CZ191098A3

CZ191098A3 - Způsob výroby hyaluronidázy a její použití

Info

Publication number: CZ191098A3
Application number: CZ981910A
Authority: CZ
Inventors: Below Gudrun Von; Bernhard Schweigle; Bernd Göricke
Original assignee: Pharma Dessau Gmbh
Priority date: 1997-06-17
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 1999-01-13
Also published as: ES2263190T3; EP0892045B1; EP1624057A3; ATE398171T1; EP1624057B1; DE19726626C1; DE59813491D1; DK1624057T3; ATE323760T1; DE59814240D1; EP0892045A2; EP1624057A2; CZ289560B6; ES2306004T3; EP0892045A3

Description

Způsob výroby hyaluronidázy a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši a z kaše se v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovánému srážení síranem amonným, a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, přičemž se sražená frakce hyaluronidázy podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, přičemž se dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a při čemž se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy galenicky upraví, jakož i použití takto vyrobeného přípravku, obsahujícího hyaluronidázu.

Oblast techniky

Jako hyaluronidáza se označuje skupina enzymů, které štěpí kyselinu hyaluronovou. Hyaluronová kyselina je vytvořena lineární sestavou střídaj ících se zbytků kyseliny glukuronové a zbytků N-acetylglukosaminu a vykazuje molekulovou hmotnost od méně než 20 000 až daleko přes 1 000 000. V organismu kyselina hyaluronová tvoří zejména hlavní součást určitých vysokomolekulárních proteoglykanů, které se vyskytují například ve tkáních kůže, chrupavek a ve vazivech. V takových proteoglykanech, například v chondroitin-4/6-sulfátu a mukotinsulfátu, případně v dermatansulfátu, tvoří kyselina hyaluronová sice ústřední, • ·· · nikoliv však s bílkovinou kovalentně vázanou jednotku. Hyaluronidázy mohou štěpením proteoglykanů vytvořit tkáň propustnou pro cizí látky. Vyskytují se zejména v akrosomu spermií a jejich štěpné působení na proteoglykany umožňuje buňkám spermií nakonec přirozené splynutí s vaječnou buňkou. Proto jsou všechny spermie, zásadně obsažené ve varlatech všech druhů zvířat, vhodné k získávání hyaluronidáz v hospodářsky použitelných množstvích. Zejména jsou vhodná varlata velkých jatečných zvířat.

Při srážení bílkovin se rozpuštěné bílkoviny a/nebo enzymy precipitují reakcí se srážedlem. Při frakcionovaném srážení se využívá toho, že různé bílkoviny, a/nebo enzymy, vykazují rozdílnou afinitu ke srážedlu. Při tom se většinou v prvém stupni srážení vysrážejí a oddělí nežádoucí bílkoviny a/nebo enzymy, ve druhém stupni se pak ze zbývajícího roztoku vysrážejí požadované bílkoviny a/nebo enzymy a takto získaná sražená frakce se vede k dalšímu zpracování. Při frakcionovaném srážení je podstatné sladění množství srážedel, použitých v dotyčném stupni srážení, s příslušným výchozím materiálem, případně s množstvím použitého výchozího materiálu. Tohoto sladění se zpravidla dosáhne koncentrací srážedla v roztoku, obsahujícím bílkoviny a/nebo enzymy. Když se například v prvém stupni srážení pracuje s příliš vysokou koncentrací srážedla, pak se rušivě oddělí též žádoucí bílkoviny a/nebo enzymy a tyto jsou ztraceny. Když se naproti tomu v prvém stupni pracuje s příliš nízkou koncentrací srážedla, pak rušivě zůstává v roztoku mnoho nežádoucích bílkovin a/nebo enzymů. Podobné platí pro druhý stupeň srážení, při kterém se maj í vysrážet požadované bílkoviny, a/nebo enzymy.

Výraz dialýza označuje oddělování rozpuštěných molekul podle jejich velikosti pomocí difuse, případně zadržování, na polopropustné membráně. Dialýza se používá zejména pro oddělování vysokomolekulárních látek, jako jsou například bílkoviny a enzymy, od látek nízkomolekulárních, jako jsou například soli, monosacharidy, aminokyseliny a podobně. Při čištění adsorpci a desorpci se jedná o způsob obohacování, který využívá různých adsorpěních vlastostí adsorbovaných látek na adsorbentu. Volbou adsorbentu, jakož i nastavením určitých podmínek adsorpce, jsou určité cílové látky přednostně adsorbovány a/nebo desorbovány a tak obohaceny, zatímco nežádoucí látky buď nejsou adsorbovány a oddělí se s kapalnou fází a/nebo nejsou desorbovány a oddělují se s pevnou fází.

Výraz galenická úprava označuje zpracování látky na přípravek, který se může bezprostředně, nebo po rozpuštění, například ve fyziologickém roztoku soli, dodávat do organismu, aniž by vznikaly problémy se snášenlivostí, podmíněné podáváním.

Z praxe je známo čištění hyaluronidázy srážením těžkými kovy. Tento způsob však vyžaduje zvláště pečlivé odstranění všech iontů těžkých kovů ze získaného přípravku vzhledem k jejich toxicitě. Dále je z praxe známo získávání hyaluronidázy frakcionovaným srážením ethanolem. Při tom bez dalšího nejsou ziskatelné apyrogenní přípravky. Konečně je známé čištění pomocí různých adsorpěních látek, například pomocí aktivního uhlí, fosforečnanu vápenatého, nebo hydroxydu hlinitého. Při tom ale neuspokojuje docílitelný výtěžek.

Jeden způsob výše uvedeného druhu je znám z literatury ze spisu DD-PS-24229. V rámci tohoto známého postupu se ···· pracuje po srážení síranem amonným se dvěma stupni adsorpce a desorpce s hydrátem oxidu hlinitého za použití rozdílných systémů pufrů. V rámci srážení síranem amonným se pracuje s prvním stupni srážení s 30% koncentrací síranu amonného a v druhém stupni srážení s koncentrací 70 % síranu amonného. Při tom se získává apyrogenní přípravek s neuspokojivým výtěžkem a k tomu jsou náklady příliš vysoké.

Podstata vynálezu

Naproti tomu je předmětem předloženého vynálezu vyřešení technického problému, totiž vypracování způsobu výroby přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, který se může provádět s dobrou hospodárností co do nákladů a výtěžku, a který poskytuje přípravek, který je při použití v medicíně zvláště účinný.

K vyřešení tohoto problému bylo podle vynálezu zjištěno, že se frakcionované srážení síranem amonným v prvém stupni provádí v 10 až 29% vodném roztoku, výhodně ve 12 až 25% roztoku, síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65% roztoku, výhodně ve 25 až 50% roztoku, bráno jako % hmotnostní, síranu amonného a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltraci s mezí vyloučení od 5 000 až do 30 000 Dalton, výhodně do 15 000 Dalton. Výraz ultrafiltrace označuje způsob filtrace, při kterém se za tlaku oddělují větší částice, a/nebo molekuly, od rozpouštědel a menších molekul.

Ultrafiltr je při tom označován mezí vyloučení, která udává molekulovou hmotnost, až při které jsou molekuly membránou filtru propouštěny. Výraz % hmotnostní znamená g síranu amonného na 100 g roztoku síranu amonného.

φ φ φφφφ

Způsobem podle vynálezu se překvapivě získá přípravek, který se vyznačuje zvláště vysokou fyziologickou účinnosti a který se při tom může získat relativně jednoduše a za příznivých nákladů. Zvláštní význam při tom má poznatek, že fyziologická účinnost není monotonní funkcí čistoty přípravku. Spíše bylo zjištěno, že přípravek, obsahující hyaluronidázu se zvláště vysokou čistotou, má menší fyziologickou účinnost proti přípravku, vyrobenému podle vynálezu. To může mít řadu příčin. Za prvé může při mimořádně vysoké čistotě chybět stabilizující účinek cizích (neaktivních) bílkovin, což opět vede k nižší aktivitě samotné hyaluronidázy. Takový komplex může též vést ke značně zvýšené době prodlení hyaluronidázy v organismu. Za druhé nelze vyloučit, že při krajně vysoké čistotě hyaluronidázy byly odděleny cizí (neaktivní) bílkoviny, které mohou působit jako adjuvanty pro hyaluronidázu. Přípravek, získaný podle vynálezu však přesto vykazuje, co do různých fyziologických účinků optimální aktivitu, což pravděpodobně, zejména ve srovnání se spisem DD-PS-24 229, je způsobeno poměrně úzkým odstupňováním koncentrací při srážení síranem amonným.

V podrobnostech existují různé možnosti provádění způsobu podle předloženého vynálezu. Následující možnosti j sou výhodné.

Roztok bílkovin a enzymů z břečky v kyselém prostředí se může připravit pomocí 0,02 až 0,2 molární, výhodně 0,1 molární, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k býčím varlatům činí 0,2 : 1 až 5:1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1 , nejvýhodněji asi 1 : 1, přičemž se směs břečky a kyseliny octové nejméně 2 hodiny, výhodně více než ·· ···· hodiny, míchá a potom se takto získaný eluát odstředěním, nebo filtrací oddělí od nerozpustných pevných částic.

Výhodně se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni srážení v 15 až 20% , výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni srážení v 30 až 40% , výhodně ve 34,3% m vodném roztoku síranu amonného, bráno jako % hmotnostní. V prvém stupni srážení vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy se mohou od kapalné fáze oddělit odstředěním nebo filtrací.

Sražená frakce hyaluronidázy se pečlivě suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30 mosm/kg. Obsah bílkovin v dialyzované sražené frakci hyaluronidázy se nastaví na 1,0 až 4,0 %, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla. Pak se upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a vzniklá sraženina se odstředí. Osmolalita je definována rovnicí m = (-ln a^)/M^, kde je m osmolalita v mol/kg (případně mosm/kg), a^ je aktivita rozpouštědla A (zde vody) a je molekulová hmotnost rozpouštědla A . Stanovení obsahu bílkovin podle Kjeldahla je v podstatě známým stanovením dusíku dle Kjeldahla, z něhož se zpětně může vypočítat obsah bílkovin. K tomu se odkazuje na Rompp, Chemie Lexikon,

1995, Paperback Ausgabe, Band 3, s. 2446, jakož i na tam uvedené citáty.

Dále je výhodné, když se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni adsorpce, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, pak se přidá citrátový pufr (pH 8,0) v objemu 1/5 až 1/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, pak se provede

stupeň adsorpčního postupu přidáním 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50 ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, nejvýhodněji asi 30 ml/g bílkoviny, a po provedeném stupni postupu adsorpce se podrobí získaný sediment nejméně jednomu promývání, výhodně 2 promýváním, při pH 7,5 až 9,5, výhodně při asi pH 8,5 a pak se rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce. Promývání se provádí výhodně promývacím pufrem z jednoho dílu citrátového pufru (pH 8) a 1 až 50, výhodně 10 dílů (hmotnostních) vody, přičemž objem promývacího pufru při každém promytí odpovídá celkovému objemu hyaluronidázy + citrátový pufr a přičemž se po každém rozmíchání sraženiny v promývacím pufru nastaví pH na asi 8,5 pomocí 0,1 m roztoku kyseliny citrónové.

Dále je výhodné, když se provede ultrafiltrace s mezí vyloučení 9 000 - 11 000 Dalton, výhodně 10 000 Dalton, a když se provede ultrafiltrace s tím, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 3 000 I.E./ml, výhodně nejméně 5 500 I.E./ml. Stanovení aktivity hyaluronidázy se provádí zkouškou vysvětlenou dále v příkladu provedení. Po ultrafiltraci se může provést dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.

S přihlédnutím k oddělení patogenních zárodků a k zabránění vzniku pyrogenů je výhodné, když se po dialýze pro oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltrací provede sterilizační filtrace. Při sterilizační filtraci se použije filtr, jehož velikost pórů zaručuje zadržení bakterií a případně i virů.

V rámci vynálezu má samozřejmý význam použití • · · · · · přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, pro výrobu léčiv pro léčení chorob, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, jakož i použití přípravků obsahujících hyaluronidázu, vyrobených podle vynálezu, k výrobě léčiv, nebo souprav léčiv pro léčení nádorových chorob, přičemž se přípravek, obsahující hyaluronidázu, smísí s jedním nebo několika obvyklými cytostatiky a galenicky se upraví, nebo se přípravek, obsahující hyaluronidázu, jakož i jedno nebo více cytostatik, balí oddělené nebo odděleně podává jako složka léčivé soupravy. Jako léčivá souprava se při tom označuje takzvané kombinované balení, v němž jsou prostorově oddělené dva přípravky s účinnými látkami, jejichž účinné látky jsou při jedné lékařské indikaci určeny k současnému, nebo časově oddělenému podávání. V druhém případě může být výhodné, když je přípravek s hyaluronidázou určen k podání před cytostatikem. Jako cytostatika se označují látky, které mohou usmrcovat buňky, zejména buňky nádorové, anebo mohou alespoň působit proti jejich šíření.

Jako choroby, které jsou vyvolány tvorbou usazenin v krevním řečišti, je možné například jmenovat: arteriosklerózu, zejména v srdečních koronárních tepnách, v krční tepně a tepnách, zásobujících mozek; v těžkých případech to je původcem srdečního infarktu, apoplexie, poruch prokrvení extremit, vaziv, jakož i ostatních orgánů, jako jsou varlata atd. Tyto choroby jsou vyvolány usazeninami na vnitřních stěnách cév, jimiž je snížen průtok cévami. Tyto usazeniny na vnitřních stěnách se označují jako plak. Plak se může odstranit mechanickou cestou, například pomocí srdečního katetru, ale též chemickou nebo biochemickou cestou. V posledním případě se rozkládají látky, z nichž je plak vytvořen (například hyalin-vápenaté usazeniny) a tak se alespoň částečně převádějí do roztoku. Překvapivě bylo zjištěno při zkoumání průtoku na vyjmutých cévách, zúžených plakem, že použitím přípravku, obsahujícího hyaluronidázu a vyrobeného podle vynálezu, se v protékajícím médiu docílilo pozoruhodné snížení průtokového odporu. To je možné připsat rozpuštění plaku působením hyaluronidázy. V prvých klinických zkouškách byl navíc zjištěno, že se stav pacientů, trpících srdečními oběhovými potížemi, vyvolanými plakem, značně zlepšil po podání přípravku, vyrobeného podle vynálezu. Podávání se provádělo intravenosními injekcemi 1500 jednotek přípravku, rozpuštěného ve fyziologickém roztoku, třikrát týdně. Rovněž je možné podávání injekcemi i.p nebo i.m., jakž i zvolení jiných koncentrací, případně dávek. Rovněž je možné použití pro profylaxi.

Při použití přípravku, vyrobeného podle vynálezu, pro výrobu léčivého prostředku, případně léčivého souboru, pro léčbu nádorových onemocnění, bylo překvapivě zjištěno, že tento speciální přípravek vykazuje zvláště dobré působení jako adjuvans pro rozličná cytostatika. To spočívá pravděpodobně v působení hyaluronidázy, které činí tkáně propustnými. Jako vhodná antineoplastika, případně cytostatika se například uvádějí: Perfosamid, Cyclophosphamid,Lomustin, Mechlorethamin, Prednison, Vincristin, Methotrexat, Procarbazin, Peptichemio, Doxorubicin, Vindesin, Cisplatin a Mitomycin (C). Zvláště výhodně se pak používaj í cytostatika ze skupiny antagonistů pyrimidinu, zejména Gemcitabiny. Uvedená cytostatika jsou volně k dostání a je možné je koupit. Po prvých zkouškách se ukázalo zvláště slibné používání přípravku podle vynálezu ve spojení s Gamcitabinem pro léčení kolorektálních karcinomů a to zejména též u pacientů, kteří jsou resistentní na 5-FU/Leucovorin. Při tom se Gemcitabin podává ve směsi s přípravkem podle

• · · · vynálezu, nebo odděleně v dávce od 200 do 5 000, výhodně od 500 do 4 000 mg/m², nejvýhodněji 1 000 mg/m² ve dnech 1, 8, 15 a následnou přestávkou 1 týden a pak znovu v čase 30-60 min. pomocí infuse. Množství hyaluronidázy podávané společně, případně 1/2 hodiny nebo až 3 hodiny před tím, činilo 100 až 4 000 I.E., výhodně 300 až 1 000 I.E. Pokud se týká chronologie podávání jsou samozřejmě možné obměny.

Dále je možné používat přípravek, vyrobený podle vynálezu, jako léčivo k terapii nádorů, případně k profylaxi nádorů, bez přídavku dalších látek. Zvláště přídavek cytostatika není nutně potřebný. To spočívá na poznatku, že pprostředek podle vynálezu odbouráváním kyseliny hyaluronové u nádorových buněk tyto může současně demaskovat s následkem, že imunitní systém těla takto demaskované buňky nádoru může rozpoznat a zničit.

Příklady provedení vynálezu

Příklad

V dalším bude vynález blíže osvětlen pomocí příkladu výroby. Při tom se použily tyto pufry: citrátový pufr s pH 8,0 z 2,80 % obj. 0,lm roztoku kyseliny citrónové a 97,20 % obj. 0,2m roztoku dinatriumhydrogenfosfátu; pufr z octanu sodného s pH 4,2 z 3 ,33 % obj. lm roztoku octanu sodného, 6,66 % obj. lm kyseliny octové a 90,01 % obj. vody. Pokud se použije voda v některém pufru, nebo v jiné souvislosti příkladu provedení, pak jde o stupeň čistoty pro injekce.

Jako systém zkoušení pro stanovení aktivity hyaluronidázy v meziproduktech a v konečných produktech se ·· ····

použila zkouška snížení zákalu. Stanovení spočívá na působení hyaluronidázy, hydrolyzující kyselinu hyaluronovou. Kyselina hyaluronová vytváří zákal s vhodnými látkami, jako je například normální koňské sérum, nebo roztok albuminu. Snižování zákalu v reakční směsi se sleduje spektrálním fotometrem (zkouška na snížení zákalu). Meziprodukty se podle potřeby předem zředí fosfátovým pufrem, lyofylizované konečné produkty se rozpustí ve fyziologickém roztoku (podmínky: teplota místnosti). Pak se přidá zkušební roztok (30 mg kyseliny hyaluronové, rozpuštěné v 25 ml redestilované vody a ve dni stanovení zředěné fosfátovým pufrem v poměru 1 + 2). Dodatečně se přidá použitelný roztok séra. Množství kyseliny hyaluronové se volí tak, aby se použil přebytek vůči stanovovanému množství enzymu. Snížení zákalu se určuje fotometricky snížením extinkce při 640 nm. Aktivita se vypočítá ze získané extinkce pomocí srovnávací křivky (vzniklé ze standardních zředění). Jako standard se použil vnitřní standard, jehož složení souhlasí se složením konečného produktu a jehož aktivita byla zjištěna pomocí standardu VHO opakovaným stanovením. Aktivita standardu VHO byla stanovena pomocí vhodného londýnského základního standardu (mezinárodní standard) .

Nejprve se 30 kg býčích varlat, zbavených kůže a očištěných, v polozmraženém stavu rozemele mlýnkem na maso. Získaná kaše se míchá alespoň 4 hodiny s 30 1 0,1 m kyseliny octové, přičemž se převedou do roztoku bílkoviny, a/nebo enzymy. Eluát se oddělí odstředěním nebo filtrací. Zbytek se zahodí.

Takto získaný eluát se pak podrobil frakcionovanému srážení síranem amonným. K tomu účelu se za míchání přidalo 212 g síranu amonného na litr a po jeho rozpuštění se ještě ·· ····

minut míchalo.. Z toho vznikl asi 17,6 % hmotn. roztok síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu je asi 1). Sraženina se odstředila, nebo odfiltrovala a zahodila.

K získanému filtrátu, případně odstředěné kapalině, se přidalo 282 g síranu amonného a 30 minut se míchalo. Z toho vznikl asi 34,3 % hmot. roztok síranu amonného (za předpokladu, že hustota extraktu, obsahujícího síran amonný, je asi 1,1009). Sraženina se nechala přes noc usadit. Sraženina se oddělila filtrací, případně odstředěním, při čemž se získala sražená frakce hyaluronidázy jako pevná látka. Sražená frakce hyaluronidázy se suspendovala v asi 4 1 vody, případně se rozpustila a dialyzovala. Dialýza probíhala až do osmolality 20 mosm/kg. Obsah bílkoviny po dialýze se přidáním vody nastavil na 1,9 - 2,1 % (podle Kjeldahla).

U takto získaného roztoku se pH uvedlo přídavkem 1 n NaOH na 5,1. Po odstředění dialýzou oddělené sraženiny, získané síranem amonným, následovala sterilizační filtrace.

Takto získaný surový přípravek (sražená frakce hyaluronidázy) se zředil na obsah bílkovin 1,4 - 1,6 % (podle Kjeldahla) a pak se přidala 1/10 jeho objemu citrátového pufru. Po přidání 2,5 - 3,5 % roztoku hydrátu oxidu hlinitého (30 ml/g bílkoviny) se nastavilo pH na 8,5., 30 minut se míchalo a pak se odstředilo. Vzplývající kapalina se dekantovala a zahodila. Pak se provedla dvě promytí sraženiny promývacím pufrem (1 díl citrátového pufru a 10 dílů vody). Objem promývacího pufru při každém promytí při tom odpovídal celkovému objemu surového přípravku a citrátového pufru. Při tom se po každém rozmíchání sedliny v promývacím pufru nastavilo pH na 8,5 pomocí 0,1 m kyseliny citrónové. Vzplývající kapalina, odstředěná po každém promytí, se zahodila. Sedlina se pak rozmíchala v dvojnásobném objemu pufru z octanu sodného a pH se

přidáním kyseliny octové (konc.) nastavilo na 4,2. Po míchání (30 minut) následovalo odstředění desorpční směsi. Dekantovaná vzplývaj ící kapalina se pak zpracovala následujícím způsobem a sedlina se zahodila.

Takto vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se pak sterilizačně filtrovala ponorným filtrem (vrstvy fy. Seitz, typ BIO 10) a pak se zahustila pomocí ultrafiltru s mezí vyloučení 10 000 Dalton (patrony z dutých vláken, případně kazetový systém fy. Millipore) až do případné minimální aktivity 5 500 I.E./ml. Pak se při konstantní objemu dialyzovalo až do osmolality 10 - 30 mosm/kg. Před dalším zpracováním se odebral vzorek ke stanovení bílkovin a aktivity a vypočítal se poměr I.E. hyaluronidáza/mg bílkoviny (stanovení bílkovin dle Kjeldahla).

Na litr takto získaného produktu se přidalo 0,26 litru 3,6 % částečného hydrolyzátu želatiny, tak aby směs obsahovala 7,5 mg želatinového částečného hydrolyzátu v ml. Na to navázala sterilizační filtrace. Pak mohlo dojít k balení s uvedením požadované aktivity v jednotce balení. Při tom se přidalo k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny, případně vody, při čemž se vždy muselo přidat k tomu potřebné množství částečného hydrolyzátu želatiny jako ochranného koloidu. Nakonec proběhlo plnění do ampulek 1 ml na příklad přes membránový filtr 0,2 μπι, nebo přes filtrační svíčku. Ihned po naplnění se ampulky zmrazily a lyofylizovaly. K zatavení ampulek má dojít naráz tak, aby zbytková vlhkost v uzavřeném přípravku činila pod 5 % (ztráta sušením pod DAB 10).

Claims

Patentové nátolcy

1. Způsob výroby hyaluronidázu obsahujícího přípravku, při kterém se varlata savců, zejména býčí varlata, rozmělní na kaši, přičemž se z kaše v kyselém prostředí rozpustí bílkoviny a enzymy na eluát, který se podrobí frakcionovanému srážení síranem amonným a tak se získá sražená frakce hyaluronidázy, přičemž se sražená frakce hyaluronidázy podrobí dialýze k oddělení síranu amonného, dialyzovaná sražená frakce hyaluronidázy se pro vyčištění podrobí adsorpčnímu a desorpčnímu pochodu na hydrátu oxidu hlinitého a vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy se galenicky upraví, vyznačující se tím, že se prvé frakcionované srážení provádí v 10 až 29% vodném roztoku síranu amonného, a ve druhém stupni srážení v 15 až 65% vodném roztoku síranu amonného, a že se vyčištěná sražená frakce hyaluronidázy před galenickou úpravou podrobí ultrafiltraci s mezí vyloučení 5 000 až 30 000 Dalton,
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se roztok bílkovin a enzymů z břečky v kyselém prostředí připraví pomocí 0,02 až 0,2 molární, výhodně 0,1 molární, kyseliny octové, přičemž hmotnostní poměr kyseliny octové k varlatům činí 0,2 : 1 až 5 : 1, výhodně 0,8 : 1 až 1,2 : 1, nej výhodněj i 1:1, při čemž se směs břečky a kyseliny octové míchá nejméně 2 hodiny, výhodně více než 4 hodiny a při tom se takto získaný eluát oddělí od nerozpustných pevných částic odstředěním nebo filtrací.
3. Způsob podle měkterého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se frakcionované srážení síranem amonným provádí v prvním stupni v 15 až 20% výhodně v 17,5% vodném roztoku síranu amonného a v druhém stupni ve 30 až 40% , výhodně v 34,3% vodném roztoku síranu amonného.
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se v prvém stupni vysrážené nežádoucí bílkoviny a enzymy a v druhém stupni srážení získaná sražená frakce hyaluronidázy oddělí od kapalné fáze odstředěním nebo filtrací.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se sražená frakce hyaluronidázy suspenduje ve vodě a dialýza se provede až do osmolality 10 až 40 mosm/kg, výhodně do 20 až 30 mosm/kg, že se obsah bílkovin v dialyzované sražené frakci hyaluronidázy nastaví na 1,0 až 4,0 %, výhodně na 1,9 až 2,1 %, podle Kjeldahla, že se pak se upraví pH na 4,5 až 5,8, výhodně na asi 5,1 a že se vzniklá sraženina odstředí.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se obsah bílkovin sražené frakce hyaluronidázy, použité ve stupni dialýzy, nastaví na 1,0 až 2,0 %, výhodně na 1,4 až 1,6 %, dle Kjeldahla, že se pak přidá citrátový pufr o pH 8,0 v objemu 1/5 až 1/20, výhodně 1/10 objemu použité sražené frakce hyaluronidázy, že se pak provede stupeň adsorpčního postupu přidáním roztoku 1,0 až 10%, výhodně 2,5 až 3,5% roztoku hydrátu oxidu hlinitého, přičemž množství přidaného roztoku oxidu hlinitého činí 10 až 50 ml/g bílkoviny, výhodně 20 až 40 ml/g bílkoviny, nejvýhodněji asi 30 ml/g bílkoviny, že se • · · · « • « • · » · · ·· · ·« · · • · ·· « po provedeném stupni postupu adsorpce podrobí získaná sraženina nejméně jednomu promývání při pH 7,5 až 9,5, výhodně při pH asi 8,5 a že se pak rozmícháním ve vodném roztoku s pH 3,5 až 6,0, výhodně s pH asi 4,5, provede stupeň desorpce.
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provede s mezí vyloučení 9 000 až 11 000 Dalton, výhodně 10 000 Dalton.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace provádí tak, aby aktivita získané hyaluronidázy činila nejméně 3 000 I.E/ml, výhodně nejméně 5 500 I.E./ml.
9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se po ultrafiltraci provede dialýza až do osmolality 5 až 50 mosm/kg, výhodně do 10 až 30 mosm/kg.
10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se po dialýze k oddělení síranu amonného a/nebo před ultrafiltraci provede sterilizační filtrace.
11. Použití přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, vyrobeného podle některého z nároků 1 až 10, k výrobě léčiva k léčení chorob, vyvolaných tvorbou plaku v cévách.
12. Použití přípravku, obsahujícího hyaluronidázu, vyrobeného podle některého z nároků 1 až 10, k výrobě léčiva nebo soupravy léčiv k léčení nádorových chorob, kde se ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · • ·· ·· · · přípravek, obsahující hyaluronidázu smísí s jedním cytostatikem, nebo s více obvyklými cytostatiky, a galenicky se upraví, nebo kde jsou přípravek, obsahující hyaluronidázu, jakož i jedno cytostatikum, nebo více cytostatik odděleny a tvoří odděleně podávané složky léčivé soupravy.
13. Použití podle nároku 12 k výrobě léčiva k léčení kolorektálních karcinomů.
14. Použití podle některého z nároků 12 nebo 13, při kterém se použije cytostatikum, nebo směs cytostatik ze skupiny antagonistů pyrimidinu, výhodně Gemcitabin.