JPH11509727A - ペプチド混合物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、好ましくはホエイをベースとした蛋白質物質の加水分解によって特定の明細を有するペプチド調製物の産業的製法に関する。該方法はいくつかの工程を含み、それは該方法を制御して、例えば、低ミネラル含有量のため腹膜透析および非経口投与によく適した製品を得るのを容易とする。該方法は高収率を与える。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド混合物の製法 本発明は、特に分子量、浸透圧、細菌学およびミネラルの含有量に関して、所 望の特性を有するペプチド混合物の改良された産業上有利な方法に関する。 かかる混合物は、腹膜透析および非経口投与用の、ならびに他の薬理学的およ び浸透圧適用用の剤として、または該剤において使用するのによく適する。 哺乳動物腎臓の正常機能は、一定の酸−塩基バランスおよび電解質バランスを 維持する、および血液からの身体代謝の過剰流体および望ましくない生成物を除 去する活性を含む。腎臓病を持つ個体において、腎臓のこの機能は正常レベルの ５％以下と低くまで低下し得る。腎臓機能がかなり低下すると、生命を維持する ならば、人工的手段を使用して腎臓を置き換えなければならない。これは、臨床 的には透析の使用によって達成される。これを達成するための最も通常の方法の うちの１つは血液透析であり、そこでは、患者の血液を人工腎臓透析器に通す。 この透析器では、合成の半透膜が人工腎臓として働き、患者の血液はそれと一方 側で接触し、半透膜の反対側には透析用流体または透析液があり、その組成は患 者の血液中の望まない生成物が拡散によって膜を自然に通過して流体に入るよう なものである。かくして、血液は実質的に腎臓が行うと同様に浄化され、血液は 患者の身体に戻される。この透析方法は患者を透析器に数時間、しばしば１週間 当たり数回物理的に「つなぎ止める」ことを必要とする。効果的ではあるが、こ の方法は明らかな理由で多数の不便を呈する。 血液の体外処理に必要な血液透析に伴う不利のいくつかは、必要な半透膜とし て患者自身の腹膜を利用する技術の使用によって克服される。腹膜は非常に多数 の血管および毛細血管を含有し、かくして、天然半透膜として作用できる膜ライ ニングである。透析溶液は腹壁中、カテーテルを介して腹腔に導入される。透析 液についての適当な滞留時間は、透析液と血液の間で溶質を交換させる。流体の 除去は、血液から透析液に適当な浸透圧勾配を供して、血液からの水流出を可能 とすることによって達成される。かくして、正しい酸−塩基バランス、電解質バ ランス、および流体バランスが血液に付与されて、望まない生成物が血液から除 去される。透析が完了した後、透析溶液はカテーテルを通して身体腹腔からかな り簡単に排出される。１を超えるタイプの腹腔透析があるが、連続外来腹腔透析 （ＣＡＰＤ）として知られる技術は特に好都合であり、というのは、溶質および 流体の置換の持続の間に患者が装置に繋がれたままであることを要しないからで ある。唯一の必要な着座期間は透析溶液の注入および排出の間である。 腹腔透析で使用する剤の組成に関してはかなり特定的な要件がある。これらの 要件はさらに患者間で変化する。剤はもちろん非毒性であることが必要である。 加えて、それらは、分子サイズ、導電率ならびに塩およびミネラルの含有量に関 して正しい明細を有しなければならない。 必要な浸透圧勾配の達成に関して現在達成された最も広い許容性を有する剤は グルコースである。グルコースは、非毒性であり、もし血液に侵入すれば容易に 代謝されるという利点を有する。しかしながら、その使用に関する主要な問題は 、透析液から血液に容易に取られるということである。いずれの物質も結局は血 液循環に入るものであるが、グルコースは腹膜を余りにも迅速に通過して、浸透 圧勾配は注入の２−３時間以内で破壊される。これは、限外濾過の方向の逆行を 引き起こし、望まない結果を引き起こし、すなわち、水は透析処理の終わりに向 けて透析液から再吸収される。さらに、取られるグルコースの量は、患者のエネ ルギー摂取の大きな割合を表し、恐らくは、１２−３５％より高い。これは非糖 尿病患者にかなり影響するというのではないが、そのグルコーストレランスが既 に損なわれている患者に対してひどい代謝負荷となり得る。この付加された負荷 は高血糖症および肥満に関与し得、これは、多数のＣＡＰＤ患者で観察されてい る。増大したグルコース付加に起因する高血糖症の危険を低下させるために、糖 尿病患者は腹腔透析液にインスリンを添加しなければならないというさらなる不 便および危険を蒙る。 グルコースを含有する透析流体は、腹膜中の蛋白質の非酵素的グリコシル化の ため腹膜の濾過効率を低下させ得る。この関係で、James W．Dobbie「New Conce pts in Molecular Biology and Ultrastructural Pathology of the Peritoneum : Their Significance for Peritoneal Dialysis」in American Journal of Kid ney Diseases Vol．XV，No．2，1990年2月，97-109頁を引用する。 また、グルコースの使用は、透析液の調製においても問題を呈する。透析液の 滅菌は、典型的には、加熱によって達成され、加熱は生理学的ｐＨ値において、 グルコースのカラメル化を引き起こす。これを補うために、透析液のｐＨ値は通 常５.０ないし５.５に調整される。この低ｐＨ値（身体につき正常であるものよ りもこれまで低かった）は、流入に際していくらかの患者によって経験された苦 痛の原因となりかねず、腹膜の硬化症を引き起こし得るもので、これは溶質平衡 または除去の減少を引き起こすであろう(Schmidtら，Arch．Int．med．141: 126 5-1266，1980)。 これらの不利が、高度に望ましい浸透圧剤としてのグルコースに対する適当な 代替物の発見をなさしめた。多数の物質が、生理学的に不活性で、腹膜を容易に は通過せず、非毒性で、かつ適当な浸透圧を発揮する基準に適合するとして提案 されてきた。多数の提案されている物質はグルコースの代替物に適しないことが 判明している。例えば、デキストラン(Gjessing，Acta Med．Scan.，185:237-23 9，1960)またはポリアニオン(米国特許第４３３９４３３号明細書)の使用がそれ らの高分子量のため提案されている。これらで、腹膜を通っての血液へのそれら の核酸の低下が達成される。しかしながら、溶質輸送のプロセスにおけるリンパ 系の役割は自体高分子量の利点を明らかに制限する(Allenら，Amer．J．Physiol .，119: 776-782，1937)。また、ポリアニオンに関しては、それらの毒性作用が どのようにものか明らかではなく、というのは、それらのほとんどは代謝可能で はないからである。代謝に関する同様の問題が、ソルビトール、キシリトールお よびグルコースポリマーのごとき化合物で観察される。非常にゆっくりと代謝さ れるソルビトールは高浸透圧性昏睡および死亡の例に関連付けられ(Rajaら，Ann ．Int．Med.，73: 993-994，1970)、もはや使用されていない。また、キシリト ールおよびグルコース両ポリマーは血液に蓄積する傾向にあり、不愉快な副作用 に関係し得る(Bazayatoら，Trans Amer．Soc．Artif．Interm．Organs，28: 280 -286，1982)。その浸透圧性能でグルコースに匹敵するフルクトースは、同一不 利の多くを呈する。この高価格のため、決して広い使用を達成しなかった。 より有望なのは、グルコースを置き換えるための酸の提案されている使用であ る。アミノ酸はよく許容されており、知られている不利な副作用はない(Orenら ， Perit．Dial．Bull，3: 66-72)。それらの低分子量のため、それらはグルコース よりも質量に基づいてより高い浸透圧効果を発揮する。しかしながら、この結果 、恐らくは血液へのより迅速な摂取となり、浸透圧勾配の迅速な喪失を引き起こ す。アミノ酸摂取は、グルコース摂取とは異なり、多くのＣＡＰＤ患者で観察さ れる蛋白質喪失を補い得る点で有利であろうが、グルコースと比較して場合にア ミノ酸溶液のほとんどの禁制価格の点でかなりの不利がある。さらに、アミノ酸 のより迅速な摂取の結果かなりの窒素負荷となり、これは血液尿窒素レベルをか なり増加させる。かくして、アミノ酸でさえ適当な代替物を供しないことが観察 される。 腹膜透析の方法における改良がＤＫ１６８ ０８０に開示された発明によって 達成されており、これを後記にてより詳細に記載する。ここに、グルコースに対 する安全で有利な代替物であるばかりか、使用が経済的である浸透圧剤を使用す る。ホエイ蛋白質のごとき高品質蛋白質の酵素加水分解から得られる比較的低分 子量オリゴペプチドの混合物（３００−２０００ダルトン）を、腹膜透析溶液に おいて効果的な浸透圧剤として使用することができる。アミノ酸溶液との比較に おいて、いくぶん高い分子量のペプチドは血液への迅速な摂取を妨げ、浸透圧勾 配のより効果的な維持、ならびに血液における窒素の望まない増加の防止を可能 とする。非常にゆっくりではあるが、結局は血清に吸収されるペプチド混合物は 、さらに、価値ある規定食補充物を供し、ペプチド混合物は高品質蛋白質に由来 する。最後に、この発明のペプチド混合物は低コストが容易に接近できる浸透圧 剤源を提供する。 約５０００ダルトンを超える分子量を有するペプチドはアレルギーの問題を生 じる可能性があり、これは身体に導入される製品では特に許容されない。 この種のペプチド混合物は、さらに、腹膜透析として使用するのに適したいず れの浸透圧バランス水溶液とも組み合わせることができる。有用な透析液は、こ の目的に効果的に浸透圧をバランスさせるためには、水および望まない代謝産物 の腹膜を横切っての拡散を引き起こすのに十分な濃度の電解質を含有しなければ ならない。要件は個体間で変化し得るので、標準的な透析溶液はない。通常の溶 液は、例えば、特定量のナトリウム、塩化物、乳酸塩、マグネシウムおよびカル シウムを含有するであろう。典型的な透析液の含有量は、浸透剤の量の特定なく して、以下のリストから得られる。グルコース溶液では、グルコース一水和物は 、典型的には、１.５ないし４.２５％の量で添加する。これは可能な溶液の丁度 一例を表し、パターンの変形は当業者に明らかであろう。透析液におけるペプチ ド混合物の割合は変化し得るが、通常は、透析溶液の約１ないし約１５重量％の 範囲にある。いずれにせよ、使用するペプチドの量は支持電解質と一緒になって 約３００ないし約５００ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧を付与するのに十分でなければな らない（正常な血清浸透圧は２８０ｍＯｓｍ／ｌ）である。溶解液の投与は腹膜 透析で通常なされるようにして達成される。腹膜透析の例示的態様は「Peritonea l Dialysis」、K．Nolph編，Martinus Nighoff Publishers，1981に記載されてい る。個々の患者に必要な特別の処理は患者の医師によって容易に決定される。 典型的な腹腔透析溶液の成分は以下の通りである（ｍｅｑ／ｌ単位）： ナトリウム １３２.０ カルシウム ３.５ マグネシウム ０.５ 塩化物 ９６.０ 乳酸塩アニオン ４０.０ 国際出願ＷＯ８７／０１２８６および対応するＥＰ特許第２７０５４５号明細 書、米国特許第４９０６６１６号明細書、およびデンマーク特許第１６５７３４ 号明細書から、乳製品の酵素的加水分解によって透析流体を生じることが知られ ている。これらのうち、ホエイ画分に言及されているが、それはかなり不明確な 化学組成を有し、除去するのが困難な多数の残存蛋白質を含有するという欠点を 有し、これは、加水分解が再現性がなく、加水分解生成物が汚染するという傾向 を含むと述べられている。その結果、β−ラクトグロブリンおよびα−ラクトア ルブミン、特にカゼイン画分の使用が好ましい。酵素加水分解はカゼイン酸ナト リウムの水溶液で行う。加水分解の後、細菌フィルターを通して濾過を行し、生 成物を所望の浸透圧に調整し、ｐＨを塩の添加によって調整する。 しかしながら、カゼインは、腎臓病に罹った患者に適しない高リン含有量のた め適当でない。 ＥＰ特許第２１８９００号明細書および対応するデンマーク特許第１６８６９ ２号および第１６８０８０号明細書および米国特許第５０３９６０９号より、前 記したごとく、約３００ないし約２０００ダルトンの分子量を有するペプチドの 混合物が知られており、この混合物は腹膜透析に関連する浸透圧活性剤として使 用するのによく適する。同文献は、酵素加水分解、続いての透析および逆浸透圧 によって高品質蛋白質からの混合物を製造する方法を開示する。蛋白質として、 例えば、ホエイ蛋白質が使用される。該方法はかなり面倒で、非常に特別な装置 を必要とし、組成を変化させることができない。これは特に低分子量Ｎ−含有物 質、ラクトースおよびミネラル、特にアルブミンに重要である。というのは、こ の方法によっては、これらの成分がいったん透析液に含まれれば除去することが できないからである。 さらに、ＷＯ９４／１４４６８はペプチドおよびグルコースを含有する透析溶 液を開示する。該文献は、かかるペプチドを生産する何らの特別な方法も開示し ない。 米国特許第４４２７６５８号は、栄養目的に特によく適したホエイ蛋白質の加 水分解物を開示している。それは十分に加水分解され、その結果、高含有量の遊 離アミノ酸を有する。１５％より多量の遊離アミノ酸があり得る。これは一般に 望ましくなく、推奨される濃度が５％未満である場合は透析に対して特に劣質で ある。加水分解物は蛋白質分解酵素、パンクレアチンでの加水分解によって生成 され、加水分解は１２％トリクロロ酢酸で沈殿性窒素がなくなるまで継続する。 国際出願ＷＯ ９２／２１２４８は、出発物質として、固形分として計算して 少なくとも６５％の蛋白質含有量を有するホエイ蛋白質生成物を用い、非ｐＨ安 定加水分解、続いて限外濾過／マイクロ濾過と組合せることによって、栄養目的 でホエイ蛋白質加水分解物の製造方法に関する。該方法は、良好な味覚で官能的 に許容される生成物を高収率で提供する。しかしながら、該生成物は透析製品の ためには余りにも高いミネラル含有量を有する。 しかして、必要に応じて適当な分子量および適当な窒素およびミネラル含有量 を有する透析、非経口投与および他の目的によく適したペプチド調製物を製造で きることが判明した。これは、調製物の組成を容易かつ経済的に制御できる特に 有利な方法によって達成される。該方法は容易に利用可能な装置によって行うこ とができる。 腹膜透析および／または非経口投与で使用するのにおよび他の目的によく適し たペプチド混合物（この混合物は２００−２０００ダルトンのペプチド分子量お よび低ミネラル含有量を有する）を製造する本発明の方法は、それにより、加水 分解条件下で蛋白質を水溶液中で処理するものであり、以下の工程： ａ）８％蛋白質溶液中で測定して、１２０−２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ₂Ｏの範 囲の浸透圧増加が達成されるまで加水分解し、 ｂ）マイクロ濾過し、遠心しまたはクロマトグラフィーで分離して、それによ り望まない高分子量物質を除去し、 ｃ）工程（ｂ）からの透過物を限外濾過し、あるいはクロマトグラフィー法に よってそれを処理して、所望のペプチドを単離し、 ｄ）工程（ｃ）からの透過物をナノ濾過し、またはクロマトグラフィー法によ ってそれを処理し、 ｅ）ナノ濾過からの保持物を収集し、可能ならばそれを冷却し、 ｆ）ｐＨを電気透析に最適の値に予め調整した後、工程（ｅ）からの保持物を 電気透析し、 ｇ）得られた生成物を所望により滅菌濾過し、 ｈ）しかる後に滅菌生成物を所望により乾燥する を有してなることを特徴とする。 本発明のこの方法によると、２００ないし２０００ダルトン、特に４００ない し１５００ダルトン、特に１０００ダルトン未満の分子量を有するペプチド混合 物を製造することができ、これは透析成分に望ましい。本発明の方法によると、 極端に低いミネラル含有量、 最大０.０１％のリン含有量、 最大０.５ｐｐｍのアルミニウム含有量、 最大０.６％のナトリウム含有量、 最大０.７％の塩化物含有量、 最大０.０２％のカリウム含有量、および 最大０.０１％のマグネシウム含有量 を有するペプチド混合物を製造することもできる。 ホエイ蛋白質はよく適した蛋白質出発物質である。これは特にホエイ蛋白質濃 縮物がよい。特に好ましいホエイ蛋白質濃縮物は商標ＢＩＰＲＯＲ下で販売され ている製品である。それは９０％の蛋白質を含有し、非常に少量の脂質、ラクト ースおよびミネラルを含有する。栄養様のホエイ蛋白質は、大豆単離物およびカ ゼインよりも高い値、例えば、より高いＴＤ（真の消化性）、ＢＶ（生物学的値 ）、ＮＰＵ（正味の蛋白質利用）、およびＰＥＲ（蛋白質効果比）、同一サイズ の全卵（卵白＋卵黄）の値を有する。 本発明の方法によって生産されたペプチド混合物におけるペプチドのほぼ５０ ％が必須アミノ酸よりなる。結果として、このペプチド混合物は、炭水化物、脂 質、ビタミン類、ミネラル類等の適当な混合によって、非経口および末梢非経口 投与にもよく適する。この関係で、Encyclopedoa of Food Science，Food Techn ology and Nutrition，3420-3422頁，「Parenteral Nutrition」、およびEssentia ls of Nutrition and Diet Therapy，1994，Mosby; 第18章; Feeding Methods: 「 Enteral and Farenteral Nutririon」を引用する。 しかしながら、例えばカゼインおよび大豆蛋白質のごとき他の蛋白質出発物質 を使用することもできるが、前記したごとく、それらはホエイ出発物質ほどは有 利ではない。 原理的には、酸または塩基加水分解を使用できるが、酵素加水分解によって良 好な収率が得られる。酸または塩基加水分解は、さらに、組成を変化させるより 未制御のプロセスを与え、該プロセスによっていくつかのアミノ酸、例えばＬｅ ｕ、Ｖａｌおよび／またはＩｌｅが破壊され得る。結果として、酵素加水分解が 通常は選択される。 有用な酵素は、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよびパンク レアチンを含む。特に、Novo Nordisk A/Sからの酵素製品アルカラーゼ（Alcala se^R）およびニュートラーゼ(Neutrase^R)はよく適合することが判明した。 酵素選択および出発物質に依存して、加水分解に先立って、水に溶解させた出 発物質の加熱処理を行うことができ、これは収率を増加させおよび／または処理 時間を低下させる。もし加熱処理を行うならば、１−３分間の温度約８０−９０ ℃での処理がホエイ蛋白質の場合に通常適当であろう。アルカラーゼ（Alcalase^R ）およびニュートラーゼ(Neutrase^R)での酵素加水分解は３０−６５℃、好まし くは５２−５３℃で行うが、加水分解温度は使用する酵素または酵素類に依存す る。 加水分解の程度は、浸透圧増加を測定することによって、あるいはアミノ窒素 を測定することによって、あるいは塩基での滴定によってモニターする。加水分 解の間、使用する酵素に応じて、ｐＨは一定であるか、あるいは変化させること ができる。かくしてｐＨはアルカラーゼ（Alcalase^R）／ニュートラーゼ(Neutra se^R)を使用する場合は、通常、８.５および６.０の間である。 非加水分解蛋白質の加水分解混合物、凝集体および脂質成分の含有物は、例え ば、マイクロ濾過、遠心、またはクロマトグラフィー法によって加水分解混合物 から分離して、ペプチドを元の加水分解混合物から分離する。 保持物の透析濾過によって、透過物におけるペプチドの増大した収率が得られ る。この製法工程は高分離性能下で行い、高分子量物質の大部分はペプチド（透 過物）から除去される。透過物から高分子量成分の残りを除去するには、限外濾 過を行うか、あるいは透過物のクロマトグラフィー精製を行う。これらの製法工 程は、前記マイクロ濾過よりもかなり低い分離性能下で行い、全ての高分子量物 質のペプチド混合物からの除去を確実とする。水ならびに低分子量窒素含有物質 および塩の除去には、ナノ濾過またはクロマトグラフィー法によってペプチド混 合物を分離する。得られたペプチド混合物は、ここに、乾燥分に関しては上昇濃 縮されており、同時に、ミネラルおよび窒素含有物質の含有量の低下が達成され た。 電気透析工程においては、ｐＨ４−５、特に約４.５で最良のミネラル除去が 達成される。電気透析は導電率を測定することによって容易にモニターされ、こ れは、ミネラル除去工程で低下する。ミネラルのかかる除去は、腹膜透析および 非経口および末梢−非経口投与用の製品で重要である。 一般に、ｐＨおよび温度を個々の製造工程で調整して酵素および分離のための 最適製法条件を達成する。 さらに、細菌および微生物の除去のために滅菌工程を導入して、非常に高い細 菌学的性質の最終産物が得られる。 本発明の製法は公知技術よりも優れた大きな利点を有する。特に、これらの利 点は、分割された工程に存在し、これは、正しい地点にてプロセスで介在し、そ れをおよび、結果として所望の生成物の組成を制御する改良された可能性を供す る。さらに、それは高収率を与える経済的に有利な製法である。 前記したごとく、それは、通常に使用される装置、すなわち、酪農地帯内で使 用される装置で行うことができ、これは、特別に製作された装置を使用するＥＰ ２１８９００から公知の方法に関しては当てはまらない。勿論、これは、公知の 技術と比較して、本発明の方法は、この理由だけでもより経済的に行える。 前記デンマーク特許第１６８０８０号において（第１４頁、２７ｆｆ行参照） 、信頼できる分離が得られない点で、透析濾過にひどい不利が伴うことが維持さ れている。本発明の方法により、特別の限外濾過膜（ＵＦ−膜）を用いることに よってこの問題は解決され、それにより、２０００ダルトンをかなり超える分子 量を有する分子は、本発明の方法によって製造されたペプチド混合物に最小かつ 有意でない量で生じる。かかるＵＦ−膜は１９８４年以来商業的に入手できる。 さらに、本発明においては、前記したごとく、特別の出発物質、すなわち、９ ０％と大量の蛋白質および非常に低含有量の脂質およびラクトースおよびミネラ ルを有するホエイ蛋白質製品を使用する。脂質の含有量は、典型的には、約０. ５％であり、ラクトースの含有量は、典型的には、０.５％であり、他方、ミネ ラル含有量は１.６％である。それにより、十分に純粋な製品が容易に得られ、 というのは、脂質、ラクトースおよびミネラルは前記適用で望ましくないからで ある。さらに、微生物含有量は非常に低い。 以下の実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。 実施例 ２０.０ｋｇのホエイ蛋白質単離体粉末を２１０リットルの脱ミネラル水に溶 解させる。溶液を８５℃で２分間加熱処理し、約５０℃まで冷却し、加水分解タ ンクに移す。０.２％の酵素製品アルカラーゼＲ−２.４Ｌおよび０.１％の酵素 製剤ニュートラーゼＲ−０.５Ｌを添加する。使用する両酵素はNovo-Nordisk A/ sから市販されている。約５０℃での１５時間の加水分解の後、浸透圧増加は１ ６６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ₂Ｏである。生成物を６０℃まで加熱し、しかる後、仏 国の会社Societe des Ceramique Techniquesからの０.２μｍ膜でマイクロ濾過 する。マイクロ濾過は約６０℃で行い、透析濾過は約２００リットルの脱ミネラ ル水で行う。平均フラックスは約１５０ｌ／（ｍ²＊時間）である。透過物を収 集し、８５℃で３分間加熱処理し、５０℃まで冷却する。しかる後、透過物を、 米国カリフォルニア州Escondidoの会社Desalination Systems，Inc.からのタイ プＤｅｓａｌ Ｇ５０の限外濾過膜で５０℃にて限外濾過する。該膜は１５００ ０のカットオフを有する。限外濾過での平均フラックスは５.８ ｌ／（ｍ²＊時 間）である。透過物を７０℃で２分間加熱処理し、６０℃まで冷却し、しかる後 、それを、約６０℃にて、英国の会社ＰＣＩ Membrane Systems，Inc.からのタ イプＰＣＩ ＡＦＣ３０の膜でナノ濾過する。平均フラックスは２４０ ｌ／（ ｍ²＊時間）である。ナノ濾過保持物を７０℃で２分間加熱処理し、５℃まで冷 却し、しかる後、希塩酸によってｐＨ４.５まで調整する。約１０℃および５０ Ｖ程度の領域における電圧にて生成物を電気透析し、該プロセスの間、電流は６ .５Ａから０.５Ａまで低下する。導電率はここに０.８ｍＳまで低下する。電気 透析膜は仏国の会社EurodiaからのタイプＮＥＯＳＥＰＴＡ−ＡＭＸおよび−Ｃ ＭＸのものである。しかる後、電気透析保持物を収集は、７０℃で２分間加熱処 理し、６０℃まで冷却し、しかる後、それを、６０℃にて、仏国の会社Societe des Ceramique Techniquesからのタイプ０.０５μｍフィルターのフィルターで 滅菌濾過する。平均フラックスは２３００ ｌ／（ｍ²＊時間）である。収集し た滅菌生成物をデンマーク国の会社Niro AtomizerからのタイプＮｉｒｏ Ｍｉ ｎｏｒのスプレイタワーで乾燥し、粉末形態の９.０ｋｇのペプチド混合物が得 られる。 得られた生成物を分析し、以下の結果が得られる。 ｐＨ ４.７５ 蛋白質含有量 ９０.５重量％（Ｎ％＊６.３８） 乾燥分含有量 ９６.８重量％ 脂質含有量 ＜０.０２重量％ ラクトース含有量 ＜０.１重量％ 灰分含有量 ０.１７重量％ リン含有量 ０.００７重量％ ナトリウム含有量 ０.０１２重量％ カリウム含有量 ０.００６重量％ 塩化物含有量 ＜０.０５重量％ カルシウム含有量 ０.００８重量％ アルミニウム含有量 ＜重量後０.５ｐｐｍ Ｍ_w＊） ６２０ Ｍ_n＊） ４１０ 分子量＜２０００Ｄ＊） ９９.２４ 分子量＜１０００Ｄ＊） ８６.４６ 合計微生物含有量 ＜グラム当たり１ ＊）分子量の測定は、Waters高圧ポンプ（５１０）、インジェクターおよびデ ィテクター（２１４ｎｍ）を用いて行った。使用したカラムは連結した３×ＴＳ ＫＧ２０００ ＳＷＸＬシリーズであり、雰囲気温度で作動させた。移動相は０ .０５Ｍリン酸緩衝液／０.５Ｍ塩化アンモニウム緩衝液（０.１％ＴＦＡおよび ２５％アセトニトリル含有）よりなるものであった。カラムを、異なる分子量を 含有するいくつかのペプチド標準で平衡化させた。最小二乗法によって、最適第 ３多項値(polynomium)を計算した。得られた曲線を較正曲線として使用した。 試料を移動相に５ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解させた。２０マイクロリットルの 試料を注射した。ディテクター応答−対−溶出容量を記録した。クロマトグラム を時間セグメント（および溶出容量セグメント）に分割し、各セグメントは溶出 容量および時間間隔にわたってのクロマトグラムの面積によって特徴付けられる 。 各々、重量および数分子量は以下の式により求めた。 ここに、Ｍ_wは重量平均分子量であり、Ｍ_nは数平均分子量であり、Ａ_iは、各 時間間隔にわたっての累積ディテクター応答として計算された、各セグメントに ついてのクロマトグラムの面積である。Ｍ_w，ｉは各セグメントについての対応 する分子量である。その値は時間間隔にわたっての平均溶出容量を使用する較正 曲線によって計算される。 アミノ酸分析、重量％ チロシン ３.７０ トリプトファン １.９０ シスチン ２.６２ メチオニン ２.０５ アスパラギン酸 １０.９ スレオニン ４.５３ セリン ３.９５ グルタミン酸 １７.１ プロリン ４.４３ グリシン １.７０ アラニン ５.６９ バリン ５.１４ イソロイシン ５.３８ ロイシン １２.０ フェニルアラニン ３.５３ ヒスチジン ２.３３ リシン １０.３ アルギニン １.９７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アルベルツェン，クリスチャン デンマーク国 ＤＫ−6920 ヴィデバーク ボグリヴェイ 16 (72)発明者 ペデルセン，ベント イー デンマーク国 ＤＫ−9670 ログストル イスラントヴェイ ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 以下の工程： ａ）８％蛋白質溶液中で測定して、１２０−２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ₂Ｏの 範囲の浸透圧増加が達成されるまで加水分解し、 ｂ）マイクロ濾過し、遠心しまたはクロマトグラフィーで分離して、それによ り望まない高分子量物質を除去し、 ｃ）工程（ｂ）からの透過物を限外濾過し、あるいはクロマトグラフィー法に よってそれを処理して、所望のペプチドを単離し、 ｄ）工程（ｃ）からの透過物をナノ濾過し、またはクロマトグラフィー法によ ってそれを処理し、 ｅ）ナノ濾過からの保持物を収集し、可能ならばそれを冷却し、 ｆ）ｐＨを電気透析に最適の値に予め調整した後、工程（ｅ）からの保持物を 電気透析し、 ｇ）得られた生成物を所望により滅菌濾過し、 ｈ）しかる後に滅菌生成物を所望により乾燥する を有してなることを特徴とする腹膜透析および／または非経口投与で使用するの におよび他の目的によく適したペプチド混合物であって２００および２０００ダ ルトンの間のペプチド分子量および低ミネラル含有量を有するペプチド混合物の 製法。 ２． 濾過条件および他の条件が所望のミネラル含有量に応じて選択されること を特徴とする、以下の組成： 最大０.０１％のリン含有量、 最大０.５ｐｐｍのアルミニウム含有量、 最大０.６％のナトリウム含有量、 最大０.７％の塩化物含有量、 最大０.０２％のカリウム含有量、および 最大０.０１％のマグネシウム含有量 を持つ低ミネラル含有量を有するペプチド混合物を製造する請求項１記載の製法 。 ３． 加水分解および濾過条件ならびに他の条件が所望の分子量に応じて選択さ れることを特徴とする４００ないし１５００ダルトンの分子量を有するペプチド 混合物を製造する請求項１記載の製法。 ４． 加水分解および濾過条件ならびに他の条件が所望の分子量に応じて選択さ れることを特徴とする１０００ダルトンまでの分子量を有するペプチド混合物を 製造する請求項１記載の製法。 ５． 出発物質として使用される蛋白質物質がホエイ製品、特にホエイ蛋白質濃 縮物であることを特徴とする請求項１記載の製法。 ６． 出発物質として使用する蛋白質物質が商標ＢＩＰＲＯＲ下で販売されるタ イプのホエイ蛋白質単離体、または対応する製品であることを特徴とする請求項 ５記載の製法。 ７． 加水分解が酵素的加水分解であることを特徴とする請求項１記載の製法。 ８． 酵素的加水分解をアルカラーゼ(Alcalase^R)およびニュートラーゼ(Neutra se^R)、または対応する酵素製品で行うことを特徴とする請求項８記載の製法。 ９． 個々の工程の間において、加熱処理および／または冷却を必要に応じて行 うことを特徴とする請求項１記載の製法。