ES2306004T3 - Un preparado que contiene hialuronidasa y su uso farmaceutico. - Google Patents

Abstract

Preparado, que se puede obtener mediante un procedimiento, que contiene hialuronidasa, en el que los testículos de mamíferos, en especial los de los toros, se trituran hasta hacer una papilla, con lo cual se disuelven en el ácido las proteínas y encimas de la papilla que forman un eluato, con lo cual el eluato sufre una precipitación de sulfato de amonio fraccionado y de esta forma se obtiene una fracción de precipitación de hialuronidasa, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa se somete a una diálisis para la separación de sulfato de amonio, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa dializada es sometida a efectos de limpieza a una fase de proceso de absorción o desorción de hidrato de óxido de aluminio, con lo cual se prepara de forma galénica la fracción limpiada de precipitado de hialuronidasa, donde la precipitación de sulfato de amonio fraccionada se lleva a cabo en una primera fase de precipitación en una solución de sulfato de amonio acuoso al 10-29 peso% y en una segunda fase de precipitación en una solución de sulfato de amonio acuoso al 15-65 peso-% y donde la fracción de hialuronidasa limpiada se somete antes de la preparación galénica a una filtración con un límite de exclusión de 5.000 a 30.000 dalton.

Description

Un preparado que contiene hialuronidasa y su uso farmacéutico.

La invención se refiere a un preparado que se puede obtener mediante un procedimiento que contiene hialuronidasa, en el que los testículos de mamíferos, en especial los de los toros, se trituran hasta hacer una papilla, con lo cual se disuelven en el ácido las proteínas y encimas de la papilla que forman un eluato, con lo cual el eluato sufre una precipitación de sulfato de amonio fraccionado y de esta forma se obtiene una fracción de precipitación de hialuronidasa, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa se somete a una diálisis para la separación de sulfato de amonio, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa dializada es sometida a efectos de limpieza a una fase de proceso de absorción o desorción de hidrato de óxido de aluminio, con lo cual se prepara de forma galénica la fracción limpiada de precipitado de hialuronidasa, así como las aplicaciones del preparado con el contenido de hialuronidasa así fabricado. Como hialuronidasa se designa a un grupo de encimas que inducen la disociación de ácido hialurónico. El ácido hialurónico está compuesto de forma lineal de ácido glucónico alternante y de restos de N-acetilglucosamina y presenta un peso molecular de menos de 20.000 hasta más de 1.000.000. El ácido hialurónico forma, especialmente en un organismo, un componente principal de determinados proteoglúcidos de alto peso molecular, que se hallan, entre otros, en los tejidos de la piel, de los cartílagos y de los tejidos conjuntivos. En este tipo de proteoglúcidos, como por ejemplo el sulfato de condroitina 4/6 y el sulfato de mucotina, o bien el sulfato de dermatano, el ácido hialurónico forma una unidad fundamental compuesta central, pero, sin embargo, no covalente con la proteína. Las hialuronidasas hacen los tejidos permeables a las substancias extrañas por medio de la disociación de los proteoglúcidos. Se hallan principalmente en el acrosoma de esperma y su efecto de disociación de proteoglúcidos permite finalmente a las células del esperma la fusión natural con un óvulo. Por eso son idóneos principalmente en los testículos del esperma, contenido en todos los tipos de animales para la obtención de hialuronidasas en cantidades económicamente rentables. Especialmente útiles son los testículos de grandes reses de matanza. En una precipitación de proteínas se precipitan proteínas disueltas y/o encimas por medio de una reacción con el medio de precipitación. En una precipitación fraccionada se aprovecha el hecho de que diversas proteínas y/o encimas presentan una afinidad diferente respecto del medio de precipitación. En ese caso no se precipitan o se disocian normalmente las proteínas y/o las encimas deseadas en una primera fase de precipitación, en una segunda fase de precipitación y entonces a partir de la solución restante se precipitan las proteínas y/o encimas deseadas y la fracción de precipitación así obtenida continúa procesándose. En esencia, en la precipitación fraccionada, la relación de las cantidades de medio de precipitación empleadas en las fases de precipitación correspondientes está referida al material de partida correspondiente, o bien a la cantidad de material empleado. Esta relación se realiza normalmente por medio de la concentración de medio de precipitación de la solución que contiene las proteínas y/o las encimas. Si, por ejemplo, se trabaja en la primera fase de precipitación con una concentración de medio de precipitación alta, se perderán y disociarán también las proteínas y/o las encimas deseadas. Si, por el contrario, se trabaja en la primera fase de precipitación con una concentración de medio de precipitación demasiado pequeña, permanecerán de forma perjudicial muchas proteínas y/o encimas no deseadas en la solución. Lo mismo se puede decir de la segunda fase de precipitación en la que las proteínas y/o la encimas deseadas han de ser precipitadas. El término diálisis designa la separación de moléculas disueltas en función de su tamaño, como consecuencia de la difusión o de la retención por medio de una membrana semipermeable. La diálisis se emplea principalmente para la disociación de substancias de alto peso molecular como las proteínas y las encimas, de bajo peso molecular como las sales, los monosacáridos, aminoácidos, etc. En el caso de una limpieza por medio de absorción y desorción se trata de un método de enriquecimiento que aprovecha las diversas propiedades de absorción en un absorbente. Por medio de la elección del absorbente así como del ajuste de determinadas condiciones de absorción se da preferencia a la absorción de determinadas substancias de destino y/o a la desorción produciéndose de esta forma un enriquecimiento, mientras que las substancias no deseadas, o bien no se absorben y se disocian con la fase líquida y/o no se desorben y se disocian con la fase sólida. La expresión preparación galénica se refiere al procesamiento de una substancia convirtiéndola en un preparado que se puede suministrar a un organismo directamente o después de su disolución, por ejemplo, en una solución fisiológica de cloruro sódico, sin que se produzcan problemas de tolerancia condicionados por su forma de suministro.

Se conoce por la práctica la forma de limpiar hialuronidasas por medio de la precipitación de metal pesado. Este modo de procedimiento requiere en cualquier caso la separación muy cuidadosa de todos los iones de metales pesados del preparado obtenido debido a su toxicidad. Se sabe además por la práctica la forma de obtener hialuronidasas mediante la precipitación fraccionada de etanol. Con ello no se pueden obtener sin más preparados libres de pirógeno. Después de todo se conoce la limpieza por medio de diferentes absorbentes, por ejemplo, carbón activo, fosfato cálcico o hidróxido de aluminio. Sin embargo, con ello no se consigue el beneficio que es posible alcanzar.

Es conocido un procedimiento del tipo citado al principio de la bibliografía DD-PS-24229. Dentro del marco del procedimiento conocido hasta aquí, se trabaja a continuación una precipitación de sulfato de amonio con dos fases de procedimiento de absorción y desorción con hidrato de óxido de aluminio, empleando diferentes sistemas intermedios. En el marco de la precipitación de sulfato de amonio se trabaja en la primera fase de precipitación con una concentración de sulfato de amonio al 30% y en la segunda fase de precipitación con una concentración de sulfato de amonio del 70%. Con ello se obtiene un preparado libre de pirógeno con un rendimiento no satisfactorio, además, el coste es desagradablemente alto.

Por otro lado, el invento presenta el problema técnico de precisar de un preparado que contenga hialuronidasas, el cual se ha de realizar con una buena rentabilidad desde el punto de vista del coste y del rendimiento y que sea especialmente eficaz en su aplicación médica.

Para la solución del problema, el invento enseña que la precipitación de sulfato de amonio fraccionado se ha de realizar en una primera fase de precipitación en una solución de sulfato de amonio acuosa con un peso-% de 10-29, preferiblemente con un peso-% de 12-25, y en una segunda fase de precipitación en una solución acuosa de sulfato de amonio con un peso-% de 15-65, preferiblemente con un peso-% de 25-50 y que la fracción de precipitación de hialuronidasa limpiada sea sometida antes de la preparación galénica a una ultrafiltración con un límite de exclusión de 5.000 a 30.000 dalton, preferiblemente 15.000 dalton. La expresión ultrafiltración se refiere a un procedimiento de filtración en el cual se disocian bajo presión las partículas más grandes y/o las moléculas de los disolventes y de las moléculas más pequeñas. Un ultrafiltro queda con ello identificado por medio del límite de exclusión que indica hasta qué limite de masa molecular deja pasar a las moléculas a través de la membrana del filtro. La expresión peso-% indica los g. de sulfato de amonio por cada 100 g. de solución de sulfato de amonio.

Sorprendentemente, con el procedimiento al que se refiere el invento se obtiene un preparado que se caracteriza por una eficiencia fisiológica especialmente alta y que, sin embargo, se puede producir comparativamente de una forma más sencilla y económica. Tiene una importancia especial el que el conocimiento de la eficiencia fisiológica no es una función monótona de la pureza del preparado. Antes bien se ha encontrado que un preparado con contenido de hialuronidasas con una pureza extremadamente alta tiene un efecto fisiológico menor que un preparado producido según el invento. Esto puede deberse a diversos motivos. Por un lado, con una pureza extrema puede faltar el efecto estabilizador de proteínas extrañas (inactivas), lo que a su vez conduce a una menor actividad de la misma hialuronidasa. Una complejidad de este tipo puede conducir también a un tiempo de retardo de la hialuronidasa en el organismo claramente superior. Por otro lado, no se puede excluir que en el caso de una pureza extrema de la hialuronidasa se hayan disociado las proteínas extrañas (inactivas), que potencian la acción de la hialuronidasa. Un preparado producido según el invento muestra, sin embargo, una actividad óptima desde el punto de vista del efecto fisiológico, lo que probablemente se deba especialmente, en contraste con la bibliografía DD-PS-24229, a la relativamente estrecha graduación de concentración del precipitado de sulfatote amonio.

En particular, existen diferentes posibilidades de realización del procedimiento según el invento. Se prefieren las posibilidades siguientes.

La disolución en el ácido de las proteínas y las encimas de la papilla se puede realizar por medio de ácido acético molar 0,02-0,2, preferiblemente 0,1, donde la relación de peso de ácido acético respecto de los testículos de toro es de 0,2:1 hasta 5:1, preferiblemente 0,8:1 hasta 1,2:1, en el caso óptimo aprox. 1:1, donde la mezcla de papilla y ácido acético se remueve durante al menos 2 horas, preferiblemente más de 4 horas y donde el eluato obtenido a continuación se disocia por medio de centrifugación o filtración de los cuerpos sólidos no diluidos.

La precipitación de sulfato de amonio se realiza de forma ventajosa en la primera fase de precipitación con un peso-% de 15-20, preferentemente con un peso-% de 17,5, de solución de sulfato de amonio acuosa y en una segunda fase de precipitación con un peso-% de 30-40, preferentemente con un peso-% aproximado de 34,3 de solución de sulfato de amonio acuosa. Las proteínas y encimas no deseadas, precipitadas en la primera fase de precipitación y la fracción de precipitación de hialuronidasas contenida en la segunda fase de precipitación pueden disociarse de la fase líquida por medio de centrifugación o filtración.

La fracción de precipitación de hialuronidasas en particular queda suspendida preferentemente en agua y la diálisis se realiza hasta una osmolaridad de 10-40 mosm/kg, preferentemente de 20-30 mosm/kg. El contenido de proteínas de la fracción de precipitación de hialuronidasas dializada se ajusta a 1,0-4,0%, preferentemente a 1,9-2,1%, medido según Kjeldahl. El pH se ajusta a continuación a 4,5-5,8, preferentemente a aproximadamente 5,1 y se centrifuga el precipitado resultante: la osmolaridad viene definida por la ecuación m = (-1n a_{A}) / M_{A}, donde m es la osmolaridad en mol/kg (o bien mosm/kg), a_{A} la actividad del disolvente A (aquí agua) y M_{A} la masa molar del disolvente A. La determinación del contenido de proteínas según Kjeldahl es en esencia la conocida definición de nitrógeno de Kjeldahl, a partir de la cual se puede deducir el contenido de proteínas. En este punto se hace referencia, a modo de ejemplo, a la bibliografía de Römpp, Diccionario de química, 1995, edición de bolsillo, tomo 3, pág. 2246, así como las citas contenidas en el mismo.

Por lo demás, es preferible que el contenido de proteínas de la fracción de precipitación de hialuronidasas empleado en la fase de absorción se ajuste a 1,0-2,0%, preferentemente a 1,4-1,6%, medido según Kjeldhal y después se añada tampón de citrato (pH 8,0) en una proporción de 1/5-1/20, preferentemente un 1/10, del volumen de fracción de precipitación de hialuronidasas empleado, después se realice la fase del procedimiento de absorción mediante la adición de una solución de hidrato de óxido de aluminio al 1,0-10%, preferentemente al 2,5-3,5%, donde la cantidad de la solución de hidrato de óxido de aluminio añadida es de 10-50 ml/g de proteínas, preferentemente de 20-40 ml/g y en el mejor de los casos de 30 ml/g y que se someta después de la fase del procedimiento de absorción al sedimento obtenido a 1 lavado al menos, preferiblemente a 2 lavados, con un pH de 7,5-9,5, preferentemente con un pH aprox. de 8,5 y después se realice la fase del procedimiento de desorción por medio de la agitación en una solución acuosa con un pH de 3,5-6,0, preferentemente un pH de aprox. 4,2. Los lavados se realizan preferentemente con un tampón de lavado a partir de una parte de tampón de citrato (pH 8,0) y 1-50 partes de agua, preferentemente 10 partes (referido a los pesos), donde el volumen del tampón de agua de cada lavado se corresponde con el volumen total de hialuronidasa + tampón de citrato y donde después de cada agitación del sedimento en el tampón de agua se ajusta el pH a aprox. 8,5 con 0,1 m de ácido cítrico.

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Además, es preferible que la ultrafiltración se realice con un límite de exclusión de 9.000-11.000 dalton, preferentemente de 10.000 dalton y que la ultrafiltración se realice con la medida de que la actividad de hialuronidasa obtenida sea de al menos 3000 I.E./ml, preferentemente de al menos 5500 I.E /ml. La determinación de la actividad de hialuronidasa se realiza mediante un test que se explica con más detalle en el ejemplo de ejecución. Después de la ultrafiltración se puede realizar una diálisis hasta una osmolaridad de 5-50 mosm/kg, preferentemente de 10-30 mosm/kg.

Con respecto a la disociación de gérmenes patógenos y para evitar la aparición de pirógenos, es beneficioso si se realiza una filtración de esterilización después de la diálisis para la disociación de sulfato de amonio y/o la ultrafiltración. En una filtración de esterilización se emplea un filtro cuyas dimensiones de poros garantizan la retención de bacterias y también de virus en su caso.

Tiene importancia en sí mismo, en el marco del invento, el empleo de un preparado con contenido de hialuronidasas producido según el invento para la producción de un medicamento para el tratamiento de enfermedades producidas por la formación de plaquetas en los vasos sanguíneos, así como el empleo de un preparado con contenido de hialuronidasas producido según el invento para la producción de un medicamento o de un paquete de medicamentos para el tratamiento de afecciones tumorales, donde el preparado que contiene hialuronidasas se mezcla con una o varias citostáticas habituales y se prepara de forma galénica, o donde el preparado con contenido de hialuronidasas, así como una o varias citostáticas, forman componentes separados y componentes a suministrar por separado del paquete de medicamentos. Por paquete de medicamentos se designa a un así llamado paquete combinado en el que están embalados dos preparados de agente activo diferentes, separados físicamente, cuyos preparados de agente activo están determinados, sin embargo, para un enriquecimiento simultáneo o retardado en una indicación médica. En última instancia puede ser preferible que el preparado de hialuronidasa esté determinado para el enriquecimiento antes del citostático. Como citostáticas se designan las substancias que inducen la eliminación de células, especialmente células tumorales, o al menos frenan su proliferación.

En cuanto a enfermedades provocadas por la formación de plaquetas en los vasos sanguíneos se citan a modo de ejemplo: la arteriosclerosis, en especial la de los vasos coronarios, de la carótida y de las arterias que conducen al cerebro; en casos graves, esto conduce a la formación de cuadros clínicos de infarto del miocardio, de apoplejía, de trastornos circulatorios de las extremidades, del tejido conjuntivo, así como de otros órganos como los testículos, etc. Estas enfermedades se originan normalmente debido a sedimentos internos en los vasos sanguíneos, como consecuencia de los cuales se reduce el flujo de los vasos sanguíneos. Estos sedimentos en las paredes interiores se designan como placas. Estas placas se pueden reducir por medios mecánicos, por ejemplo por medio de catéter de corazón, pero también por medios químicos o biológicos. En última instancia se descomponen las substancias de las que se compone la placa (por ejemplo, sedimentos hialino-calcáreos), y así se se disuelven al menos de forma parcial. Sorprendentemente, en los análisis de flujo en vasos sanguíneos lixiviados, parcialmente obstruidos por la placa, se ha puesto de manifiesto que, mediante el empleo de un preparado con contenido de hialuronidasas producido según el invento, se obtiene una notable mejora de la resistencia al flujo en el medio de perfusión. Esto se debe a la disolución de la placa debida a la acción de las hialuronidasas. Además, en los primeros análisis clínicos se encontró que el estado de los pacientes con dolencias debidas a la circulación del corazón condicionada por la placa mejoraba notablemente después de haberles suministrado el preparado producido según el invento. Las dosis se suministraron por medio de una inyección i.V. de 1500 unidades del preparado, disueltas en suero fisiológico, tres veces por semana. Asimismo, es posible la dosis a través de inyección i.p. o i.m., así como la elección de otras concentraciones o dosis. También es posible el empleo a efectos de profilaxis.

Al emplear un preparado producido según el invento para la producción de un medicamento o de un paquete de medicamentos para el tratamiento de enfermedades tumorales se encontró, sorprendentemente, que este preparado especial mostraba un efecto especialmente bueno como ayudante de los más diversos citostáticos. Esto se debe probablemente al efecto permeable del tejido de la hialuronidasa. Se citan a modo de ejemplo como antineoplásicas adecuadas: perfosamida, ciclofosfamida, lomustina, mecloretamina, prednisona, vincristina, metotrexato, porcarbacina, pepticemida, doxorubicina, vindesina, cisplatina y mitomicina (c). Sin embargo, se emplean principalmente citostáticos del grupo de pirimidinantagonistas, especialmente gemcitabina. Los citostáticos nombrados se pueden obtener libremente y adquirirlos previa compra. Tras los primeros ensayos, parece muy prometedor el empleo de un preparado según el invento junto con gemcitabina para el tratamiento de carcinomas colorectales y precisamente en pacientes que son resistentes a la 5-FU/leucovorina. Para ello se suministra gemcitabina mezclada con un preparado según el invento, o bien por separado, en una dosis de 200 a 5000, preferentemente de 500 a 4000 mg/m^{2}, y de forma óptima 1000 mg/m^{2} los días 1, 8, 15, seguidos de 1 semana de descanso, después se vuelve a iniciar durante un espacio de tiempo de 30-60 min. por medio de infusión. Las cantidades de hialuronidasa suministradas en cada caso de ½ a 3 h antes, suponen 100 a 4000 I.E., preferentemente 300 a 1000 I.E. Desde el punto de vista de la cronología del suministro son posibles, naturalmente, las variaciones.

Además, es posible utilizar un preparado producido según el invento como medicamento para terapias tumorales, o bien profilaxis tumorales sin la adición de otras substancias. Ante todo, no es forzosamente necesario el suministro de un citostático. Esto se basa en el conocimiento de que el preparado según el invento induce en cierto modo, por medio de la reducción de ácido hialurónico en células tumorales, el desenmascaramiento de éstas con la consecuencia de que el sistema inmunológico del propio cuerpo induce la detección y eliminación de las células tumorales hasta aquí desenmascaradas.

A continuación se explica con más detalle el invento de la mano de un ejemplo de producción. Se han empleado los tampones siguientes: tampón cítrico pH 8,0 de 2,80 vol.-% 0,1 m ácido cítrico y 97,20 vol-% 0,2 m dinatriohidrogenofosfato; tampón de acetato sódico pH 4,2 de 3,33 vol.-% 1m acetato sódico, 6,66 vol.-% 1 m ácido acético y 90,01 vol.-% de agua.

Siempre que se emplee agua en un tampón o en otra relación del ejemplo de realización, se tratará del grado de pureza "para inyección".

Como sistema de test para la determinación de la actividad de hialuronidasa en los productos intermedios y finales se emplea el test de reducción turbidométrico. La determinación se basa en el efecto de las hialuronidasas de hidrolización del ácido hialurónico. El ácido hialurónico produce turbidez con las substancias adecuadas como, p.ej., suero normal de caballo o solución de albúmina. La disminución de la turbidez en la mezcla de la reacción se observa de forma fotométrico-espectral (test de reducción turbidimétrico). Los productos intermedios se diluyen previamente, si es necesario, con tampón de fosfato, los productos finales liofilizados se diluyen con suero fisiológico (condiciones: temperatura ambiente). A continuación se mezclan con la solución de test (30 mg de ácido hialúrico en solución de agua bidestilada de 25 ml y diluida el día de la determinación en una relación 1-2 con tampón de fosfato). Adicionalmente se añade solución corriente de suero. La cantidad de ácido hialurónico se elige de tal manera que se emplee un excedente en relación con la cantidad de encima a determinar. La reducción de turbidez se determina fotométricamente mediante la disminución de la extinción a 640 mm. La actividad se calcula por medio de la extinción obtenida mediante la curva de referencia (resulta de las diluciones estándar). Como estándar se utiliza un estándar interno que concuerda con la composición del producto final y cuya actividad se ha calculado mediante un estándar-WHO en determinaciones múltiples. La actividad del estándar-WHO se determina mediante un estándar original londinense (estándar internacional).

En primer lugar se desmenuzan 30 kg de testículos de toro sin piel y limpiados en estado semicongelado con una trituradora de carne. La papilla obtenida se remueve durante al menos 4 horas con 30l 0,1m de ácido acético con lo que las proteínas y/o las encimas se quedan en la solución. El eluato se separa por medio de centrifugación o filtración. El residuo se desecha.

El eluato así obtenido se somete a continuación a una precipitación de sulfato de amonio fraccionado. Para ello se mezcla, agitándolo con 212 g de sulfato de amonio por litro y se sigue removiendo después de su disolución durante 30 min. De aquí resulta una solución de sulfato de amonio de aprox. 17,5 peso-% (suponiendo que la densidad del extracto es de aprox. 1). La precipitación se centrifuga o se filtra entonces y se desecha. El filtrado o el centrifugado obtenido se mezcla entonces con 282 g de sulfato de amonio por litro y se remueve durante 30 min. De aquí resulta una solución de sulfato de amonio de aprox. 34,3 peso-% (suponiendo que la densidad del extracto del sulfato de amonio ya contenido es de aprox. 1,1009). Se deja reposar durante la noche el precipitado. La disociación de la precipitación se produce mediante filtración o centrifugación, donde la fracción de precipitación de hialuronidasa se obtiene en forma de cuerpo sólido. La fracción de precipitación de hialuronidasa se suspende en aprox. 4 l de agua, o bien se disuelve y se dializa. La diálisis se realiza hasta una osmolaridad de 20-30 mosm/kg. El contenido de proteínas después de la diálisis se ajusta a 1,9-2,1% (según Kjeldahl) añadiendo agua. El pH de la solución así obtenida se lleva, con 1n NaOH, a un valor de 5,1. Después de la centrifugación del precipitado de sulfato de amonio dializado se produce una filtración aséptica.

El preparado en bruto así obtenido (fracción de precipitación de hialuronidasa) se diluye en un contenido proteico de 1,4-1,6% (según Kjeldahl) y se mezcla a continuación con 1/10 de su volumen de tampón de citrato. Después de añadir hidrato de óxido de aluminio (30 ml/g proteínas) a una solución del 2,5 al 3,5% se ajusta el pH a 8,5, se remueve durante 30 min. y se centrifuga a continuación. El sobrante se decanta y se desecha. A continuación se realizan dos lavados del precipitado con tampón de agua (1 parte de tampón de citrato y 10 partes de agua). El volumen del tampón de agua de cada fase de lavado se corresponde con ello con el volumen total de preparado en bruto y tampón de citrato. Al mismo tiempo se ajusta el pH después de cada agitación del sedimento en tampón de agua con 0,1 m de ácido cítrico a 8,5. Los sobrantes del centrifugado de cada lavado son desechados. El sedimento se remueve después en el doble de volumen de tampón de acetato de sodio y se ajusta el pH añadiendo ácido acético (concen.) al 4,2. Después de remover (30 min.) se produce la centrifugación de la mezcla de desorción. El sobrante decantado se procesa como se indica a continuación y el sedimento se desecha.

La fracción de precipitado de hialuronidasa limpiada hasta aquí se filtra después asépticamente por medio de filtros de lecho profundo (capas de la empresa Seitz, tipo BIO 10) y después se concentra con un ultrafiltro con un límite de exclusión de 10.000 dalton (cartuchos de fibra hueca o sistema de casette de la empresa Millipore) hasta una actividad mínima eventual de 5.500 I.E./ml. A continuación se dializa a volumen constante hasta una osmolaridad de 10-30 mosm/kg. Antes de continuar con el procesamiento se toma una muestra para la determinación de las proteínas y de la actividad y se calcula la relación I.E. de hialuronidasa/mg (determ. de proteínas según Kjeldahl).

Por cada litro de producto obtenido de esta forma se añaden 0,26 litros de hidrolizado parcial de gelatina al 3,6%, de forma que la mezcla contenga 7,5 mg de hidrolizado parcial de gelatina. Ahora se continúa con una filtración aséptica. Después se puede realizar el empaquetado, en función de la medida de la actividad deseada por unidad de empaquetado. Al mismo tiempo se añade la cantidad necesaria de hidrolizado parcial de gelatina o de agua por lo cual debería de estar siempre presente una cierta cantidad de hidrolizado de parcial de gelatina como coloide protector. El llenado se realiza finalmente, por ejemplo, por medio de un filtro de membrana de 0,2 \mum o de bujías filtrantes en ampollas de 1ml. Inmediatamente después del llenado se congelan las ampollas y se liofilizan. La fundición de las ampollas se debería realizar de forma ininterrumpida, en la inteligencia de que la humedad residual en el preparado cerrado esté por debajo del 5% (pérdida de secado según DAB10).

Claims (9)

1. Preparado, que se puede obtener mediante un procedimiento, que contiene hialuronidasa, en el que los testículos de mamíferos, en especial los de los toros, se trituran hasta hacer una papilla, con lo cual se disuelven en el ácido las proteínas y encimas de la papilla que forman un eluato, con lo cual el eluato sufre una precipitación de sulfato de amonio fraccionado y de esta forma se obtiene una fracción de precipitación de hialuronidasa, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa se somete a una diálisis para la separación de sulfato de amonio, con lo cual la fracción de precipitación de hialuronidasa dializada es sometida a efectos de limpieza a una fase de proceso de absorción o desorción de hidrato de óxido de aluminio, con lo cual se prepara de forma galénica la fracción limpiada de precipitado de hialuronidasa, donde la precipitación de sulfato de amonio fraccionada se lleva a cabo en una primera fase de precipitación en una solución de sulfato de amonio acuoso al 10-29 peso% y en una segunda fase de precipitación en una solución de sulfato de amonio acuoso al 15-65 peso-% y donde la fracción de hialuronidasa limpiada se somete antes de la preparación galénica a una filtración con un límite de exclusión de 5.000 a 30.000 dalton.

2. Empleo del preparado según la demanda 1 para la producción de un medicamento para terapias o profilaxis de enfermedades producidas por la formación de plaquetas en los vasos sanguíneos.

3. Empleo según la demanda 2 para la terapia o profilaxis de arteriosclerosis de, por ejemplo, vasos coronarios, carótida y de arterias que conducen al corazón, del infarto de corazón, de apoplejía y de trastornos circulatorios de las extremidades y del tejido conjuntivo.

4. Empleo según la demanda anterior, por lo cual se prepara el medicamento para la inyección i.p. o i.m.

5. Empleo de la hialuronidasa según la demanda 1 para la producción de un medicamento para terapia tumoral o profilaxis tumoral, especialmente para profilaxis o terapia de carcinomas colorectales.

6. Empleo según la demanda 6, para lo cual el medicamento se produce como ayudante para citostática.

7. Paquete de medicamentos que abarca una hialuronidasa según la demanda 1, así como un citostático o varias cistostáticas.

8. Paquete de medicamentos según la demanda 8 para lo cual el citostático es del grupo compuesto de perfosamida, ciclofosfamida, lomusinta, mecloroetamina, prednisona, vincristina, metotrexato, procabacina, peptidquemio, doxorubicina, vindesina, cisplatina y/o mitomicina.

9. Paquete de medicamentos según la demanda 8 o 9 para lo cual se ha seleccionado la citostática del grupo de pirimidinantagonistas, especialmente la gemcitabina.