ES2214542T3

ES2214542T3 - Metodo para producir una mezcla de peptidos.

Info

Publication number: ES2214542T3
Application number: ES96921915T
Authority: ES
Inventors: Dereck E. W. Chatterton; Grete Berntsen; Kristian Albertsen; Bent E. Pedersen
Original assignee: Arla Foods AMBA
Current assignee: Arla Foods AMBA
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2016-06-28
Also published as: DE69631793T2; AU6299196A; KR19990028632A; NO976118L; EP0871371A1; US6060269A; CA2226001A1; ATE260567T1; NZ311633A; CN1064216C; NO317285B1; DE69631793D1; WO1997001966A1; JPH11509727A; AU704743B2; EP0871371B1; CN1192656A; KR100437984B1; NO976118D0

Abstract

LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA A UN METODO PARA LA PRODUCCION INDUSTRIAL DE UN PREPARADO DE PEPTIDOS QUE POSEE UNAS ESPECIFICACIONES DEFINIDAS POR HIDOLISIS DE UN MATERIAL PROTEINICO, PREFERIBLEMENTE CON BASE DE SUERO LACTEO. EL METODO COMPRENDE DIVERSAS ETAPAS, LAS CUALES FACILITAN EL CONTROL DEL METODO, DE FORMA QUE SE OBTENGA UN PRODUCTO EL CUAL, P. EJ., DEBIDO AL BAJO CONTENIDO EN MINERALES, ES ADECUADO COMO NUTRIENTE EN DIALISIS PERITONEAL Y PARENTERAL. EL METODO PROPORCIONA UN ALTO RENDIMIENTO.

Description

Método para producir una mezcla de péptidos.

La presente invención se refiere a un método mejorado y ventajoso desde un punto de vista industrial para producir una mezcla de péptidos con unas especificaciones deseadas, en particular en lo que se refiere a peso molecular, osmolalidad, bacteriología y contenido en minerales.

Dichas mezclas resultan adecuadas para ser utilizadas como o en agentes para diálisis peritoneal y en nutrición parenteral, así como en otras aplicaciones farmacéuticas y cosméticas.

La función normal de los riñones de los mamíferos incluye actividades como el mantenimiento de un equilibrio ácido-base constante y de un equilibrio de electrolitos constante, y la eliminación de la sangre de los líquidos sobrantes y de los productos de desecho del metabolismo del cuerpo. En un individuo con enfermedad renal, este funcionamiento del riñón puede verse reducido hasta un valor tan bajo como el 5% o menos del nivel normal. Cuando la función renal disminuye de manera significativa, se deben utilizar medios artificiales para sustituir la actividad del riñón si se quiere mantener la vida. Esto se consigue clínicamente mediante el uso de la diálisis. Uno de los métodos más comunes para conseguir esto es la hemodiálisis, en la que la sangre del paciente se pasa a través de un riñón artificial que actúa como dializador. En este dializador, una membrana sintética semipermeable actúa como un riñón artificial con el que la sangre del paciente se pone en contacto en un lado, mientras que en el lado contrario de la membrana se encuentra un líquido de diálisis o dializante, cuya composición es tal que los productos de desecho de la sangre del paciente pasaran por difusión de manera natural a través de la membrana, al líquido. De esta manera, la sangre se limpia, esencialmente de la misma manera a como lo hubiera hecho el riñón, y la sangre se devuelve al cuerpo del paciente. Este método de diálisis requiere que el paciente se encuentre físicamente "enganchado" al dializador durante varias horas, frecuentemente varias veces a la semana. Aunque resulta eficaz, este método, por razones obvias, presenta varios inconvenientes.

Algunas de las desventajas asociadas a la hemodiálisis, que requiere de un tratamiento extracorpóreo de la sangre, se superan mediante el uso de técnicas que utilizan el peritoneo del paciente como la membrana semipermeable que se necesita. El peritoneo es el revestimiento membranoso que contiene un gran número de vasos y capilares sanguíneos, y que es por lo tanto capaz de actuar como una membrana semipermeable natural. La disolución de diálisis se introduce en la cavidad peritoneal a través de un catéter en la pared abdominal. Un tiempo de residencia adecuado del líquido dializante permite intercambiar solutos entre el líquido dializante y la sangre. La eliminación de líquidos se consigue al lograrse un gradiente osmótico adecuado entre la sangre y el líquido dializante que permite la salida de agua de la sangre. De esta manera, se imparte a la sangre el equilibrio ácido-base correcto, el equilibrio de electrolitos correcto y el equilibrio de líquidos correcto, y los productos de desecho se eliminan de la sangre. Después de haberse completado la diálisis, la disolución de diálisis se drena de manera sencilla de la cavidad del cuerpo a través del catéter. Aunque existe más de una clase de diálisis peritoneal, la técnica particularmente favorita es la conocida como diálisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA), por no requerir que el paciente permanezca atado al aparato durante la duración del reemplazamiento de solutos y de líquido. El único periodo sedentario que se requiere es durante la infusión y el drenaje de la disolución de diálisis.

Existen requerimientos bastante específicos en cuanto a la composición de los agentes que se utilizan en la diálisis peritoneal. Además, estos requerimientos pueden variar de un paciente a otro. Por supuesto, los agentes no pueden ser tóxicos. Adicionalmente, deben tener las especificaciones correctas en cuanto a peso molecular, conductividad, y contenido en sales y minerales.

En la actualidad, el agente que ha logrado una mayor aceptación general en cuanto a la obtención del gradiente osmótico requerido es la glucosa. La glucosa presenta la ventaja de no ser tóxica así como de ser rápidamente metabolizable si pasa a la sangre. Sin embargo, el mayor problema que presenta su utilización es que es rápidamente absorbida pasando a la sangre desde el líquido dializante. Aunque cualquier sustancia entrará eventualmente en la circulación sanguínea, la glucosa atraviesa el peritoneo tan rápido que el gradiente osmótico desaparece en 2-3 horas después de la infusión. Esto puede causar incluso una reversión de la dirección de la ultrafiltración, produciendo el resultado no deseado, es decir, que el agua se reabsorba del líquido dializante hacia el final del tratamiento de diálisis. Aún más, la cantidad de glucosa que se aporta puede representar una gran proporción de la ingesta de energía del paciente, siendo posiblemente tan alta como un 12-35%. Mientras que este hecho no afecta significativamente a los pacientes no diabéticos, puede resultar una carga metabólica severa para un paciente cuya tolerancia a la glucosa se encuentra previamente alterada. Esta carga adicional puede estar implicada en hiperglucemia y obesidad, que han sido observadas en varios pacientes DPCA. Los pacientes diabéticos, se encuentran con el inconveniente añadido y el riesgo de tener que añadir insulina al líquido dializante peritoneal, con el fin de reducir los riesgos de hiperglucemia que resultan de un incremento de la carga de glucosa.

El líquido de diálisis que contiene glucosa puede reducir la eficacia de la filtración del peritoneo debido a la glicosilación no enzimática de las proteínas del peritoneo. A este respecto, se hace referencia a un artículo de James W. Dobbie "New Concepts in Molecular Biology and Ultrastructural Pathology of the Peritoneum: Their Significance for Peritoneal Dialysis" en American Journal of Kidney Diseases Vol. XV, No. 2, Febrero 1990, páginas 97-109.

La utilización de glucosa también presenta problemas en la preparación del líquido dializante. La esterilización del líquido dializante se consigue normalmente por calor que, a un valor de pH fisiológico, producirá una caramelización de la glucosa. Para compensar este hecho, el valor de pH del líquido dializante se ajusta normalmente a 5,0-5,5. Este valor bajo de pH, bastante más bajo de lo que es normal para el cuerpo, puede ser el responsable del dolor experimentado por algunos pacientes en la entrada del líquido, y pudiera producir esclerosis de la membrana peritoneal, que por su parte causaría un descenso en la equilibración o eliminación de solutos (Schmidt et al., Arch. Int. Med., 141:1265-1266, 1980).

Estas desventajas hacen altamente deseable el descubrimiento de una alternativa apropiada a la glucosa como agente osmótico. Se han sugerido varias sustancias que cumplen los criterios de ser biológicamente inertes, no cruzar la membrana peritoneal fácilmente, no ser tóxicas, y ejercer una presión osmótica adecuada. Se ha demostrado que varios de los materiales sugeridos no eran sustitutos adecuados de la glucosa. Por ejemplo, se ha propuesto la utilización de dextranos (Gjessing, Acta Med. Scan., 185:237-239, 1960) o polianiones (especificación de la patente de EEUU No. 4.339.433) debido a su alto peso molecular. Por esta razón, se consigue una reducción de su difusión a través del peritoneo a la sangre. Sin embargo, el papel del sistema linfático en el proceso de transporte de solutos limita claramente las ventajas del alto peso molecular per se (Allen et al., Amer. J. Physiol., 119:776-782, 1937). Respecto a los polianiones tampoco está claro cual sería su acción tóxica, al no ser la mayoría de ellos metabolizables. Se observan problemas similares de metabolismo con compuestos como sorbitol, xilitol y polímeros de glucosa. El sorbitol, que se metaboliza muy lentamente, se ha asociado con casos de coma hiperosmolar y muerte (Raja et al., Ann. Int. Med., 73:993-994, 1970), y no se sigue utilizando. Tanto el xilitol como los polímeros de glucosa también tienden a acumularse en la sangre, y pueden estar asociados con efectos secundarios desagradables (Bazyato et al., Trans Amer. Soc. Artif. Interm. Organs, 28:280-286, 1982). La fructosa, que es comparable a la glucosa en cuanto a su capacidad osmótica, también presenta muchas de estas desventajas. Debido a su alto coste, no ha alcanzado un uso generali-
zado.

La propuesta de utilización de aminoácidos para reemplazar a la glucosa resulta más prometedora. Los aminoácidos se toleran bien, sin presentar efectos secundarios adversos conocidos (Oren et al., Perit. Dial. Bull., 3:66-72). Debido a su menor peso molecular, producen un efecto osmótico mayor, referido a la masa, que la glucosa. Sin embargo, este hecho también resulta en una absorción más rápida en la sangre, produciendo una pérdida rápida del gradiente osmótico. Aunque el transporte de aminoácidos, a diferencia del transporte de glucosa, puede resultar beneficioso al compensar la pérdida de proteínas observada en muchos pacientes DPCA, existe una desventaja considerable en cuanto a los costes casi prohibitivos de las disoluciones de aminoácidos cuando se comparan con las de glucosa. Aún más, el transporte más rápido de aminoácidos resulta en una carga de nitrógeno considerable que aumenta significativamente los niveles de nitrógeno en forma de urea en la sangre. Por consiguiente, se ha visto que ni siquiera los aminoácidos representan unos sustitutos adecuados.

Se han logrado mejoras en el método de diálisis peritoneal por la invención descrita en DK 168.080, que aparece descrita con más detalle más adelante. En ella se utiliza un agente osmótico que no sólo es una alternativa a la glucosa segura y beneficiosa, sino que además su utilización resulta económica. Se ha visto que una mezcla de oligopéptidos de peso molecular relativamente bajo (300-2.000 Daltons) derivados de la hidrólisis enzimática de una proteína de alta calidad, como la proteína del suero de la leche, puede ser utilizada como un agente osmótico eficaz en una disolución de diálisis peritoneal. En comparación con una disolución de aminoácidos, el mayor peso molecular de los péptidos impide el transporte rápido a la sangre, permitiendo un mantenimiento más eficaz del gradiente osmótico, impidiendo además el aumento de nitrógeno no deseado en la sangre. La mezcla de péptidos que, finalmente aunque muy despacio, es absorbida en el suero proporciona además un suplemento dietético valioso, al derivar la mezcla de péptidos de una proteína de alta calidad. Finalmente, la mezcla de péptidos presente proporciona una fuente de agente osmótico de bajo coste y de fácil obtención.

Los péptidos con un peso molecular por encima de aproximadamente 5.000 Daltons pueden producir problemas alérgicos, lo que por supuesto resulta particularmente inaceptable en productos que se van a introducir en el cuerpo.

Una mezcla de péptidos de la presente clase puede además combinarse con cualquier disolución osmóticamente equilibrada adecuada para ser utilizada como líquido dializante peritoneal. Los líquidos dializantes útiles deben contener, con el fin de estar osmóticamente equilibrados para el presente objetivo, electrolitos en una concentración suficiente como para producir la difusión del agua y de productos metabólicos de desecho a través del peritoneo. No existe una disolución estándar de diálisis, porque los requerimientos pueden variar de un individuo a otro. Una disolución habitual contiene, por ejemplo, cantidades específicas de sodio, cloruro, lactato, magnesio y calcio. El contenido de una típica disolución de líquido dializante se muestra en la siguiente lista, sin especificarse la cantidad del agente osmótico. En una disolución de glucosa, la glucosa monohidrato se añade normalmente en una cantidad de aproximadamente 1,5 a 4,25%. Se debe entender que esto representa sólo un ejemplo de una posible disolución, y que las variaciones en el modelo serán aparentes para una persona especializada en el tema. La proporción de la mezcla de péptidos en el líquido dializante puede variar, pero normalmente se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 15% en peso de la disolución de líquido dializante. En cualquier caso, la cantidad de péptido utilizada debe ser la suficiente como para conferir, junto con los electrolitos, una osmolalidad de aproximadamente 300 a aproximadamente 500 mOsm/l (la osmolalidad normal en suero es 280 mOsm/l). La administración del líquido dializante se realiza en la forma en la que normalmente se hace en la diálisis peritoneal. En "Peritoneal Dialysis", K. Nolph, ed., Martinus Nighoff Publishers, 1981, se describen ejemplos de formas de diálisis peritoneal. El tratamiento particular que requiera un paciente individual lo puede determinar fácilmente el médico del paciente.

Los componentes de una disolución de diálisis peritoneal típica son (en meq/l):

Sodio	132,0
Calcio	3,5
Magnesio	0,5
Cloruro	96,0
Anión lactato	40,0

A partir de la solicitud de patente internacional WO 87/01.286 y de las correspondientes especificación de patente EP No. 270.545, especificación de patente de EEUU No. 4.906.616, y la especificación de patente danesa No. 165.734, se conoce la obtención de un líquido de diálisis mediante la hidrólisis enzimática de productos lácteos. Entre estos, se menciona la fracción del suero, pero se afirma que presenta el inconveniente de tener una composición química bastante indefinida y de contener varias proteínas residuales que resultan difíciles de eliminar, lo que conlleva una tendencia a que la hidrólisis no sea reproducible, y a que el producto de la hidrólisis se contamine. Por lo tanto, se prefiere la utilización de \beta-lactoglobulina y \alpha-lactoalbúmina, y en particular la fracción de caseína. La hidrólisis enzimática se lleva a cabo en una disolución acuosa de caseinato sódico. Después de la hidrólisis, se lleva a cabo una filtración a través de un filtro de bacteria, y el producto se ajusta a la osmolalidad deseada, y el pH se ajusta por la adición de sal.

Sin embargo, la caseína resulta menos apropiada debido a su alto contenido en fósforo que no es adecuado para pacientes que presentan enfermedades renales.

A partir de la especificación de patente EP No. 218.900 y las correspondientes especificaciones de patentes danesas No. 168.692 y 168.080 y la especificación de patente de EEUU No. 5.039.609, como se ha mencionado anteriormente, se conocen mezclas de péptidos que presentan un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 2.000 Daltons, siendo dichas mezclas apropiadas para ser utilizadas como agentes osmóticos activos en la diálisis peritoneal. Las mismas referencias describen un método para producir dicha mezcla a partir de una proteína de alta calidad mediante hidrólisis enzimática seguida de diálisis y ósmosis reversa. Como proteína, se utiliza, por ejemplo, la proteína del suero de la leche. El proceso resulta bastante laborioso y requiere de un equipamiento especial, y no resulta posible variar la composición. Esto es particularmente importante respecto a sustancias de bajo peso molecular que contengan N, lactosa y minerales, en particular aluminio, debido a que en este proceso no es posible eliminar estos componentes una vez que se han incluido en el líquido dializante.

Además, WO 94/14.468 describe disoluciones de diálisis que contienen péptidos y glucosa. No se describe ningún método en especial para producir dichos péptidos.

La especificación de patente de EEUU No. 4.427.658 describe un hidrolizado de proteína del suero de la leche que resulta particularmente apropiado para fines nutricionales. Se encuentra totalmente hidrolizado y por lo tanto tiene un alto contenido en aminoácidos libres. Puede presentar hasta un 15% de aminoácidos libres. Generalmente esto no es deseable, especialmente para diálisis donde la concentración recomendada se encuentra por debajo del 5%. El hidrolizado se obtiene por hidrólisis con una enzima proteolítica, por ejemplo pancreatina, y la hidrólisis se continua hasta que no haya nitrógeno precipitable con ácido tricloroacético al 12%.

La solicitud de patente internacional No. WO 92/21.248 se refiere a un método para producir un hidrolizado de proteína del suero de la leche con fines nutricionales mediante la utilización como material de partida de un producto de la proteína del suero de la leche que presenta un contenido en proteína de al menos el 65%, calculado como materia seca, y una combinación de una hidrólisis seguida de una ultracentrifugación/microfiltración. El método proporciona, con alto rendimiento, un producto de buen sabor y aceptable desde un punto de vista organoléptico. Sin embargo, el producto presenta una alto contenido en minerales que resulta demasiado alto para productos de diáli-
sis.

Se ha descubierto que es posible producir preparaciones de péptidos adecuadas para diálisis, nutrición parenteral y otros propósitos, con un peso molecular conveniente y un contenido en minerales y nitrógeno conveniente, dependiendo de lo que se necesite. Esto se consigue mediante un método particularmente ventajoso mediante el cual es posible controlar la composición de la preparación de manera fácil y económica. El método se puede llevar a cabo mediante un equipamiento fácilmente accesible.

El método de acuerdo con la invención para producir una mezcla de péptidos que resulte apropiada para ser utilizada en la diálisis peritoneal y/o en la nutrición parenteral y para otros propósitos, dicha mezcla tiene un peso molecular de péptidos de 200-2.000 Daltons, y un contenido mineral bajo, tan bajo que es adecuada para diálisis peritoneal, pertenece a la clase en la que una proteína se trata en una disolución acuosa bajo condiciones hidrolizantes, y se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:

a): hidrolizar hasta que se alcance un aumento de la osmolalidad en el intervalo 120-250 mOsm/kg de H_{2}O, medido en una disolución de proteína al 8%,

b): microfiltrar, centrifugar o separar cromatográficamente, con el fin de eliminar las sustancias de alto peso molecular no deseadas,

c): ultrafiltrar el permeado de la etapa (b), o tratarlo mediante un método cromatográfico con el fin de aislar los péptidos deseados,

d): nanofiltrar el permeado de la etapa (c), o tratarlo mediante un método cromatográfico,

e): recoger el retenido de la nanofiltración, posiblemente enfriarlo,

f): electrodializar el retenido de la etapa (e) después de ajustar el pH al valor óptimo para la electrodiálisis,

g): opcionalmente esterilizar por filtración el producto obtenido,

h): después de ello, si se desea, el producto estéril se seca.

Mediante este método de acuerdo con la invención es posible producir una mezcla de péptidos con un peso molecular de 200 a 2.000 Daltons, preferiblemente de 400 a 1.500 Daltons, y en particular menos de 1.000 Daltons, lo que resulta deseable para un ingrediente de diálisis. Mediante el método de acuerdo con la invención, es también posible producir una mezcla de péptidos con un contenido en minerales extremadamente bajo, v.gr.

un contenido en fósforo de 0,01% como máximo,

un contenido en aluminio de 0,5 ppm como máximo,

un contenido en sodio de 0,6% como máximo,

un contenido en cloruro de 0,7% como máximo,

un contenido en potasio de 0,02% como máximo,

un contenido en magnesio de 0,01% como máximo.

La proteína del suero de la leche es una proteína adecuada como material de partida. Esto se aplica especialmente a un concentrado de proteína del suero de la leche. Un concentrado de proteína del suero de la leche particularmente preferido es el producto comercializado bajo la marca comercial BIPROR. Este producto contiene un 90% de proteína y tiene un contenido muy bajo en grasa, lactosa y minerales. Desde un punto de vista nutricional, la proteína del suero de la leche tiene un gran valor, por ejemplo mayor TD (digestibilidad real), BV (valor biológico), NPU (utilización neta de proteína), y PER (relación de eficacia proteica) que los aislados de soja y caseína, con valores similares a los del huevo completo (clara + yema).

Aproximadamente el 50% de los péptidos de la mezcla de péptidos producida mediante el método de acuerdo con la invención consiste en aminoácidos esenciales. Por lo tanto, esta mezcla de péptidos resulta también apropiada para nutrición parenteral y nutrición periférica-parenteral si se añaden a la mezcla carbohidratos, grasas, vitaminas, minerales, etc. A este respecto se hace referencia a la Enciclopaedia of Food Science, Food Technology and Nutrition, páginas 3420-3422 "Parenteral Nutrition", y a Essentials of Nutrition and Diet Therapy, 1994, Mosby; capítulo 18, Feeding Methods: "Enteral and Parenteral Nutrition".

Sin embargo, es también posible la utilización de otros materiales de partida proteicos, como por ejemplo caseína y proteína de soja, pero como ya se ha mencionado, no son tan ventajosos como los materiales de partida basados en el suero de la leche.

En principio, se pueden utilizar hidrólisis ácidas o básicas, pero se consigue un mayor rendimiento mediante la hidrólisis enzimática. Además, las hidrólisis ácidas o básicas dan lugar a un proceso menos controlado con una composición que varía, y algunos aminoácidos pueden incluso ser destruidos en el proceso, por ejemplo Leu, Val y/o Ile. Por lo tanto, se da normalmente preferencia a la hidrólisis enzimática.

Dentro de las enzimas útiles se incluyen, por ejemplo, pepsina, tripsina, quimiotripsina y pancreatina. Se ha comprobado que en particular los productos enzimáticos Alcalase® y Neutrase® de Novo Nordisk A/S resultan apropiados.

Dependiendo de la enzima y del material de partida elegidos se puede llevar a cabo un tratamiento con calor del material de partida disuelto en agua antes de la hidrólisis, lo que da lugar a una apertura de la proteína que puede aumentar el rendimiento y/o reducir el tiempo del tratamiento. Si se lleva a cabo un tratamiento con calor, en el caso de la proteína del suero de la leche resulta normalmente apropiado un tratamiento a una temperatura de aproximadamente 80-90ºC durante 1-3 minutos. Una hidrólisis enzimática con Alcalase® y Neutrase® se lleva a cabo a 30-65ºC, preferentemente a 52-53ºC, pero la temperatura de la hidrólisis depende, por supuesto, de la enzima o enzimas utilizadas.

El grado de hidrólisis se monitoriza mediante la determinación del incremento de la osmolalidad, o determinando nitrógeno-amino, o mediante una titulación con una base. Durante la hidrólisis el pH puede permanecer constante o puede variar, dependiendo de la enzima utilizada. El pH varía normalmente entre 8,5 y 6,0 cuando se utiliza Alcalase®/Neutrase®.

El contenido en proteína no hidrolizada, agregados y componentes grasos de la mezcla de hidrólisis se separa de la mezcla de hidrólisis, por ejemplo por microfiltración, centrifugación, o por un método cromatográfico con el fin de separar los péptidos de la mezcla de hidrólisis original.

Mediante la diafiltración del retenido se obtiene un rendimiento mayor de péptidos en el permeado. Esta etapa del proceso se lleva a cabo en condiciones de alta separación, y se eliminan la mayoría de las sustancias de alto peso molecular de los péptidos (el permeado). Con el fin de eliminar el resto de los componentes de alto peso molecular del permeado, se lleva a cabo una ultrafiltración, o una purificación cromatográfica del permeado. Estas etapas del proceso tienen lugar con un potencial de separación menor que la microfiltración precedente, y se realizan para asegurar la eliminación de todo el material de alto peso molecular de la mezcla de péptidos. Para eliminar el agua y el material de bajo peso molecular que contenga nitrógeno y sales, se separa la mezcla de péptidos mediante nanofiltración o métodos cromatográficos. La mezcla de péptidos resultante se concentra en cuanto a materia seca, y al mismo tiempo se obtiene una reducción en el contenido del material que contiene minerales y nitrógeno.

En la etapa de electrodiálisis la mejor eliminación de minerales se obtiene a un pH de 4-5, en particular de aproximadamente 4,5. La electrodiálisis se monitoriza fácilmente por medición de la conductividad, que se ve reducida en la etapa con la eliminación de minerales. Esta eliminación de minerales resulta significativa en productos para diálisis peritoneal y parenteral y nutrición periférica-parenteral.

Generalmente, el pH y la temperatura se ajustan durante las etapas individuales del proceso para alcanzar las condiciones óptimas del proceso para las enzimas y las separaciones.

Además, las etapas de esterilización se introducen para conseguir la eliminación de bacterias y microorganismos con el fin de obtener un producto final con una calidad bacteriológica muy alta.

El método de acuerdo con la invención presenta grandes ventajas sobre los procesos conocidos. En particular, estas ventajas residen en las etapas de separación, que ofrecen una mayor posibilidad de intervenir en el proceso en el lugar adecuado y de controlarlo y, como resultado, controlar la composición del producto deseado. Además, es un proceso ventajoso económicamente que presenta un rendimiento alto.

Como ya se ha mencionado, se puede llevar a cabo utilizando un equipamiento utilizado habitualmente, v.gr. equipamiento que se utiliza normalmente en el sector lácteo, que no es el caso del método que se conoce a partir de EP 218.900, que emplea aparatos construidos especialmente. Por supuesto esto significa, solamente por esta razón, que el método de acuerdo con la invención, comparado con las técnicas conocidas, resulta más económico de llevar a cabo.

En la patente danesa anterior No. 168.080, véase la página 14, línea 27, se mantiene que la ultrafiltración presenta graves desventajas en cuanto a que no se puede obtener una separación fiable. Mediante el método de acuerdo con la invención, este problema se ha solucionado mediante la utilización de una membrana de ultrafiltración especial (membrana UF) por la cual las moléculas con un peso molecular considerablemente por encima de los 2.000 Daltons sólo aparecen en cantidades mínimas e insignificantes en la mezcla de péptidos producida mediante el método de acuerdo con la invención. Dichas membranas UF se encuentran disponibles comercialmente desde 1984.

Además, en el presente método, como ya se ha mencionado, se utiliza preferentemente un material de partida especial, v.gr. un producto de la proteína del suero de la leche que tiene un 90% de proteína y un contenido bajo tanto en grasa como en lactosa y minerales. El contenido en grasa es normalmente de aproximadamente 0,5%, y el contenido en lactosa es normalmente 0,5%, mientras que el contenido en minerales es 1,6%. Por esta razón, se obtiene más fácilmente un producto lo suficientemente puro para las aplicaciones mencionadas, al ser la grasa, lactosa y minerales productos no deseados. Además, también es muy bajo el contenido en microorganismos.

La invención se explica con más detalle mediante el ejemplo siguiente.

Ejemplo

Se disuelven 20,0 kg de polvo de proteína del suero de la leche en 210 litros de agua desmineralizada. La disolución se trata con calor a 85ºC durante 2 minutos, se enfría a aproximadamente 50ºC, y se transfiere a un tanque de hidrólisis. Se añaden 2,4 L del producto enzimático ALCALASE® 0,2% y 0,5 L de la preparación enzimática NEUTRASE® 0,1%. Las dos enzimas utilizadas las comercializa Novo-Nordisk A/S. Después de la hidrólisis durante 15 horas a aproximadamente 50ºC el aumento de la osmolalidad es 166 mOsm/kg de H_{2}O. El producto se calienta hasta 60ºC, y se microfiltra con una membrana de 0,2 \mum de la compañía Société des Céramique Techniques, Francia. La microfiltración tiene lugar a aproximadamente 60ºC, y la diafiltración se realiza con aproximadamente 200 litros de agua desmineralizada. El flujo medio es aproximadamente 150 l/(m^{2}*hora). El permeado se recoge y se trata con calor a 85ºC durante 3 minutos, y se enfría hasta 50ºC. Posteriormente, el permeado se ultrafiltra a 50ºC en una membrana de ultrafiltración del tipo Desal G50 de la compañía Desalination Systems, Inc., Escondido, California, EEUU. La membrana tiene un punto de corte de 15.000. El flujo medio en la ultrafiltración es 5,8 l/(m^{2}*hora). El permeado se trata con calor a 70ºC durante 2 minutos, y se enfría hasta 60ºC, y después se nanofiltra en una membrana del tipo PCI AFC30 de la compañía PCI Membrane Systems Ltd., Inglaterra, a aproximadamente 60ºC. El flujo medio es 240 l/(m^{2}*hora). El retenido en la nanofiltración se trata con calor a 70ºC durante 2 minutos, y se enfría hasta 5ºC, y después se ajusta a pH 4,5 mediante HCl diluido. El producto se electrodializa a aproximadamente 10ºC y con un voltaje en el área de aproximadamente 50 V, y durante el proceso la corriente se reduce de 6,5 A a 0,5 A. De esta manera, la conductividad disminuye hasta 0,8 mS. Las membranas de electrodiálisis son del tipo NEOSEPTA-AMX y -CMX de la compañía Eurodia, Francia. El retenido de la electrodiálisis se recoge y se trata con calor a 70ºC durante 2 minutos, y se enfría hasta 60ºC, y después se esteriliza por filtración a 60ºC con un filtro del tipo 0,05 \mum de la compañía Société des Céramique Techniques, Francia. El flujo medio es 2.300 l/(m^{2}*hora). El producto recogido, esterilizado por filtración, se seca en una torre de pulverización del tipo Niro Minor de la compañía Niro Atomizer, Dinamarca, y se obtienen 9,0 kg de mezcla de péptidos en forma de polvo.

El producto obtenido se analiza, obteniéndose los resultados siguientes:

pH	4,75
Contenido en proteínas	90,5% en peso (N%*6,38)
Contenido en materia seca	96,8% en peso
Contenido en grasas	<0,02% en peso
Contenido en lactosa	<0,1% en peso
Contenido en cenizas	0,17% en peso
Contenido en fósforo	0,007% en peso
Contenido en sodio	0,012% en peso
Contenido en potasio	0,006% en peso
Contenido en cloruro	<0,05% en peso
Contenido en calcio	0,008% en peso
Contenido en aluminio	<0,5 ppm después de peso
\overline{M_{w}}*	620
\overline{M_{n}}*	410
Peso molecular < 2.000 D*)	99,24
Peso molecular < 1.000 D*)	86,46
Contenido total en microorganismos	<1 por gramo

*) Las determinaciones del peso molecular se realizaron utilizando una bomba de alta presión de Waters (510), un inyector y un detector (214 nm). Las columnas utilizadas fueron 3x TSK G2.000 SWXL series conectadas y operadas a temperatura ambiente. La fase móvil consistió en 0,05 M tampón fosfato/0,5 M disolución de cloruro amónico que contenía 0,1% TFA y 25% de acetonitrilo. Las columnas se calibraron con diferentes estándars de péptidos de diferente peso molecular. Mediante el método de mínimos cuadrados se calculó el polinomio de tercer grado más adecuado. La curva resultante se utilizó como curva de calibración.

La muestra se disolvió en la fase móvil a una concentración de 5 mg/ml. Se inyectaron 20 microlitros de la muestra. Se registró la respuesta del detector frente al volumen de elución. El cromatograma se dividió en segmentos de tiempo (y segmentos de volumen de elución), estando cada segmento caracterizado por el volumen de elución y por el área del cromatograma durante el intervalo de tiempo.

Los pesos moleculares se determinaron después del peso y del número, respectivamente, de acuerdo con las ecuaciones siguientes:

\overline{M_{w}} = \frac{\sum_{i}(A_{i} x M_{w,i})}{\sum_{i}A_{i}}

\hskip1cm

\overline{M_{n}} = \frac{\sum_{i}A_{i}}{\sum_{i}(A_{i}/M_{w,i})}

donde

\overline{M_{w}} es el peso molecular promedio en peso

\overline{M_{n}} es el peso molecular promedio en número

A_{i} es el área del cromatograma para cada segmento, determinada como la respuesta acumulada del detector durante cada intervalo de tiempo. M_{w,i} es el peso molecular correspondiente para cada segmento. El valor se calcula mediante la curva de calibración utilizando el volumen de elución medio durante el intervalo de tiempo.

Análisis de aminoácidos, % en peso:

Tirosina	3,70
Triptófano	1,90
Cistina	2,62
Metionina	2,05
Ácido aspártico	10,9
Treonina	4,53
Serina	3,95
Ácido glutámico	17,1
Prolina	4,43
Glicina	1,70
Alanina	5,69
Valina	5,14
Isoleucina	5,38
Leucina	12,0
Fenilalanina	3,53
Histidina	2,33
Lisina	10,3
Arginina	1,97

Claims

1. Un método para producir una mezcla de péptidos que es muy adecuada para su utilización en diálisis peritoneal y/o nutrición parenteral, y en otras aplicaciones, cuya mezcla tiene un peso molecular de péptidos entre 200 y 2.000 Daltons y un contenido en minerales tan bajo que resulta adecuada para la diálisis peritoneal, por cuyo método una proteína se trata en una disolución acuosa bajo condiciones hidrolizantes, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

e): recoger el retenido de la nanofiltración, posiblemente enfriarlo,

g): opcionalmente, esterilizar por filtración el producto obtenido,

h): después de ello, si se desea, el producto estéril se seca.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para producir una mezcla de péptidos con un contenido en minerales bajo con la siguiente composición:

un contenido en fósforo de 0,01% como máximo,

un contenido en aluminio de 0,5 ppm como máximo,

un contenido en sodio de 0,6% como máximo,

un contenido en cloruro de 0,7% como máximo,

un contenido en potasio de 0,02% como máximo, y

un contenido en magnesio de 0,01% como máximo,

caracterizado porque las condiciones de filtración y otras condiciones se seleccionan de acuerdo con el contenido en minerales deseado.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para producir una mezcla de péptidos con un peso molecular de 400 a 1.500 Daltons, caracterizado porque las condiciones de hidrólisis y filtración así como otras condiciones se seleccionan de acuerdo con el peso molecular deseado.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para producir una mezcla de péptidos con un peso molecular de hasta 1.000 Daltons, caracterizado porque las condiciones de hidrólisis y filtración así como otras condiciones se seleccionan de acuerdo con el peso molecular deseado.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el material proteico utilizado como material de partida es un producto del suero de la leche, en particular un concentrado de proteína del suero de la leche.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la hidrólisis es una hidrólisis enzimática.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque entre las etapas individuales se lleva a cabo, según se considere necesario, tratamiento con calor y/o enfriamiento.