CZ289560B6 - Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu - Google Patents
Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289560B6 CZ289560B6 CZ19981910A CZ191098A CZ289560B6 CZ 289560 B6 CZ289560 B6 CZ 289560B6 CZ 19981910 A CZ19981910 A CZ 19981910A CZ 191098 A CZ191098 A CZ 191098A CZ 289560 B6 CZ289560 B6 CZ 289560B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hyaluronidase
- precipitated
- fraction
- ammonium sulfate
- carried out
- Prior art date
Links
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 33
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 10
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 8
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 3
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N (2R,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(hydroxymethyl)-6-methoxy-3-sulfooxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H]([C@@H](OC)[C@H](O)[C@H]2O)C(O)=O)[C@H]1NC(C)=O FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 108010053334 Peptichemio Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000003790 pyrimidine antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
e en se t²k zp sobu v²roby hyaluronid zu obsahuj c ho p° pravku, p°i kter m se b² varlata rozm ln na ka i a z ka e se v kysel m prost°ed rozpust b lkoviny a enzymy na elu t, kter² se podrob frakcionovan mu sr en s ranem amonn²m a tak se z sk sra en frakce hyaluronid zy, sra en frakce hyaluronid zy se podrob dial²ze k odd len s ranu amonn ho, dialyzovan sra en frakce hyaluronid zy se pro vy i t n podrob adsorp n mu a desorp n mu pochodu na hydr tu oxidu hlinit ho a vy i t n sra en frakce hyaluronid zy se galenicky uprav . e en se vyzna uje t m, e se frakcionovan sr en s ranem amonn²m prov d v prvn m stupni ve vodn m 10 a 29% roztoku s ranu amonn ho a ve druh m stupni v 15 a 65% vodn m roztoku s ranu amonn ho a e se vy i t n sra en frakce hyaluronid zy p°ed galenickou ·pravou podrob ultrafiltraci s mez vylou en od 5000 do 30 000.\
Description
Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši a z kaše se v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovanému srážení síranem amonným, a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, sražená frakce hyaluronidázy se podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy se pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se galenicky upraví.
Dosavadní stav techniky
Jako hyaluronidáza se označuje skupina enzymů, které štěpí kyselinu hyaluronovou. Hyaluronová kyselina je vytvořena lineární sestavou střídajících se zbytků kyseliny glukuronové a zbytků N-acetylglukosaminu a vykazuje molekulovou hmotnost od méně než 20 000 až daleko přes 1 000 000. V organismu kyselina hyaluronová tvoří zejména hlavní součást určitých vysokomolekulámích proteoglykanů, které se vyskytují například v chondroitin-4/6-sulfátu a mukotinsulfátu, případně v dermatansulfátu, tvoří kyselina hyaluronová sice ústřední, nikoliv však s bílkovinou kovalentně vázanou jednotku. Hyaluronidázy mohou štěpením proteoglykanů vytvořit tkáň propustnou pro cizí látky. Vyskytují se zejména v akrosomu spermií a jejich štěpné působení na proteoglykany umožňuje buňkám spermií nakonec přirozené splynutí s vaječnou buňkou. Proto jsou všechny spermie, zásadně obsažené ve varlatech všech druhů zvířat, vhodné k získávání hyaluronidáz v hospodářsky použitelných množstvích. Zejména jsou vhodná varlata velkých jatečních zvířat.
Při srážení bílkovin se rozpuštěné bílkoviny a/nebo enzymy precipitují reakcí se srážedlem. Při frakcionovaném srážení se využívá toho, že různé bílkoviny, a/nebo enzymy, vykazují rozdílnou afinitu ke srážedlu. Přitom se většinou v prvém stupni srážení vysrážejí a oddělí nežádoucí bílkoviny a/nebo enzymy, ve druhém stupni se pak ze zbývajícího roztoku vysrážejí požadované bílkoviny a/nebo enzymy a takto získaná sražená frakce se vede k dalšímu zpracování. Při frakcionovaném srážení je podstatné sladění množství srážedel, použitých v dotyčném stupni srážení, s příslušným výchozím materiálem, případně s množstvím použitého výchozího materiálu. Tohoto sladění se zpravidla dosáhne koncentrací srážedla v roztoku, obsahujícím bílkoviny a/nebo enzymy. Když se například v prvém stupni srážení pracuje s příliš vysokou koncentrací srážedla, pak se rušivě oddělí též žádoucí bílkoviny a/nebo enzymy a tyto jsou ztraceny. Když se naproti tomu v prvém stupni pracuje s příliš nízkou koncentrací srážedla, pak rušivě zůstává v roztoku mnoho nežádoucích bílkovin a/nebo enzymů. Podobné platí pro druhý stupeň srážení, při kterém se mají vysrážet požadované bílkoviny, a/nebo enzymy.
Výraz dialýza označuje oddělování rozpuštěných molekul podle jejich velikosti pomocí difúze, případně zadržování, na polopropustné membráně. Dialýza se používá zejména pro oddělování vysokomolekulámích látek, jako jsou například bílkoviny a enzymy, od látek nízkomolekulárních, jako jsou například soli, monosacharidy, aminokyseliny a podobně. Při čištění adsorpcí adesorpcí se jedná o způsob obohacování, který využívá různých adsorpčních vlastností adsorbovaných látek na adsorbentu. Volbu adsorbentu, jakož i nastavením určitých podmínek adsorpce, jsou určité cílové látky přednostně adsorbovány a/nebo desorbovány a tak obohaceny, zatímco nežádoucí látky buď nejsou adsorbovány a oddělí se s kapalnou fází a/nebo nejsou desorbovány a oddělují se s pevnou fází.
Výraz galenická úprava označuje zpracování látky na přípravek, který se může bezprostředně, nebo po rozpuštění, například ve fyziologickém roztoku soli, dodávat do organismu, aniž by vznikaly problémy se snášenlivostí, podmíněné podáváním.
Z praxe je známo čištění hyaluronidázy srážením těžkými kovy. Tento způsob však vyžaduje zvláště pečlivé odstranění všech iontů těžkých kovů ze získaného přípravku vzhledem kjejich toxicitě. Dále je z praxe známo získávání hyaluronidázy frakcionovaným srážením ethanolem. Přitom bez dalšího nejsou získatelné apyrogenní přípravky. Konečně je známé čištění pomocí různých adsorpčních látek, například pomocí aktivního uhlí, fosforečnanu vápenatého, nebo hydroxidu hlinitého. Přitom ale neuspokojuje docílitelný výtěžek.
Jeden způsob výše uvedeného druhuje znám z literatury ze spisu DD-PS-24229. V rámci tohoto známého postupu se pracuje po srážení síranem amonným se dvěma stupni adsorpce a desorpce s hydrátem oxidu hlinitého za použití rozdílných systémů pufrů. V rámci srážení síranem amonným se pracuje v prvním stupni srážení s 30 % koncentrací síranu amonného a v druhém stupni s koncentrací 70 % síranu amonného. Přitom se získává apyrogenní přípravek s neuspokojivým výtěžkem a k tomu jsou náklady příliš vysoké.
Podstata vynálezu
Naproti tomu je předmětem předloženého vynálezu vyřešení technického problému, totiž vypracování způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, který se může provádět s dobrou hospodárností co do nákladů a výtěžku, a který poskytuje přípravek, který je při použití v medicíně zvláště účinný.
K vyřešení tohoto problému bylo podle vynálezu zjištěno, že se frakcionované srážení síranem amonným v prvém stupni provádí v 10 až 29% vodném roztoku, výhodně ve 12 až 25% roztoku, síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65 % roztoku, výhodně ve 25 až 50 % roztoku, bráno jako % hmotnostní, síranu amonného a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltraci s mezí vyloučení od 5000 až do 30 000, výhodně do 15 000. Výraz ultrafiltrace označuje způsob filtrace, při kterém se za tlaku oddělují větší částice, a/nebo molekuly, od rozpouštědel a menších molekul. Ultrafiltr je přitom označován mezí vyloučení, která udává molekulovou hmotnost, až při které jsou molekuly membránou filtru propouštěny. Výraz % hmotností znamená g síranu amonného na 100 g roztoku síranu amonného.
Způsobem podle vynálezu se překvapivě získá přípravek, který se vyznačuje zvláště vysokou fyziologickou účinností a který se přitom může získat relativně jednoduše a za příznivých nákladů. Zvláštní význam přitom má poznatek, že fyziologická účinnost není monotónní funkcí čistoty přípravku. Spíše bylo zjištěno, že přípravek, obsahující hyaluronidázu se zvláště vysokou čistotou, má menší fyziologickou účinnost proti přípravku, vyrobenému podle vynálezu. To může mít řadu příčin. Za prvé může při mimořádně vysoké čistotě chybět stabilizující účinek cizích (neaktivních) bílkovin, což opět vede k nižší aktivitě samotné hyaluronidázy. Takový komplex může též vést ke značně zvýšené době prodlení hyaluronidázy v organismu. Za druhé nelze vyloučit, že při krajně vysoké čistotě hyaluronidázy byly odděleny cizí (neaktivní) bílkoviny, které mohou působit jako adjuvanty pro hyaluronidázy. Přípravek, získaný podle vynálezu však přesto vykazuje co do různých fyziologických účinků optimální aktivitu, což pravděpodobně, zejména ve srovnání se spisem DD-PS-24 229, je způsobeno poměrně úzkým odstupňováním koncentrací při srážení síranem amonným.
V podrobnostech existují různé možnosti provádění způsobu podle předloženého vynálezu. Následující možnosti jsou výhodné.
-2CZ 289560 B6
Roztok bílkovin a enzymů z kaše v kyselém prostředí se může připravit pomocí 0,02 až 0,2 molámí, výhodně 0,1 molámí, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k býčím varlatům činí 0,2 : 1 až 5 : 1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1, obzvláště asi 1 : 1, přičemž se směs kašo a kyseliny octové nejméně 2 hodiny, výhodně více než 4 hodiny, míchá a potom se takto získaný eluát odstředěním nebo filtrací oddělí od nerozpustných pevných částic.
Výhodně se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni srážení v 15 až 20%, výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni srážení v 30 až 40%, výhodně ve 34,3% vodném roztoku síranu amonného, bráno jako % hmotnostní. V prvém stupni srážení vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy se mohou od kapalné fáze oddělit odstředěním nebo filtrací.
Sražená frakce hyaluronidázy se pečlivě suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30mosm/kg. Obsah bílkovin vdialyzované sražené frakci hyaluronidázy se nastaví na 1,0 až 4,0%, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla. Pak se upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a vzniklá sraženina se odstředí. Osmolalita je definována rovnicí m = (-ln aA) / MA, kde je osmolalita v mol/kg (případně mosm/kg), aA je aktivita rozpouštědla A (zde vody) a MA je molekulová hmotnost rozpouštědla A. Stanovení obsahu bílkovin podle Kjeldahla je v podstatě známým stanovením dusíku dle Kjeldahla, z něhož se zpětně může vypočítat obsah bílkovin. K tomu se odkazuje na Rómpp, Chemie Lexikon, 1995, Paperback Ausgabe, Band 3, s. 2446, jakož i na uvedené citáty.
Dále je výhodné, když se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni adsorpce, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, pak se přidá citrátový pufr (pH 8,0) v objemu 1/5 až 1/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, pak se provede stupeň adsorpčního postupu přidáním 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50 ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, nejvýhodněji asi 30 ml/g bílkoviny, a po provedeném stupni postupu adsorpce se podrobí získaný sediment nejméně jednomu promývání, výhodně 2 promýváním, při pH 7,5 až 9,5, výhodně při pH asi 8,5 a pak se rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce. Promývání se provádí výhodně promývacím pufrem z jednoho dílu citrátového pufru (pH 8) a 1 až 50, výhodně 10 díly (hmotnostních) vody, přičemž objem promývacího pufru při každém promytí odpovídá celkovému objemu hyaluronidázy + citrátový pufr a přičemž se po každém rozmíchání sraženiny v promývacím pufru nastaví pH na asi 8,5 pomocí 0,1 roztoku kyseliny citrónové.
Dále je výhodné, když se provede ultrafiltrace s mezí vyloučení 9000 - 11 000, výhodně 10 000, a když se provede ultrafiltrace stím, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 3000I.E./ml, výhodně nejméně 5500I.E./ml. Stanovení aktivity hyaluronidázy se provádí zkouškou vysvětlenou dále v příkladu provedení. Po ultrafiltraci se může provést dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.
S přihlédnutím k oddělení patogenních zárodků a k zabránění vzniku pyrogenů je výhodné, když se po dialýze pro oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltraci provede sterilizační filtrace. Při sterilizační filtraci se použije filtr, jehož velikost pórů zaručuje zadržení bakterií a případně i virů.
Významné je použití přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, pro výrobu léčiv pro léčení chorob, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, jakož i použití přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, k výrobě léčiv, nebo souprav léčiv pro léčení nádorových chorob, přičemž se přípravek, obsahující hyaluronidázu, smísí s jedním nebo několika obvyklými cytostatiky a galenicky se upraví, nebo se přípravek, obsahující hyaluronidázu, jakož i jedno nebo více cytostatik, balí odděleně nebo odděleně podává jako složka léčivé soupravy. Jako léčivá souprava se přitom označuje takzvané kombinované balení, v němž jsou prostorově oddělené dva přípravky s účinnými látkami, jejichž účinné látky
-3CZ 289560 B6 jsou při jedné lékařské indikaci určeny k současnému, nebo časově oddělenému podávání. V druhém případě může být výhodné, když je přípravek s hyaluronidázou určen k podání před cytostatikem. Jako cytostatika se označují látky, které mohou usmrcovat buňky, zejména buňky nádorové, anebo mohou alespoň působit proti jejich šíření.
Jako choroby, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, je možné například jmenovat: arteriosklerózu, zejména v srdečních koronárních tepnách, v krční tepně a tepnách, zásobujících mozek; v těžkých případech to je původcem srdečního infarktu, apoplexie, poruch prokrvení extremit, vaziv, jakož i ostatních orgánů, jako jsou varlata atd. Tyto choroby jsou vyvolány usazeninami na vnitřních stěnách cév, jimiž je snížen průtok cévami. Tyto usazeniny na vnitřních stěnách se označují jako plak. Plak se může odstranit mechanickou cestou, například pomocí srdečního katétru, ale též chemickou nebo biochemickou cestou. V posledním případě se rozkládají látky, z nichž je plak vytvořen (například hyalin-vápenaté usazeniny) a tak se alespoň částečně převádějí do roztoku. Překvapivě bylo zjištěno při zkoumání průtoku na vyjmutých cévách, zúžených plakem, že použitím přípravku, obsahujícího hyaluronidázu a vyrobeného podle vynálezu, se v protékajícím médiu docílilo pozoruhodné snížení průtokového odporu. To je možné připsat rozpuštění plaku působením hyaluronidázy. V prvých klinických zkouškách bylo navíc zjištěno, že se stav pacientů, trpících srdečními oběhovými potížemi, vyvolanými plakem, značně zlepšil po podání přípravku, vyrobeného podle vynálezu. Podávání se provádělo intravenózními injekcemi i.p. nebo i.m., jakož i zvolení jiných koncentrací, případně dávek. Rovněž je možné použití pro profylaxi.
Při použití přípravku, vyrobeného podle vynálezu, pro výrobu léčivého prostředku, případně léčivého souboru, pro léčbu nádorových onemocnění, bylo překvapivě zjištěno, že tento speciální přípravek vykazuje zvláště dobré působení jako adjuvans pro rozličný cytostatika. To spočívá pravděpodobně v působení hyaluronidázy, které činí tkáně propustnými. Jako vhodný antineoplastika, případně cytostatika se například uvádějí: Perfosamid, Cyclophosphamid, Lomustin, Mechlorethamin, Prednison, Vincristin, Methotrexat, Procarbazin, Peptichemio, Doxorubicin, Vindesin, Cisplatin a Mitomycin (C). Zvláště výhodně se pak používají cytostatika ze skupiny antagonistů pyrimidinu, zejména Gemcitabiny. Uvedený cytostatika jsou volně k dostání a je možné je koupit. Po prvých zkouškách se ukázalo zvláště slibné používání přípravku podle vynálezu ve spojení s Gemcitabinem pro léčení kolorektálních karcinomů a to zejména též u pacientů, kteří jsou rezistentní na 5-FU/Leucovorin. Přitom se Gemcitabin podává ve směsi s přípravkem podle vynálezu, nebo odděleně v dávce od 200 do 5000, výhodně od 500 do 4000 mg/m2, nej výhodněji 1000 mg/m2 ve dnech 1,8, 15 a následnou přestávkou 1 týden a pak znovu v čase 30 - 60 min pomocí infuze. Množství hyaluronidázy podávané společně, případně 1/2 hodiny nebo až 3 hodiny předtím, činilo 100 až 40001.E., výhodně 300 až 10001.E. Pokud se týká chronologie podávání jsou samozřejmě možné obměny.
Dále je možné používat přípravek, vyrobený podle vynálezu, jako léčivo k terapii nádorů, případně k profylaxi nádorů, bez přídavku dalších látek. Zvláště přídavek cytostatika není nutně potřebný. To spočívá na poznatku, že prostředek podle vynálezu odbouráváním kyseliny hyaluronové u nádorových buněk tyto může současně demaskovat s následkem, že imunitní systém těla takto demaskované buňky nádoru může rozpoznat a zničit.
Příklady provedení vynálezu
Příklad
V dalším bude vynález blíže osvětlen pomocí příkladu výroby. Přitom se použily tyto pufry: citrátový pufr spH8,0 z 2,80% obj. 0,lm roztoku kyseliny citrónové a 97,20% obj. 0,2m roztoku dinatriumhydrogenfosfátu; pufr zoctanu sodného spH4,2 z 3,33% obj. lm roztoku octanu sodného, 6,66% obj. lm kyseliny octové a 90,01 % obj. vody. Pokud se použije voda
-4CZ 289560 B6 v některém pufru, nebo v jiné souvislosti příkladu provedení, pak jde o stupeň čistoty „pro injekce“.
Jako systém zkoušení pro stanovení aktivity hyaluronidázy v meziproduktech a v konečných produktech se použila zkouška snížení zákalu. Stanovení spočívá na působení hyaluronidázy, hydrolyzující kyselinu hyaluronovou. Kyselina hyaluronová vytváří zákal s vhodnými látkami, jako je například normální koňské sérum, nebo roztok albuminu. Snižování zákalu v reakční směsi se sleduje spektrálním fotometrem (zkouška na snížení zákalu). Meziprodukty se podle potřeby předem zření fosfátovým pufrem, lyofylizované konečné produkty se rozpustí ve fyziologickém roztoku (podmínky: teplota místnosti). Pak se přidá zkušební roztok (30 mg kyseliny hyaluronové, rozpouštěné v 25 ml redestilované vody a ve dni stanovení zředěné fosfátovým pufrem v poměru 1 + 2). Dodatečně se přidá použitelný roztok séra. Množství kyseliny hyaluronové se volí tak, aby se použil přebytek vůči stanovovanému množství enzymu. Snížení zákalu se určuje fotometricky snížením extinkce při 640 nm. Aktivita se vypočítá ze získané extinkce pomocí srovnávací křivky (vzniklé ze standardních zředění). Jako standard se použil vnitřní standard, jehož složení souhlasí se složením konečného produktu a jehož aktivita byla zjištěna pomocí standardu WHO opakovaným stanovením. Aktivita standardu WHO byla stanovena pomocí vhodného londýnského základního standardu (mezinárodní standard).
Nejprve se 30 kg býčích varlat, zbavených kůže a očištěných, v polozmraženém stavu rozemele mlýnkem na maso. Získaná kaše se míchá alespoň 4 hodiny s 30 1 0,1 m kyseliny octové, přičemž se převedou do roztoku bílkoviny, a/nebo enzymy. Eluát se oddělí odstředěním nebo filtrací. Zbytek se zahodí.
Takto získaný eluát se pak podrobil frakcionovanému srážení síranem amonným. K tomu účelu se za míchání přidalo 212 g síranu amonného na litr a po jeho rozpuštění se ještě 30 minut míchalo. Z toho vznikl asi 17,6 % hmotn. roztoku síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu je asi 1). Sraženina se odstředila, případně odstředěné kapalině, se přidalo 282 g síranu amonného a 30 minut se míchalo. Z toho vznikl asi 34,3% hmot, roztok síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu, obsahujícího síran amonný, je asi 1,1009). Sraženina se nechala přes noc usadit. Sraženina se oddělila filtrací, případně odstředěním, přičemž se získala sražená frakce hyaluronidázy jako pevná látka. Sražená frakce hyaluronidázy se suspendovala v asi 4 1 vody, případně se rozpustila a dialyzovala. Dialýza probíhala až do osmolality 20 mosm/kg. Obsah bílkoviny po dialýze se přidáním vody nastavil na 1,9-2,1 % (podle Kjeldahla). U takto získaného roztoku se pH uvedlo přídavkem 1 nNaOH na 5,1. Po odstředění dialýzou oddělené sraženiny, získané síranem amonným, následovala sterilizační filtrace.
Takto získaný surový přípravek (sražená frakce hyaluronidázy) se zředil na obsah bílkovin 1,4- 1,6 % (podle Kjeldahla) a pak se přidala 1/10 jeho objemu citrátového pufru. Po přidání 2,5 - 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého (30 ml/g bílkoviny) se nastavilo pH na 8,5, 30 minut se míchalo a pak se odstředilo. Vzplývající kapalina se dekantovala a zahodila. Pak se provedla dvě promytí sraženiny promývacím pufrem (ldíl citrátového pufru a 10 dílů vody). Objem promývacího pufru při každém promytí přitom odpovídal celkovému objemu surového přípravku a citrátového pufru. Přitom se po každém rozmíchání sedliny v promývacím pufru nastavilo pH na 8,5 pomocí 0,lm kyseliny citrónové. Vzplývající kapalina, odstředěná po každém promytí, se zahodila. Sedlina se pak rozmíchala v dvojnásobném objemu pufru z octanu sodného a pH se přidáním kyseliny octové (konc.) nastavilo na 4,2. Po míchání (30 minut) následovalo odstředění desorpční směsi. Dekantovaná vzplývající kapalina se pak zpracovala následujícím způsobem a sedlina se zahodila.
Takto vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se pak sterilizačně filtrovala ponorným filtrem (vrstvy fy. Seitz, typ BIO 10) a pak se zahustila pomocí ultrafiltru smezí vyloučení 10 000 Dalton (patrony z dutých vláken, případně kazetový systém fy. Millipore) až do případné minimální aktivity 5500 I.E./ml. Pak se při konstantním objemu dialyzovalo až do osmolality
-5CZ 289560 B6
10-30mosm/kg. Před dalším zpracováním se odebral vzorek ke stanovení bílkovin a aktivity a vypočítal se poměr I.E. hyaluronidáza/mg bílkoviny (stanovení bílkovin dle Kjeldahla).
Na litr takto získaného produktu se přidalo 0,26 litru 3,6% částečného hydrolyzátu želatiny, tak aby směs obsahovala 7,5 mg želatinového částečného hydrolyzátu v ml. Na to navázala sterilizační filtrace. Pak mohlo dojít k balení s uvedením požadované aktivity v jednotce balení. Přitom se přidalo k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny, případně vody, přičemž se vždy muselo přidat k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny jako ochranného koloidu. Nakonec proběhlo plnění do ampulek 1 ml na příklad přes membránový filtr 0,2 pm, nebo přes filtrační svíčku. Ihned po naplnění se ampulky zmrazily a lyofylizovaly. K zatavení ampulek má dojít naráz tak, aby zbytková vlhkost v uzavřeném přípravku činila pod 5 % (ztráta sušením pod DAB 10).
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši, přičemž se z kaše v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovanému srážení síranem amonným a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, přičemž se sražená frakce hyaluronidázy podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy se pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se galenicky upraví, vyznačující se tím, že se prvé frakcionované srážení provádí v 10 až 29% vodném roztoku síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65% vodném roztoku síranu amonného, a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltrací s mezí vyloučení 5000 až 30 000.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se roztok bílkovin a enzymů z kaše v kyselém prostředí připraví pomocí 0,02 až 0,2 molámí, výhodně 0,1 molámí, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k varlatům činí 0,2 : 1 až 5 : 1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1, nej výhodněji 1:1, přičemž se směs kaše a kyseliny octové míchá nejméně 2 hodiny, výhodně více než 4 hodiny a přitom se takto získaný eluát oddělí od nerozpustných pevných částic odstředěním nebo filtrací.
- 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni v 15 až 20% výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni ve 30 až 40%, výhodně v 34,3% vodném roztoku síranu amonného.
- 4. Způsob podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, že se v prvém stupni vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy oddělí od kapalné fáze odstředěním nebo filtrací.
- 5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že se sražená frakce hyaluronidázy suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30 mosm/kg, že se obsah bílkovin v dialyzované sražené frakci hyaluronidázy nastaví na 1,0 až 4,0 %, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla, že se pak upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a že se vzniklá sraženina odstředí.
- 6. Způsob podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím, že se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni dialýzy, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, že se pak přidá citrátový pufr o pH 8,0 v objemu 1/5 až-6CZ 289560 B61/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, že se pak provede stupeň adsorpčního postupu přidáním roztoku 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, obzvláště asi 30 ml/g bílkoviny, že se po provedeném stupni postupu adsorpce podrobí získaná sraženina nejméně jednomu promývání při pH 7,5 až 9,5, výhodně při pH asi 8,5 a že se pak rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce.
- 7. Způsob podle některého z nároků laž6, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provede s mezí vyloučení 9000 až 11 000, výhodně 10 000.
- 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provádí tak, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 30001.E./ml, výhodně nejméně 55001.E./ml.
- 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, v y z n a č u j í c í se t í m, že se po ultrafiltraci provede dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.
- 10. Způsob podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že se po dialýze k oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltraci provede sterilizační filtrace.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19726626A DE19726626C1 (de) | 1997-06-17 | 1997-06-17 | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ191098A3 CZ191098A3 (cs) | 1999-01-13 |
CZ289560B6 true CZ289560B6 (cs) | 2002-02-13 |
Family
ID=7833389
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19981910A CZ289560B6 (cs) | 1997-06-17 | 1998-06-17 | Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1624057B1 (cs) |
AT (2) | ATE398171T1 (cs) |
CZ (1) | CZ289560B6 (cs) |
DE (3) | DE19726626C1 (cs) |
DK (1) | DK1624057T3 (cs) |
ES (2) | ES2306004T3 (cs) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5866120A (en) | 1995-11-22 | 1999-02-02 | Advanced Corneal Systems, Inc. | Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase |
US6610292B2 (en) | 1995-11-22 | 2003-08-26 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders |
DE19726626C1 (de) * | 1997-06-17 | 1998-09-03 | Pharma Dessau Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats |
WO2004092361A1 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Process for isolating and purifing ovine hyaluronidase |
CN103725659A (zh) * | 2013-11-24 | 2014-04-16 | 青岛康原药业有限公司 | 一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法 |
DE102015107307B3 (de) * | 2015-05-11 | 2016-09-08 | Labor L + S Aktiengesellschaft | Optisches Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DD24229A (cs) * | ||||
US3708575A (en) * | 1970-05-13 | 1973-01-02 | Biorex Laboratories Ltd | Method for the treatment of atherosclerosis employing glucuronoglycos-aminoglycan-hyaluronate-lyase |
RU2027759C1 (ru) * | 1992-02-03 | 1995-01-27 | Пак Владимир Николаевич | Способ получения гиалуронидазы |
RU2054943C1 (ru) * | 1992-03-30 | 1996-02-27 | Харьковское предприятие по производству иммунобиологических и лекарственных препаратов "Биолек" | Способ получения гиалуронидазы |
US5747027A (en) * | 1995-04-07 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | BH55 hyaluronidase |
US5958750A (en) * | 1996-07-03 | 1999-09-28 | Inctye Pharmaceuticals, Inc. | Human hyaluronidase |
DE19726626C1 (de) * | 1997-06-17 | 1998-09-03 | Pharma Dessau Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats |
-
1997
- 1997-06-17 DE DE19726626A patent/DE19726626C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-06-15 DE DE59813491T patent/DE59813491D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-15 AT AT05090293T patent/ATE398171T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-06-15 AT AT98250209T patent/ATE323760T1/de active
- 1998-06-15 ES ES05090293T patent/ES2306004T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-15 DE DE59814240T patent/DE59814240D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-15 ES ES98250209T patent/ES2263190T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-15 EP EP05090293A patent/EP1624057B1/de not_active Revoked
- 1998-06-15 EP EP98250209A patent/EP0892045B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-15 DK DK05090293T patent/DK1624057T3/da active
- 1998-06-17 CZ CZ19981910A patent/CZ289560B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0892045A2 (de) | 1999-01-20 |
CZ191098A3 (cs) | 1999-01-13 |
EP1624057A3 (de) | 2007-03-07 |
DE59813491D1 (de) | 2006-05-24 |
ATE398171T1 (de) | 2008-07-15 |
DE59814240D1 (de) | 2008-07-24 |
ATE323760T1 (de) | 2006-05-15 |
DE19726626C1 (de) | 1998-09-03 |
ES2306004T3 (es) | 2008-11-01 |
EP0892045B1 (de) | 2006-04-19 |
EP1624057A2 (de) | 2006-02-08 |
EP0892045A3 (de) | 2001-02-07 |
EP1624057B1 (de) | 2008-06-11 |
ES2263190T3 (es) | 2006-12-01 |
DK1624057T3 (da) | 2008-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5439882A (en) | Blood substitute | |
US5099003A (en) | Method of preparing a sterile plasma-protein solution containing fibrinogen and factor xiii | |
US4341764A (en) | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor | |
US4482485A (en) | Method of preparation of human urine origin colony-stimulating factor and kallikrein | |
GB1597204A (en) | Process of preparing a serum protein composition for intravenous application | |
US3916026A (en) | Method for the preparation of gamma-globulin suitable for intravenous use | |
KR960007922B1 (ko) | 조직단백질 pp4의 저온살균법 | |
US4845078A (en) | Method for treating hematopoietic diseases | |
US4455300A (en) | Fibronectin compositions | |
JP2954347B2 (ja) | プリン誘導体及びグルタチオンで安定化されたポリヘモグロビン | |
CZ289560B6 (cs) | Způsob výroby přípravku obsahujícího hyaluronidázu | |
JPS6042207B2 (ja) | 胎盤よりプラスミノ−ゲン型活性化合物を抽出する方法 | |
CZ299357B6 (cs) | Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu a zpusoby jeho prípravy | |
JPH10505322A (ja) | カゼインから得られるプペチドを浸透圧剤としておよび重炭酸塩イオンを緩衝剤として含む透析液 | |
JPH06312922A (ja) | 美白剤 | |
JPH06504290A (ja) | シュウ酸カルシウム結石病の治療用化合物および医薬組成物 | |
DE69130483T2 (de) | Verbesserter blutersatz | |
CN85103712A (zh) | 血细胞分离剂及配制方法 | |
JPH03505200A (ja) | 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用物質を含む製剤の製造方法 | |
Bruning | Purification and clinical application of the four factors of the prothrombin complex | |
JPH02215730A (ja) | 細胞増殖抑制剤 | |
JPH054399B2 (cs) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180617 |