RO121089B1

RO121089B1 - Soluţie apoasă de hemoglobină polimerată cu glutaraldehida, procedeu de preparare şi utilizarea acesteia

Info

Publication number: RO121089B1
Application number: RO98-01433A
Authority: RO
Inventors: Richard E. Dewoskin; Marc D. Doubleday
Original assignee: Northfield Laboratories, Inc.
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2006-12-29
Also published as: IS4854A; DK0928294T3; OA10884A; PT928294E; BG63919B1; AP1028A; CN1219939A; IL126376A0; CA2250274C; US20100197566A1; NO324121B1; DE69722422T2; ES2200177T3; US20030191050A1; EP0928294B1; AU740210B2; PL329108A1; WO1997035883A1; JP2000507947A; US6498141B2

Abstract

Invenţia se referă la o soluţie apoasă de hemoglobină polimerizată cu grutaraldehidă, care este un înlocuitor acelular de celule roşii sanguine, cuprinzând în esenţă o soluţie de hemoglobină peridoxilată, polimerizată, reticulată, liberă de tetramer, lipsită de contaminanţi stromali, la un procedeu pentru producerea soluţiei de hemoglobină utilizată pentru tratarea unui pacient care a suferit pierderi de sânge.

Description

Prezenta invenție se referă la o soluție apoasă de hemoglobină, polimerizată cu glutaraldehidă, care este un înlocuitor acelular de celule roșii sanguine cuprinzând în esență o soluție de hemoglobină piridoxilată, polimerizată, reticulată, liberă de tetramer, care este lipsită de contaminant stromali, și la un procedeu pentru producerea soluției de hemoglobină utilizată pentru tratarea unui pacient care a suferit pierderi de sânge.

Este cunoscut faptul că băncile de sânge au asigurat sângele integral pentru înlocuire pe durata operațiilor chirurgicale, datorită unor traume, sau în alte situații. Totuși, sângele integral obținut de la donatori umani nu este adecvat pentru o serie de utilizări. în mod deosebit, utilizarea sângelui integral este problematică datorită cerințelor privind clasa donatorului, problemelor de stabilitate și limita de viață și a toxicității provocate de virusuri și alți contaminanți. Aceste probleme sunt pertinente, în mod special, în situații de urgență, cum ar fi utilizarea sângelui de către militari. Ca urmare, s-a depus mult efort pentru dezvoltarea unorînlocuitori pentru sângele integral obținut de la donatori umani. Această dezvoltare a avut drept rezultat diferite modificări la sângele integral de la oameni sau alte surse mamifere. Hemoglobina liberă de stroma este cunoscută în practica actuală ca având capacități de transport de oxigen și legare reversibilă (sau ligand) a oxigenului. întrucât problemele de toxicitate au făcut imposibilă utilizarea ei ca Înlocuitor de sânge, hemoglobina liberă de stroma a necesitat modificări suplimentare pentru a asigura un produs netoxic, utilizabil din punct de vedere farmaceutic.

Aceste modificări includ (1) livrarea hemoglobinei libere sau practic libere de stroma și contaminanți stromali; (2) piridoxilarea; (3) polimerizarea sau reticularea; (4) îndepărtarea tetramerului; și (5) modificări cu monoxid de carbon sau alți liganzi.

Totuși, soluțiile de hemoglobină produse ca urmare a acestor tehnici, deși capabile să transporte cantități suficiente de oxigen pentru a întreține viața, au condus la multe efecte secundare și proprietăți nedorite. De exemplu, un efect secundar major care deranjează este o scădere a performanței rinichiului. Aceste modificări s-au considerat a fi datorită prezenței unor contaminanți nedoriți cum sunt endotoxina bacteriană sau fragmente ale membranelor celulelor roșii (stroma). Deși contaminanți cum sunt aceștia pot produce într-adevăr modificări renale, soluțiile de hemoglobină practic libere de contaminanții menționați încă mai produc disfuncții renale substanțiale. Cauza pentru aceste disfuncții renale poate fi atribuită unor cantități, inacceptabile din punct de vedere fiziologic, de tetramer de hemoglobină nepolimerizată. Alte efecte secundare nedorite ale infuziei de hemoglobină tetramerică sunt vasoconstricția, hemoglobinuria, scăderea ritmului inimii, creșterea presiunii sângelui arterial principal și extravazarea infuzatului în special în cavitatea peritoneală.

în practică, nici un înlocuitor de sânge cunoscut ca derivat din hemoglobină nu a reușit să înlăture problemele de toxicitate. Aceste produse prezintă, de asemenea, o perioadă de înjumătățire a vieții inacceptabil de scăzută după administrarea la pacienți umani. Asemenea perioade de înjumătățire a vieții reclamă înlocuirea volumului de sânge la perioade scurte de timp, repetate. Ca urmare, există o necesitate reală privind produse de hemoglobină care să nu fie toxice pentru pacienți și care să aibă o perioadă de înjumătățire substanțială după administrare. Desigur, aceste produse trebuie să fie capabile să transporte în mod reversibil oxigenul către țesuturi într-un mod similar celui realizat de sângele integral.

Problema pe care rezolvă invenția este o soluție apoasă de hemoglobină, polimerizată cu glutaraldehidă, și un procedeu pentru prepararea acestei soluții

Soluție apoasă de hemoglobină, polimerizată cu glutaraldehidă, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că nu are mai mult decât cantități acceptabile fiziologic de hemoglobină tetrameră în soluție și are, raportat la greutatea hemoglobinei totale din soluție, o distribuție a greutății moleculare de: -10 până la 24% polimer de hemoglobină cu greutate

RO 121089 Β1 moleculară de aproximativ 12Θ kd; -18 până la 30% polimer de hemoglobină cu greutate 1 moleculară de aproximativ 192 kd și -45 până la 70% polimer de hemoglobină cu greutate moleculară de aproximativ 256 kd, determinată prin HPLC cu excludere dimensională. 3

Procedeul pentru prepararea unei soluții apoase de hemoglobină polimerizată cu glutaraldehidă, înlăttură dezavantajele de mai sus prin aceea că cuprinde etapele de:5

a) îndepărtare a leucocitelor prin filtrarea unui amestec care conține celulele roșii sangvine printr-un filtru care are o dimensiune a porilor medie minimă suficientă pentru a 7 împiedica trecerea leucocitelor;

b) liză a celulelor roșii sanguine;9

c) filtrare a suspensiei de celule lizate printr-un filtru pentru a produce o soluție de hemoglobină lipsită de stromă și material de perete celular;11

d) încălzire a soluției de hemoglobină de la c) până la o temperatură de 60-62‘C pentru aproximativ 10 h și filtrarea soluției tratate termic pentru a obține o soluție de hemoglobină13 tratată termic liberă de stroma;

e) degazare a soluției de hemoglobină tratată termic la o temperatură de aproximativ15

10’C, pentru a produce o spumă care să conducă la o soluție de hemoglobină degazeificată;

f) polimerizare a soluției de hemoglobină cu o soluție apoasă de glutaraldehidă pentru17 a produce o soluție de hemoglobină piridoxilată cu distribuția moleculară dorită a polimerilor de hemoglobină și aproximativ 65-75%, în greutate, polimer și aproximativ 25 -35% în greu-19 tate tetramer raportat la greutatea totală a hemoglobinei;

g) oxigenare și diluare cu apă a soluției polimerizate până când soluția va conține 21 aproximativ 4% în greutate hemoglobină;

h) purificare a soluției oxigenate din etapa g) pentru a îndepărta hemoglobina 23 tetramerică și colectarea hemoglobinei polimerizate, piridoxilate, purificate până când soluția conține nu mai mult decât cantități fiziologic acceptabile de hemoglobină tetramerică; 25

i) deoxigenare a soluției de hemoglobină polimerizată și purificată;

j) reglare a pH-ului la aproximativ 8,8-9,0 și a nivelurilor de electrolit în soluția de 27 hemoglobină polimerizată, piridoxilată și purificată pentru a reprezenta nivelurile din plasma normală; și 29

k) concentrare și sterilizare a soluției obținute din etapa j).

Prezenta invenție asigură înlocuitori de hemoglobină care nu sunt toxici pentru 31 oameni și care au o durată considerabilă de înjumătățire de cel puțin 15 h atunci când sunt administrați la oameni. Produsele de hemoglobină din prezenta invenție sunt libere de 33 stroma, piridoxilate și polimerizate, și sunt de asemenea libere de contaminanți virali și de alți contaminanți toxici (celule albe sanguine) și plateleți. 35

Prezenta invenție cuprinde, de asemenea, procedee pentru producerea înlocuitorilor de hemoglobină conform invenției. Procedeele includ îndepărtarea leucocitelor și plateleților 37 din sânge; spălarea și Uzarea celulelor roșii sanguine; îndepărtarea contaminanților stromali și a stromei prin filtrare și tratament termic; prepararea formei deoxi a hemoglobinei; piridoxi- 39 larea și polimerizarea; purificarea ulterioară și concentrarea; și deoxigenarea. Produsul de hemoglobină rezultat poate fi apoi formulat pentru a asigura un produs de hemoglobină 41 având nivele ale diferiți lor electroliți în domenii normale din punct de vedere fiziologic.

Invenția de față asigură, de asemenea, o formulare apoasă a hemoglobinei piridoxi- 43 late, polimerizate, în care hemoglobina este o hemoglobină glutaraldehid-polimerizată conținând material tetrameric, având profilul greutății moleculare din fig. 3. Această formulare 45 poate fi utilizată pentru a prepara un înlocuitor acelular al celulei roșii sanguine. Pentru aceasta, formularea este mai întâi purificată pentru a îndepărta tetramerul și apoi este corn- 47 binată cu cantități adecvate de electroliți pentru a produce un înlocuitor acelular de celule

RO 121089 Β1 roșii sanguine, acceptabil din punct de vedere fiziologic, care poate fi utilizat ulterior pentru a trata un pacient uman care necesită o infuzie a unui transportor de oxigen.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- nu este toxic pentru organism;

- are perioadă de înjumătățire substanțială după administrare.

în continuare se face o scurtă descriere a desenelor din fig. 1 ...6, care reprezintă:

- fig. 1,o diagramă schematică care înfățișează porțiunea de procedeu și echipamentul utilizat pentru a obține soluția de hemoglobină deoxigenată, produsă în vederea piridoxilării și polimerizării;

- fig. 2, o diagramă schematică care înfățișează porțiunea de procedeu și utilajele respective începând cu piridoxilarea și polimerizarea, și conducând la un produs de hemoglobină deoxigenat, purificat, piridoxilat, polimerizat și porțiunea de procedeu și utilajele respective utilizate pentru a formula produsul hemoglobină final având nivele fiziologice de electroliți;

- fig. 3, o cromatogramă a cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) a unui material polimerizat după tratamentul cu glicină înainte de purificare. Produsul polimerizat este indicat prin vârfuri (pic-uri) la timpi de retenție (RT-retention times) de 15, 57,16,08,17,00 și 18,19. Materialul tetrameric este indicat prin vârfuri (pic-uri) la timpi de retenție de 19,88 și 20,51. Polimerul reprezintă 76,2% din acest material;

- fig. 4, o cromatogramă prin cromatografie de lichid de înaltă performanță (HPLC) a produsului hemoglobină din invenție. Hemoglobina polimerizată este indicată prin vârfuri (pic-uri) la timpi de retenție de 15,7,16,33,17,32 și 18,56. Tetramerul este indicat prin vârful (pic-ul) la un timp de retenție de 21, 18;

- fig. 5, o diagramă schematică care înfățișează un proces de purificare pe coloană cromatografică utilizat în cadrul prezentei invenții;

- fig. 6, o diagramă schematică, care înfățișează un proces de purificare prin filtrare prin membrană utilizat în cadrul prezentei invenții.

în continuare se face o descriere detaliată a modului de realizare preferat al invenției. Prezenta invenție se referă la un înlocuitor acelular de celule (globule) roșii sanguine cuprinzând hemoglobină practic liberă de tetramer, piridoxilată, polimerizată, reticulată, care este substanțial lipsită de stroma, contaminanți stromali și de alți contaminanți.

Așa cum este utilizat aici, termenul reticulat reprezintăamplasarea chimică a punților moleculare pe sau într-o moleculă, sau între molecule cu scopul de a modifica forma, dimensiunea, funcția sau caracteristicile fizice ale moleculei. Moleculele reticulate pot fi polimerizate sau ne-polimerizate, respectiv moleculele reticulate pot fi tetramerice.

Așa cum este utilizat aici, termenul tetramer se referă la molecule de hemoglobină având o greutate moleculară de aproximativ 64 Kd, respectiv, termenul se referă atât la molecule de hemoglobină native, cât și la cele reticulate intramolecular.

Așa cum este utilizat aici, termenul practic liber de tetramer denotă nivelul de puritate în raport cu contaminarea cu tetramer la care anumite răspunsuri biologice la tetramerul administrat în mamifer nu mai sunt prezente. Un criteriu principal este absența modificărilor funcției renale atunci când sunt infuzate cantități eficiente din punct de vedere farmaceutic, respectiv, la un nivel al purității de aproximativ 99% sau mai mare (tetramerul este prezent într-o cantitate mai mică de 1%. Produsul preferat obținut prin procedeul din invenția de față conține nu mai mult de 0,8 procente tetramer raportat la greutatea hemoglobinei totale (THb). Cu alte cuvinte, un produs practic liber de tetramer în conformitate cu prezenta invenție conține nu mai mult decât cantități acceptabile din punct de vedere fiziologic de tetramer de hemoglobină nepolimerizat Produse preferate în mod special din

RO 121089 Β1 prezenta invenție conțin mai puțin de aproximativ 0,5 % tetramer; produsele invenției, 1 preferate în mod deosebit, conțin aproximativ 0,3-0,4 % tetramer. Se consideră că asemenea cantități de tetramer ar fi acceptabile din punct de vedere fiziologic. 3

Așa cum este utilizat aici termenul produs ultrapurificat sau produs purificat au aceeași semnificație ca și termenul practic liber de tetramer”.5

Așa cum este utilizat aici, procentul total de hemoglobină (THb) este definit drept grame de hemoglobină/100 ml de soluție.7

Așa cum este utilizat aici, termenul soluție de polimerizare, reprezintă o soluție care conține un agent de polimerizare sau reticulare, cum ar fi glutaraldehidă, imidoesteri, 9 diaspirină sau alții, într-un agent purtător adecvat din punct de vedere biochimic.

Așa cum este utilizat aici, termenul de polimerizat reprezintă plasarea punților mole-11 cutare între molecule sau unități tetramerice în care dimensiunea și greutatea moleculelor polimerizate rezultate este crescută în raport cu hemoglobina nativă sau tetramerică. Hemo- 13 globina polimerizată nu este hemoglobină tetramerică.

Prin soluție de hemoglobină așa cum este utilizată aici, se înțelege o soluție de 15 hemoglobină tetramerică sau de molecule de hemoglobină polimerizate în care moleculele nu sunt conținute în celulele roșii sanguine. O asemenea soluție nu este necesar a fi liberă 17 sau practic liberă de stroma sau de contaminanți stromali ai celulei roșii sanguine. Totuși, soluțiile de hemoglobină polimerizată preferate sunt libere de stroma sau contaminanți 19 stromali ai celulei roșii sanguine.

Prin termenul membrană semipermeabilă se înțelege o membrană permeabilă pen- 21 tru anumite specii de molecule și nepermeabilă pentru altele, respectiv, o membrană care acționează drept filtru selectiv excluzând anumite greutăți moleculare. 23

Produsul din procedeul conform prezentei invenții, o soluție de hemoglobină piridoxilată, polimerizată, practic liberă de hemoglobină tetramerică (nativă sau reticulată intra- 25 molecular), de stroma și de diferiți alți contaminanți, produsă prin tratament termic, hemoglobină tetramerică inactivată viral, este acceptată din punct de vedere fiziologic și este 27 utilizabilă din punct de vedere terapeutic și clinic. Produsul are capacitate de legare reversibilă a oxigenului, ceea ce este necesar pentru proprietățile de transport al oxigenului. Este 29 cel mai notabil faptul că produsul demonstrează caracteristici bune de încărcare și descărcare în utilizare, ceea ce se corelează cu faptul de a avea o curbă de disociere oxigen- 31 hemoglobină (Ρ_Μ) similară cu cea a sângelui integral. Produsul leagă oxigenul cu mare afinitate în capilarele din plămâni și apoi eliberează oxigenul în mod adecvat către țesuturile din 33 corp. Produsul nu reclamă deci studii de compatibilitate cu un recipient.

Produsul are de asemenea, atunci când este administrat la oameni, o perioadă de 35 înjumătățire de cel puțin aproximativ 15 h și mai preferabil de aproximativ 24 h. Acest produs de hemoglobină poate fi infuzat la pacienți în cantități de până la aproximativ 3,0 I și chiar 37 până la aproximativ 5,01. Cu alte cuvinte, produsul de hemoglobină conform prezentei invenții poate fi utilizat pentru a completa practic întreg volumul de sânge al pacientului uman, 39 fără a provoca vasoconstricție, toxicitate renală, hemoglobinuria sau alte probleme asociate cu administrarea intravenoasă a agenților purtători de oxigen sintetici sau semisintetici și a 41 înlocuitorilor de sânge. Astfel, invenția include o metodă de transfuzie către pacient, preferabil un pacient uman, a unui produs de hemoglobină pirldoxilat, polimerizat, liber de tetra- 43 meri, lipsit de stroma, care nu este toxic pentru pacient, în care cantitatea este de până la cel puțin aproximativ 5,01.0 asemenea metodă include atașarea la pacient sau la subiectul 45 respectiv a unui dispozitiv de infuzie sau un alt asemenea echipament pentru infuzia sau transfuzia către pacient. 47

Procedeul din această invenție este unic prin faptul că el conduce la obținerea unui produs având un nivel de tetramer nu mai mare de aproximativ un procent și, mai preferabil, 49 nu mai mare de aproximativ 0,8% în greutate, raportat la greutatea hemoglobinei totale din

RO 121089 Β1 soluție. Procedeul din prezenta invenție asigură un avantaj suplimentar prin faptul că el poate conduce la un produs final practic liber de antigeni microbieni și virali, și patogeni. Asemenea antigeni microbieni și virali și patogeni sunt reduși la nivele nedetectabile. Produsul este steril așa cum a fost determinat prin analizele menționate în United States Pharmacopoeia XXIII, Capitolul 71. Exemple de asemenea antigeni și patogeni includ, de exemplu, organisme microbiene, rickețiale, fungice, protozoare, virale și alte organisme. Cel mai important este ca procedeul să asigure un produs biologic lipsit de virusuri care ar putea cauza hepatită și sindrom dobândit al deficienței imunologice (SIDA).

Atâta timp cât proprietățile fiziologice sunt respectate, produsul biologic din această invenție, atunci când este infuzat în cantități de până la cel puțin 0,5 I, nu provoacă vasoconstricție, toxicitate renală, hemoglobinuria și alte probleme legate de administrarea intravenoasă a unor soluții de hemoglobină cunoscute conținând cantități nedorite din punct de vedere fiziologic de hemoglobină tetramerică. Administrarea intravenoasă a produsului obținut prin procedeul descris aici nu conduce la o scădere apreciabilă a producției de urină, nu produce o descreștere apreciabilă a vitezei de filtrare glomerulare, nu conduce la o extravazare apreciabilă în cavitatea peritoneală și nu conduce la modificări apreciabile în ceea ce privește culoarea urinei produse.

Prin urmare, procedeul prezentei invenții asigură un înlocuitor acelular al celulei roșii sanguine utilizabil în tratamentul traumelor, infarctului miocardic, aritmie, anemie acută și tulburări de deficiență ale oxigenului cum este hipoxemia, hipoxia sau hipoxia în stadiul final datorate deteriorării sau incapacității plămânului de a oxigena complet sângele. Produsul este, de asemenea, utilizabil în tratamentul oricărei boli sau afecțiuni medicale necesitând un fluid de reanimare (de exemplu traume, șoc hemoragie specific), expander de volum intravascular sau transfuzie de schimb. Suplimentar față de tratamentul medical, produsul poate fi utilizabil în conservare a organelor pentru transplanturi.

Procedeul prezentei invenții cuprinde următoarele proceduri:

1. aspirarea și filtrarea celulelor roșii

2. spălarea/lizarea celulelor

3. tratament termic

4. concentrare prin ultrafiltrare

5. degazeificare

6. modificare chimică

7. purificare

8. poli concentrare UP

9. deoxigenare

10. formulare

Materia primă preferată în procedeul din prezenta invenție este sânge integral uman depășit sau celule roșii sanguine ambalate. Suplimentar poate fi utilizat, de asemenea, sânge nedepășit (care se află în termenul dat). Este preferabil ca în acest procedeu să nu se folosească sânge integral dacă acesta a fost depozitat mai mult de 2 săptămâni după expirarea termenului indicat pe sac. Utilizarea sângelui integral depășit cu mai mult de 2 săptămâni de la data expirării conduce la dificultăți suplimentare privind extracția hemoglobinei și îndepărtarea resturilor celulare cum sunt proteinele stromale și contaminanții.

Toate procedeele descrise aici sunt aplicabile și la alt sânge de mamifer cu unele mici modificări posibile cunoscute specialiștilor în practica curentă. Cea mai mare parte din proces poate fi efectuată la temperatura de aproximativ 2 până la 8’C, preferabil la aproximativ 4”C.

în timpul aspirării și filtrării, celulele roșii sanguine (RBC - red blood cells) sunt extrase aseptic din sacii de donare fără introducerea aerului în sânge și traversează o serie

RO 121089 Β1 de filtre pentru a se obține o suspensie de celule roșii sanguine având o cantitate redusă de 1 leucocite și de plateleți. Suspensia rezultată este apoi supusă spălării / lizării celulelor.

Suspensia este spălată în atmosferă de bioxid de carbon cu o soluție de aproximativ 3 1% clorură de sodiu pentru a îndepărta proteinele din plasma reziduală. Celulele roșii sanguine spălate sunt apoi tratate cu apă pentru injecții (WFI-water for injection) pentru a liza 5 celulele și amestecul rezultat este limpezit folosind o unitate de filtrare în contra curent. Produsul limpezit este apoi tratat termic pentru a precipita materialul stromal adițional care 7 este îndepărtat prin filtrare. Produsul din această procedură este o soluție de hemoglobină liberă de stroma (SFH-stroma-free hemoglobin) cu un conținut de hemoglobină totală (THb) 9 de aproximativ 3% (g/vol).

Soluția de hemoglobină tratată termic și liberă de stroma conținând carboxihemo- 11 globină este concentrată și degazată, pentru a se obține o soluție SFH conținând deoxihemoglobină. Degazeificarea implică în primul rând saturarea soluției de carboximemoglobină cu 13 oxigen timp de aproximativ 16 h, pentru a se obține o soluție de hemoglobină oxigenată, și aproximativ 7% în greutate, raportat la greutatea totală de hemoglobină, de carboxihemo- 15 globină. în continuare, oxigenul este îndepărtat cu azot, argon sau heliu, pentru a forma soluția conținând hemoglobină liberă, respectiv hemoglobină necomplexată, și aproximativ 17 7% în greutate, raportat la greutatea totală de hemoglobină, de oxihemoglobină. Soluția degazată rezultată este filtrată și transferată într-un vas în vederea modificării chimice. 19 în continuarea degazării, soluția de hemoglobină liberă de stroma este piridoxilată folosind piridoxal-5'-fosfat (PSP) într-un raport molar piridoxal-5'-fosfat față de hemoglobină 21 de aproximativ 1:1 până la 3:1. Ca o alternativă, hemoglobina liberă de stroma poate fi piridoxilată folosind 2-Nor-2 formilpiridoxal-5'-fosfat. Un agent de reducere cum este 23 cianoborohidrură de sodiu sau preferabil borohidrură de sodiu este adăugat la amestecul de piridoxilare. Excesul de reactiv și sărurile sunt îndepărtate prin dializă contra apei lipsită de 25 pirogen sau, preferabil diafiltrare cu apă pentru injecții (WFI). Hemoglobina piridoxilată este apoi polimerizată cu soluție de glutaraldehidă. 27

Soluția de hemoglobină piridoxilată, liberă de stroma, este polimerizată folosind o soluție apoasă de glutaraldehidă. Durata polimerizării și cantitatea de glutaraldehidă utilizată 29 este funcție de volumul de soluție de hemoglobină, de randamentul dorit de polimeri și de distribuția dorită a greutății moleculare. în general, durate mai mari de polimerizare conduc 31 la creșterea randamentului și a distribuției greutății moleculare a polimerilor. Un randament de aproximativ 75% în greutate de polimer, raportat la greutatea totală a hemoglobinei, se 33 obține în aproximativ 16-18 h. Punctul final preferat al polimerizării este definit ca fiind acel punct în care soluția conține aproximativ 75% în greutate de polimeri, raportat la greutatea 35 hemoglobinei totale, așa cum este monitorizat cu ajutorul cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) de excludere dimensională. Ca o alternativă, punctul final este definit 37 ca fiind punctul la care soluția conține aproximativ 65% de polimeri raportat la greutatea totală a hemoglobinei, respectiv de aproximativ 2,5 ore. 39

Reacția de polimerizare este întreruptă brusc prin adăugare de glicină apoasă. Soluția tampon trebuie adăugată în cel mai scurt timp posibil. Reticularea este apoi stabili- 41 zată prin adăugarea, de asemenea în cel mai scurt timp posibil, a unei soluții apoase de borohidrură de sodiu. Această soluție polimerizată este concentrată în continuare și apoi 43 diafiltrată sub atmosferă de oxigen pentru a oxigena soluția. Se adaugă în final apă la soluție până ce soluția conține aproximativ 4% în greutate hemoglobină. 45

Polimerizarea în conformitate cu procedura din prezenta invenție conduce la un randament ridicat de polimeri având un domeniu îngust al greutății moleculare, așa cum este 47 arătat în fig. 3 și exemplul 1, care urmează.

RO 121089 Β1

Soluția de hemoglobină piridoxilată, polimerizată, este apoi purificată cu ajutorul cromatografiei pe coloană, prin filtrare, de exemplu prin filtrare prin membrană, sau prin ambele tehnici, pentru a îndepărta hemoglobina reziduală nepolimerizată (tetramerică) din soluție. Soluția de hemoglobină polimerizată purificată este apoi concentrată până la aproximativ 6% folosind un aparat de ultrafiltrare, preparată în vederea schimbului de gaze.

Soluția concentrată este apoi deoxigenată cu azot. Deoxigenarea are loc la aproximativ 10-12*C, până ce cantitatea de oxihemoglobină din soluție este mai mică de aproximativ 16 % în greutate din hemoglobina totală.

Soluția de hemoglobină deoxigenată, purificată și polimerizată este apoi concentrată prin ultrafitrare sub atmosferă de azot într-un recipient răcit. pH-ul este ajustat la valoarea de 8,8-9,0 și cantitatea de electroliți poate fi ajustată la cât este necesar pentru a reprezenta nivelele din plasma normală. Suplimentar, pot fi adăugați în mod opțional antioxidanți convenționali cum sunt glutation, ascorbat sau glucoză. După ce soluția este concentrată până la nivelul dorit, preferabil de aproximativ 10% în greutate, hemoglobina liberă de stroma, lipsită de tetramer, purificată, piridoxilată, polimerizată, este sterilizată prin filtrare și transferată via un aparat de transfer steril în containere acceptabile din punct de vedere farmaceutic.

Caracteristicile soluției de hemoglobină rezultate sunt arătate aici în continuare:

	Hemoglobină polimerizată
Total hemoglobină (g/dl)^1>	9,5-12,0
Methemoglobină (% din total Hb )¹⁾	mai mic de 8
Carboxihemoglobină (% din total Hb)^1>	mai mic de 5
P₅₀ (torr)ⁿ	23-32
Osmolalitate (mmol/kg)²⁾	280 - 360
Sodiu (mmol/kg)²⁾	135-155
Potasiu (mmol/1)³⁾	3,5 - 4,5
Cloruri (mmol/1 )³⁾	85-110
Fier liber (ppm)⁴⁾	mai mic de 2,0
Distribuția greutății moleculare Vârf (pic) 128Kd(%)⁵⁾	10-24
Distribuția greutății moleculare Vârf (pic) 192 Kd (%)⁵⁾	18-30
Distribuția greutății moleculare Vârf (pic) 265 Kd (%)⁵’	45-70
Tetramer (64 K) (%)⁵⁾	mai mic de 0,8
Endotoxin (Eu/ml)⁶⁾	mai mic de 0,03
Fosfolipide ng/Hb⁷⁾	mai mic de 50
Glicolipide ng/Hb⁷’	mai mic de 2

RO 121089 Β1 ¹⁾ Nivelul din hemoglobină polimerizată a fost determinat pe cale spectrofoto-1 metrică.

²⁾ Nivelul din hemoglobina polimerizată a fost determinat prin osmometrie. 3 ³⁾ Nivelul din hemoglobina polimerizată a fost determinat cu electrod specific de ioni.5 ^4> Nivelul din hemoglobina polimerizată a fost determinat prin absorbție atomică.7 ⁵¹ Determinat cu ajutorul cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) de excludere - dimensională.9 ⁶¹ Determinat prin LAL folosind un test disponibil comercial de la Associates of Cape Cod, componentele testului având numerele de catalog 100-5, 800 -1, și 3100 - 5.11 ⁷⁾ Determinat cu ajutorul cromatografiei în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC).13

Exemplele care urmează demonstrează anumite aspecte ale prezentei invenții. Cu toate acestea, trebuie considerat că aceste exemple sunt date doar în scopuri ilustrative și15 nu au pretenția de a fi pe de-a întregul definitive privind condițiile și scopul acestei invenții. Toate temperaturile sunt exprimate în grade Celsius, în afară de cazul când se specifică 17 altfel. Atâta timp cât nu se menționează altfel, toate procentajele, de exemplu hemoglobină totală (THb), sunt exprimate ca greutate/volum (gr/vol). Trebuie, de asemenea, admis că, 19 deși sunt date condițiile tipice de reacție (de exemplu, temperatura, durata reacției), condițiile care se situează deasupra sau dedesubtul acestui domeniu specific pot fi de asemenea 21 utilizate, dar în general mai puțin convenabil.

în afară de cazul în care se menționează contrar, toate recipientele și rezervoarele 23 utilizate în procedeul din prezenta invenție sunt confecționate din oțel inoxidabil 316-L, preferabil un grad farmaceutic din acest oțel inoxidabil, care a fost foarte bine polizat și ca 25 urmare ușor și rapid de curățat. Diferitele conducte și țevi de legătură sunt confecționate din același oțel inoxidabil sau din teflon de grad farmaceutic sau din tuburi de silicon. Filtrele și 27 membranele utilizate în acest procedeu pot fi comandate de la Millipore Inc., Pall-Filtron, sau de la Cuno Inc. 29

Perioada deînjumătățire a produsului rezultat conform prezentei invenții este determinată in vivo la mamifere, de exemplu la oameni. în mod obișnuit, o probă de sânge este 31 prelevată de la mamifer după o perioadă de timp de la data la care a fost infuzat cu produs. Cantitatea de produs este apoi determinată centrifugând proba de sânge, exprimând porți- 33 unea de plasmă, determinând nivelele de hemoglobină din plasmă pe cale spectrofotometrică și apoi corelând cantitatea de produs rămasă în mamifer cu perioada de înjumătățire 35 a produsului.

Cromatografia de lichid de înaltă performanță (HPLC) cu excludere-dimensională 37 conform invenției a fost efectuată după cum urmează:

Proba este diluată cu tampon de fosfat de potasiu 0,2 M, având pH-ul egal cu 6,9,39 până la 0,2 g/dl, filtrată printr-un filtru de 0,2 microni și injectată în sistemul cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) constând din următoarele componente (în ordinea 41 fluxului sistemului):

1. Pompă model Pharmacia 224843

- faza mobilă este fosfat de potasiu 0,2 M, pH 6,9

- debitul este de 1,0 ml/minut45

2. Tubulatură 45 cm PEEK sau de titan, 0,010 inches diametrul interior.47

3. Injector Rheodyne 7725i model cu buclă de probă 200 pl

PEEK49

4. Tubulatură 18 cm PEEK sau de titan, 0,010 inches diametrul interior51

RO 121089 Β1

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Filtru tip turlă de biserică model A431 de 0,5 μ

Tubulatură de 9 cm PEEK sau de titan, 0,010 inches diametru interior.

Coloană Phenomenex Biosep SEC S - 3000 75x7,8 mm Guard.

Tubulatură de 24 cm PEEK sau de titan, 0,010 inches diametru interior.

Coloană analitică Phenomenex Biosep SEC S - 3000 75x7,8 mm.

Tubulatură 23 cm PEEK sau de titan, 0,010 inches diametru interior.

Detector Pharmacia Uvicord SD UV

- lungime de undă: 280 nm

- debitul celular: 8 μΙ voi., lungimea pasului egală cu

2,5 mm

- domeniu : 2AUFS

- constanta de timp : 10 s

Vârful (pic-ul) de absorbanță la 280 nm este înregistrat pe un Integrator LKB 2221, care integrează suprafețele vârfului (pic-ului) individual și calculează aria hemoglobinei totale pentru fiecare specie de polimeri.

O înțelegere mai bună a invenției de față poate fi obținută din următoarele exemple nelimitative.

Exemplul 1. Referindu-ne acum la fig. 1, sacii de la donatorul 20, de sânge expirat (sânge integral sau celule roșii sanguine ambalate) sunt situați într-un aparat de aspirare aseptic adecvat 22. Un exemplu de aparat de aspirare adecvat este un sistem având două stații de aspirare. Odată ce sacul de la donator este introdus în stația de aspirare, un ac prevăzut în sistemul de aspirație găurește sacul de la donor, introduce aproximativ 150 ml de soluție apoasă de clorură de sodiu 1% (g/vol) și aspiră sângele depășit din sacul de la donor sub presiune redusă sau vacuum. Sângele aspirat este trecut printr-un filtru cu înălțimea de 100 μ 24 și, în continuare, traversează filtrele 26 cu înălțimea de 5 μ, montate în serie. Atunci când sângele traversează filtrele de 5 μ, leucocitele sunt îndepărtate din sânge. în mod obișnuit, sunt aspirate aproximativ 170 de unități de sânge integral expirat ca dată, filtrate și în continuare transferate în rezervorul 1, așa cum este arătat în fig. 1. Filtrele sunt apoi spălate cu aproximativ 751 de soluție de clorură de sodiu 1% (g/vol).

înainte de introducerea sângelui în rezervorul 1, rezervorul 1 este încărcat cu aproximativ 70 I de soluție apoasă de clorură de sodiu 1%. După ce toate cele 170 de unități de sânge integral expirat ca dată au fost aspirate, filtrate și transferate și filtrele au fost spălate, rezervorul conține aproximativ 2501 de soluție de hemoglobină totală de 4%. în timpul fazelor de aspirație și de filtrare, rezervorul 1 este menținut la presiune redusă, respectiv un vacuum de 20-28 țoii de coloană de mercur. Odată ce tot sângele expirat ca dată a fost transferat în rezervorul 1, vacuum-ul este întrerupt și este introdus monoxid de carbon în rezervor, astfel încât rezervorul conține o atmosferă de monoxid de carbon.

Rezervorul 1 este cuplat la un filtru cu flux tangențial 28 de 0,65 μ, așa cum este arătat în fig. 1. Șarja inițială de 250 I de soluție de hemoglobina totală de 4% este concentrată la aproximativ 125 de I de soluție de hemoglobină totală de 8% prin microfiltrare în filtrul cu flux tangențial. pH-ul soluției de hemoglobină în acest punct este de aproximativ 6 până la 6,5. După concentrare la 8% hemoglobină totală, soluția este spălată prin adăugare de soluție de clorură de sodiu 1% (g/vol), diafiltrată, filtratul fiind îndepărtat cu același debit cu

RO 121089 Β1 care este adăgată soluția de clorură de sodiu. Cei 1251 de soluție de hemoglobină sunt în 1 mod obișnuit spălați cu aproximativ 8 volume de soluție de clorură de sodiu 1 % (aproximativ 1000 de I). în continuare, după spălare, soluția este concentrată la aproximativ 701, respectiv 3 la aproximativ 14% hemoglobină totală și se adaugă apă pentru injecții, pentru a aduce volumul soluției la aproximativ 1801. Prin adăugarea apei de injecții (WFI), celulele se umflă 5 și se rup, eliberând hemoglobina în soluție. Concentrația soluției de hemoglobină rezultată este de aproximativ 5% hemoglobină totală (THb). 7

Soluția rezultată este limpezită în timp ce este încă în rezervorul 1. Soluția este inițial concentrată la aproximativ 50 I și filtratul este transferat în rezervorul 2. în timp ce soluția 9 este pompată prin filtru, contaminanții stromali ai celulelor roșii sanguine și materialul peretelui celulelor sunt reținuți și îndepărtați de către filtru. Cei 50 I de soluție rămași în 11 rezervorul 1 sunt spălați (diafîltrați) cu aproximativ 2,5 volume de apă pentru injecții (WFI). Aceste 2,5 volume de apă de spălare sunt adăugate la rezervorul 2. Materialul rămas în 13 rezervorul 1 este apoi concentrat la aproximativ 201, iar filtratul este adăugat la rezervorul

2. Volumul rezultat în rezervorul 2 este de aproximativ 2801 de soluție de 3,3% hemoglobină 15 totală.

Soluția rezultată de hemoglobină liberă de stroma este apoi încălzită în rezervorul 1 17 la o temperatură de aproximativ 60-62’C o perioadă de timp de aproximativ 10 h. în această perioadă de timp, soluția este agitată moderat. în timp ce soluția este încălzită și trece de 19 temperatura de aproximativ 55’C, se formează un precipitat.

Soluția rezultată de 3,3% hemoglobină totală (THb) (g/vol) liberă de stroma, tratată 21 termic, este apoi filtrată printr-un filtru de 0,2 μ (30) urmat de un filtru de 0,1 μ 32 și transferată în rezervorul 3. Soluția de hemoglobină filtrată este apoi concentrată la aproxi- 23 mativ 18% hemoglobină totală (THb) și în continuare spălată și diafiltrată cu 4 volume de apă de injecții (WFI) (180 I). Concentrarea și diafiltrarea este efectuată folosind un ultra-filtru 34 25 de 10 kilodalton greutate moleculară. Drenajul 35 asociat cu ultrafiltrul 34 colectează filtratul.

La acest punct, soluția de 45 I de hemoglobină totală 18% conține mai puțin de 50 ng de 27 fosfolipide per gram de hemoglobină, mai puțin de 2 ng de glicolipide per gram de hemoglobina, mai puțin de 1 % methemoglobină, mai puțin de 0,03 unități de endotoxin per mililitru 29 la o valoare a pH-ului egală cu 6 până la 6,5. Această hemoglobină în soluție este carboxihemoglobină. 31

Soluția de carboxihemoglobină rezultată este apoi transferată în rezervorul 4, unde carboxihemoglobina este mai întâi oxigenată și apoi deoxigenată. Rezervorul 4 este echipat 33 cu un inel distribuitor cuplat la linia de oxigen și de azot, un racord de alimentare de la partea inferioară a rezervorului către un aparat de pulverizare cu măsurare, poziționat la partea 35 superioară a rezervorului 4, și un colector deversor conectat la vasul de spumă 36, astfel încât spuma generată în rezervorul 4 este alimentată în vasul de spumă 36, unde spuma 37 condensează formând un lichid care este reîntors în rezervorul 4. Rezervorul 4 mai include un strat de inele Pali, care umple o treime din volumul rezervorului. Vasul de spumă 36 in- 39 clude o aerisire pentru îndepărtarea gazului. Soluția din rezervorul 4 este o soluție de hemoglobină totală de 13%. 41 în timpul fazei de oxigenare, oxigenul este distribuit prin soluție cu un debit suficient pentru a realiza o dispersie uniformă a gazului în vas. Vasul cu un volum de 200 I este 43 barbotat cu un debit de gaz de 25 l/min. Oxigenarea carboxihemoglobinei este efectuată o perioadă de timp de aproximativ 16 h, astfel încât soluția rezultată să conțină mai puțin de 45 5% carboxihemoglobină raportată la greutatea hemoglobinei totale. Oxigenarea este efectuată la o temperatură de aproximativ 10‘C. Spuma generată în rezervorul 4 este colectată 47 în vasul de spumă 36 și, după decantare, soluția rezultată este transferată înapoi în rezervorul 4. 49

RO 121089 Β1

După oxigenare, soluția este barbotată cu un debit similar de azot timp de aproximativ 6 h sau până când mai puțin de 10% din oxihemoglobină raportată la greutatea hemoglobinei totale rămâne în soluție. Barbotarea cu azot este efectuată la o temperatură de aproximativ 10*C și la o valoare a pH-ului de aproximativ 6 până la 6,5. Ca o alternativă, carboxihemoglobina ar putea fi transformată la deoxihemoglobină folosind un schimbător tip membrană. Trebuie menționat că aici nu are loc nici o denaturare substanțială a hemoglobinei așa cum ne-am fi așteptat de la faza de spumare. Soluția deoxigenată rezultată este acum preparată pentru o modificare chimică.

Referindu-ne acum la fig. 2, soluția de deoxihemoglobină este transferată în rezervorul (5) în vederea unei modificări chimice. La rezervorul 5 conținând soluția de deoxihemoglobină la o temperatură de aproximativ 4*C, s-a adăugat apoi o soluție apoasă de piridoxil5-fosfat (PSP) (93,75 g/l) într-un raport molar PSP față de hemoglobină de 1:1 până la 3:1. Un raport molar piridoxil-5-fosfat față de hemoglobină de 2:1 este preferat. Piridoxilarea este condusă la o temperatură de aproximativ 4’C. Soluția de piridoxil-5-fosfat este în mod obișnuit adăugată timp de aproximativ 1 min și amestecată timp de aproximativ 15 min, după care se adaugă o soluție de borohidrură de sodiu/hidroxid de sodiu la soluția de hemoglobină într-un raport molar borohidrură de sodiu față de hemoglobină de aproximativ 20:1.0 soluție apoasă adecvată de borohidrură de sodiu/hidroxid de sodiu conține 0,8 g de hidroxid de sodiu per 21 și 90,8 g de borohidrură de sodiu per 21. Soluția de borohidrură este adăugată cât de rapid posibil într-un timp de aproximativ 1 min și apoi se agită timp de 1 h. Soluția de hemoglobină piridoxilată de 501 este în continuare diafiltrată folosind un ultra-filtru 38 de 10 kilodalton pentru a îndepărta excesul de reactanți cu 4 volume de apă de injecții (WSI). Drenajul (40) asociat cu ultra-filtrul 38 colectează filtratul de la filtrul 38.

După diafiltrare cu 4 volume, respectiv 2001 de apă pentru injecții (WFI), hemoglobina este polimerizată. La rezervorul 5 conținând hemoglobina piridoxilată se adaugă suficientă apă de injecții pentru a prepara o soluție de hemoglobină totală de 4,5% (aproximativ 1751 de soluție de hemoglobină). La soluția de hemoglobină piridoxilată se adaugă o soluție de glutaraldehidă într-un raport molar glutaraldehidă față de hemoglobină de aproximativ 24:1. Soluția de glutaraldehidă este în mod obișnuit adăugată la soluția de hemoglobină o perioadă de timp de 2,5 h cu o pompă dozatoare. Reacția de polimerizare are loc timp de aproximativ 18 h. Distribuția greutății moleculare dorite este de aproximativ 75% polimer și 25% tetramer. Polimerii ce urmează a se obține au o greutate moleculară mai mică de aproximativ 600.000 predominând fracțiunea cu greutatea moleculară cuprinsă între 100.000 și 350.000.

Atunci când reacția de polimerizare atinge distribuția greutății moleculare dorite (după aproximativ 18 h), se adaugă glicină apoasă (aproximativ 166 g/l) (cu o răcire bruscă) la soluția de hemoglobină într-un raport molar glicină față de hemoglobină de 140:1. Vezi fig. 3 care reprezintă o cromatogramă obținură prin cromatografie de lichid de înaltă performanță (HPLC) a produsului rezultat hemoglobină polimerizată, reacție întreruptă cu glicină. Soluția rezultată este apoi amestecată timp de 10 minute, după care se adaugă o soluție de borohidrură de sodiu/hidroxid de sodiu (având concentrația identificată mai sus) la soluția de hemoglobină într-un raport molar borohidrură de sodiu față de hemoglobină de 28:1. Amestecul rezultat este agitat timp de aproximativ 1 oră. Soluția este apoi concentrată până la aproximativ 501 (pe ultra-filtru 38) și spălată cu 4 volume (2001) de apă de injecții. Un alicot suplimentar de borohidrură de sodiu cu același raport molar indcat mai sus a fost adăugat la soluția concentrată și s-a agitat din nou timp de 1 h. Soluția rezultată a fost spălată cu 4 volume de apă de injecții (2001), rezultând o hemoglobină liberă de stroma, piridoxilată, polimerizată, care a fost tratată termic.

RO 121089 Β1

Soluția rezultată a fost oxigenată lăsând soluția să stea sub atmosferă de oxigen și 1 apoi a fost transferată la sistemul de purificare 42. Purificarea poate fi realizată pe coloană cromatografică, prin filtrare, preferabil filtrare prin membrană (dialfiltrare), sau o combinație 3 de filtrare și cromatografie pe coloană.

într-un exemplu de realizare a invenției, soluția este transferată în vasul de alimentare 5 a coloanei cromatografice, rezervorul 6, așa cum este arătat în fig. 5. în acest mod de realizare, soluția rezultată de oxihemoglobină este apoi diluată la aproximativ 2001 (4% hemo- 7 globină totală) în rezervorul 6 și concentrația clorurii este ajustată la 22 mM cu soluție de clorură de sodiu. Nu este necesară nici o ajustare a concentrației de sodiu. 9

Cinci alicoți de 401 din soluția de hemoglobină rezultată au fost apoi supuși cromatografiei folosind coloana 44. Coloana 44 conține un gel de afinitate care este un gel de 11 agaroză modificată cu un colorant galben (obținut comercial de la Affinity Chromatography, Ltd., drept Mimetic Yellow No. 1) având o mai mare afinitate pentru polimer decât pentru 13 tetramer.

Cromatografia este efectuată după cum urmează. 40 I de soluție de hemoglobină 15 liberă de stroma, piridoxilată, polimerizată, oxigenată este încărcată într-o coloană 44. Coloana este spălată cu 15 volume ale coloanei (aproximativ 7501) de soluție apoasă tam- 17 pon de clorură de sodiu 30 mM pentru a îndepărta tetramerul. Coloana este apoi spălată cu aproximativ 250 I de soluție tampon de clorură de sodiu 300 mM pentru a îndepărta 19 polimerul. Fracțiunile de polimer sunt colectate în rezervorul 7. Fracțiunile nedorite sunt trimise la drenajul 46. După ce fiecare alicot a fost îndepărtat, coloana este regenerată cu 21 o soluție (1501) de acid clorhidric 15 mM, reechilibrată cu o soluție apoasă (2501) de clorură de sodiu 30 mM și un alt alicot de soluție de alimentare (40 I) este încărcat în coloană. 23

Coloana este din nou spălată cu soluție de clorură de sodiu 30 mM urmată de o soluție de clorură de sodiu de 300 mM. 40 de alicoți de soluție de hemoglobină sunt adăugați în 25 coloană și supuși cromatografiei până ce rezervorul 6 se golește.

Fracțiunile colectate în rezervorul 7 sunt ultrafiltrate (concentrate) folosind filtrul 48 27 asociat cu drenajul 50 până la un volum de aproximativ 401 (6% hemoglobină totală). Soluția de hemoglobină concentrată este apoi transferată în rezervorul de schimb 8 pentru 29 deoxigenare.

Ca o alternativă, soluția este transferată într-un vas de reciclu filtrat 10, așa cum este 31 arătat în fig 6. Hemoglobina este apoi diluată până la aproximativ 4% hemoglobină totală (THb) în rezervorul 10. Soluția de hemoglobină totală de 4% este apoi diafiltrată folosind 33 clorură de sodiu 10 mM și un filtru 52 pentru greutate moleculară 300.000, obtenabil pe cale comercială de la Pali - Filtron. Filtrarea este continuată până când aproximativ 97% din mate- 35 rialul hemoglobină trece prin filtru în rezervorul 11. (Aproximativ 3% din material, respectiv polimeri cu greutate moleculară mare, este reținut în rezervorul 10). Cantitatea de hemo- 37 globină este determinată pe cale spectrofotometrică folosind un coaximetru.

Materialul rezultat în rezervorul 11 este aproximativ 2-4% hemoglobină totală și 39 conține aproximativ 7-10% tetramer raportat la hemoglobină. Hemoglobina totală 2-4% este apoi diafiltrată folosind soluție de clorură de sodiu 10 mM și un filtru 54 pentru greutate 41 moleculară de 100.000, disponibil comercial de la Pall-Filtron, asociat cu trapa de drenaj 56. Filtrarea este continuată până ce nivelul de tetramer, determinat cu ajutorul cromatografiei 43 prin excludere dimensională folosind o coloană BioSep SEC-S 3000 600x7,8 mm, este mai mic de 0,8% în greutate raportat la masa de hemoglobină. Soluția de hemoglobină purificată 45 rezultată rămâne inițial în rezervorul 11 și apoi este transferată la rezervorul de schimb de gaz 8 pentru deoxigenare. 47

RO 121089 Β1

Rezervorul de schimb de gaz 8 poate fi același ca rezervorul 4 sau, în mod preferabil, un rezervor diferit. Rezervorul de schimb de gaz 8 este echipat în esență în același mod ca rezervorul de schimb de gaz 4, reprezentat în fig. 1, și este atașat la vasul de spumă 58 întrun mod identic cu cel al rezervorului 4 și a vasului de spumă 36. Deoxigenarea este efectuată într-un interval de timp de aproximativ 2,5 h cu ajutorul unui barbotor de azot la temperatura de aproximativ 10*C și la o valoare a pH-ului soluției de aproximativ 7,5. Se continuă barbotarea azotului până când în soluție rămâne mai puțin de aproximativ 16% oxihemoglobină, raportată la greutatea de hemoglobina totală. Soluția de deoxihemoglobină rezultată este în continuare transferată la rezervorul 9 pentru formulare.

în rezervorul de formulare 9, soluția este mai întâi concentrată la aproximativ 7% hemoglobină totală, iar pH-ul ajustat de la valoarea de aproximativ 8,8 până la 9,0 la temperatura de 4’C. Ajustarea pH-ului se face utilizând soluție de hidroxid de sodiu 0,2 M. Apoi, se adaugă soluții de electrolit la soluția de hemoglobină având pH-ul cuprins între 8,8 și 9,0. Se adaugă apoi glucoză și glicină pentru a se obține concentrațiile finale de aproximativ 5 g/l și respectiv 1,75 g/l. La soluție se adaugă clorură de potasiu, obținându-se o concentrație de aproximativ 3,5 până la 4,5 mM. Se adaugă apoi soluție de clorură de sodiu 3M pentru a se obține o concentrație de clorură de 85-110 mM. Se adaugă în continuare lactat de sodiu pentru a se obține o concentrație a ionului de sodiu de 135-155 mmol. în final se adaugă o soluție de acid ascorbic 0,45 molar pentru a crește concentrația de acid ascorbic până la aproximativ 1000 mg/l. Acidul ascorbic este adăugat drept agent de prezervare/agent antioxidant, în vederea stocării. Soluția de hemoglobină rezultată are o osmolaritate finală de aproximativ 280 - 360 mmol/kg.

Soluția de hemoglobină formulată este apoi concentrată la aproximativ 10% hemoglobină totală utilizând filtrul 60 asociat cu trapa de drenaj 62, iar soluția de hemoglobină 10% este apoi sterilizată prin filtrare pe filtrul 64 și încărcată aseptic în pungi presterilizate.

Caracteristicile produsului preparat în acest exemplu, șarja A, sunt arătate în tabelul următor. Suplimentar, caracteristicile șarjelor B și C, ambele produse în conformitate cu procedura menționată mai sus pentru șarja A, sunt arătate în tabelul următor.

TEST	Șarja
A	B	C
Hemoglobină, g/dl	10,4	10,2	10,2
Methetnoglobină, %	4,6	6,0	5,6
Carboxihemoglobină, %	0,2	1,4	1,5
P 50(Torr, pH 7,35- 7,45, PCO₂ 35-40 tom)	28,5	26,8	27,0
Osmolalitate, mmol/kg	318	320	317
Sodiu, mmol/l	142	144	142
Potasiu, mmol/l	4,0	4,0	4,0
Cloruri, mmol/l	98	99	94
Fier liber, ppm	0,7	1,2	1,0
Distribuția greutății	128: 16	128:11	128:16
moleculare, % la	192:26	192:23	192 : 26
fiecare, MW (Kd)	256®: 58	256®: 66	256®:58
Tetramer, %	0,4	0,3	0,4
Endotoxin, Eu/ml	<0,03	<0,03	<0,03

⁸ Materialul include, de asemenea, o cantitate mică de material cu greutate moleculară mare.

RO 121089 Β1 în cele de mai sus a fost prezentată o descriere detaliată a modurilor preferate de 1 realizare a prezentei invenții doar în scopuri ilustrative și nicidecum limitative. Este de asemenea de înțeles că orice alte modificări alternative, sau soluții echivalente, evidente persoa- 3 nelor specializate în domeniu, având la bază această descriere, se intenționează a fi incluse în scopul invenției de față, revendicată. 5

Claims

Revendicări 7

1. Soluție apoasă de hemoglobină, polimerizată cu glutaraldehidă, caracterizată prin 9 aceea că nu are mai mult decât cantități acceptabile fiziologic de un conținut de hemoglobină tetrameră în soluție și are, raportat la greutatea hemoglobinei totale din soluție, o distribuție 11 a greutății moleculare de: 10 până la 24% polimer de hemoglobină cu greutate moleculară de aproximativ 128 kd, 18 până la 30% polimer de hemoglobină cu greutate moleculară de13 aproximativ 192 kd, și 45 până la 70% polimer de hemoglobină cu greutate moleculară de aproximativ 256 kd, determinată prin HPLC cu excludere dimensională.15
2. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta mai cuprinde:17

a) hemoglobină totală între 9,5 și 12,0 g/dl;

b) methemoglobină totală mai puțin de 8% din masa de hemoglobină totală;19

c) carboxi-hemoglobină totală mai puțin de 5% din masa de hemoglobină totală;

d) concentrația de sodiu între 135 și 155 mmol/l;21

e) concentrația de potasiu între 3,5 și 4,5 mmol/l;

f) concentrația de clorură între 85 și 110 mmol/l;23

g) concentrația de fier liber total mai mică de 2,0 ppm;

h) endotoxină mai puțin de 0,03 EU/ml;25

i) fosfolipide mai puțin de 50 ng/Hb;

j) glicolipide mai puțin de 2 ng/Hb;27

k) o osmolaritate între 280 și 360 mmol/kg;

l) o disociere oxigen-hemoglobină între 23 până la 32 torr.29
3. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta conține nu mai mult decât aproximativ 1 % din hemoglobina tetramerică raportată31 la greutatea hemoglobinei totale.
4. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea 33 că aceasta conține nu mai mult decât 0,8% din hemoglobina tetramerică raportată la greutatea hemoglobinei totale.35
5. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta are o durată de înjumătățire la un pacient uman de aproximativ 15 h.37
6. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta are o durată de înjumătățire, la un pacient uman, de aproximativ 24 h.39
7. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta este capabilă să fie perfuzată, la un pacient uman, într-o cantitate de până la 41 aproximativ 3 I, fără a determina o descreștere a performanțelor rinichiului, și are o durată de înjumătățire, la pacientul uman, de aproximativ 24 h. 43
8. Soluție apoasă de hemoglobină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde 16% polimer de hemoglobină cu o masă moleculară de aproximativ 45 128 kd, 26% polimer de hemoglobină cu o masă moleculară de aproximativ 192 kd și 58% polimer de hemoglobină cu o masă moleculară de aproximativ 256 kd, care este capabilă 47 să fie perfuzată la un pacient uman într-o cantitate de până la aproximativ 31, fără a determina o descreștere a performanțelor rinichiului. 49

RO 121089 Β1
9. Soluție apoasă de hemoglobină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este capabilă să fie perfuzată la un pacient uman într-o cantitate de aproximativ de 1,51 fără a provoca o scădere a performanțelor rinichiului.
10. Procedeu pentru prepararea unei soluții apoase de hemoglobină polimerizată cu glutaraldehidă, așa cum este definită în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde etapele de:

a) îndepărtare a leucocitelor prin filtrarea unui amestec care conține celulele roșii sangvine printr-un filtru care are o dimensiune a porilor medie minimă suficientă pentru a împiedica trecerea leucocitelor;

b) lizare a celulelor roșii sanguine;

c) filtrare a suspensiei de celule Uzate printr-un filtru pentru a produce o soluție de hemoglobină lipsită de stromă și material de perete celular;

d) încălzire a soluției de hemoglobină de la c) până la o temperatură de 60-62’C pentru aproximativ 10 h și filtrarea soluției tratate termic pentru a obține o soluție de hemoglobină tratată termic liberă de stroma;

e) degazare a soluției de hemoglobină tratată termic la o temperatură de aproximativ 10“C, pentru a produce o spumă care să conducă la o soluție de hemoglobină degazeificată;

f) polimerizare a soluției de hemoglobulinăcu o soluție apoasă de glutaraldehidă pentru a produce o soluție de hemoglobină polimerizată cu distribuția moleculară dorită a polimerilor de hemoglobină și aproximativ 65-75%, în greutate, polimeri și aproximativ 25 -35% în greutate tetramer raportat la greutatea totală a hemoglobinei;

g) oxigenare a și diluare cu apă a soluției polimerizate până când soluția va conține aproximativ 4% în greutate hemoglobină;

h) purificare a soluției oxigenate din etapa g), pentru a îndepărta hemoglobina tetramericăși colectarea hemoglobinei polimerizate, purificate, până când soluția conține nu mai mult decât cantități fiziologic acceptabile de hemoglobină tetramerică;

i) deoxigenare a soluției de hemoglobină polimerizată și purificată;

j) reglare a pH-ului la aproximativ 8,8-9,0 și a nivelurilor de electrolit în soluția de hemoglobină polimerizată, purificată pentru a reprezenta nivelurile din plasma normală; și

k) concentrare și sterilizare a soluției obținute din etapa j).
11. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că mai cuprinde etapa b-1, spălarea filtratului din etapa a) cu o soluție de clorură de sodiu 1%, sub o atmosferă de monoxid de carbon, pentru a îndepărta proteinele plasmatice reziduale.
12. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că mai cuprinde etapa 1-1, concentrarea și diafiltrarea soluției de hemoglobină liberă de stroma, tratată termic pentru a obține o soluție de carboxihemoglobină tratată termic, ulterior etapei 1.
13. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că, în etapa h), purificarea se desfășoară până când soluția va conține nu mai mult de aproximativ 1% tetramer, raportat la greutatea hemoglobinei totale.
14. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că, în etapa i), deoxigenarea se desfășoară folosind azot.
15. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că, ulterior etapei e), produsul mai cuprinde etapa e'), piridoxilarea soluției degazate de la punctul e), cu 1 la 3 moli de piridoxal-5'-fosfat pe mol de hemoglobină pentru a rezulta o soluție de hemoglobină piridoxilată.
16. Utilizarea soluției definite în revendicarea 1 pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea unui pacient care suferă de pierderi de sânge.