.

i ca. 1 time, blir permeatet (væsken som går gjennom membranen) tilbakeført til hydrolysesonen for å oppnå det ønskede hydrolyse-innhold av myseproteiner. Når totalhydrolyse er oppnådd, tilføres proteinkonsentratet som skal behandles til reaktoren i en hastighet identisk med den til permeatet. I det spesielle tilfelle man benytter en temperatur på ca. 40°C holdes pH-verdien ved 8,0 i reaksjonssonen, proteininnholdet på ca. 80 g/ liter i mateoppløsningen til reaktoren og et forhold mellom pankreatin og substrat på ca. 12 hvorved den totale "kontinuerlige" driftsperiode er i størrelsesorden 7 til 8 timer.

Det vil bemerkes at en preliminær varmebehandling av den konsentrerte myseproteinoppløsning ikke vil forbedre den totale fermenterbarhet.

Blant de proteiner som er til stede i oppløsningen av proteolysert konsentrat er serumalbumin den som hydrolyseres vanskeligst av pankreatin.

Produktene som oppnås kan ha tallrike anvendelser når det gjelder næring og terapi. Produktene ifølge oppfinnelsen er av en slik type at de ved hjelp av virkningen av intestinal-mottagere setter i gang utskillelse av internpankreatiske hormoner (f.eks. insulin og glukagon) og setter i gang utskillelse av gastrointestinale hormoner (f.eks. gastrin, gastrisk inhibitorpolypeptid).

Produktene ifølge oppfinnelsen kan benyttes med henblikk

på terapeutisk næring eller som intensivbehandlingsmedisin,

de forbedrer fordøyelsesmangler ved resekterte innvoller,

for å oppnå næringsautonomi etter et visst tidsrom og derved å stoppe rørmating av pasienten. Mer generelt kan produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen benyttes med henblikk på terapeutisk næring eller som medisin ved behandling av fordøyelsesinfeksjoner slik som f.eks. gastritt, peptisk sår, ileitt og kolitt.

Tatt i betraktning den fysikalske form for det nye produkt

(et pulver som er oppløselig i et vanndig medium), gir inn-givelsesformen ikke grunn til problemer. De nye produkter kan inngis eller administreres f.eks. via enteraltrakten, f.eks. ved blanding med vanlig mat. De kan også presenteres i form av sammensetninger med vanlige strekkmidler slik som f.eks. er egnet for oralinngivelse. De egnede sammensetninger for de forskjellige formål kan således presenteres i form av piller eller kapsler med kjente strekkmidler slik som talkum, magnesiumstearat, fint oppdelt silisiumdioksyd eller andre kjente bærere.

Oppfinnelsen skal nå illustreres ved hjelp av eksempler. I

de følgende eksempler vil det bli benyttet en apparatur som beskrives under henvisning til de ledsagende tegninger der fig. 1 viser et generelt skjematisk riss av apparaturen; og

fig. 2 viser et flytdiagram som viser membranenzymreaktoren som benyttes i fig. 1.

Som angitt i fig. 1, omfatter apparaturen en ultrafiltrerings-enhet og en enzymreaktor. Mysen tilføres via rørledning 1 først gjennom en varmeveksler 2 og en sentrifugalseparator 3 før den tilføres til ultrafiltreringsmodulen. Den oppvarmede myse med sentrifugerbare uoppløselige stoffer fjernet tilføres via rørledning 4 til tanken 5 samtidig som vann tilføres via rørledning 6. Vannet benyttes kontinuerlig for diafiltrering. Ultrafiltreringsmodulen selv er angitt ved den generelle henvisning 7. Retentatet eller konsentratet som holdes tilbake av ultrafiltreringsmembranet gjenvinnes via rørledning 8.

Det er anordnet innretninger 9 for å justere pH-verdien i retentatet så vel som dettes konsentrasjon. Når disse trinn er ferdig, blir retentatet transportert via rørledning 10

og tilført til buffertanken 11 hvorfra det trekkes av for hydrolyse i enzymreaktoren. For dette formål føres mysen via rørledningen 12 forbundet med buffertanken 11 til enzymreaktoren som er angitt med 13. Hydrolysatet som utgjør sluttproduktet gjenvinnes via rørledning 14. For spesielle prøver ble mysen eller forkonsentratet ultrafiltrert i en DDS-modul med et overflateareal på 9 m<2>, utstyrt med "BR 6 P" membran av kommersielt tilgjengelig type og ultrafiltreringen ble gjennomført i satser ved en temperatur på 50°C. De forskjellige retentater som ble oppnådd ved ultrafiltrering alene eller ved diafiltrering ble spraytørket.

Fig. 2 viser membranenzymreaktoren. Denne består fremfor alt

i av en reaksjonsbeholder som generelt er angitt med 15. Kontinuerlig tilførsel av myseproteiner bevirkes via rørledning 16. En apparatur 17 tjener til å måle og å holde pH-verdien

i reaksjonsbeholderen ved nøytralisering av H -ionene som blir satt fri under oppbrytingen av de peptidiske bindinger. Apparaturen er en pH-stat av type "Mettler" som omfatter en spenningsforsterker, en ekvivalenspunktselektor og en automatisk reagensbyrette og reagensen er en basisk forbindelse som nevnt ovenfor. Det ble ikke funnet noen utilbørlig slitasje på eller

sammenbrudd av elektrodene. Hydrolyseproduktet trekkes av fra reaksjonsbeholderen via rørledningen 18 og ved hjelp av en pneumatisk diafragmapumpe 19. En slik pumpe kan f.eks. være en type "LP 20A" med en pumpehastighet på 720 l/time ved 1,7 bar. På utsiden av pumpen passerer produktet inn i rørledningen 20 og bringes til et forfilter 21 med en porøsi-tet på 150 vm. Referansetallet 22 angir ultrafiltreringsmodulen .

I det spesielle tilfelle benyttes det et "DC 10 S" system

av kommersielt tilgjengelig type omfattende hulfiberultra-filtreringspatroner. Permeatet ble gjenvunnet i rørledning 23 og besto av det ønskede peptidiske hydrolysat. Retentatet fra ultrafiltreringsmodulen 22 ble trukket via en rørledning 24, tilført til en veksler 25 og transportert via rørledning 26 for tilbakeføring til reaksjonsbeholderen 15.

Membranene som ble benyttet var hulfiltertypen med de følgende egenskaper:

For de heri angitte prøver ble det benyttet myse av industriell opprinnelse fra en blanding av Emmental- og Saint-Paulin-myser og pH-verdien lå i området mellom 6,2 og 6,4. Etter skumming ble mysen varmebehandlet ved 58-60°C i ca. 15 sekunder. Den kunne deretter konsentreres ved fordamping til et faststoffinnhold på 50%. Dette forkonsentrat ble deretter fortynnet 2,5 ganger for å unngå for stor krystallisering av laktose og avkjølt til en temperatur nær 4°C før lagring over natt. Som en variant ble visse myser benyttet i eksemplene under fremstilt in situ fra råmelk eller varmebehandlet melk ved melkesyre-eller løypeutfelling.

Under de vanlige eksperimentelle betingelser ble proteinkonsentratet rekonstituert til et proteininnhold på 100 g/liter i reaksjonsbeholderen 15. Reaksjonstemperaturen ble satt til ca. 4 0°C. Apparaturen 17 måler og opprettholder pH-verdien. Etter utjevning av temperaturen og justering av pH-verdien,

ble det nettopp rekonstituerte enzym (pankreatin) tilsatt. Tilsetningen av den alkaliske forbindelse ble kontinuerlig målt for å opprettholde pH-verdien i reaksjonssonen. Hver sats som ble trukket av ble underkastet utfelling i 12%-ig trikloreddiksyre og proteolysen ble fulgt mens man bestemte innholdet av oppløselig nitrogen i det flytende materiale og de befridde NH2~grupper.

Faststoffinnholdet i prøvene av mysen, ultrafiltrat og hydrolysatet ble bestemt ved tørking i en ovn ved 102-105°C i 7 timer. Nitrogeninnholdet ble bestemt ved hjelp av en mikro-kjeldahl på en "Technicon" autoanalysør:

Det totale nitrogeninnhold ble bestemt ved direkte måling

etter fortynning (Total Nitrogenous Material).

Ikke-protein nitrogeninnholdet (NPN) ble bestemt ved måling etter utfelling av proteiner med 12%-ig trikloreddiksyre.

Askeinnholdet ble bestemt ifølge AOAC-metoden (AOAC Standard, 1945).

Bestemmelsen av innholdet av mineralstoffer ble utført ved atomabsorbsjon i en "Tecnitron 1200" apparatur ifølge en rapport av G.K. Myrphy og V. Rhea, "Determination of Major Cations in Milk by Atomic Absorption Spectrophotometry",

"J. Dairy Sc", 50, 313-317 (1967), modifisert av Brule et al,

i "Etude de la Teneur en Minéraux des Produits Obtenus lors de 1'Ultrafiltration du Lait sur Membrane", "Le Lait", 539-540, 600-615, 1974.

Mengden av frie NH2~grupper ble bestemt ved reaksjon med ninhydrin etter alkalisk hydrolyse ifølge Hirs et al., "J. Biol. Chem.", 219, 1190 (1956) ved hjelp av trinitrobenzensulfonsyre ifølge Fields, "Biochem, J.", 124, 581-590 (1971).

Bestemmelsen av mengden av aminosyrer ble utført ifølge Spackman et al., "Anal. Chem.", 30, 1190 (1958). Peptidene (2 mg)

ble hydrolysert i 24 timer, 48 timer og 96 timer ved 110°C i vakuumforseglede rør pr. ml 6N HC1, destillert to ganger. Resultatene er uttrykt i gram pr. 100 gram aminosyrer etter korreksjon for destruksjon av treonin, serin, cystin og tyrosin under hydrolysen.

Mengden av tryptofan ble bestemt separat i henhold til Spies-metoden av 1957 ved kolorimetrisk reaksjon med paradimetyl-aminobenzaldehyd etter hydrolyse med pronase.

Målingen av de optiske densiteter ved 280 nm og 420 nm (bestemmelse av mengden av N^-grupper med TNBS) og ved 570 nm (bestemmelse av mengden av NP^-grupper med ninhydrin), og kurven for absorbsjonsspektra for proteiner, peptider eller aminosyrer med henblikk på deres identifikasjon ble utført på et "Acta VI" spektrofotometer i en kvartscelle med 1 cm lang optisk vei.

Mengden av gjenværende aktivitet av trypsin i det peptidiske hydrolysat ble bestemt i henhold til Hummel-metoden, "Can.

J. Biochem. Physiol.", 37, 1393 (1959), ved å følge økningen

av absorbsjonen ved 247 nm på grunn av hydrolysen av et syntetisk stoff, p-toluensulfonyl-L-argininmetylester (TAME).

Den kvalitative og kvantitative bestemmelse av oppløselige proteiner (laktoglobulin, laktalbumin, serumalbumin) i mysen, retentantene, ultrafiltratene, proteinkonsentratet før, etter og under hydrolyse, ble gjennomført ved elektroforese i en polyakrylamidgel ifølge Aschaffenburg-metoden (se "Protein Phenotyping by Direct Polyacrylamide Gel electrophoresis of Whole Milk", "Biochem. Biphys., Acta", 82, 188-191 (1964), modifisert: Gelen som ble benyttet var enten 5% eller 9% av en 1:1 blanding av akrylamid og bisakrylamid (Cyanogum:Apelab, Paris).

Platene ble etter eksponering til amidosort og avfarging med 10% eddiksyre avlest ved hjelp av et Philips densito-meter.

Separering av proteiner, peptider og frie aminosyrer ifølge deres molekylvekt ble gjennomført ved filtrering gjennom Sephadex gel.

Som funksjon av arten av bestanddelene som skulle separeres ble det benyttet følgende gel:

Elueringsmidlene ble analysert ved å måle den optiske densi-tet ved 280 nm og ved å bestemme antall frie Nl^-grupper med ninhydrin.

Fraksjonering av peptidene og aminosyrer som funksjon av deres isoelektriske punkt og deres ladning ble oppnådd ved å bruke kationbytteharpikser av typen "AG 50 x W2". Det peptidiske hydrolysat ble bragt i kontakt med harpiksen i satser ved forskjellige pH-verdier. Etter en kontaktperiode og av-setning, ble den flytende del analysert.

Eksempel 1

I dette eksempel ble det benyttet en apparatur av den generelle type som er vist i fig. 1 samt en enzymreaktor av den type som er vist i fig. 2. Mysen ble behandlet på forhånd i sentri-fugeseparatoren 3 ved en hastighet på 1 000 g i 15 minutter før tilførsel til apparaturen.

Enzymet som ble benyttet var pankreatin som kommersielt er tilgjengelig under betegnelsen "SIGMA", av storfeopprinnelse med en aktivitet på 4 NF (fransk standard). Reaksjons-betingelsene i reaksjonsbeholderen i enzymreaktoren var som følger:

Hydrolysen av myseproteinene ble fulgt ved hjelp av elektroforese i_en polyakrylamidgel. Resultatene er vist i fig. 3.

Figuren viser forskjellige trinn i reaksjonen ved tidspunktene 7 minutter og 70 minutter, tendensen for elektroforeskurvene tilsvarende oppløseliggjøringen av myseproteinene. Diagrammet i den nedre del av fig. 3 representerer vandringen av de forskjellige proteiner. B-laktoglobulin er angitt med forkortelsen g<->lakto, a-laktalbumin ved forkortelsen a-lakta og storfeserumalbumin ved forkortelsen BSA.

Polyakrylamidgelen kan benyttes ved en konsentrasjon på 9%. Resultatene som vises i fig. 3 viser at hastigheten for hydrolysen av proteiner er forskjellig. B-laktoglobulin blir hurtigere hydrolysert enn a-laktalbumin som igjen er hurtigere enn serumalbumin. Serumalbumin er i det minste delvis ufølsom overfor proteolyse. Storfeserumalbumin i mysen kan derfor ikke hydrolyseres totalt.

Fig. 4 er en figur tilsvarende fig. 3, men angir resultatene ved kontinuerlig drift i reaktoren. Elektroforesemålingene i en 9% polyakrylamid av den kontinuerlige hydrolyse av myseproteinkonsentratet med pankreatin i enzymreaktoren bekrefter at storfeserumalbuminet akkumuleres i reaktoren.

Etter 3 timers. drift av reaktoren ble bunnen av beholderen renset ved diafiltrering og analysert. Resultatene er angitt i diagrammet i fig. 5. Fig. 5 viser molekylfordelingen for bestanddelene som er tilstede i enzymreaktoren ved slutten av pankreasehydrolysen av myseproteinkonsentratet etter rensing ved diafiltrering ("Sephadex G-100" gel, fosfatbuffer, pH 7,5).

I

Filtreringskurven antyder nærværet av tre bestanddelsgrupper: Den første med høyest molekylvekt har en høy absorbsjon ved 280 nm (med et søkk) for lavt NB^-innhold;

den andre hvis elektroforetiske bilde og absorbsjonsspektrum ved 280 nm tilsvarer det for storfeserumalbumin; og den tredje med lav molekylvekt, d.v.s. peptidene.

Eksemplene 2 og 3

Disse eksempler angår også kontinuerlig oppløseliggjøring av myseproteiner med pankreatin i enzymreaktoren. Driftsbetingelsene er som angitt i tabell 1.

I de to prøver ble den tilsynelatende hydrolysegrad (oppløselig nitrogen/totalt nitrogen) holdt konstant på grunn av liten enzymtilførsel. Lengden av reaktordriften var fra 7 til 8 timer.

Resultatene ses best i diagrammene i fig. 6 og 7. Langs abscissen er angitt reaksjonstiden i timer og langs ordinaten konsentrasjonen av faststoffer eller proteiner i produktene angitt i gram/liter. I fig. 6 og 7 angir kurvene (a) henholdsvis (b) den tilsynelatende hydrolysegrad av permeatet og ultrafiltreringsretentatet mens kurven (c) angir faststoffekstrakten i retentatet.

Deretter skal det resulterende hydrolysat karakteriseres.

Fig. 8 illustrerer molekyltordelingen av peptidene som oppnås ved pankreasehydrolyse av et myseproteinkonsentrat som en funksjon av kontakttiden mellom enzym og substrat. Målingene ble utført ved filtrering gjennom en "Sephadex G 50" gel og eluering med en 30%-ig eddiksyre. Fig. 8 viser virkningen av kontakttiden mellom enzym og substrat. Fig. 9 viser molekyltordelingen for peptidene som ble oppnådd ved pankreasehydrolyse av et myseproteinkonsentrat etter totalenzymatisk hydrolyse og disse målinger ble utført på en "Sephadex G 15" gel med eluering med 30%-ig eddiksyre. Som vist i fig. 9, hadde alle peptider som ble oppnådd en størrelse på mindre enn 2 000 og hovedandelen lå mellom dipeptid og dekapeptid. Mengden av frie aminosyrer er liten og kan ansettes til en mengde på mindre enn 10%. Bruken av forskjellige membraner med forskjellig sperregrense viste ingen forskjell mellom peptidene som ble oppnådd på membraner med sperregrense på 5 000 og de som ble oppnådd med membraner med en sperregrense på'10 000. Fig. 10 viser at gjennomgangen av pankreatisk hydrolysat igjennom en membran med sperregrense 5 000 med en membran med sperregrense 15 000 modifiserer kurven for molekylfordelingen av peptidene. Denne figur illustrerer derfor muligheten for modifisering av fordeling av peptidene ved å underkaste det totale opprinnelige hydrolysat som tidligere er oppnådd med en membran med sperregrense 5 000 en ultrafiltrering med en "PM 2"-membran med en sperregrense på 1 500-2 000. Målingene ble utført med en "Sephadex G 15"

gel med eluering med 30% eddiksyre.

Andre målinger ble utført på sammensetningene av produktene som ble oppnådd ved bestemmelse av hvilke fraksjoner som var dialyserbare og ikke-dialyserbare. Sperregrensen ved dialyse befinner seg ved en molekylvekt på ca. 2 000. Tabell 2 nedenfor tilsvarer aminogrammet for den dialyserbare fraksjon I og den ikke-dialyserbare fraksjon II i et pankreasehydro-lysat fra myseproteinkonsentratet.

Resultatene er uttrykt i gram pr. 100 gram proteiner bortsett fra for tryptofan som er angitt i gram pr. 100 gram fryse-tørket pulver.

For ytterligere å karakterisere pankreasehydrolysatet ble det bragt i kontakt med en kationisk harpiks i en mengde på 7 g harpiks pr. 100 mg hydrolysat med et peptidinnhold på 36 g pr. liter. De ble holdt i kontakt i 2 timer ved omgivelses-temperatur og forskjellige pH-verdier.

Fig. Ila, 11b og lic viser molekylfordelingen for peptider ikke festet til den kationiske harpiks og inneholdt i de

forskjellige flytende deler ved pH 2, pH 5 henholdsvis pH

7,5. Diagrammene i fig. 12 antyder deres vesentlige aminosyresammensetning (uttrykt som %-andel av det opprinnelige hydrolysat). Sekvensen av aminosyrene i diagrammet er fra venstre mot høyre: Ile, Leu, Lys, Met, Cys, Phe, Tyr, Thr,

Trp og Val.

Det bemerkes at bindingen av peptidene er forskjellige

avhengig av pH-verdien ved reaksjonen. Ved pH 2 binder de små peptider og frie aminosyrer seg fortrinnsvis til de største. De siste er svake hva angår lyse, cystein, tyrosin, fenylalanin og tryptofan. Etter hvert som pH-verdien nærmer seg nøytralverdien, reduseres nitrogenbinding. Ved pH 7,5

er aminosyresammensetningen i den flytende del meget nær den for det opprinnelige hydrolysat.

Disse forskjellige resultater viser at fraksjonering av hydrolysatet er mulig i henhold til denne teknikk. Ved å variere pH-verdien i reaksjonen, arten av harpiks, konsentrasjonen,

er det mulig å oppnå peptinfraksjoner med nøyaktige karakte-ristika .

Det ble utført andre eksperimenter med ultrafiltrering av totalhydrolysatet over membraner med en sperregrense på ca.

2 000 og i stand til partielt å holde tilbake peptider med en molekylvekt på over 1 500. Fig. 13 viser molekyltordelingen for peptidene og de frie aminosyrer i fraksjonen som går gjennom 2 000-membranet ("Sephadex G 15" gel 30%-ig eddiksyre). Permeatfraksjonen av pankreatinhydrolysatet har lite cystein

og anriket på fenylalanin, tryptofan med henblikk på det opprinnelige hydrolysat. Fig. 4 viser den vesentlige aminosyresammensetning (uttrykt som %-andel av innholdet i det opprinnelige hydrolysat), peptider og frie aminosyrer inneholdt i fraksjonen som går gjennom 2 000-membranet.

Eksempel 4

Det ble arbeidet under betingelser tilsvarende de i eksemplene 2 og 3. Det peptidiske hydrolysat ble konsentrert og deretter tørket. Pulveret hadde de nedenfor angitte egenskaper:

Analysen av nitrogeninnholdet ble utført ved mikro-Kjeldahl. Pulveret var fortynnet i

2% natriumsitrat

0,5N NaOH

destillert vann

Resultatene ble uttrykt i nitrogen multiplisert med 6,38.

Utfelling med 12% TCA:null

Mengde NPN flytende på N/100 pulver: llg

Eksemplene som følger illustrerer anvendelse av produktene ifølge oppfinnelsen på sammensetninger for intensivbehandlingsnæring.

Eksempel 5

Dette eksempel angår et intensivbehandlingsprodukt som anvendes via enteralkanalen på pasienter som krever et proteininntak i størrelsesorden 7-12% av det totale kaloriinnhold.

Et slikt produkt tilfredsstiller næringsmiddelkrav når det gjelder mukoviscidose eller cystisk fibrose i pankreas, nyreutilstrekkelighet så vel som for pasienter som lider under infeksjoner eller betennelser i innvollsveggene. Proteinene tilføres fortrinnsvis i forfermentert form.

Én egnet sammensetning er den følgende: Peptidisk hydrolysat ifølge oppfinnelsen 2,5 g lipider:

En blanding av like deler:

Glycider:

Vitarai ner:

Mineralelementer:

Eksempel 6

Dette eksempel angår et intensivbehandlingsprodukt som anvendes via enteralkanalen på pasienter som krever et proteininntak i størrelsesorden 25% av det totale kaloriinnhold i forfermentert form og med et lite lipidinntak. Dette kan være tilfeller ved betydelig vevødeleggelse etter alvorlige skader eller forbrenninger.

En egnet sammensetning er den følgende: Peptidhydrolysat ifølge oppfinnelsen 8 g lipider:

Glycider: i Vitaminer:

Mineraler:

Eksempel 7

Dette eksempel viser fremstilling av farmasøytiske sammensetninger som skal tas oralt. Det ble fremstilt piller på vanlig måte fra den følgende formulering: Peptidisk hydrolysat ifølge oppfinnelsen 200 mg QS-strekkmiddel for pillen til 300 mg

Strekkmidlet som ble benyttet var talkum, magnesiumstearat eller silisiumdioksyd tilgjengelig kommersielt under betegnelsen "Aerosil".

På samme måte ble det fremstilt kapsler inneholdende 100 mg av det peptidiske hydrolysat ifølge oppfinnelsen og et vanlig strekkmiddel for kapslene q.s. 200 mg.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av enzymatisk totalhydrolysat fra myseprotein, karakterisert ved at mysens ultrafiltreringsretentat bringes i kontakt med proteolytiske enzymer som helt er i stand til å spalte myseprotein i menneskekroppens fordøyelseskanal, hvilket enzym er pankreatin, i form av pankreaseekstrakt eller syntetblanding, inneholdende trypsin og kymotrypsin og andre sekundære naturlige, i pankreaseekstrakt forekommende enzymer, hvilket enzym i forhold til substratet anvendes i en mengde av 8 til 15 vekt-% fortrinnsvis 12 vekt-%, hvorved hydrolysen fortsettes inntil produktet ikke inneholder restprotein, d.v.s. ikke inneholder nitrogen som faller ut med 12 vekt-%-ig trikloreddiksyre, og inntil det oppnås et peptidhydrolysat av hvis peptider minst 50% inneholder 2 til 5 aminosyrer og der mengden frie aminosyrer er under 15%, hvoretter det oppnådde hydrolysat gjenvinnes .
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at et meget rent proteinkonsentrat fremstilles ved at mysen utsettes for ultrafiltrering ledsaget av eller fulgt av diafiltrering.
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at de uoppløselige fraksjoner fjernes fra mysen ved sentrifugering før ultrafiltrering.
4. 4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at proteinkonsentratet mikrofiltreres etter oppnåelse av myseproteiner for fjerning av lipide restfraksjoner, lipoproteiner og mikroorganismer.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at ultrafiltreringsretentatet hydrolyseres kontinuerlig med enzymer ved å føre det til reaksjonssonen i den hensikt å bringe det i effektiv kontakt med enzymet, at reaksjonsproduktet fjernes kontinuerlig

   og føres fra reaksjonssonen til ultrafiltreringssonen, hvorfra permeat også fjernes kontinuerlig og som danner det ønskede produkt, og at reaksjonen får fortsette inntil permeatet er et enzymatisk totalhydrolysat, hvilket permeat resirkuleres fra ultrafiltreringssonen til reaksjonssonen.
6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at pH-verdien reguleres i reaksjonssonen til en verdi mellom 7 og 9, fortrinnsvis mellom 7,5 og 8,5, ved å tilsette et basisk reagens som er natriumhydroksyd, natriumkarbonat, kaliumhydroksyd, kaliumkarbonat, kalsiumhydroksyd eller aluminiumhydroksyd eller en blanding av to eller flere av disse.
7. 7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at hydrolysen utføres ved en temperatur på 37 til 45°C og fortrinnsvis 40°C.