CZ289560B6

CZ289560B6 - Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu

Info

Publication number: CZ289560B6
Application number: CZ19981910A
Authority: CZ
Inventors: Below Gudrun Von; Bernhard Schweigle; Bernd Göricke
Original assignee: Pharma Dessau Gmbh
Priority date: 1997-06-17
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 2002-02-13
Also published as: ES2263190T3; EP0892045B1; EP1624057A3; ATE398171T1; EP1624057B1; CZ191098A3; DE19726626C1; DE59813491D1; DK1624057T3; ATE323760T1; DE59814240D1; EP0892045A2; EP1624057A2; ES2306004T3; EP0892045A3

Abstract

e en se t²k zp sobu v²roby hyaluronid zu obsahuj c ho p° pravku, p°i kter m se b² varlata rozm ln na ka i a z ka e se v kysel m prost°ed rozpust b lkoviny a enzymy na elu t, kter² se podrob frakcionovan mu sr en s ranem amonn²m a tak se z sk sra en frakce hyaluronid zy, sra en frakce hyaluronid zy se podrob dial²ze k odd len s ranu amonn ho, dialyzovan sra en frakce hyaluronid zy se pro vy i t n podrob adsorp n mu a desorp n mu pochodu na hydr tu oxidu hlinit ho a vy i t n sra en frakce hyaluronid zy se galenicky uprav . e en se vyzna uje t m, e se frakcionovan sr en s ranem amonn²m prov d v prvn m stupni ve vodn m 10 a 29% roztoku s ranu amonn ho a ve druh m stupni v 15 a 65% vodn m roztoku s ranu amonn ho a e se vy i t n sra en frakce hyaluronid zy p°ed galenickou ·pravou podrob ultrafiltraci s mez vylou en od 5000 do 30 000.\

Description

Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši a z kaše se v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovanému srážení síranem amonným, a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, sražená frakce hyaluronidázy se podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy se pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se galenicky upraví.

Dosavadní stav techniky

Jako hyaluronidáza se označuje skupina enzymů, které štěpí kyselinu hyaluronovou. Hyaluronová kyselina je vytvořena lineární sestavou střídajících se zbytků kyseliny glukuronové a zbytků N-acetylglukosaminu a vykazuje molekulovou hmotnost od méně než 20 000 až daleko přes 1 000 000. V organismu kyselina hyaluronová tvoří zejména hlavní součást určitých vysokomolekulámích proteoglykanů, které se vyskytují například v chondroitin-4/6-sulfátu a mukotinsulfátu, případně v dermatansulfátu, tvoří kyselina hyaluronová sice ústřední, nikoliv však s bílkovinou kovalentně vázanou jednotku. Hyaluronidázy mohou štěpením proteoglykanů vytvořit tkáň propustnou pro cizí látky. Vyskytují se zejména v akrosomu spermií a jejich štěpné působení na proteoglykany umožňuje buňkám spermií nakonec přirozené splynutí s vaječnou buňkou. Proto jsou všechny spermie, zásadně obsažené ve varlatech všech druhů zvířat, vhodné k získávání hyaluronidáz v hospodářsky použitelných množstvích. Zejména jsou vhodná varlata velkých jatečních zvířat.

Při srážení bílkovin se rozpuštěné bílkoviny a/nebo enzymy precipitují reakcí se srážedlem. Při frakcionovaném srážení se využívá toho, že různé bílkoviny, a/nebo enzymy, vykazují rozdílnou afinitu ke srážedlu. Přitom se většinou v prvém stupni srážení vysrážejí a oddělí nežádoucí bílkoviny a/nebo enzymy, ve druhém stupni se pak ze zbývajícího roztoku vysrážejí požadované bílkoviny a/nebo enzymy a takto získaná sražená frakce se vede k dalšímu zpracování. Při frakcionovaném srážení je podstatné sladění množství srážedel, použitých v dotyčném stupni srážení, s příslušným výchozím materiálem, případně s množstvím použitého výchozího materiálu. Tohoto sladění se zpravidla dosáhne koncentrací srážedla v roztoku, obsahujícím bílkoviny a/nebo enzymy. Když se například v prvém stupni srážení pracuje s příliš vysokou koncentrací srážedla, pak se rušivě oddělí též žádoucí bílkoviny a/nebo enzymy a tyto jsou ztraceny. Když se naproti tomu v prvém stupni pracuje s příliš nízkou koncentrací srážedla, pak rušivě zůstává v roztoku mnoho nežádoucích bílkovin a/nebo enzymů. Podobné platí pro druhý stupeň srážení, při kterém se mají vysrážet požadované bílkoviny, a/nebo enzymy.

Výraz dialýza označuje oddělování rozpuštěných molekul podle jejich velikosti pomocí difúze, případně zadržování, na polopropustné membráně. Dialýza se používá zejména pro oddělování vysokomolekulámích látek, jako jsou například bílkoviny a enzymy, od látek nízkomolekulárních, jako jsou například soli, monosacharidy, aminokyseliny a podobně. Při čištění adsorpcí adesorpcí se jedná o způsob obohacování, který využívá různých adsorpčních vlastností adsorbovaných látek na adsorbentu. Volbu adsorbentu, jakož i nastavením určitých podmínek adsorpce, jsou určité cílové látky přednostně adsorbovány a/nebo desorbovány a tak obohaceny, zatímco nežádoucí látky buď nejsou adsorbovány a oddělí se s kapalnou fází a/nebo nejsou desorbovány a oddělují se s pevnou fází.

Výraz galenická úprava označuje zpracování látky na přípravek, který se může bezprostředně, nebo po rozpuštění, například ve fyziologickém roztoku soli, dodávat do organismu, aniž by vznikaly problémy se snášenlivostí, podmíněné podáváním.

Z praxe je známo čištění hyaluronidázy srážením těžkými kovy. Tento způsob však vyžaduje zvláště pečlivé odstranění všech iontů těžkých kovů ze získaného přípravku vzhledem kjejich toxicitě. Dále je z praxe známo získávání hyaluronidázy frakcionovaným srážením ethanolem. Přitom bez dalšího nejsou získatelné apyrogenní přípravky. Konečně je známé čištění pomocí různých adsorpčních látek, například pomocí aktivního uhlí, fosforečnanu vápenatého, nebo hydroxidu hlinitého. Přitom ale neuspokojuje docílitelný výtěžek.

Jeden způsob výše uvedeného druhuje znám z literatury ze spisu DD-PS-24229. V rámci tohoto známého postupu se pracuje po srážení síranem amonným se dvěma stupni adsorpce a desorpce s hydrátem oxidu hlinitého za použití rozdílných systémů pufrů. V rámci srážení síranem amonným se pracuje v prvním stupni srážení s 30 % koncentrací síranu amonného a v druhém stupni s koncentrací 70 % síranu amonného. Přitom se získává apyrogenní přípravek s neuspokojivým výtěžkem a k tomu jsou náklady příliš vysoké.

Podstata vynálezu

Naproti tomu je předmětem předloženého vynálezu vyřešení technického problému, totiž vypracování způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, který se může provádět s dobrou hospodárností co do nákladů a výtěžku, a který poskytuje přípravek, který je při použití v medicíně zvláště účinný.

K vyřešení tohoto problému bylo podle vynálezu zjištěno, že se frakcionované srážení síranem amonným v prvém stupni provádí v 10 až 29% vodném roztoku, výhodně ve 12 až 25% roztoku, síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65 % roztoku, výhodně ve 25 až 50 % roztoku, bráno jako % hmotnostní, síranu amonného a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltraci s mezí vyloučení od 5000 až do 30 000, výhodně do 15 000. Výraz ultrafiltrace označuje způsob filtrace, při kterém se za tlaku oddělují větší částice, a/nebo molekuly, od rozpouštědel a menších molekul. Ultrafiltr je přitom označován mezí vyloučení, která udává molekulovou hmotnost, až při které jsou molekuly membránou filtru propouštěny. Výraz % hmotností znamená g síranu amonného na 100 g roztoku síranu amonného.

Způsobem podle vynálezu se překvapivě získá přípravek, který se vyznačuje zvláště vysokou fyziologickou účinností a který se přitom může získat relativně jednoduše a za příznivých nákladů. Zvláštní význam přitom má poznatek, že fyziologická účinnost není monotónní funkcí čistoty přípravku. Spíše bylo zjištěno, že přípravek, obsahující hyaluronidázu se zvláště vysokou čistotou, má menší fyziologickou účinnost proti přípravku, vyrobenému podle vynálezu. To může mít řadu příčin. Za prvé může při mimořádně vysoké čistotě chybět stabilizující účinek cizích (neaktivních) bílkovin, což opět vede k nižší aktivitě samotné hyaluronidázy. Takový komplex může též vést ke značně zvýšené době prodlení hyaluronidázy v organismu. Za druhé nelze vyloučit, že při krajně vysoké čistotě hyaluronidázy byly odděleny cizí (neaktivní) bílkoviny, které mohou působit jako adjuvanty pro hyaluronidázy. Přípravek, získaný podle vynálezu však přesto vykazuje co do různých fyziologických účinků optimální aktivitu, což pravděpodobně, zejména ve srovnání se spisem DD-PS-24 229, je způsobeno poměrně úzkým odstupňováním koncentrací při srážení síranem amonným.

V podrobnostech existují různé možnosti provádění způsobu podle předloženého vynálezu. Následující možnosti jsou výhodné.

-2CZ 289560 B6

Roztok bílkovin a enzymů z kaše v kyselém prostředí se může připravit pomocí 0,02 až 0,2 molámí, výhodně 0,1 molámí, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k býčím varlatům činí 0,2 : 1 až 5 : 1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1, obzvláště asi 1 : 1, přičemž se směs kašo a kyseliny octové nejméně 2 hodiny, výhodně více než 4 hodiny, míchá a potom se takto získaný eluát odstředěním nebo filtrací oddělí od nerozpustných pevných částic.

Výhodně se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni srážení v 15 až 20%, výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni srážení v 30 až 40%, výhodně ve 34,3% vodném roztoku síranu amonného, bráno jako % hmotnostní. V prvém stupni srážení vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy se mohou od kapalné fáze oddělit odstředěním nebo filtrací.

Sražená frakce hyaluronidázy se pečlivě suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30mosm/kg. Obsah bílkovin vdialyzované sražené frakci hyaluronidázy se nastaví na 1,0 až 4,0%, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla. Pak se upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a vzniklá sraženina se odstředí. Osmolalita je definována rovnicí m = (-ln a_A) / M_A, kde je osmolalita v mol/kg (případně mosm/kg), a_A je aktivita rozpouštědla A (zde vody) a M_A je molekulová hmotnost rozpouštědla A. Stanovení obsahu bílkovin podle Kjeldahla je v podstatě známým stanovením dusíku dle Kjeldahla, z něhož se zpětně může vypočítat obsah bílkovin. K tomu se odkazuje na Rómpp, Chemie Lexikon, 1995, Paperback Ausgabe, Band 3, s. 2446, jakož i na uvedené citáty.

Dále je výhodné, když se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni adsorpce, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, pak se přidá citrátový pufr (pH 8,0) v objemu 1/5 až 1/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, pak se provede stupeň adsorpčního postupu přidáním 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50 ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, nejvýhodněji asi 30 ml/g bílkoviny, a po provedeném stupni postupu adsorpce se podrobí získaný sediment nejméně jednomu promývání, výhodně 2 promýváním, při pH 7,5 až 9,5, výhodně při pH asi 8,5 a pak se rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce. Promývání se provádí výhodně promývacím pufrem z jednoho dílu citrátového pufru (pH 8) a 1 až 50, výhodně 10 díly (hmotnostních) vody, přičemž objem promývacího pufru při každém promytí odpovídá celkovému objemu hyaluronidázy + citrátový pufr a přičemž se po každém rozmíchání sraženiny v promývacím pufru nastaví pH na asi 8,5 pomocí 0,1 roztoku kyseliny citrónové.

Dále je výhodné, když se provede ultrafiltrace s mezí vyloučení 9000 - 11 000, výhodně 10 000, a když se provede ultrafiltrace stím, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 3000I.E./ml, výhodně nejméně 5500I.E./ml. Stanovení aktivity hyaluronidázy se provádí zkouškou vysvětlenou dále v příkladu provedení. Po ultrafiltraci se může provést dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.

S přihlédnutím k oddělení patogenních zárodků a k zabránění vzniku pyrogenů je výhodné, když se po dialýze pro oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltraci provede sterilizační filtrace. Při sterilizační filtraci se použije filtr, jehož velikost pórů zaručuje zadržení bakterií a případně i virů.

Významné je použití přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, pro výrobu léčiv pro léčení chorob, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, jakož i použití přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, k výrobě léčiv, nebo souprav léčiv pro léčení nádorových chorob, přičemž se přípravek, obsahující hyaluronidázu, smísí s jedním nebo několika obvyklými cytostatiky a galenicky se upraví, nebo se přípravek, obsahující hyaluronidázu, jakož i jedno nebo více cytostatik, balí odděleně nebo odděleně podává jako složka léčivé soupravy. Jako léčivá souprava se přitom označuje takzvané kombinované balení, v němž jsou prostorově oddělené dva přípravky s účinnými látkami, jejichž účinné látky

-3CZ 289560 B6 jsou při jedné lékařské indikaci určeny k současnému, nebo časově oddělenému podávání. V druhém případě může být výhodné, když je přípravek s hyaluronidázou určen k podání před cytostatikem. Jako cytostatika se označují látky, které mohou usmrcovat buňky, zejména buňky nádorové, anebo mohou alespoň působit proti jejich šíření.

Jako choroby, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, je možné například jmenovat: arteriosklerózu, zejména v srdečních koronárních tepnách, v krční tepně a tepnách, zásobujících mozek; v těžkých případech to je původcem srdečního infarktu, apoplexie, poruch prokrvení extremit, vaziv, jakož i ostatních orgánů, jako jsou varlata atd. Tyto choroby jsou vyvolány usazeninami na vnitřních stěnách cév, jimiž je snížen průtok cévami. Tyto usazeniny na vnitřních stěnách se označují jako plak. Plak se může odstranit mechanickou cestou, například pomocí srdečního katétru, ale též chemickou nebo biochemickou cestou. V posledním případě se rozkládají látky, z nichž je plak vytvořen (například hyalin-vápenaté usazeniny) a tak se alespoň částečně převádějí do roztoku. Překvapivě bylo zjištěno při zkoumání průtoku na vyjmutých cévách, zúžených plakem, že použitím přípravku, obsahujícího hyaluronidázu a vyrobeného podle vynálezu, se v protékajícím médiu docílilo pozoruhodné snížení průtokového odporu. To je možné připsat rozpuštění plaku působením hyaluronidázy. V prvých klinických zkouškách bylo navíc zjištěno, že se stav pacientů, trpících srdečními oběhovými potížemi, vyvolanými plakem, značně zlepšil po podání přípravku, vyrobeného podle vynálezu. Podávání se provádělo intravenózními injekcemi i.p. nebo i.m., jakož i zvolení jiných koncentrací, případně dávek. Rovněž je možné použití pro profylaxi.

Při použití přípravku, vyrobeného podle vynálezu, pro výrobu léčivého prostředku, případně léčivého souboru, pro léčbu nádorových onemocnění, bylo překvapivě zjištěno, že tento speciální přípravek vykazuje zvláště dobré působení jako adjuvans pro rozličný cytostatika. To spočívá pravděpodobně v působení hyaluronidázy, které činí tkáně propustnými. Jako vhodný antineoplastika, případně cytostatika se například uvádějí: Perfosamid, Cyclophosphamid, Lomustin, Mechlorethamin, Prednison, Vincristin, Methotrexat, Procarbazin, Peptichemio, Doxorubicin, Vindesin, Cisplatin a Mitomycin (C). Zvláště výhodně se pak používají cytostatika ze skupiny antagonistů pyrimidinu, zejména Gemcitabiny. Uvedený cytostatika jsou volně k dostání a je možné je koupit. Po prvých zkouškách se ukázalo zvláště slibné používání přípravku podle vynálezu ve spojení s Gemcitabinem pro léčení kolorektálních karcinomů a to zejména též u pacientů, kteří jsou rezistentní na 5-FU/Leucovorin. Přitom se Gemcitabin podává ve směsi s přípravkem podle vynálezu, nebo odděleně v dávce od 200 do 5000, výhodně od 500 do 4000 mg/m², nej výhodněji 1000 mg/m² ve dnech 1,8, 15 a následnou přestávkou 1 týden a pak znovu v čase 30 - 60 min pomocí infuze. Množství hyaluronidázy podávané společně, případně 1/2 hodiny nebo až 3 hodiny předtím, činilo 100 až 40001.E., výhodně 300 až 10001.E. Pokud se týká chronologie podávání jsou samozřejmě možné obměny.

Dále je možné používat přípravek, vyrobený podle vynálezu, jako léčivo k terapii nádorů, případně k profylaxi nádorů, bez přídavku dalších látek. Zvláště přídavek cytostatika není nutně potřebný. To spočívá na poznatku, že prostředek podle vynálezu odbouráváním kyseliny hyaluronové u nádorových buněk tyto může současně demaskovat s následkem, že imunitní systém těla takto demaskované buňky nádoru může rozpoznat a zničit.

Příklady provedení vynálezu

Příklad

V dalším bude vynález blíže osvětlen pomocí příkladu výroby. Přitom se použily tyto pufry: citrátový pufr spH8,0 z 2,80% obj. 0,lm roztoku kyseliny citrónové a 97,20% obj. 0,2m roztoku dinatriumhydrogenfosfátu; pufr zoctanu sodného spH4,2 z 3,33% obj. lm roztoku octanu sodného, 6,66% obj. lm kyseliny octové a 90,01 % obj. vody. Pokud se použije voda

-4CZ 289560 B6 v některém pufru, nebo v jiné souvislosti příkladu provedení, pak jde o stupeň čistoty „pro injekce“.

Jako systém zkoušení pro stanovení aktivity hyaluronidázy v meziproduktech a v konečných produktech se použila zkouška snížení zákalu. Stanovení spočívá na působení hyaluronidázy, hydrolyzující kyselinu hyaluronovou. Kyselina hyaluronová vytváří zákal s vhodnými látkami, jako je například normální koňské sérum, nebo roztok albuminu. Snižování zákalu v reakční směsi se sleduje spektrálním fotometrem (zkouška na snížení zákalu). Meziprodukty se podle potřeby předem zření fosfátovým pufrem, lyofylizované konečné produkty se rozpustí ve fyziologickém roztoku (podmínky: teplota místnosti). Pak se přidá zkušební roztok (30 mg kyseliny hyaluronové, rozpouštěné v 25 ml redestilované vody a ve dni stanovení zředěné fosfátovým pufrem v poměru 1 + 2). Dodatečně se přidá použitelný roztok séra. Množství kyseliny hyaluronové se volí tak, aby se použil přebytek vůči stanovovanému množství enzymu. Snížení zákalu se určuje fotometricky snížením extinkce při 640 nm. Aktivita se vypočítá ze získané extinkce pomocí srovnávací křivky (vzniklé ze standardních zředění). Jako standard se použil vnitřní standard, jehož složení souhlasí se složením konečného produktu a jehož aktivita byla zjištěna pomocí standardu WHO opakovaným stanovením. Aktivita standardu WHO byla stanovena pomocí vhodného londýnského základního standardu (mezinárodní standard).

Nejprve se 30 kg býčích varlat, zbavených kůže a očištěných, v polozmraženém stavu rozemele mlýnkem na maso. Získaná kaše se míchá alespoň 4 hodiny s 30 1 0,1 m kyseliny octové, přičemž se převedou do roztoku bílkoviny, a/nebo enzymy. Eluát se oddělí odstředěním nebo filtrací. Zbytek se zahodí.

Takto získaný eluát se pak podrobil frakcionovanému srážení síranem amonným. K tomu účelu se za míchání přidalo 212 g síranu amonného na litr a po jeho rozpuštění se ještě 30 minut míchalo. Z toho vznikl asi 17,6 % hmotn. roztoku síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu je asi 1). Sraženina se odstředila, případně odstředěné kapalině, se přidalo 282 g síranu amonného a 30 minut se míchalo. Z toho vznikl asi 34,3% hmot, roztok síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu, obsahujícího síran amonný, je asi 1,1009). Sraženina se nechala přes noc usadit. Sraženina se oddělila filtrací, případně odstředěním, přičemž se získala sražená frakce hyaluronidázy jako pevná látka. Sražená frakce hyaluronidázy se suspendovala v asi 4 1 vody, případně se rozpustila a dialyzovala. Dialýza probíhala až do osmolality 20 mosm/kg. Obsah bílkoviny po dialýze se přidáním vody nastavil na 1,9-2,1 % (podle Kjeldahla). U takto získaného roztoku se pH uvedlo přídavkem 1 nNaOH na 5,1. Po odstředění dialýzou oddělené sraženiny, získané síranem amonným, následovala sterilizační filtrace.

Takto získaný surový přípravek (sražená frakce hyaluronidázy) se zředil na obsah bílkovin 1,4- 1,6 % (podle Kjeldahla) a pak se přidala 1/10 jeho objemu citrátového pufru. Po přidání 2,5 - 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého (30 ml/g bílkoviny) se nastavilo pH na 8,5, 30 minut se míchalo a pak se odstředilo. Vzplývající kapalina se dekantovala a zahodila. Pak se provedla dvě promytí sraženiny promývacím pufrem (ldíl citrátového pufru a 10 dílů vody). Objem promývacího pufru při každém promytí přitom odpovídal celkovému objemu surového přípravku a citrátového pufru. Přitom se po každém rozmíchání sedliny v promývacím pufru nastavilo pH na 8,5 pomocí 0,lm kyseliny citrónové. Vzplývající kapalina, odstředěná po každém promytí, se zahodila. Sedlina se pak rozmíchala v dvojnásobném objemu pufru z octanu sodného a pH se přidáním kyseliny octové (konc.) nastavilo na 4,2. Po míchání (30 minut) následovalo odstředění desorpční směsi. Dekantovaná vzplývající kapalina se pak zpracovala následujícím způsobem a sedlina se zahodila.

Takto vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se pak sterilizačně filtrovala ponorným filtrem (vrstvy fy. Seitz, typ BIO 10) a pak se zahustila pomocí ultrafiltru smezí vyloučení 10 000 Dalton (patrony z dutých vláken, případně kazetový systém fy. Millipore) až do případné minimální aktivity 5500 I.E./ml. Pak se při konstantním objemu dialyzovalo až do osmolality

-5CZ 289560 B6

10-30mosm/kg. Před dalším zpracováním se odebral vzorek ke stanovení bílkovin a aktivity a vypočítal se poměr I.E. hyaluronidáza/mg bílkoviny (stanovení bílkovin dle Kjeldahla).

Na litr takto získaného produktu se přidalo 0,26 litru 3,6% částečného hydrolyzátu želatiny, tak aby směs obsahovala 7,5 mg želatinového částečného hydrolyzátu v ml. Na to navázala sterilizační filtrace. Pak mohlo dojít k balení s uvedením požadované aktivity v jednotce balení. Přitom se přidalo k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny, případně vody, přičemž se vždy muselo přidat k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny jako ochranného koloidu. Nakonec proběhlo plnění do ampulek 1 ml na příklad přes membránový filtr 0,2 pm, nebo přes filtrační svíčku. Ihned po naplnění se ampulky zmrazily a lyofylizovaly. K zatavení ampulek má dojít naráz tak, aby zbytková vlhkost v uzavřeném přípravku činila pod 5 % (ztráta sušením pod DAB 10).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši, přičemž se z kaše v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovanému srážení síranem amonným a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, přičemž se sražená frakce hyaluronidázy podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy se pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se galenicky upraví, vyznačující se tím, že se prvé frakcionované srážení provádí v 10 až 29% vodném roztoku síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65% vodném roztoku síranu amonného, a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltrací s mezí vyloučení 5000 až 30 000.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se roztok bílkovin a enzymů z kaše v kyselém prostředí připraví pomocí 0,02 až 0,2 molámí, výhodně 0,1 molámí, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k varlatům činí 0,2 : 1 až 5 : 1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1, nej výhodněji 1:1, přičemž se směs kaše a kyseliny octové míchá nejméně 2 hodiny, výhodně více než 4 hodiny a přitom se takto získaný eluát oddělí od nerozpustných pevných částic odstředěním nebo filtrací.
3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni v 15 až 20% výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni ve 30 až 40%, výhodně v 34,3% vodném roztoku síranu amonného.
4. Způsob podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, že se v prvém stupni vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy oddělí od kapalné fáze odstředěním nebo filtrací.
5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že se sražená frakce hyaluronidázy suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30 mosm/kg, že se obsah bílkovin v dialyzované sražené frakci hyaluronidázy nastaví na 1,0 až 4,0 %, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla, že se pak upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a že se vzniklá sraženina odstředí.
6. Způsob podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím, že se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni dialýzy, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, že se pak přidá citrátový pufr o pH 8,0 v objemu 1/5 až

-6CZ 289560 B6

1/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, že se pak provede stupeň adsorpčního postupu přidáním roztoku 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, obzvláště asi 30 ml/g bílkoviny, že se po provedeném stupni postupu adsorpce podrobí získaná sraženina nejméně jednomu promývání při pH 7,5 až 9,5, výhodně při pH asi 8,5 a že se pak rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce.
7. Způsob podle některého z nároků laž6, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provede s mezí vyloučení 9000 až 11 000, výhodně 10 000.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provádí tak, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 30001.E./ml, výhodně nejméně 55001.E./ml.
9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, v y z n a č u j í c í se t í m, že se po ultrafiltraci provede dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.
10. Způsob podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že se po dialýze k oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltraci provede sterilizační filtrace.