RU2054943C1 - Способ получения гиалуронидазы - Google Patents
Способ получения гиалуронидазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2054943C1 RU2054943C1 SU5043835A RU2054943C1 RU 2054943 C1 RU2054943 C1 RU 2054943C1 SU 5043835 A SU5043835 A SU 5043835A RU 2054943 C1 RU2054943 C1 RU 2054943C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- subjected
- preparing
- chloroform
- solution
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способу получения ферментов. Полученные ферменты могут быть использованы в медицине для приготовления лекарственных средств и в научно-исследовательской работе. Изобретение направлено на повышение выхода целевого продукта и улучшение качества препарата. При производстве гиалуронидазы полученный из семенников крупного рогатого скота экстракт фермента очищают. Концентрируют на полых волокнах. Волокна отсекают вещества с молекулярной массой более 10000 а. е. с. до 1/8 - 1/10 от исходного объема. Затем добавляют 4 - 6 об.% хлороформа в присутствии 1 моль/л натрия хлористого. 3 табл.
Description
Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способу получения ферментов, которые могут быть использованы в медицине для приготовления лекарственных средств и в научно-исследовательской работе.
Известен способ получения гиалуронидазы из Streptomyces путем выращивания продуцента на питательной среде, отделения культуральной жидкости, концентрирования раствора, осаждения фермента органическими растворителями и высушивания (авт.св. СССР N 974816, кл. С 12 9/26, 1982).
Данный способ имеет ряд существенных недостатков: длительность процесса, низкий выход целевого продукта, большие объемы культуральной жидкости и органических растворителей, что затрудняет промышленное внедрение препарата.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата из семенников крупного рогатого скота путем экстракции водой, двухкратного осаждения ацетоном при температуре от 0 до -2оС, выдерживания раствора при температуре 6-10оС, обработки эфиром и ацетоном (Лидаза. Регламент производства N7-91 Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов. 1991, Харьков).
Данный способ также имеет ряд недостатков: значительная потеря активности фермента за счет тепловых стадий и обработки органическими растворителями, недостаточная очистка от низкомо- лекулярного балласта, большие объемы органических растворителей, низкий выход целевого продукта, длительность технологии.
Изобретение направлено на решение следующих задач: повышение выхода целевого продукта за счет сокращения длительности технологии, удаления балластных белков без обработки агентами, приводящими к денатурации фермента, удаления низкомолекулярных балластных веществ, стандартизация технологии.
При использовании изобретения длительность процесса составляет 6-7 сут (по прототипу 12-14 сут), увеличен выход целевого продукта в 2,5-3,5 раза, что связано с отсутствием обработок ацетоном и сокращением длительности процесса; уменьшено содержание низкомолекулярных примесей: цветность препарата, полученного по предлагаемому способу, при 400 нм не более 0,1 (по прототипу 0,25-0,3) при одинаковом содержании фермента.
Это достигается тем, что полученный экстракт фермента подвергают очистке и концентрации до 1/8-1/10 от исходного объема путем ультрафильтрации через полые волокна, пропускающие белковые молекулы молекулярной массы не более 10000 а. е. м. и осаждения балластных белков при помощи хлороформа и натрия хлористого.
Способ осуществляют следующим образом.
Семенники крупного рогатого скота очищают от оболочек и подвергают измельчению. Полученную массу экстрагируют водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 в течение 6 ч при температуре 6-10оС. Затем экстракт подвеpгают центрифугированию и полученный прозрачный раствор концентрируют путем ультрафильтрации на полых волокнах (ВПУ 15) до конечного объема 1/8-1/10 от исходного. Раствор охлаждают до 4-8оС и смешивают с охлажденным до температуры от -10 до -15оС хлороформом. Смесь интенсивно перемешивают, прибавляют натрий хлористый и выдерживают в течение 1,5-2 ч, а затем осадок отделяют центрифугированием. Прозрачный фильтрат очищают от хлористого натрия путем ультрафильтрации. Очищенный и концентрированный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофилизации.
П р и м е р 1. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрированию до конечного объема 2,75 л (1/8 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6оС, медленной струей приливают 110 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 4 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 159,5 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,0 г с активностью 128 условных единиц (УЕ) в 30 мг/мл.
П р и м е р 2. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрируют до конечного объема 2,45 л (1/9 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6оС, медленной струей приливают 123 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 5 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 142,1 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,3 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл.
П р и м е р 3. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрированию до конечного объема 2,2 л (1/10 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6оС, медленной струей приливают 132 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 6 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 127,6 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,5 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл.
Выбранные соотношения подтверждаются данными, приведенными в табл. 1 и 2.
Как видно из данных, приведенных в табл. 1, оптимальным является концентрация раствора 1/8-1/10 от первоначального объема. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности препарата, что, в свою очередь, снижает выход целевого продукта. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, оптимальным является содержание хлороформа в растворе продукта 4-6 об. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности фермента.
Данные, подтверждающие преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом, приведены в табл. 3.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ из семенников крупного рогатого скота, включающий измельчение сырья, экстракцию водным раствором уксусной кислоты, обработку органическим растворителем, перемешивание, инкубацию с последующим отделением целевого продукта, его ампулирование и высушивание, отличающийся тем, что после экстракции сырье центрифугируют, надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации и концентрированию до 1/8 - 1/10 от исходного объема, после охлаждения добавляют 4 - 6 об.% хлороформа в присутствии 1 моль/л хлористого натрия, центрифугируют, а супернатант повторно подвергают ультрафильтрации.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5043835 RU2054943C1 (ru) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | Способ получения гиалуронидазы |
UA93080809A UA6702C2 (uk) | 1992-03-30 | 1993-03-16 | Спосіб одержання гіалуронідази |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5043835 RU2054943C1 (ru) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | Способ получения гиалуронидазы |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2054943C1 true RU2054943C1 (ru) | 1996-02-27 |
Family
ID=21605069
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5043835 RU2054943C1 (ru) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | Способ получения гиалуронидазы |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2054943C1 (ru) |
UA (1) | UA6702C2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0892045A3 (de) * | 1997-06-17 | 2001-02-07 | Pharma Dessau GmbH | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats |
RU2671537C2 (ru) * | 2016-09-01 | 2018-11-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Самсон-Мед" | Препарат гиалуронидазы и способ его получения |
-
1992
- 1992-03-30 RU SU5043835 patent/RU2054943C1/ru active
-
1993
- 1993-03-16 UA UA93080809A patent/UA6702C2/uk unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Регламент по производству лидазы Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов. 1991, Харьков * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0892045A3 (de) * | 1997-06-17 | 2001-02-07 | Pharma Dessau GmbH | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats |
EP1624057A3 (de) * | 1997-06-17 | 2007-03-07 | Riemser Arzneimittel AG | Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparates |
RU2671537C2 (ru) * | 2016-09-01 | 2018-11-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Самсон-Мед" | Препарат гиалуронидазы и способ его получения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
UA6702C2 (uk) | 1994-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU694176B2 (en) | Novel process for the isolation of clavulanic acid and of pharmaceutically acceptable salts thereof from the fermentation broth of streptomyces sp. p 6621 ferm p 2804 | |
US4793996A (en) | Method of making soybean extract inhibitor | |
WO1984000688A1 (fr) | Preparations immunostimulantes a base d'arn ribosomaux et procede de preparation des arn | |
RU2054943C1 (ru) | Способ получения гиалуронидазы | |
EP0813536B2 (en) | Process for the preparation of pharmaceutically acceptable salts of clavulanic acid | |
RU2180002C2 (ru) | Способ получения коллагеназы | |
US5061627A (en) | Method for preparing enzymes from crustaceans | |
SU1575946A3 (ru) | Способ получени концентрата глюкозоизомеразы | |
RU2435862C1 (ru) | Способ получения высокополимерной рнк из отработанных пивных дрожжей | |
RU2208637C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
RU1417244C (ru) | Способ получения вещества, восстанавливающего функцию предстательной железы | |
RU2159284C1 (ru) | Способ получения гиалуронидазы | |
US2652357A (en) | Selective extraction of substances possessing antipernicious anemia activity with diethylacetic acid | |
RU2041885C1 (ru) | Способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб | |
RU2051969C1 (ru) | Способ получения бактериальных липополисахаридов | |
RU2130070C1 (ru) | Способ получения пероксидазы | |
RU2055586C1 (ru) | Способ получения средства, обладающего бактерицидным действием | |
RU2023720C1 (ru) | Способ получения фактора xiii свертывания крови | |
KR880001120B1 (ko) | 엘라스타제의 정제 방법(Elastase의 精製方法) | |
RU2090195C1 (ru) | Способ получения рибонуклеазы панкреатической | |
SU706088A1 (ru) | Способ получени гидролизата печени свиньи | |
JPS61293391A (ja) | 補酵素qの製造法 | |
SU787413A1 (ru) | Способ получени фосфодиэстераз | |
SU854978A1 (ru) | Способ очистки молокосвертывающего фермента | |
RU2045279C1 (ru) | Способ получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью |