CZ299357B6 - Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu a zpusoby jeho prípravy - Google Patents
Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu a zpusoby jeho prípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299357B6 CZ299357B6 CZ0310098A CZ310098A CZ299357B6 CZ 299357 B6 CZ299357 B6 CZ 299357B6 CZ 0310098 A CZ0310098 A CZ 0310098A CZ 310098 A CZ310098 A CZ 310098A CZ 299357 B6 CZ299357 B6 CZ 299357B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hemoglobin
- solution
- weight
- total
- polymerized
- Prior art date
Links
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 243
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 243
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 228
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 42
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 108010076770 hemoglobin polymer Proteins 0.000 claims abstract description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 28
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 23
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 19
- 108010003320 Carboxyhemoglobin Proteins 0.000 claims description 17
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 14
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 12
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000007872 degassing Methods 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 8
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 claims description 7
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 claims description 3
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 14
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 9
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 6
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010002255 deoxyhemoglobin Proteins 0.000 description 6
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 5
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 5
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 201000001505 hemoglobinuria Diseases 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 108010011424 polyhemoglobin-pyridoxal-5-phosphate Proteins 0.000 description 2
- -1 pyridoxyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- CRZDHHVBLGDCIO-UHFFFAOYSA-N (4,6-diformyl-5-hydroxypyridin-3-yl)methyl dihydrogen phosphate Chemical compound OC1=C(C=O)N=CC(COP(O)(O)=O)=C1C=O CRZDHHVBLGDCIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-carboxyphenoxy)-4-oxobutanoyl]oxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1OC(=O)CCC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 0 CCC(CCCCCC*1=C2C(C3=C4)=C1CCCC(C1)C(CC5)C5C1[C@](C)C4=C(C)C3=C2)[*@@](*CC*C(C1)C2C1C(C(C)C1)C1*2)C(C)=CCC Chemical compound CCC(CCCCCC*1=C2C(C3=C4)=C1CCCC(C1)C(CC5)C5C1[C@](C)C4=C(C)C3=C2)[*@@](*CC*C(C1)C2C1C(C(C)C1)C1*2)C(C)=CCC 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002146 exchange transfusion Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000004931 filters and membranes Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036044 hypoxaemia Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N n-(9,10-dioxoanthracen-1-yl)-4-[4-[[4-[4-[(9,10-dioxoanthracen-1-yl)carbamoyl]phenyl]phenyl]diazenyl]phenyl]benzamide Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2NC(=O)C(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1N=NC(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC2=C1C(=O)C1=CC=CC=C1C2=O AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002103 osmometry Methods 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- WHOMFKWHIQZTHY-UHFFFAOYSA-N pyridoxine 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(CO)=C1O WHOMFKWHIQZTHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- AGGKEGLBGGJEBZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylenedisulfotetramine Chemical compound C1N(S2(=O)=O)CN3S(=O)(=O)N1CN2C3 AGGKEGLBGGJEBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000001043 yellow dye Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Surgery (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu, který obsahuje 10 až 24 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, 18 až 30 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a 45 až 70 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa a zpusoby jeho prípravy. Tento roztok je možno použít pro lécení pacienta postiženého ztrátou krve.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká vodného roztoku pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu a způsobů jeho přípravy. Hemoglobinového roztoku podle vynálezu je možno použít jako nebuněčné náhrady červených krvinek při ztrátě krve apod.
Dosavadní stav techniky
Radu let krevní banky poskytují pro použití v průběhu chirurgických zákroků (v případech úrazů, apod.) plnou krev. Použití plné krve od lidských dárců není však v řadě případů vhodné, a to zejména díky problémům, souvisejícím s vyhledáváním vhodného dárce, se stabilitou a uchovatelností a v neposlední řadě i s eventuální toxicitou takovéto krve, způsobenou přítomností virů a jiných kontaminantů. Tyto problémy jsou zvláště patrné v mimořádných situacích, např. při použití plné krve ve vojenském lékařství. Díky tomu se věnovala značná pozornost vývoji náhrad plné krve od lidských dárců. Vznikla řada modifikací krve lidských nebo savčích dárců. Hemo20 globin bez obsahu stromálních kontaminantů je v oboru znám svou vlastností přenosu a reverzibilního vázání kyslíku nebo jiného ligandu. Neboť toxikologické problémy zabránily jeho použití, hledaly se další způsoby, jak hemoglobin bez obsahu stromálních kontaminantů modifikovat tak, aby vznikl netoxický, farmaceuticky použitelný produkt.
Uvedené modifikace zahrnují (1) získání hemoglobinu bez obsahu nebo s minimálním obsahem stromatu a stromálních kontaminantů; (2) pyridoxylaci; (3) polymeraci nebo zesíťování; (4) odstranění tetrameru; a (5) modifikaci oxidem uhelnatým nebo jinými ligandy.
Hemoglobinové roztoky, připravené uvedenými postupy, sice vykazují schopnost přenášet dos30 tatečné množství kyslíku, a tím zabraňovat ireverzibilním poškozením tkání, objevily se u nich nicméně nežádoucí vedlejší účinky a vlastnosti. Jedním z nejzávažnějších vedlejších účinků je přitom např. zhoršení činnosti ledvin. Vznik tohoto problému se přičítal přítomnosti nežádoucích kontaminantů, např. bakteriálního endotoxinu nebo fragmentů membrán červených krvinek (stromatu). Přestože uvedené kontaminanty skutečně způsobují poruchy renálních funkcí, i použití hemoglobinových roztoků bez obsahu nebo s minimálním obsahem výše uvedených kontaminantů má za následek závažnou renální dysfunkci. Příčina je připisována fyziologicky nepřijatelnému množství nezpolymerovaného hemoglobinového tetrameru. Dalšími vedlejšími účinky při infuzi tetramerového hemoglobinu jsou vazokonstrikce, hemoglobinurie, zpomalení srdečního rytmu, zvýšení středního arteriálního krevního tlaku a extravazace infuzátu zejména do pobřišniční duti40 ny.
Dodnes není známa jediná hemoglobinová krevní náhrada, u které by nedocházelo ke komplikacím vzniklým v souvislosti s její toxicitou. Doposud popsané produkty měly také po podání lidskému pacientovi nepřijatelně nízký poločas, což má za následek nutnost neustálé výměny krve, a to ve velmi krátkých intervalech. Potřeba hemoglobinových produktů, které jsou pro pacienta netoxické a které mají po podání vyšší hodnotu poločasu, tedy dále trvá. Samozřejmé přitom je, že tyto produkty musí být schopny reverzibilně vázat a přenášet kyslík ke tkáním, a to obdobným způsobem, jakým se tomu děje u plné krve.
Podstata vynálezu
Vynález se týká hemoglobinových náhrad, které jsou pro člověka netoxické a které vykazují po podání člověku poločas minimálně 15 hodin. Hemoglobinové produkty podle vynálezu jsou pyri55 doxylátové a polymerované a neobsahují stromální, virové ani jiné toxické kontaminanty. Tyto
-1 CZ 299357 B6 produkty navíc obsahují pouze minimální množství leukocytů (bílých krvinek) a krevních destiček.
Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení
- A) je vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu, který obsahuje 10 až 24 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, až 30 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a až 70 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa.
Přednostní provedení prvního aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména
- B) Vodný roztok podle provedení A), který obsahuje
a) hemoglobin celkem v koncentraci 9,5 až 12,0 g/dl;
b) methemoglobin celkem v množství nižším než 8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
c) karboxyhemoglobin celkem v množství nižším než 5 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost 20 hemoglobinu celkem;
d) sodík v koncentraci od 135 do 155 mmol/1;
e) draslík v koncentraci od 3,5 do 4,5 mmol/1 a
f) chlorid v koncentraci od 85 do 110 mmol/kg.
- C) Vodný roztok podle provedení B), který obsahuje
g) volné železo celkem v množství nižším než 2,0 ppm;
h) tetramer hemoglobinu celkem v množství nižším než 0,8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem; a
i) endotoxin v množství nižším než 0,03 EU/ml.
- D) Vodný roztok podle provedení C), který dále obsahuje
j) fosfolipidy v množství nižším než 50 ng/Rb; a
k) glykolipidy v množství nižším než 2 ng/Rb.
- E) Vodný roztok podle provedení B), který má osmolalitu od 280 do 360 mmol/kg.
- F) Vodný roztok podle provedení B), který vykazuje hodnotu disociace kyslík-hemoglobin 3,0 až 4,3 kPa.
-G) Vodný roztok podle provedení A), který v těle humánního pacienta vykazuje poločas asi hodin.
-H) Vodný roztok podle provedení A), který v těle humánního pacienta vykazuje poločas asi 24 hodin.
-1) Vodný roztok podle provedení A), který po infuzí humánnímu pacientovi v množství až do asi 5 1 nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin.
- J) Vodný roztok podle provedení A), který po infuzi humánnímu pacientovi v množství až do 50 asi 5 I nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin a v těle humánního pacienta vykazuje poločas asi 24 hodin.
-2CZ 299357 B6
- K.) Vodný roztok podle provedení A), kde hemoglobinem je glutaraldehydem zpolymerovaný hemoglobin.
- L) Roztok podle provedení A), kde hemoglobin obsahuje asi 16 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a asi 58 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa.
- M) Vodný roztok podle provedení A), který vykazuje ío a) obsah hemoglobinu celkem od 9,5 do 12,0 g/dl;
b) obsah methemoglobinu celkem nižší než 8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
c) obsah karboxyhemoglobinu celkem nižší než 5 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
d) hodnotu P50 v rozmezí od 3,0 do 4,3 kPa;
e) osmolalitu od 280 do 360 mmol/kg;
f) koncentraci sodíku od 135 do 155 mmol/1;
g) koncentraci draslíku od 3,5 do 4,5 mmol/1;
h) koncentraci chloridu od 85 do 110 mmol/kg;
i) obsah volného železa celkem pod 2,0 ppm;
j) hladinu tetrameru nižší než 0,8 % hmotnostního, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
k) obsah endotoxinu nižší než 0,03 EU/ml;
l) obsah fosfolipidů nižší než 50 ng/Rb; a
m) obsah glykolipidů nižší než 2 ng/Rb.
-N) Vodný roztok podle provedení A), který obsahuje asi 16 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a asi 58 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa, kde všechna procenta jsou hmotnostní a jsou vztažena na hmotnost hemoglobinu celkem.
- O) Roztok podle provedení N), který po infuzí humánnímu pacientovi v množství až do asi 1,5 1 nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin.
Vynález rovněž zahrnuje způsoby výroby hemoglobinových náhrad podle vynálezu. Tyto postu35 py zahrnují odstranění leukocytů a krevních destiček z krve; promytí a lýzu červených krvinek; odstranění stromálních kontaminantů a stromatu filtrací a tepelným zpracováním; přípravu deoxyhemoglobinu; pyridoxylaci a polymeraci; další přečištění a zahuštění; a odkysličení. Vzniklý hemoglobinový produkt může být formulován k získání hemoglobinového produktu s takovými hladinami různých elektrolytů, které leží v normálních fyziologických rozmezích.
Dalším aspektem předmětu vynálezu je způsob přípravy výše definovaného roztoku zpolymerovaného hemoglobinu, který zahrnuje (a)odstranění leukocytů filtrací směsi obsahující červené krvinky přes filtr, který má minimální průměrnou velikost pórů postačující k zabránění průchodu leukocytů;
(b) lýzu červených krvinek;
(c) přidání oxidu uhelnatého a zahřívání produktu (b) na teplotu asi 60 až 62 °C po dobu asi 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku;
(d) filtraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku za účelem odstranění stromatu a stromálních kontaminantů vysrážených při zahřívání;
(e) odplynění tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku probubláváním tepelně zpracovaného roztoku při teplotě asi 10 °C kyslíkem a potom dusíkem za vzniku pěny;
-3 CZ 299357 B6 (f) pyridoxylaci odplyněného roztoku za vzniku roztoku pyridoxylováného hemoglobinu;
(g) polymerací roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za vzniku roztoku zpolymerovaného hemoglobinu;
(h) sycení roztoku kyslíkem;
(i) přečištění roztoku za účelem odstranění tetramemího hemoglobinu a shromáždění přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu přičemž roztok obsahuje méně než 0,8 % hmotnostního tetrameru, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
(j) odstranění kyslíku z přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu; a (1) úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu na ío fyziologické hodnoty.
Ve výhodném provedení tohoto způsobu se zejména
- odplyněný roztok pyridoxyluje uvedením tohoto odplyněného roztoku do styku s pyridoxal5-fosfátem v molámím poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do asi 3:1, zvláště asi 2:1;
- pyridoxal-5-fosfát se uvádí do styku s hemoglobinem a borhydridem po dobu asi jedné hodiny;
- hemoglobin se v roztoku zpolymeruje uvedením tohoto roztoku do styku s glutaraldehydem v molámím poměru glutaraldehydu k hemoglobinu od asi 24:1;
- roztok se uvádí do styku s glutaraldehydem po dobu asi 18 hodin, načež se reakce ukončí prudkým ochlazením.
Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je způsob přípravy výše definovaného roztoku zpolymerovaného hemoglobinu, který zahrnuje (a) vedení krve s prošlou nebo neprošlou dobou expirace vhodným odsávacím zařízením při sníženém tlaku;
(b)odstranění leukocytů z krve zpracované odsáváním filtrací směsi obsahující červené krvinky přes sadu filtrů, jejichž minimální průměrná velikost pórů postačuje k zabránění průchodu leukocytů;
(c) přidání oxidu uhelnatého k produktu ze stupně (b) za vzniku hemoglobinového roztoku o pH nižším než 7;
(d) promytí roztoku ze stupně (c) 1 % roztokem chloridu sodného za vzniku promytého roztoku;
(e) zředění promytého roztoku ze stupně (d) vodou za vzniku roztoku lýzovaných buněk;
(f) filtraci roztoku lýzovaných buněk přes filtr za vzniku hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů a materiálu buněčných stěn;
(g) zahřívání a filtraci hemoglobinového roztoku ze stupně (f) na teplotu asi 60 až 62 °C po dobu asi 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů;
(h) zkoncentrování a diafíltraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stro40 málních kontaminantů za vzniku roztoku karboxyhemoglobinu;
(i) odplynění roztoku karboxyhemoglobinu probubláváním tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku při teplotě asi 10 °C kyslíkem a potom dusíkem za vzniku pěny;
(j) pyridoxylaci odplyněného roztoku za použití pyridoxal-5-fosfátu při molámím poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1 za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu;
(k) polymerací roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za použití vodného roztoku glutaraldehydu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu s distribucí molekulových hmotností asi 65 až 75 % polymeru a 25 až 35 % tetrameru;
(l) sycení kyslíkem a ředění zpolymerovaného roztoku, dokud roztok neobsahuje asi 4 % hmot50 nostní hemoglobinu;
-4CZ 299357 B6 (m) přečištění roztoku ze stupně (1) za účelem odstranění tetramemího hemoglobinu a shromažďování přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu, přičemž roztok obsahuje méně než 0,8 % hmotnostního tetrameru, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;
(n) odstranění kyslíku z roztoku přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu dusíkem;
(o) úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu na hodnotu asi 8,8 až 9,0; a (p) zkoncentrování a sterilizaci roztoku s upraveným pH ze stupně (o).
ío Ještě dalšími aspekty předmětu vynálezu jsou
i) Vodný roztok obsahující asi 16% hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26% hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a asi 58 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa, kde všechna procenta jsou hmotnostní a jsou vztažena na hmotnost hemoglobinu celkem v roztoku, pro použití jako léčivo pro léčení humánního pacienta, který potřebuje transfuzi.
ii) Roztok podle provedení A) prvního aspektu předmětu vynálezu pro použití pro léčení pacienta postiženého ztrátou krve.
Jak již bylo zmíněno ve výše uvedeném souhrnu, vynález rovněž zahrnuje vodný přípravek pyri20 doxylovaného polymerovaného hemoglobinu, přičemž hemoglobin je glutaraldehydem polymerovaný hemoglobin obsahující tetramerové podjednotky, jejichž distribuce molekulárních hmotností je znázorněna na obr. 3. Tento přípravek může být použit pro výrobu nebuněěné náhrady červených krvinek v tomto případě se přípravek nejprve přečistí, čímž dochází k odstranění tetrameru, načež se sloučí s příslušným množstvím elektrolytů, čímž vzniká fyziologicky přijatel25 ná nebuněčná náhrada červených krvinek, která je následně použitelná v případech, kdy zdravotní stav lidského pacienta vyžaduje infuzi látky - přenašeče kyslíku.
Stručný popis obrazových příloh
Obr. 1 je schematickým diagramem znázorňujícím tu fázi výroby, která vede k získání hemoglobinového roztoku prostého kyslíku pro následnou pyridoxylaci a polymeraci.
Obr. 2 je schematickým diagramem znázorňujícím tu fázi výroby, která zahrnuje pyridoxylaci a 35 polymeraci a která vede k přečištěnému pyridoxylovanému polymerovanému hemoglobinovému produktu prostému kyslíku, a tu fázi výroby, která vede ke vzniku hemoglobinového produktu s fyziologicky odpovídajícími hladinami elektrolytů.
Obr. 3 znázorňuje stopovou analýzu polymerovaného materiálu za použití vysokotlaké kapalino40 vé chromatografie, a to po reakci s glycinem a před přečištěním. Polymerovaný produkt je charakterizován píky při. retenčních dobách 15,57, 16,08, 17,00 a 18,19. Tetramerový materiál je charakterizován píky v retenčních dobách 19,88 a 20,51. Polymemí složka tvoří 76,2 % uvedeného materiálu.
Obr. 4 znázorňuje stopovou analýzu hemoglobinového produktu podle vynálezu za použití vysokotlaké kapalinové chromatografie. Polymerovaný hemoglobin je charakterizován píky v retenčních dobách 15,7, 16,33, 17,32 a 18,56. Tetramer je charakterizován pikem v retenční době 21,18.
Obr. 5 je schematickým diagramem znázorňujícím čisticí fázi sloupcovou chromatografií, která je součástí výrobního postupu podle vynálezu.
Obr. 6 je schematickým diagramem znázorňujícím čisticí fázi membránovou filtrací, která je součástí výrobního postupu podle vynálezu.
-5CZ 299357 B6
Vynález se týká nebuněčné náhrady červených krvinek, která obsahuje zesíťovaný, polymerovaný pyridoxylovaný hemoglobin bez obsahu nebo s minimálním obsahem tetramerových podjednotek, stromatu a stromálních a jiných kontaminantů.
Uváděný výraz „zesíťovaný“ znamená chemické vbudování molekulových můstků na nebo do molekuly, případně mezi molekuly, což má za následek změnu tvaru, velikosti a funkčních nebo fyzikálních vlastností dané molekuly. Zesíťované molekuly mohou být polymerované nebo nepolymerované, tj. zesíťované molekuly mohou být i tetramemí.
Uváděný výraz „tetramer“ se týká molekul hemoglobinu, jejichž molekulová hmotnost je zhruba 64 Kd; výraz se vztahuje jak k nativním, tak i intramolekulámě zesíťovaným molekulám hemoglobinu.
Uváděný výraz „v podstatě prostý tetrameru“ označuje takovou míru čistoty s ohledem na obsah tetrameru, při kterém již nedochází při podání uvedeného množství tetrameru u savce, jemuž je podán, k určitým biologickým odezvám. Hlavním kritériem je přitom nepřítomnost zhoršení činnosti ledvin po podání farmaceuticky účinného množství dané látky, k čemuž dochází při míře čistoty 99 % a více (podíl tetrameru je tedy nižší než 1 %). Produkt vyrobený postupem podle vynálezu neobsahuje výhodně více než 0,8 % tetrameru vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu (total hemoglobin (THb )). Jinými slovy, produkt podle vynálezu v podstatě prostý tetrameru neobsahuje větší než fyziologicky přijatelná množství nezpolymerovaného hemoglobinového tetrameru. Výhodně obsahují produkty podle vynálezu méně než 0,5 %; nejvýhodněji obsahují produkty podle vynálezu 0,3 až 0,4 % tetrameru, Bylo prokázáno, že takováto množství tetrameru jsou fyziologicky přijatelná.
Uvedené výrazy „ultrapřečištěný produkt“ nebo „přečištěný produkt“ mají stejný význam jako výraz „v podstatě prostý tetrameru“.
Uvedený výraz „% celkového hemoglobinu“ odpovídá množství gramů hemoglobinu na 100 ml roztoku.
Uvedený výraz „polymerační roztok“ znamená roztok, který obsahuje „zesíťovací“ nebo polymerační činidlo, např. glutaraldehyd, imidostery, diaspirin, apod., v biochemicky přijatelném nosiči.
Uvedený výraz „polymerovaný“ znamená vřazení molekulových můstků mezi molekuly nebo tetramemí podjednotky, přičemž velikost a hmotnost výsledného polymeruje větší než u nativního nebo tetramemího hemoglobinu. Polymerovaný hemoglobin není tetramemí hemoglobin.
Uvedený výraz „hemoglobinový roztok“ znamená roztok tetramemího hemoglobinu nebo polymerovaných molekul hemoglobinu, přičemž tyto molekuly nejsou obsaženy v buňkách červených krvinek. Takový roztok nemusí neobsahovat stroma červených krvinek nebo stromální kontaminanty. Výhodně však roztoky polymerovaného hemoglobinu neobsahují stroma ani stromální kontaminanty.
Výraz „semipermeabilní membrána“ označuje takovou membránu, která je propustná jen pro určité druhy molekul a která tak funguje jako selektivní filtr, který zabraňuje průchodu molekul určitých molekulových hmotností.
Produkt vyrobený postupem podle vynálezu - roztok polymerovaného, pyridoxylovaného hemoglobinu prostého tetramemího (nativního nebo zesíťovaného) hemoglobinu a stromálních a jiných kontaminantů, vyrobený z tepelně zpracovaného, virově inaktivovaného tetramemího hemoglobinu - je fyziologicky přijatelný a terapeuticky a klinicky použitelný. Produkt má schopnost reverzibilně vázat kyslík, což je pro transport kyslíku nezbytné. Zejména vykazuje produkt podle vynálezu solidní schopnosti při vytváření a zanikání vazby produkt - kyslík, což dokazuje i
-6CZ 299357 B6 disociační křivka kyslík hemoglobin (P50), která je obdobná plné krvi. Produkt podle vynálezu váže kyslík s vysokou afinitou v plicních kapilárách a poté ho v odpovídající míře uvolňuje do tkání celého těla. Použití produktu podle vynálezu rovněž nevyžaduje stanovení kompatibility vůči příjemci.
Produkt podle vynálezu vykazuje dále po podání člověku poločas nejméně 15 hodin, výhodněji asi 24 hodin. Hemoglobinový produkt podle vynálezu může být podáván pacientovi formou infuze, a to v objemu asi 3,0 litry, a dokonce až asi 5,0 litrů. Jinými slovy, hemoglobinový produkt podle vynálezu může nahradit v podstatě celou pacientovu krev, aniž by způsobil vazokonstrikce, otravu ledvin, hemoglobinurii nebo jiné potíže, spojené s intravenózním podáním syntetických nebo semisyntetických přenašečů kyslíku a krevních náhrad. Vynález tedy zahrnuje i způsob provedení transfuze netoxického polymerovaného pyridoxylátového hemoglobinového produktu bez obsahu stromatu a tetramer, a to u pacienta, výhodně člověka, v množství až asi 5,0 litrů. Tento způsob zahrnuje připojení pacienta k infuznímu nebo jinému zařízení, které umožňuje pro15 vést infuzi nebo transfuzi.
Způsob výroby podle vynálezu je jedinečný v tom, že vede k produktu, v němž obsah tetrameru nepřesahuje asi 1 %, výhodněji asi 0,8 %, hmotnosti vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu v roztoku. Způsob podle vynálezu je také výhodný z toho hlediska, že umožňuje získat konečný produkt, který je v podstatě prostý mikrobiálních a virových antigenů a patogenů. Obsah takovýchto mikrobiálních a virových antigenů a patogenů je zredukován na nedetekovatelné množství, tj. produkt je podle analýzy uvedené v kapitole 71 „United States Pharmacopoeia“, r.XXIII, sterilní. Příkladem uvedených antigenů a patogenů jsou bakteriální, rikeciální, fungální, protozonní, virové a jiné organismy. Nejdůležitější je však skutečnost, že způsob výroby podle vynálezu vede k získání biologického produktu bez obsahu virů, které způsobují hepatitidu a syndrom získaného selhání imunity (AIDS).
Co se týče jeho fyziologických vlastností, nezpůsobuje biologický produkt podle vynálezu při infuzi v množství až 5,0 litrů vazokonstrikce, renální toxicitu, hemoglobinurii, ani jiné komplika30 ce, spojené s intravenózním podáním známých hemoglobinových roztoků, které obsahují fyziologicky nepřijatelné množství tetramemího hemoglobinu. Intravenózní podání produktu podle vynálezu nijak nesnižuje produkci moči a rychlost glomerulámí filtrace, nemá za následek extravazaci do pobřišniční dutiny a změnu zabarvení produkované moči.
Způsob výroby podle vynálezu tedy zajišťuje nebuněčnou náhradu červených krvinek, která je výhodná při ošetření úrazu, při léčení infarktu myokardu, mrtvice, akutní anémie a poruch zásobování kyslíkem, např. hypoxémii, hypoxii nebo hypoxii v posledním stádiu následkem selhání funkce plic okysličovat krev. Produkt podle vynálezu je rovněž výhodný při léčení stavů, které vyžadují přísun resuscitačních tekutin (např. trauma, specifický hemoragický šok), látek zvětšují40 cích intravaskulámí objem nebo při výměnné transfuzi. Kromě použití při klinické praxi může být produkt podle vynálezu rovněž výhodně použit pro přechovávání orgánů určených pro transplantace.
Způsob výroby podle vynálezu zahrnuje následující stupně:
1. Odsátí červených krvinek a filtrace
2. Promytí/lýza buněk
3. Tepelné zpracování
4. Zahuštění ultrafiltrací
5. Odplynění
6. Chemická modifikace
7. Přečištění
8. UP-polykoncentrace
9. Deoxidace
10. Formulování
-7CZ 299357 B6
Výhodnou výchozí látkou pro výrobu podle vynálezu je plná lidská krev s prošlou dobou expirace nebo koncentrované červené krvinky. Může být rovněž použita krev s neprošlou dobou expirace. Výhodně se použije taková plná krev, jejíž doba expirace, vyznačená na sáčku s dárcovskou krví, není prošlá o více než 2 týdny. Použití krve s dobou expirace prošlou o více než 2 týdny by totiž znamenalo vznik jistých obtíží při extrahování hemoglobinu a odstraňování buněčných zbytků, např. stromálních proteinů a kontaminantů.
Všechny zde popsané postupy je možno aplikovat i na krev jiných savců, a to pouze s minimálio nimi modifikacemi, které vyplynou pro odborníka v oboru. Většina postupů se přitom provádí při teplotách od asi 2 °C do asi 8 °C, výhodně při teplotách okolo 4 °C.
V průběhu odsávání červených krvinek a filtrace jsou červené krvinky aseptický extrahovány ze sáčku s dárcovskou krví tak, že krev nepřichází do styku se vzduchem a prochází sérií filtrů, čímž vzniká suspenze červených krvinek se sníženým obsahem leukocytů a krevních destiček. Vzniklá suspenze je následně promyta a dochází k lýze buněk.
Suspenze se promyje 1% roztokem chloridu sodného pod atmosférou oxidu uhelnatého, čímž se odstraní zbytek plazmových proteinů. Promyté červené krvinky se poté zpracují vodou pro injek20 ci, čímž dochází k lýze buněk. Vzniklá směs se následně přečistí filtrací s příčným tokem. Přečištěný produkt se poté zpracovává tepelně, čímž se vysráží další stromální látky, které se následně odstraní filtrací. Produktem tohoto stupně je hemoglobinový roztok bez obsahu stromatu s obsahem celkového hemoglobinu asi 3 % (hmotn./obj.).
Tepelně zpracovaný hemoglobinový roztok bez stromálních kontaminantů s obsahem karboxyhemoglobinu se zahustí a odplyní za vzniku hemoglobinového roztoku s obsahem deoxryhemoglobinu. Odplynění zahrnuje nejprve sycení karboxyhemoglobinového roztoku kyslíkem po dobu asi 16 hodin. Vzniká roztok okysliěeného hemoglobinu s obsahem karboxyhemoglobinu asi 7 % (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Kyslík se následně odstraní dusíkem, argonem nebo heliem, čímž vzniká roztok s obsahem volného hemoglobinu, tj. hemoglobinu nesloučeného, s obsahem oxyhemoglobinu asi 7 % (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Vzniklý odplyněný roztok se přefiltruje a převede do nádoby, ve které je poté chemicky modifikován.
Po odplynění je hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů pytidoxylován za použití pyridoxal-5'-fosfátu (P5P) v molámím poměru pyridoxal-5'-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1. Hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů může být případně pyridoxylován za použití 2-Nor-2-fomylpyridoxal-5'-fosfátu. K pyridoxylační směsi se jako redukční činidlo přidá kyanborhydrid sodný nebo výhodně borhydrid sodný. Nadbytek činidla a solí se odstraní dialýzou za použití vody bez obsahu pyrogenu nebo výhodně diafiltrací vodou pro injekci. Pyridoxylátovaný hemoglobin se poté polymeruje roztokem glutaraldehydu.
Pyridoxylovaný hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se polymeruje vodným roztokem glutaraldehydu. Délka polymerace a množství přidaného glutaraldehydu přitom závisí na objemu hemoglobinového roztoku, požadovaném výtěžku polymerů a požadované distribuci molekulových hmotností. Obecně lze říci, že delší doba polymerace zvyšuje výtěžek a molekulovou hmotnost polymerů. Výtěžku zhruba 75 % (hmotnost polymeru vzhledem k hmotnosti celkového hemoglobinu) je dosaženo po asi 16 až 18 hodinách polymerace. Výhodné je polymeraci ukončit ve chvíli, kdy roztok obsahuje asi 75 % hmotnosti polymerů, přičemž tento okamžik je indikován pomocí „size-exelusion“ vysokotlaké kapalinové chromatografie. Konec polymerace se případně určí jako chvíle, kdy roztok obsahuje asi 65 % polymerů, tj. po asi 2,5 hodinách.
Polymerační reakce se ukončí přídavkem vodného roztoku glycinu. Pufr musí být přidán tak rychle, jak jen to je možné. Zesíťovací proces se následně stabilizuje co nejrychlejším přídavkem vodného roztoku borhydridu sodného. Polymerovaný roztok se poté zahustí a diafiltruje pod
-8CZ 299357 B6 atmosférou kyslíku za účelem okysličení roztoku. K roztoku se následně přidává voda, a to do chvíle, kdy roztok obsahuje asi 4 % hmotnosti hemoglobinu.
Polymeraci podle vynálezu se získají polymery, jejichž hmotnosti leží v úzkém rozmezí, jak je patrno z níže uvedeného obr. 3 a z příkladu 1.
Roztok polymerovaného pyridoxylovaného hemoglobinu se poté přečistí sloupcovou chromatografií nebo filtrací (např. membránovou filtrací) nebo postupně oběma procesy, a to za účelem odstranění zbytkového nezpolymerovaného (tetramelického) hemoglobinu z roztoku. Přečištěný ío roztok polymerovaného hemoglobinu se poté zahustí na asi 6 %, a to za použití ultrafiltračního aparátu.
Zahuštěný roztok se poté zbaví kyslíku promýváním dusíkem. Deoxidace se provádí při teplotě až 12 °C, a to do chvíle, kdy obsah oxyhemoglobinu klesne pod 16 % vztaženo na hmotnost 15 celkového hemoglobinu.
Vzniklý deoxidovaný přečištěný roztok polymerovaného hemoglobinu se poté zahustí ultrafiltrací pod atmosférou dusíku v chlazené nádobě. Hodnota pH se upraví na asi 8,8 až 9,0, obsah elektrolytů se upraví podle potřeby tak, aby odpovídal hodnotám normální plazmy. Případně mohou být přidány běžné antioxidanty, např. glutathion, askorbát nebo glukóza. Poté, co se roztok zahustí na příslušnou hodnotu, výhodně asi 10 % hmotnosti polymerizovaného pyridoxylovaného přečištěného hemoglobinu bez obsahu tetramerii a stromálních kontaminantů, je sterilizován filtrací a sterilně převeden převáděcím aparátem do vhodných farmaceuticky přijatelných obalů.
Údaje o vzniklém hemoglobinovém roztoku jsou uvedeny níže:
| Polymerovaný hemoglobin | |
| Celk. obsah hemoglobinu (g/dl)1 | 9,5-12,0; |
| Methemoglobin (% z celk. Hb)1 | méně než 8,0 |
| Karboxyhemoglobin (% z celk. Hb)1 | méně než 5,0 |
| P5o (kPa)1 | 3,07-4,27 |
| Osmolalita (mmol/kg)2 | 280-360 |
| Sodík (mmol/1)3 | 135-155 |
| Hořčík (mmol/1)3 | 3,5-4,5 |
| Chloridy (mmol/1)3 | 85-110 |
| Volné železo (ppm)4 | méně než 2 |
| Distr. molekul.hmotn. - pík 128 Kd (%)5 | 10-24 |
| Distr. molekul.hmotn. - pík 192 Kd (%)5 | 18-30 |
| Distr. molekul.hmotn. - pík 256 Kd (%)5 | 45-70 |
| Tetramer (64K) (%)5 | méně než 0,8 |
| Endotoxin (EU/ml)6 | méně než 0,03 |
| Fosfolipidy (ng/Hb)7 | méně než 50 |
| Glykolipidy (ng/Hb)7 | méně než 2 |
1 Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena spektrofotometricky.
Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena osmometricky.
3 Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena iontově selektivní elektrodou.
4 Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena atomovou absorpcí.
Stanovení vysokotlakou kapalinovou chromatografií „size exclusion“.
6 Stanovení pomocí LAL za použití testovací soupravy komerčně dostupné u Associates of 35 Cápe Cod; části soupravy mají katalogová čísla 100-5, 800-1 a3100-5.
7 Stanovení vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
-9CZ 299357 B6
V následující části jsou uvedeny příklady provedení podle vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, je teplota uváděna ve stupních Celsia. Pokud není uvedeno jinak, jsou procentuální hodnoty, např. celk. hemoglobin (THb), vyjádřeny údajem hmotnost/objem (w/v). Rovněž je nutno poznamenat, že je možno provádět uvedené reakce při teplotách vyšších či nižších, než je uvedeno, s výhradou, že je to obecně méně výhodné.
Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny nádoby a nádrže použité pro způsob výroby podle vynálezu vyrobeny z nerez oceli316-L, přičemž povrch těchto nádob a nádrží je dokonale vyleštěn, což usnadňuje a zrychluje jejich čištění. Všechny součásti spojovacího vedení a trubky jsou vyrobeny rovněž z uvedené nerez oceli nebo z teflonu či silikonu. Použité filtry a membrány jsou komerčně dostupné u společností Milliporc Inc., Pall-Filtron nebo Cuno Inc.
Poločas vzniklého produktu podle vynálezu je určen in vivo, a to u savců, např. člověka. Obecně je krevní vzorek u savce odebrán po uplynutí určité doby od infuze, kterou mu byl podán produkt podle vynálezu. Množství produktu se poté určí centrifugací krevního vzorku a vyjádří se jako množství plazmy, přičemž se spektrofotometricky stanoví hladina hemoglobinu v plazmě a poté se vztáhne množství produktu, které zůstává v daném organismu, k poločasu uvedeného produktu.
Vysokotlaká kapalinová „size-exelusion“ chromatografie se provádí následujícím způsobem:
Vzorek se zředí 0,2M pufračním roztokem fosforečnanu draselného (pH = 6,9) na hodnotu 0,2 g/dl, přefiltruje se přes 0,2μηι filtr a injekčně se převede do chromatografického systému, složeného z následujících součástí (uvedeny v pořadí odpovídajícím směru průtoku systémem):
1. Čerpadlo Pharmacia, model 2248
- mobilní fáze: 0,2M fosforečnan draselný, pH 6,9
- průtok: 1,0 ml/min.
2. Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 45 cm, 0,010 in.LD.
3. Vstřikovací tryska Rheodyne, model 7725i, s 200 μΐ vzorkovou smyčkou PEEK.
4. Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 18cm, 0,010 in.LD.
5. Fi ltr 0,5 μηι, model A431.
6. Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 9 cm, 0,010 in.I.D.
7. Kolona guard, Phenomenex Biosep SEC S-3000, 75 x 7,8 mm.
8. Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 24 cm, 0,010 in.I.D.
9. Analytická kolona, Phenomenex Biosep SEC S-3000, 600 x 7,8 mm.
10. Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 23 cm, 0,010 in.I.D.
.UV-detektor Pharmacia Uvicord SD délka vlny: 280nm průtoková komůrka: obj. 8 μΕ, délka dráhy 2,5 mm rozsah: 2 AUFS časová konstanta: 10 sekund
Absorpční pík při 280 nm je zaznamenána pomocí integrátoru LKB 221, který integruje jednotli45 vé plochy píků a vypočítá celkovou plochu hemoglobinu pro každý druh polymeru.
Níže uvedené příklady pomohou více pochopit podstatu vynálezu.
-10CZ 299357 B6
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.
Příklad 1 ío Na obr. 1 jsou znázorněny krevní konzervy 20, obsahující dárcovskou krev (plnou krev nebo koncentrát červených krvinek) s prošlou dobou expirace. Jsou umístěny ve vhodném aseptickém odsávacím zařízení 22. Příkladem takovéhoto vhodného odsávacího zařízení je systém skládající se ze dvou odsávacích jednotek. Poté, co je sáček s dárcovskou krví umístěn do odsávací jednotky, propíchne sáček jehla, jejíž pomocí je do sáčku převedeno asi 150 ml 1% (hmotn. /obj.) vod15 ného roztoku chloridu sodného. Z uvedeného sáčku se za sníženého tlaku nebo vakuově odsaje dárcovská krev s prošlou dobou expirace. Odsátá krev poté prochází filtrem 24 (hloubka 100 pm) a následně postupně dvěma filtry 26 (hloubka 5 pm). Průchodem 5pm filtry jsou z krve odstraněny leukocyty. Obvykle se odsaje asi 170 jednotek krve s prošlou dobou expirace, která se uvedeným způsobem přefiltruje a následně převede do nádrže i, jak je znázorněno na obr. 1. Filtry se poté propláchnou asi 75 litry 1% (hmotn./obj.) vodného roztoku chloridu sodného.
Předtím, než se převede krev do nádrže i, naplní se tato nádrž asi 70 litry 1% vodného roztoku chloridu sodného. Poté, co se tedy celých 170 jednotek krve s prošlou dobou expirace odsaje, přefiltruje a převede, a poté, co se propláchnou všechny uvedené filtry, obsahuje nádrž asi
250 litrů 4% hemoglobinového roztoku. V průběhu odsávací a filtrační fáze je v nádrži J udržován snížený tlak, tj. vakuum při tlaku 2,66 až 3,72 kPa. Poté, co je do nádrže i převedena veškerá krev s prošlou dobou expirace, je vakuum v nádrži X nahrazeno oxidem uhelnatým.
Nádrž i se připojí k 0,65pm tangenciálnímu průtokovému filtru 28 (obr. 1). Původní objem
250 litrů 4% hemoglobinového roztoku se zahustí na přibližně 125 litrů 8% hemoglobinového roztoku mikrofiltrací přes uvedený tangenciální průtokový filtr. pH hemoglobinového roztoku má v tomto okamžiku hodnotu asi 6 až 6,5. Po výše uvedené zahušťovací fázi se roztok promyje 1% (hmotn./obj.) roztokem chloridu sodného. 125 litrů hemoglobinového roztoku se obvykle promyje 8 obj.díly 1% roztoku chloridu sodného (asi 1000 litrů). Po promytí se roztok zahustí na objem asi 70 litrů, čímž vzniká asi 14% hemoglobinový roztok. Objem roztoku se doplní na asi 180 litrů přídavkem vody pro injekci (WFI). Přídavkem vody pro injekci nabývají buňky na objemu a praskají, přičemž se uvolňuje hemoglobin do roztoku. Koncentrace vzniklého hemoglobinového roztoku je asi 5% celkového hemoglobinu.
Ještě v nádrži 1 se vzniklý roztok přečistí. Nejprve se zahustí na objem asi 50 litrů a filtrát se převede do nádrže 2. Při průchodu filtrem se na filtru zachytí stromální kontaminanty a části buněčných stěn. Zbývajících 50 litrů roztoku v nádrži 1 se promyje (diafiltruje) asi 2,5 objemovými díly vody pro injekci (WFI) a poté přidá do nádrže 1. Materiál, který zbyl v nádrži 1_, se poté zahustí na objem asi 20 litrů a filtrát se přidá do nádrže 2. Celkem je tedy v nádrži 2 asi
280 litrů 3,3% hemoglobinového roztoku.
Vzniklý hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se poté tepelně zpracovává v nádrži 2 při teplotě asi 60 až 62 °C, a to po dobu asi 10 hodin. Roztok se přitom průběžně protřepává. Při zahřívání se v roztoku při teplotě 55 °C tvoří sraženina.
Vzniklý 3,3% hemoglobinový tepelně zpracovaný roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se poté přefiltruje přes 0,2pm filtr 30 a 0,1 pm filtr 32 a převede do nádrže 3. Přefiltrovaný hemoglobinový roztok se poté zahustí tak, aby byl asi 18%, a poté se promyje a diafiltruje 4 objemovými díly vody pro injekci (180 litry). Zahuštění a diafiltrace jsou dovršeny použitím ultrafiltru 34 (molekulová hmotnotnost 10 kd /kilodalton/). Ve výstupní nálevce 35, spojené
- 11 CZ 299357 B6 s ultrafiltrem 34, se shromažďuje filtrát. V tomto stupni obsahuje 45 litrů 18% hemoglobinového roztoku méně než 50 ng fosfolipidů na gram hemoglobinu, méně než 2 ng glykolipidů na gram hemoglobinu, méně než 1 % methemoglobinu a méně než 0,03 endotoxinových jednotek na mililitr při pH v rozmezí od 6 do 6,5. Hemoglobin v roztoku je karboxyhemoglobin.
Vzniklý karboxyhemoglobinový roztok se poté převede do nádrže 4, kde je nejprve karboxyhemoglobin oxidován a poté deoxidován. Nádrž 4 je vybavena rozstřikovačem, napojeným na přívody plynného kyslíku a dusíku, dávkovacím zařízením, umístěným v horní části nádrže, a přetokovým sběračem pěny, napojeným na nádržku na pěnu „Foam Can“ i tak, že pěna vzniká ío v nádrži 4 se převádí do nádržky na pěnu „Foam Can“ 36, ve které kondenzuje na kapalinu a odkud je převedena zpět do nádrže 4. Nádrž 4 dále obsahuje náplň kroužků Pall, která představuje asi jednu třetinu celkového objemu nádrže. Součástí nádržky na pěnu 36 je odplyňovací ventil. Roztok v nádrži 4 je 13% hemoglobinový roztok.
Během prvního oxidačního stupně je kyslík do roztoku zaváděn rychlostí, která zajistí rovnoměrnou disperzi plynu v nádobě. Do této nádoby o objemu 200 litrů je plyn zaváděn rychlostí 25 litrů za minutu. Oxidace karboxyhemoglobinu se provádí po dobu 16 hodin, takže výsledný roztok obsahuje méně než 5 % karboxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Oxidace se provádí při teplotě asi 19 °C. Pěna, vzniklá v nádrži 4, se jímá v nádržce 36 a po usa20 zení se vzniklý roztok převede zpět do nádrže 4.
Po oxidaci se do roztoku obdobným způsobem zavádí plynný dusík, a to po dobu asi 6 hodin, dokud v roztoku není méně než 10 % oxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Zavádění dusíku se provádí při teplotě asi 10 °C a pH v rozmezí od asi 6 do 6,5. Karbo25 xyhemoglobin může být případně převeden na deoxyhemoglobin použitím membránového měniče. Nutno poznamenat, že v průběhu zpěňovacího stupně v podstatě nedochází oproti očekávání k denaturaci hemoglobinu. Vzniklý roztok deoxyhemoglobinu je nyní připraven na chemickou modifikaci.
Jak je znázorněno na obr. 2, je deoxyhemoglobinový roztok převeden za účelem chemické modifikace do nádrže 5. Do této nádrže, obsahující deoxyhemoglobinový roztok o teplotě asi 4 °C, je poté přidán vodný roztok pyridoxyl-5-fosfátu (P5P) (93,75 g/1) v molámím poměru P5P k hemoglobinu od 1:1 do 3:1. Výhodně je molámí poměr P5P k hemoglobinu asi 2:1. Pyridoxylace se provádí při teplotě asi 4 °C. Roztok P5P se obvykle přidává po dobu 1 minuty a míchá se po dobu 15 minut, načež se k hemoglobinovému roztoku přidá roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného při molámím poměru borhydrid sodný k hemoglobinu asi 20:1. Vhodný vodný roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného obsahuje 0,8 g hydroxidu sodného na 2 litry a 90,8 g borhydridu sodného na 2 litry. Borhydridový roztok se přidá nejrychlejším možným způsobem v průběhu 1 minuty, načež se směs po dobu 1 hodiny míchá. Vzniklých 50 litrů roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu se poté diafiltruje za použití 10 kd ultrafiltru 38, čímž se 4 objemovými díly vody pro injekci odstraní přebytečné reaktanty. Ve výpustní nálevce 40, spojené s ultrafiltrem 38, se jímá filtrát z filtru 38.
Po diafiltraci 4 objemovými díly, tj. 200 litry, vody pro injekci je hemoglobin polymerován. Do nádrže 5, obsahující pyridoxylovaný hemoglobin, se přidá voda pro injekci v množství dostačujícím na vznik 4,5% hemoglobinového roztoku (asi 175 litrů hemoglobinového roztoku), k roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu se poté přidá roztok glutaraldehydu, a to při molámím poměru glutaraldehydu k hemoglobinu asi 24:1. Glutaraldehydový roztok se obvykle přidává dávkovacím čerpadlem po dobu asi 2,5 hodiny. Polymerační reakce se přitom nechá probíhat po dobu asi 18 hodin. Požadovaná distribuce molekulových hmotností je přitom asi 75 % polymeru a asi 25 % tetrameru. Vzniklé polymery mají molekulové hmotnosti nižší než 600 000 s převažující frakcí molekulárních hmotností v rozmezí od 100 000 do 350 000.
Když se po asi 18 hodinách polymerace dosáhne požadované distribuce molekulových hmotností, přidá se k hemoglobin ovmu roztoku vodný roztok glycinu (asi 166 g/1) v molámím poměru gly-12CZ 299357 B6 cin k hemoglobinu asi 140:1. Na obr. 3 je znázorněn diagram stanovení stop vysokotlakou kapalinovou chromatografií polymerovaného hemoglobinového produktu po přídavku glycinu. Vzniklý roztok se poté po dobu asi 10 minut míchá, načež se k němu přidá výše popsaný roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného v molámím poměru borhydrid sodný k hemoglobinu asi
28:1. Takto vzniklá směs se poté po dobu asi 1 hodiny míchá, načež se zahustí na asi 50 litrů (ultrafiltr 38) a promyje se 4 objemovými díly (200 litry) vody pro injekci. K zahuštěnému roztoku se přidá další alikvót borhydridu sodného ve výše uvedeném molámím poměru, načež se směs opět 1 hodinu míchá. Vzniklý roztok se promyje 4 objemovými díly vody pro injekci (200 litry) za vzniku polymerovaného pyridoxylovaného tepelně zpracovaného hemoglobinu bez obsahu ío stromálních kontaminantů.
Vzniklý roztok se oxiduje tím, že se nechá stát pod atmosférou kyslíku a poté se převede do čisticího systému 42. Přečištění lze rovněž provést sloupcovou chromatografií, filtrací, výhodně membránovou filtrací (diafiltrací), nebo kombinací filtrace a sloupcové chromatografie.
Při jednom z provedení podle vynálezu se roztok převede do chromatografické nádoby - nádrže 6, znázorněné na obr. 5. Při tomto provedení se vzniklý roztok oxyhemoglobinu zředí v nádrži 6 na objem asi 200 litrů (4% hemoglobinový roztok) a koncentrace chloridových aniontů se upraví na 22 mM přídavkem roztoku chloridu sodného. Úprava koncentrace sodných kationtů není nutná.
Za použití chromatografické kolony 44 se poté chromatografuje pět 40-ti litrových alikvótů vzniklého hemoglobinového roztoku. Kolona 44 obsahuje afinitní gel, kterým je agarózový gel, upravený přídavkem žlutého barviva (komerční dostupnost Affinity Chromatography, Ltd., „Mimetic Yellow“ č. 1), a který vykazuje větší afinitu k polymeru než k tetrameru.
Chromatografie se provádí následujícím způsobem: do kolony 44 se převede 40 litrů oxidovaného, polymerovaného, pyridoxylovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů. Kolona se promyje asi 750 litry 30 mM vodného natriumchloridového pufru, čímž se odstraní tetramer. Kolona se následně promyje asi 250 litry 300 mM vodného natriumchloridového pufru, čímž se vymyje polymer. Polymemí frakce se jímají v nádrži 7. Nepotřebné frakce se jímají ve výpustní nálevce 46. Kolona se regeneruje přídavkem 150 litrů 15 mM roztoku kyseliny chlorovodíkové a 250 litrů 30 mM vodného roztoku chloridu sodného, načež se do této kolony převede další alikvót (40 litrů) hemoglobinového roztoku. Kolona se opět promyje 30 mM chlo35 ridem sodným a 300 mM chloridem sodným. Do kolony se k chomatografickému zpracování přidávají další alikvóty hemoglobinového roztoku, dokud není nádrž 6 vyprázdněna.
Najímané frakce v nádrži 7 se ulrafiltrují (zahustí) použitím filtru 48, spojeným s výpustní nálevkou 50, na objem asi 40 litrů (6% hemoglobinový roztok). Zahuštěný hemoglobinový roztok se poté převede do nádrže 8, kde dochází k deoxidaci.
Roztok se případně převede do filtrační recyklační nádoby 10, jak je znázorněno na obr. 6. Hemoglobinový roztok se v nádrži 10 zředí tak, že je obsah hemoglobinu v roztoku asi 4 %. Takovýto roztok se poté diafiltruje za použití 10 mM chloridu sodného a filtru 52, (propustnost:
do mol. hm. 300 000, komerční dostupnost u společnosti Pall—Filtron). Filtrace probíhá do okamžiku, kdy filtrem projde asi 97 % hemoglobinového roztoku, který se jímá v nádrži 11. (Asi 3 % z celkového objemu roztoku, tj. polymery o vysoké molekulové hmotnosti, se zachytí v nádrži 10). Obsah hemoglobinu se určí spektrofotometricky za použití kooximetru.
Nádrž 11 obsahuje roztok obsahující asi 2 až 4 % hemoglobinu a 7 až 10 % tetrameru. 2- až 4% hemoglobinový roztok se poté diafiltruje za použití 10 mM chloridu sodného a filtru 54 (propustnost: do mol. hm. 100 000, komerční dostupnost u spol. Pall-Filtron), který je napojen na výpustní nálevku 56. Filtrace se provádí do chvíle, kdy je „size-exelusion“ chromatografií (kolona BioSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm) stanoven obsah tetrameru na hodnotu nižší než 0,8 %
-13CZ 299357 B6 hemoglobinu. Vzniklý přečištěný hemoglobinový roztok je nejdříve ponechán v nádrži 11, načež se převede za účelem deoxidace do nádrže 8.
Nádrž 8 může být stejná jako nádrž 4, výhodně je však odlišná. Nádrž 8 je vybavena v podstatě stejně jako nádrž 4 na obr. 1 a je napojena na nádržku s pěnou 58 stejným způsobem jako nádrž 4 na nádržku na pěnu 36. Deoxidace je ukončena po asi 2,5 hodinách zavádění dusíku při teplotě asi 10 °C a pH roztoku asi 7,5. Dusík je zaváděn do roztoku do chvíle, kdy tento roztok obsahuje méně než 16% oxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Vzniklý deoxyhemoglobinový roztok se následně převede do nádrže 9, kde je formulován.
Ve formulační nádrži 9 je nejprve roztok zahuštěn na asi 7% hemoglobinový roztok, jehož pH se při 4 °C upraví na hodnotu od asi 8,8 do 9,0. pH se upraví přídavkem 0,2M roztoku hydroxidu sodného. K hemoglobinovému roztoku o pH 8,8 až 9,0 se poté přidají roztoky elektrolytů. Jsou též přidány glukóza a glycin, a to v takovém množství, aby byly jejich výsledné koncentrace
5 g/1, respektive 1,75 g/1. Do roztoku se přidá rovněž chlorid draselný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace draselných kationtů od asi 3,5 do 4,5 mM. Dále se přidá 3M chlorid sodný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace chloridových aniontů 85 až 110 mM. Přidá se dále laktát sodný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace sodných kationtů 135 až 155 mM. Konečně se přidá 0,45 molární roztok kyseliny askorbové, čímž se zvýší koncentrace této kyseliny v roztoku na asi 100 mg/1. Kyselina askorbová má funkci konzervační a antioxidační látky pro účely skladování. Konečný hemoglobinový roztok má osmolalitu asi 280 až 360 mmol/kg.
Formulovaný hemoglobinový roztok se poté zahustí pomocí filtru 60, spojeného s lapačem 62, na
10% hemoglobinový roztok, který je následně sterilizován filtrací přes filtr 64 a převeden do aseptických presterilizováných krevních konzerv.
V níže uvedené tabulce 1 jsou uvedeny charakteristiky produktu, připraveného uvedeným postupem, šarže A. Tabulka 1 rovněž zahrnuje charakteristiky produktů šarží B a C, připravených výše uvedeným postupem.
- 14CZ 299357 B6
Tabulka 1
| Složka | A | Šarže B | C |
| Hemoglobin (g/dl) | 10,4 | 10,2 | 10,2 |
| Methemoglobin (%) | 4,6 | 6,0 | 5,6 |
| Karboxyhemoglobin (%) | 0,2 | 1,4 | 1,5 |
| P50 (kPa, pH 7,35-7,45, | |||
| pCO2 4,66 - 5,32 kPa) | 3,79 | 3,56 | 3,59 |
| Osmolalita (mmol/kg) | 318 | 320 | 317 |
| Sodík (mmol/1) | 142 | 144 | 142 |
| Draslík (mmol/1) | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Chloridy (mmol/l) | 98 | 99 | 94 |
| Volné železo (ppm) | 0,7 | 1,2 | 1,0 |
| Molekulární hmotnost | 128:16 | 128:11 | 128:16 |
| (% při jedn.mol.hm., kd) | 192:26 | 192:23 | 192:26 |
| 2568:58 | 2568:66 | 2568:58 | |
| Tetramer (%) | 0,4 | 0,3 | 0,4 |
| Endotoxin (EU/ml) | méně než 0,03 | méně než 0,03 | méně než |
| 0,03 |
Látka obsahuje rovněž malé množství látek o vyšší molekulové hmotnosti
Claims (24)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerováného hemoglobinu, vyznačující se t í m, že obsahuje10 až 24 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového póly 15 meru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa;18 až 30 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového póly meru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa; a45 až 70 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem, hemoglobinového póly meru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa.- 15CZ 299357 B6
- 2. Vodný roztok podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že obsahujea) hemoglobin celkem v koncentraci 9,5 až 12,0 g/dl;b) methemoglobin celkem v množství nižším než 8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost5 hemoglobinu celkem;c) karboxyhemoglobin celkem v množství nižším než 5 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;d) sodík v koncentraci od 135 do 155 mmol/1;e) draslík v koncentraci od 3,5 do 4,5 mmol/1 a ío f) chlorid v koncentraci od 85 do 110 mmol/kg.
- 3. Vodný roztok podle nároku 2, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahujeg) volné železo celkem v množství nižším než 2,0 ppm;h) tetramer hemoglobinu celkem v množství nižším než 0,8 % hmotnostních, vztaženo na hmot15 nost hemoglobinu celkem; ai) endotoxin v množství nižším než 0,03 EU/ml.
- 4. Vodný roztok podle nároku 3, v y z n a č uj í c í se t í m , že dále obsahujej) fosfolipidy v množství nižším než 50 ng/EIb; a20 k) glykolipidy v množství nižším než 2 ng/Hb.
- 5. Vodný roztok podle nároku 2, vyznačující se tím, že má osmolalitu od 280 do 360 mmol/kg.25
- 6. Vodný roztok podle nároku 2, vy z n a č uj í c í se t í m , že vykazuje hodnotu disociace kyslík-hemoglobin 3,0 až 4,3 kPa.
- 7. Vodný roztok podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se vykazuje poločas asi 15 hodin.t í m , že v těle humánního pacienta
- 8. Vodný roztok podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se vykazuje poločas asi 24 hodin.t í m , že v těle humánního pacienta
- 9. Vodný roztok podle nároku 1, vyznačující se tím, že po infuzi humánnímu 35 pacientovi v množství až do asi 5 1 nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin.
- 10. Vodný roztok podle nároku 1, vyznačující se tím, že po infuzi humánnímu pacientovi v množství až do asi 5 1 nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin a v těle humánního pacienta vykazuje poločas asi 24 hodin.
- 11. Způsob přípravy roztoku zpolymerovaného hemoglobinu podle nároku 1,vyznačující se t í m, že zahrnuje (a)odstranění leukocytů filtrací směsi obsahující červené krvinky přes filtr, který má minimální průměrnou velikost pórů postačující k zabránění průchodu leukocytů;45 (b) lýzu červených krvinek;(c) přidání oxidu uhelnatého a zahřívání produktu (b) na teplotu asi 60 až 62 °C po dobu asi 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku;(d) filtraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku za účelem odstranění stromatu a stromálních kontaminantů vysrážených při zahřívání;50 (e) odplynění tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku probubláváním tepelně zpracovaného roztoku při teplotě asi 10 °C kyslíkem a potom dusíkem za vzniku pěny;-16CZ 299357 B6 (f) pyridoxylaci odplyněného roztoku za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu;(g) polymeraci roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za vzniku roztoku zpolymerovaného hemoglobinu;(h) sycení roztoku kyslíkem;5 (i) přečištění roztoku za účelem odstranění tetramemího hemoglobinu a shromáždění přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu, přičemž roztok obsahuje méně než 0,8 % hmotnostního tetrameru, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;(j) odstranění kyslíku z přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu; a (k) úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného zpolymerovaného hemoglobinu na ío fyziologické hodnoty.
- 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že odplyněný roztok se pyridoxyluje uvedením tohoto odplyněného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátem v molámím poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do asi 3:1.
- 13. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že odplyněný roztok se pyridoxyluje uvedením tohoto odplyněného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátem v molámím poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu asi 2:1.20
- 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že pyridoxal-5-fosfát se uvádí do styku s hemoglobinem a borhydridem po dobu asi jedné hodiny.
- 15. Způsob podle nároku 14, vy z n a č uj í c í se t i m , že hemoglobin se v roztoku zpolymeruje uvedením tohoto roztoku do styku s glutaraldehydem v molárním poměru glutaraldehydu25 k hemoglobinu od asi 24:1.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznač u j í cí se tí m , že roztok se uvádí do styku s glutaraldehydem po dobu asi 18 hodin, načež se reakce ukončí prudkým ochlazením.30
- 17. Vodný roztok podle nároku 1, vyznačující se tím, že hemoglobinem je glutaraldehydem zpolymerovaný hemoglobin.
- 18. Vodný roztok obsahující asi 16 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a asi 58 %35 hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa, kde všechna procenta jsou hmotnostní a jsou vztažena na hmotnost hemoglobinu celkem v roztoku, pro použití jako léčivo pro léčení humánního pacienta, který potřebuje transfuzi.
- 19. Roztok podle nároku 1, vyznačující se tím, že hemoglobin obsahuje asi 16%40 hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26% hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 192 kDa a asi 58 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa.
- 20. Způsob přípravy roztoku polymerovaného hemoglobinu podle nároku 1, vyznačuj ící45 se t í m , že zahrnuje (a) vedení krve s prošlou nebo neprošlou dobou expirace vhodným odsávacím zařízením při sníženém tlaku;(b) odstranění leukocytů z krve zpracované odsáváním filtrací směsi obsahující červené krvinky přes sadu filtrů, jejichž minimální průměrná velikost pórů postačuje k zabránění průchodu50 leukocytů;(c) přidání oxidu uhelnatého k produktu ze stupně (b) za vzniku hemoglobinového roztoku o pH nižším než 7;(d) promytí roztoku ze stupně (c) 1 % roztokem chloridu sodného za vzniku promytého roztoku;- 17CZ 299357 B6 (e) zředění promytého roztoku ze stupně (d) vodou za vzniku roztoku lýzovaných buněk;(f) filtraci roztoku lýzovaných buněk přes filtr za vzniku hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů a materiálu buněčných stěn;(g) zahřívání a filtraci hemoglobinového roztoku ze stupně (f) na teplotu asi 60 až 62 °C po dobu5 asi 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů;(h) zkoncentrování a diafíltraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů za vzniku roztoku karboxyhemoglobinu;(i) odplynění roztoku karboxyhemoglobinu probubláváním tepelně zpracovaného hemoglobino10 vého roztoku při teplotě asi 10 °C kyslíkem a potom dusíkem za vzniku pěny;(j) pyridoxylaci odplyněného roztoku za použití pyridoxal-5''-fosfátu při molámím poměru pyridoxal-5''-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1 za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu;(k) polymerací roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za použití vodného roztoku glutar15 aldehydu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu s distribucí molekulových hmotností asi 65 až 75 % polymeru a 25 až 35 % tetrameru;(l) sycení kyslíkem a ředění zpolymerovaného roztoku, dokud roztok neobsahuje asi 4 % hmotnostní hemoglobinu;(m) přečištění roztoku ze stupně (1) za účelem odstranění tetramemího hemoglobinu a shromaž20 ďování přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu, přičemž roztok obsahuje méně než 0,8 % hmotnostního tetrameru, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;(n) odstranění kyslíku z roztoku přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu dusíkem;(o) úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného pyridoxylovaného zpolymerovaného 25 hemoglobinu na hodnotu asi 8,8 až 9,0; a (p) zkoncentrování a sterilizaci roztoku s upraveným pH ze stupně (o).
- 21. Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu podle nároku 1, vyznačující se t í m , že vykazuje30 (a) obsah hemoglobinu celkem od 9,5 do 12,0 g/dl;(b) obsah methemoglobinu celkem nižší než 8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;(c) obsah karboxyhemoglobinu celkem nižší než 5 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;35 (d) hodnotu P50 v rozmezí od 3,0 do 4,3 kPa;(e) osmolalitu od 280 do 360 mmol/kg;(f) koncentraci sodíku od 135 do 155 mmol/1;(g) koncentraci draslíku od 3,5 do 4,5 mmol/1;(h) koncentraci chloridu od 85 do 110 mmol/kg;40 (i) obsah volného železa celkem pod 2,0 ppm;(j) hladinu tetrameru nižší než 0,8 % hmotnostního, vztaženo na hmotnost hemoglobinu celkem;(k) obsah endotoxinu nižší než 0,03 EU/ml;(l) obsah fosfolipidů nižší než 50 ng/Hb; a (m) obsah glykolipidů nižší než 2 ng/Hb.
- 22. Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje asi 16 % hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 128 kDa, asi 26% hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi-18CZ 299357 B6192 kDa a asi 58% hemoglobinového polymeru o molekulové hmotnosti asi 256 kDa, kde všechna procenta jsou hmotnostní a jsou vztažena na hmotnost hemoglobinu celkem.
- 23. Roztok podle nároku 22, v y z n a č u j í c í se t í m , že po infuzi humánnímu pacientovi 5 v množství až do asi 1,5 1 nevyvolává žádný zřetelný pokles výkonnosti ledvin.
- 24. Roztok podle nároku 1 pro použití pro léčení pacienta postiženého ztrátou krve.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1438996P | 1996-03-28 | 1996-03-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ310098A3 CZ310098A3 (cs) | 1999-09-15 |
| CZ299357B6 true CZ299357B6 (cs) | 2008-07-02 |
Family
ID=21765191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0310098A CZ299357B6 (cs) | 1996-03-28 | 1997-03-27 | Vodný roztok pyridoxylovaného zpolymerovaného hemoglobinu a zpusoby jeho prípravy |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6498141B2 (cs) |
| EP (1) | EP0928294B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000507947A (cs) |
| CN (1) | CN1129608C (cs) |
| AP (1) | AP1028A (cs) |
| AT (1) | ATE241646T1 (cs) |
| AU (1) | AU740210B2 (cs) |
| BG (1) | BG63919B1 (cs) |
| BR (1) | BR9708388A (cs) |
| CA (1) | CA2250274C (cs) |
| CZ (1) | CZ299357B6 (cs) |
| DE (1) | DE69722422T2 (cs) |
| DK (1) | DK0928294T3 (cs) |
| ES (1) | ES2200177T3 (cs) |
| IL (1) | IL126376A (cs) |
| IS (1) | IS4854A (cs) |
| NO (1) | NO324121B1 (cs) |
| NZ (2) | NZ538045A (cs) |
| OA (1) | OA10884A (cs) |
| PL (1) | PL187923B1 (cs) |
| PT (1) | PT928294E (cs) |
| RO (1) | RO121089B1 (cs) |
| RU (1) | RU2203087C2 (cs) |
| SK (1) | SK134398A3 (cs) |
| UA (1) | UA64710C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997035883A1 (cs) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2200177T3 (es) * | 1996-03-28 | 2004-03-01 | Northfield Laboratories, Inc. | Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acecular de globlulo rojo. |
| WO2002085111A1 (en) | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Northfield Laboratories | Flexible container system for storage of stabilized hemoglobin solutions |
| DE10220992A1 (de) * | 2002-05-11 | 2003-12-04 | Sanguibiotech Ag | Verwendung eines oder mehrerer Sauerstoffträger, ausgewählt aus Hämoglobin, Myoglobin und Derivaten hiervon zur Behandlung einer Organfunktionsstörung infolge eines akuten Versorgungsmangels und zur Behandlung/Vermeidung einer Gewebeschädigung infolge einer solchen Störung |
| MXPA05003340A (es) * | 2002-10-03 | 2005-07-05 | Northfield Lab | Metodo para tratamiento de pacientes con perdida masiva de sangre. |
| KR20050095636A (ko) * | 2003-01-29 | 2005-09-29 | 노쓰필드 라보라토리스, 인코포레이티드 | 감소된 양의 테트라머를 지닌 중합된 헤모글로빈 용액 및이의 제조 방법 |
| RU2278677C2 (ru) * | 2004-09-30 | 2006-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "МБФ" | Средство для стимулирования эритропоэза и устранения дефицита железа |
| SE0501462L (sv) * | 2005-06-23 | 2006-09-26 | Proliff Ab | Förfarande för framställning av blodplättslysat |
| US20090004159A1 (en) * | 2006-01-24 | 2009-01-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi | Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells |
| US20070196810A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-23 | Northfield Laboratories Inc. | Polymerized Hemoglobin Media and its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells |
| RU2340354C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода |
| RU2341286C1 (ru) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа |
| RU2361608C1 (ru) | 2008-03-18 | 2009-07-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственная Компания "Медбиофарм" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода, фармацевтическая композиция (варианты) |
| US11504417B2 (en) | 2017-07-18 | 2022-11-22 | VirTech Bio, Inc. | Blood substitutes comprising hemoglobin and methods of making |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0361720A1 (en) * | 1988-09-08 | 1990-04-04 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Hemoglobin-based blood substitute and method for the preparation thereof |
| US5194590A (en) * | 1986-06-20 | 1993-03-16 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| US5464814A (en) * | 1986-06-20 | 1995-11-07 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU583272B2 (en) * | 1984-04-27 | 1989-04-27 | Synthetic Blood Corporation | Coacervate system synthetic whole blood substitute |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| SE9001378D0 (sv) * | 1990-04-18 | 1990-04-18 | Kabivitrum Ab | A method for the preparation of pyridoxylated hemoglobin |
| TW381022B (en) * | 1993-08-16 | 2000-02-01 | Hsia Jen Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute |
| ES2200177T3 (es) * | 1996-03-28 | 2004-03-01 | Northfield Laboratories, Inc. | Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acecular de globlulo rojo. |
| US5998361A (en) * | 1996-10-18 | 1999-12-07 | University Of Maryland At Baltimore | Polymerized hemoglobin |
-
1997
- 1997-03-27 ES ES97919943T patent/ES2200177T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 CN CN97194998A patent/CN1129608C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 WO PCT/US1997/005088 patent/WO1997035883A1/en active IP Right Grant
- 1997-03-27 CZ CZ0310098A patent/CZ299357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 SK SK1343-98A patent/SK134398A3/sk unknown
- 1997-03-27 EP EP97919943A patent/EP0928294B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 IL IL126376A patent/IL126376A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 JP JP9534650A patent/JP2000507947A/ja active Pending
- 1997-03-27 DE DE69722422T patent/DE69722422T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 US US09/155,419 patent/US6498141B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 CA CA002250274A patent/CA2250274C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 AP APAP/P/1998/001353A patent/AP1028A/en active
- 1997-03-27 NZ NZ538045A patent/NZ538045A/en unknown
- 1997-03-27 NZ NZ332067A patent/NZ332067A/en unknown
- 1997-03-27 PT PT97919943T patent/PT928294E/pt unknown
- 1997-03-27 AT AT97919943T patent/ATE241646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 BR BR9708388-7A patent/BR9708388A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-03-27 DK DK97919943T patent/DK0928294T3/da active
- 1997-03-27 RU RU98119535/14A patent/RU2203087C2/ru active
- 1997-03-27 PL PL32910897A patent/PL187923B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 RO RO98-01433A patent/RO121089B1/ro unknown
- 1997-03-27 UA UA98095067A patent/UA64710C2/uk unknown
- 1997-03-27 AU AU24253/97A patent/AU740210B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-25 NO NO19984473A patent/NO324121B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-25 OA OA9800177A patent/OA10884A/en unknown
- 1998-09-28 IS IS4854A patent/IS4854A/is unknown
- 1998-10-01 BG BG102810A patent/BG63919B1/bg unknown
-
2002
- 2002-10-17 US US10/274,099 patent/US20030191050A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-11-19 US US10/993,228 patent/US20050065067A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-01-10 US US11/972,322 patent/US7521417B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-20 US US12/426,566 patent/US20100197566A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5194590A (en) * | 1986-06-20 | 1993-03-16 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| US5464814A (en) * | 1986-06-20 | 1995-11-07 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| EP0361720A1 (en) * | 1988-09-08 | 1990-04-04 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Hemoglobin-based blood substitute and method for the preparation thereof |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7521417B2 (en) | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute | |
| NL194909C (nl) | Werkwijze voor de bereiding van gepolymeriseerd hemoglobine en celvrij vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes op basis daarvan. | |
| US7411044B2 (en) | Polymerized hemoglobin solutions having reduced amounts of tetramer and method for preparing | |
| EP0507870A1 (en) | POLYHEMOGLOBIN STABILIZED BY PURINE DERIVATIVES AND GLUTATHION. | |
| KR100562762B1 (ko) | 무세포성적혈구대체물을제조하기위한방법및장치 | |
| EP1308460A2 (en) | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100327 |