BG63919B1 - Неклетъчен заместител на червените кръвни клетки - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до воден разтвор на полимеризиран хемоглобин, който се прилага в хуманната медицина за трансфузии. Разтворът включва следнитехемоглобинови полимери в %: от 10 до 24 хемоглобинов полимер с мол.т. около 128, от 18 до 30 - с мол.т. около 192 и от 45 до 70 - с мол.т. около 256.По-специално водният разтвор съдържа пиридоксилиран полимеризиран хемоглобин със следните компоненти: общ хемоглобин приблизително от 9,5 до 12,0 g/dl, общ метхемоглобин < 8% от общия хемоглобин, общкарбоксихемоглобин < 5% от общия хемоглобин, концентрация на натрий от 135 до 155 mmol/kg, концентрация на калий от 3,5 до 4,5 mmol/kg, концентрация на хлорид от 85 до 110 mmol/kg, свободно желязо < 2,0 ppm, тетрамер < 0,8%, ендотоксин < 0,03 EU/ml,фосфолипиди < 50 ng/Hb и гликолипиди < 2 ng/Hb.

Description

(54) НЕКЛЕТЪЧЕН ЗАМЕСТИТЕЛ НА ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ

Област на техниката

Изобретението се отнася до воден разтвор на полимеризиран хемоглобин, по-специално, до воден разтвор на пиридоксилиран, полимеризиран хемоглобин, лишен от примеси от стромата, както и до неговото приложение за трансфузия при хора.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че кръвните банки осигуряват цяла пълноценна кръв за заместване по време на хирургични интервенции, поради травми или при други ситуации. Въпреки това, цяла пълноценна кръв, получена от хора донори, е неподходяща за много приложения. Поспециално, използването на цяла кръв е проблемно, поради съобразяването с типа на донора, стабилността и проблемите със съхранението и токсичността, породена от вируси и други контаминация. Проблемите са особено значими при спешни случаи, като например използването на кръв за нуждите на армията. Вследствие на това се хвърлят значителни усилия за разработване на заместители на цяла пълноценна кръв, получена от хора донори. Създадени са различни модификации на кръв от хора или бозайници. За лишения от строма хемоглобин е известно от състоянието на техниката, че има свойства за транспорт на кислород и свойства на обратимо свързване на кислород (или на лиганди). Проблемите с токсичността изключват възможността за използване на заместител на кръвта, тъй като за лишения от строма хемоглобин се изискват допълнителни модификации за осигуряване на нетоксичност. Тези модификации се изработват, като се получава хемоглобин, лишен или напълно лишен от строма и контаминации от стромата. След това се извършва пиридоксилиране, полимеризация или напречно омрежване, отстраняване на тетрамера и модификация с въглероден монооксид или други лиганди.

Получените чрез тези техники разтвори на хемоглобин, въпреки че са способни да пренасят достатъчни количества кислород за поддържането на живота, са свързани с нежелани ефекти и качества. Главният страничен ефект, създаващ нежелани последствия, например е намаляване дейността на бъбреците. Предполага се, че промените се дължат на присъствието на нежелана контаминация, например бактериален ендотоксин или фрагменти от мембраните на червените кръвни клетки (строма). Докато контаминацията от такъв вид може да предизвика нарушение на бъбречната дейност, хемоглобиновите разтвори, по същество лишени от посочените контаминации, също предизвикват значителни бъбречни нарушения. Причината за бъбречните нарушения се приписват на физиологично неприемливи количества неполяризиран хемоглобинов тример. Други нежелани странични ефекти от преливането на тетрамерен хемаглобин са вазоконстрикацията (съдосвиване), сърдечна недостатъчност, повишаване на средното артериално кръвно налягане и проникване извън кръвоносните съдове на инфузията, по-специално в перитонеалната кухина.

В практиката не са известни производни на хемоглобина заместители, които успешно и изцяло да превъзмогват проблемите с токсичността. Тези продукти имат също така и недопустимо нисък полуживот след прилагане върху пациент човек. Такива нива на полуживот изискват повтаряща се замяна на обема на кръвта през кратък период от време. Следователно, налице е значителна необходимост от хемоглобинови продукти, които да не са токсични за пациентите и които да имат значително време на полуживот след прилагане. Естествено тези продукти трябва да са способни обратимо да пренасят кислорода до тъканите по начин, подобен на този на пълноценната кръв.

Техническа същност на изобретението

Изобретението предоставя заместители на хемоглобин, които не са токсични за човека и имат значително време на полуживот от наймалко 15 h, когато се прилагат на хора. Хемоглобиновите продукти съгласно изобретението са лишени от строма, пиридоксилирани и полимеризирани, също така и лишени от вирусни и други токсични онечиствания. Тези продукти освен това са лишени от левкоцити (бели кръвни клетки) и тромбоцити.

Настоящото изобретение включва и ме тоди за приготвяне на заместителите на хемоглобин. Методите включват отстраняване на левкоцитите и тромбоцитите от кръвта; промиване и лизиране на червените кръвни клетки, отстраняване на замърсяванията от строма и стромата чрез филтриране и топлинна обработка, изготвяне на дезокси- форма на хемоглобина; пиридоксилиране и полимеризиране; следващо пречистване и концентриране; и дезоксигениране. От получения хемоглобинов продукт може да се изготви лекарствена форма, от която да се получи хемоглобинов продукт с нива на различни електролити в рамките на нормалните физиологични нива.

Изобретението осигурява също така и водни форми за приложение на пиридоксилиран полимеризиран хемоглобин, в които хемоглобинът е полимеризиран с глутаралдехид хемоглобин, съдържащ тетрамерен състав, който има профил на молекулно тегло, показан на фиг.З. Тези форми за приложение могат да се използват за приготвяне на неклетъчен заместител на червените кръвни клетки. В този аспект формите за приложение първо се пречистват за отстраняване на тетрамера, а след това се комбинират с подходящи количества електролит за продуциране на физиологично приемлив, неклетъчен заместител на червените кръвни клетки, които може след това да се използват за третиране на пациенти хора, нуждаещи се от вливане на кислороден носител.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 представлява схематична диаграма, очистваща част от процеса и средства, използвани за получаване на дезоксигениран хемоглобинов разтвор, приготвен за пиридоксилиране и полимеризиране.

Фигура 2 представлява схематична диаграма, описваща част от процеса и устройство, започващо с пиридоксилиране и полимеризиране и даващо дезоксигениран, пречистен, пиридоксилиран, полимеризиран хемоглобинов продукт, и част от процеса и устройство, използвано за изготвяне на лекарствени форми на крайния хемоглобинов продукт, имащ физиологичните стойности на електролит.

Фигура 3 е ВЕТХ (високо ефективна течна хроматография), показваща полимеризирания материал след третране с глицин преди пречистването. Полимеризираният продукт е отбелязан с пикове при време за задържане (RT) 15,57, 16,08, 17,00 и 18,19. Тетрамерният материал е отбелязан с пикове при RT 19,88 и 20,51. Полимерът представлява 76,2% от този материал.

Фигура 4 е ВЕТХ, показваща хемоглобиновия продукт съгласно изобретението. Полимеризираният хемоглобин е посочен чрез пикове при RT 15,7,16, 33, 17,32 и 18,56. Тетрамерът е посочен с пик при RT 21,18.

Фигура 5 представлява схематична диаграма, описваща процес на пречистване чрез колонна хроматография, използван в изобретението.

Фигура 6 представлява схематична диаграма, описваща процес на пречистване на мембранна филтрация, използван в изобретението.

Настоящото изобретение се отнася до неклетъчен заместител на червените кръвни клетки, съдържащи основно лишен от тетрамер, напречно омрежен, полимеризиран пиридоксилиран хемоглобин, който е по същество лишен от строма, онечиствания от стромата и други онечиствания.

Терминът “напречно омрежен”, както се използва тук, означава химичното местонахождение на молекулните “мостове” върху или в молекулата, или между молекулите с цел промяна на формата, размера, функцията или физичните характеристики на молекулата. Напречно омрежените молекули могат да са полимеризирани или да не са полимеризирани, т.е. напречно омрежените молекули могат да са тетрамерни.

Терминът “тетрамер”, както се използва тук, се отнася до молекули хемоглобин с молекулно тегло от приблизително 64 kD. Това означава, че терминът се отнася както до нативни, така и до междумолекулни напречно омрежени хемоглобинови молекули.

Терминът “основно лишен от тетрамер”, както се използва в изобретението, означава степента на чистота с оглед на тетрамерните онечиствания, при които вече не съществуват някои отговори на тетрамер, при прилагане върху бозайник. Главният критерий е липсата на промяна на функционирането на бъбреците, когато се вливат фармацевтично ефективни количества, което е при нива на чистота от приблизително 90% или повече (присъствие на по-малко от 1 % от тетрамера). Предпочита ният продукт, получен по метода на изобретението, не съдържа повече от 0,8% тетрамер спрямо теглото на общия хемолобин (THb). С други думи по същество лишен от тетрамер продукт съгласно изобретението не съдържа нищо повече освен физиологично приемливи количества неполимеризиран хемоглобинов тетрамер. Особено предпочитани продукти от изобретението съдържат по-малко от приблизително 0,5% тетрамер, като най-предпочитаните продукти съдържат приблизително 0,3 - 0,4% тетрамер. За такива нива на тетрамера е установено, че са физиологично приемливи.

Термините “свръхпречистен продукт”, както се използва тук, или “пречистен продукт” имат същото значение като термина “изцяло лишен от тетрамер”.

Както е използван тук, % общ хемоглобин (ТНЬ) е дефиниран като грамове хемоглобин на 100 ml разтвор.

Терминът “полимеризиращ разтвор” означава разтвор, съдържащ “напречно омрежващо” или полимеризиращо средство, като глутаралдехид, имидоестери, диаспилин или други, в биохимично подходящ носител.

Както се използва тук, терминът “полимеризиран” означава разположението на молекулните мостове между молекули или тетрамерните субединици, като размерът и теглото на получените полимеризирани молекули нараства по отношение на нативния или тетрамерния хемоглобин. Полимеризираният хемоглобин не е тетрамерен хемоглобин.

Под разтвор на хемоглобин, както се употребява тук, се разбира разтвор на тетрамерния хемоглобин или полимеризирани хемоглобинови молекули, при който молекулите не се съдържат в червените кръвни клетки. Такива разтвори не е необходимо да са лишени от строма на червени кръвни клетки или онечиствания от стромата. Предпочитани разтвори на полимеризиран хемоглобин са лишени от строма на червени кръвни клетки или онечиствания на стромата.

Под термина “полупропусклива мембрана” се разбира мембрана, пропусклива за някои видове молекули и непропусклива за други, т.е. мембрана, която действа като селективен филтър, изключващ определени молекулни тегла. Продуктът на метода съгласно изобретението е полимеризиран пиридоксилиран хемоглобинов разтвор, по същество лишен от тет рамерен (нативен или вътремалекулярно омрежен) хемоглобин, от онечиствания на стромата или други онечиствания, продуциран от топлинно обработен, вирусно инактивиран тетрамерен хемоглобин, и е физиологично приемлив, както и терапевтично и клинично полезен. Продуктът има способност за обратимо свързване на кислорода, което е необходимо свойството за транспорт на кислород. Трябва да се отбележи, че продуктът показва добри характеристики на натоварване и разтоварване при ползване, които съответстват на кривата на дисоциация на кислород - хемоглобин (Р_зо), подобна на тази на цялата (пълноценна) кръв. Продуктът свързва кислорода с висок афинитет в капилярите на белите дробове, след което адекватно освобождава кислорода в тъканите на тялото. Продуктът не се нуждае също така от изследване за съвместимост с реципиента.

Когато се прилага на хора, продуктът има полуживот, приблизително 15 h, а за предпочитане приблизително 24 h. този хемоглобинов продукт може да се влива на пациенти в количества приблизително до 3,0 L и даже приблизително до 5,0 L. Хемоглобиновият продукт съгласно изобретението може да се използва като по същество да замени целия обем от кръвта на пациента, без да причини вазоконстрикация, бъбречна интоксикация, хемоглобинурия или други проблеми, свързани с интравенозното прилагане на синтетични или полусинтетични кислородни носители и заместители на кръвта.

Изобретението включва и метод за вливане в пациент, за предпочитане пациентът е човек, на известно количество лишен от строма, лишен от тетрамер, полимеризиран, пиридоксилиран хемоглобинов продукт, който не е токсичен за пациента, като количеството е наймалко около 5,0 L. Този метод включва прикрепването на пациента или субекта към устройство за вливане или друга подобна екипировка за вливане или трансфузия на пациент.

Методът съгласно изобретението е уникален според това, че се добива продукт със степен на третрамера не повече от около 1 %, повече се предпочита не повече от 0,8% тегл. Спрямо теглото на целия хемоглобин в разтвора.

Методът съгласно изобретението има и друго предимство: крайният продукт може по същество да бъде лишен от микробиални и ви русни антигени и патогени. Такива микробиални и вируси антигени и патогени се довеждат до пренебрежимо ниски нива. Продуктът е стерилен, както се установява от анализа, проведен в United States Pharmacopeia, XXIII, Chapter 71. Примери за такива антигени и патогени са например бактерии, рикетсии, плесени, протозои, вируси и други организми. Найважното е, че методът предоставя биологичен продукт, лишен от вируси, които причиняват хепатит и синдром на придобита имунна недостатъчност (СПИН).

Доколкото биологичният продукт от изобретението засяга физиологичните свойства, при вливане в количества приблизително до 5,0 1 не се причинява съдосвиване, бъбречна интоксикация, хемоглобинария и други проблеми, свързани с интравенозното прилагане на известен хемоглобинов разтвор, съдържащ физиологично нежелани количества от тетрамерния хемоглобин. Интравенозното прилагане на продукта, продуциран по метод от изобретението, води до незебележимо намаляване степента на филтрация в гломерулите, до незабележима екстравазация в перитонеалната кухина и незабележима промяна в цвета на урината.

Методът съгласно изобретението предоставя следователно неклетьчен заместител на чревните кръвни клетки, полезен при лечението на травми, инфаркт на миокарда, удар, акутна анемия и смущения, свързани с кислородна недостатъчност, като хипоксемия (намалено количество кислород в кръвта), хипоксия (намалено количество кислород в тъканите) или краен стадий на хипоксия, причинена от недостиг в белите дробове на напълно окислена кръв. Продуктът е полезен също така при третирането на всяка болест или медицинско състояние, нуждаещите се от съживяваща течност, кръвопреливане (като травми, специфичен хеморагичен шок), от вътресъдов обемен разширител или трансфузионна замяна. Освен за медицинска употреба, продуктът може да е полезен за съхранение на органи за трансплантация.

Примери за изпълнение на изобретението

Методът съгласно изобретението включва следните етапи:

1. аспирация и филтрация на червените кръвни клетки;

2. промиване на клетките и лизис;

3. топлинна обработка;

4. ултрафилтрация и концентриране;

5. обезгазяване;

6. химична модификация;

7. пречистване;

8. UP поликонцентриране;

9. деоксигениране;

10. привеждане във фармацевтична форма.

Предпочитаният изходен продукт в метода от настоящото изобретение е пълноценна човешка кръв или пакетирани червени кръвни клетки с преминал срок на годност, като кръв с непреминал срок на годност (прясна) също може да се използва. За предпочитане при този метод не се използва пълноценна кръв, ако е била съхранявана повече от 2 седмици след срока за съхранение, отбелязан на опаковката. Използването на пълноценна кръв с преминал срок на годност с повече от 2 седмици поставя допълнителни трудности при екстракцията на хемоглобина и отстраняването на клетъчните останки, като протеини на стромата и онечиствания.

Всички описани тук процеси могат да се приложат и към кръв от други бозайници, евентуално с минимални модификации от специалистите в областта. Повечето от процесите трябва да се провеждат приблизително при 2“С до 8°С, за предпочитане приблизително 4°С.

По време на клетъчното аспириране и филтриране червените кръвни клетки (ЧКК) асептично се отделят от банката на донора, без да се въвежда въздух в кръвта, и се прокарват през серия филтри в ЧКК суспензия с намалено съдържание на левкоцити и тромбоцити. Получената суспензия се подлага след това на клетъчно промиване/лизинг.

Суспензията се промива в атмосфера на въглероден окис с 1 % разтвор на NaCl за отстраняване на остатъчните плазмени протеини. Промитите ЧКК се третират след това с вода за инжектиране (WFI) за лизиране на клетките, а получената смес се избистря чрез използване на поточна филтрационна единица. Избистреният продукт след това се обработва топлинно, за да се утаи допълнителен материал от стромата, който се отстранява чрез филтрация. Продуктът на този етап е разтвор на лишен от строма хемоглобин (SFH) с ТНЬ от приблизително 3% (тегло/обем).

Топлинно обработеният и лишен от стро5 ма хемоглобинов разтвор, съдържащ карбоксихемоглобин, се концентрира и се обезгазява, за да се получи SFH разтвор, съдържащ дезоксихемоглобин. Обезгазяването изисква първо да се насити с кислород разтворът на карбоксихемоглобин за около 16 h, за да се получи разтвор на окислен хемоглобин и приблизително 7% карбоксихемоглобин спрямо общото тегло на хемоглобина. След това кислородът се извежда навън с азот, аргон или хелий, за да се образува разтвор, съдържащ свободен хемоглобин, т.е. хемоглобин, който не е в комплекс и е около 7% спрямо общото тегло на хемоглобина. Полученият обезгазен разтвор се филтрира и се прехвърля в съд за химична модификация.

След обезгазяването разтворът на лишен от строма хемоглобин се пиридоксилира при използване на пиридоксал-5’-фосфат (Р5Р) в моларно съотношение на пиридоксал-5’-фосфат към хемоглобина приблизително от 1:1 до 3:1. Алтернативно, лишеният от строма хемоглобин може да се пиридоксилира чрез при използване на 2-Nor-2 формил пиридоксал-5’фосфат. Към сместа за пиридоксилиране се прибавя редуциращ агент, като натриев цианоборохидрид или за предпочитане натриев борохидрид. Излишъкът на реагенти и соли се отстранява чрез диализа срещу апирогенна вода или за предпочитане - чрез диафилтрация с WFI. След това пиридоксилираният хемоглобин се полимеризира с разтвор на глутаралдехид.

Разтворът на лишения от строма пиридоксилиран хемоглобин се полимеризира чрез използване на воден разтвор на глутаралдехид. Времетраенето на полимеризацията и количеството на прибавения глутаралдехид зависят от обема на хемоглобиновия разтвор, от желаното количество полимери и от желаното разпределение на молекулното тегло. По принцип по-дългото време за полимеризаиця повишава добива и разпределението на молекулното тегло. Добив от приблизително 75% от теглото на полимерите по отношение на общото тегло на хемоглобина се получава за около 16 - 18 h. Предпочитаното крайно време за полимеризацията се дефинира като момента, в който разтворът съдържа около 75% от теглото на полимера по отношение на общото тегло на хемоглобина, като се онагледява чрез изключваща-размер ВЕТХ. Алтернативно, крайна точка се дефинира като точката, при която разтворът съдържа 65% от полимерите по от ношение на общото тегло на хемоглобина, т.е. около 2,5 h.

Реакцията на полимеризация се прекъсва чрез прибавяне на воден глицин. Буферът трябва да се прибави възможно най-бързо. Напречното омрежване се стабилизира, след това чрез прибавяне отново колкото е възможно най-бързо на разтвор на натриев борохидрад. Полимеризираният разтвор след това се концентрира, а след това се диафилтрира в кислородна атмосфера, за да се окисли разтворът. Към разтвора се прибавя накрая вода, когато разтворът съдържа приблизително 4% тегл. хемоглобин.

Полимеризацията съгласно изобретението води до високи добиви на полимери, които имат близки нива на молекулно тегло, както е показано на фиг.З и в пример 1, по-долу.

Разтворът на полимеризиран пиридоксилиран хемоглобин след това се пречиства чрез колонна хроматография, филтриране, например мембранно филтриране, или и двете, за да се отстрани от разтвора остатъчният неполимеризиран (тетрамерен) хемоглобин. Разтворът на полимеризиран пиридоксилиран хемоглобин след това се концентрира до приблизително 6% чрез използване на устройство за ултрафилтрация за изготвянето на газов обмен.

Концентрираният разтвор след това се дезоксигенира с азот. Дезоксигенирането протича при 10 до 12°С, докато количеството на оксихемоглобина в разтвора не остане по-малко приблизително от 16% тегл. От общия хемоглобин.

Полученият разтвор на дезоксигениран, пречистен и полимеризиарн хемоглобин се концентрира след това чрез ултрафилтрация в азотна атмосфера, в изстуден съд. РН се довежда приблизително до 8,8 - 9,0, а количествата електролити могат да се доведат до необходимите нива, представляващи това на нормалната плазма. Освен това по желание могат да се добавят конвенционални антиоксиданти като глутатион, аскорбат или глюкоза. След като разтворът се концентрира до желаната степен, за предпочитане около 10% тегл. полимеризиран, пиридоксилиран, пречистен, лишен от тетрамер, лишен от строма хемоглобин, разтворът се стерилизира чрез филтрация и се прехвърля чрез устройство за стерилно прехвърляне във фармацевтично приемлив контейнер.

Характеристиките на получения хемоглобинов разтвор са посочени в следващата таблица:

	Полимеризиран хемоглобин
Общ хемоглобин (g/dl)1	9,5 -12,0
Мешхемоглобин (% от общия НЬ)1	<8,0
Карбоксихемоглобин (% от общия НЬ)1	<5,0
Р5() (torr)l	23 - 32
Осмотичност (mmol/Kg)2	280 - 360
Натрий (mmol/L)3	135 - 155
Калий (mmol/L)3	3,5-4,5
Хлорид (mmol/L)3	85 -110
Свободно желязо (ррт)4	<2,0
Молекулно тегло -128 Kd пик (%)5	10-24
Молекулно тегло -192 Kd пик (%)5	18-30
Молекулно тегло - 256 Kd пик (%)5	45 - 70
Тетрамер (64К)(%)5	<0,8
Ендотоксин (EU/mL)6	<0,03
фосфолипиди (ng/Hb)7	<50
Гликолипиди (ng/Hb)7	<2

1. Степен на полимеризирания хемоглобин, определена спектофотометрично.

2. Степен на полимеризирания хемоглобин, определена осмометрично.

3. Степен на полимеризирания хемоглобин, определена чрез йон-специфичен електрод.

4. Степен на полимеризирания хемоглобин, определена чрез абсорбция на атомите.

5. Определяне чрез изключваща по размер ВЕТХ.

6. Определяне чрез LAL при използване на изследване, което може да се получи от Associates of Саре Cod, съставките за изследването са с каталожни номера 100- 5, 800 - 1, и 3100 - 5.

7. Определяне чрез ВЕТХ.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери поясняват изобретението, като не претендират да дефинират изцяло условията и обхвата на изобретението. Всички температури са представени в градуси по целзий, освен ако не е уточнено друго. Ако не е посочено друго, всички проценти, например общия хемоглобин (ТНЬ), са представени като тегло/обем (x/v). Трябва, също така, да се има предвид, че реакционните условия (например температура, време за протичане на реакцията) са посочени, условията на реакцията, които са под и над тези специфични стойности, също могат да се използват, въпреки че обикновено не са толкова подходящи.

Всички използвани съдове и метални контейнери, ако не е посочено друго в метода съгласно изобретението, са изработени от 316-L неръждаема стомана, за предпочитане такава фармацевтична степен на неръждаема стомана, която е добре полирана и следователно по-лесна за почистване. Различните свързващи тръби и тръбопроводи са от същата неръждаема стомана или от Teflon с фармацевтична степен или са силиконови маркучета. Филтрите и мембраните, използвани в метода, могат да се поръчат от Millipore Inc., Pall-Foltron или от Cuno Inc.

Полуживотът на продуктите, получени по метода, се определя in vivo в бозайници, например при човек. Характерно е, че кръвната проба се взима от бозайника в определен период от време, след като е получил вливане с продукта. Количествата на продукта се определят след това чрез центрофугиране на кръвната проба, проявяване на частта на плазмата, определяне нивата на плазмения хемоглобин спектрофотометрично, след което количеството на продукта, останал в бозайника, се отнася към полуживота на продукта.

Хроматографията за изключване по размер ВЕТХ съгласно изобретението се провежда, както следва:

Пробата се разрежда с 0,2 М pH 6,9 калиево-фосфатен буфер до 0,2 g/dl, филтрира се през 0,2 μ филтър в система за ВЕТХ, състояща се от следните съставни части (по реда на потока на системата):

1. Pharmacia модел 2248 помпа

- подвижната фаза е 0,2 М pH 6,9 калиев фосфат

- скорост на потока от 1,0 mL/min;

2. 45 сш PEEK или титаниев провод, 0,010 в I.D.;

3. Rheodyne модел 77251 инжектор с 200 pL PEEK проба;

4. 18 cm PEEK или титаниев провод, 0,010 в I.D.;

5. Upchurch модел А431 0,5 μ филтър;

6.9 cm PEEK или титаниев провод, 0,010 в I.D.;

7. Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 x

7,8 mm Guard колона;

8. 24 cm PEEK или титаниев провод, 0,010 в I.D.;

9. Phenomenex Biosep SEC S-300 600 x

7,8 mm аналитична колона;

10. 23 cm PEEK или титаниев провод, 0,010 в I.D.;

11. Parmacia Uvicord SD UV детектор

- дължина на вълната: 280 nm;

- поток на клетките: 8 pL обем, 2,5 mm дължина на пътеката;

- степен: 2 AUFS;

- константата време: 10 s.

Пикът на абсорбция при 280 mm се записва чрез LKB 2221 интегратор, който интегрира отделните полета на пикове и пресмята общото поле на хемоглобина за всеки полимерен вид.

Допълнителни данни за изобретението могат да се получат от примерите, които не го ограничават.

Пример 1. Както е показано на фиг.1, донорна банка 20 с кръв с преминал срок на годност (пълноценна кръв или червени кръвни клетки) се разполага в подходящо асептично аспирационно устройство 22. Като пример за подходящо асептично аспирационно устройство се посочва система, която има две места за аспирация. След като донорната банка се разположи на мястото за аспирация, игла от аспирационното устройство пробива донорната банка, вкарва приблизително 150 ml 1 % (обем/ тегло) воден разтвор на натриев хлорид и аспирира старата кръв с преминал срок на годност от донорната банка под намалено налягане или под вакуум. Аспирираната кръв преминава през филтър 24 с дълбочина 100 μ, след което преминава 5 μ дълбоки филтри 26, свързани в серия. Докато кръвта преминава през 5 μ дълбоките филтри, се отстраняват левкоцитите от кръвта. Характерно, около 170 единици от старата пълноценна кръв с изтекъл срок на годност се аспирират, филтрират и се прехвърлят в сад, както е показано на фиг.1. След това филтрите се промиват с около 7511 % (обем/тегло) воден разтвор на натриев хлорид.

Преди въвеждането на кръвта в съд 1, съдът се зарежда с приблизително 701 1% (обем/тегло) воден разтвор на натриев хлрид. След като са аспирирани, филтрирани и прехвърлени всичките 170 единици стара пълноценна кръв с изтекъл срок на годност, и след като филтрите са промити, съдът съдържа приблизително 250 1 от 4% разтвор на общия хемоглобин. По време на аспирацията и етапите на филтриране, съдът 1 се поддържа при понижено налягане, т.е. вакуум от 20-28“Hg. След като цялата стара пълноценна кръв е прехвърлена в съд 1, вакуумът се изключва и в съда се въвежда въглероден монооксид, така че съдът да съдържа атмосфера на въглероден монооксид.

Съд 1 се свързва с 0,65 μ тангенциален поточен филтър 28, както е показано на фиг.1. Първоначалното зареждане от 2501 от 4% разтвор на общия хемоглобин се концентрира до приблизително 125 1 от 8% разтвор на общия хемоглобин чрез микрофилтрация през тангенциалния поточен филтър. pH на хемоглобиновия разтвор в този момент е около 6,5. След концентрирането до 8% от общия хемоглобин, разтворът се промива чрез добавяне на 1% (обем/тегло) разтвор на натриев хлорид, диафилтрира се и се отстранява филтратът, като при същата скорост се добавя разтвор на натриев хлорид. Посочените 125 1 хемоглобинов разтвор, по известен начин се промиват с приблизително 8 обема 1% обем/тегло) разтвор на натриев хлорид (приблизително 1,000 1). След промиването разтворът се концентрира до около 70 1, т.е. около 14% от общия хемоглобин, и се прибавя “вода за инжектиране” (WFI), за да се доведе обемът на разтвора до приблизително 180 1. При добавянето на WFI клетките набъбват и се спукват, при което освобождават хемоглобина в разтвора. Концентрацията на получения хемоглобинов разтвор е приблизително 5% от общия хемоглобин (ТНЬ). Полученият разтвор се избистря, докато е още в съда 1. Разтворът първо се концентрира до приблизително 50 1, а филтратът се прехвърля в съд 2. Тъй като разтворът се изпомпва през филтъра, замърсителите от стромата на червените кръвни клетки и материалът от клетъчните стени се задържат и се отстраняват чрез филтъра. Останалите 50 1 разтвор в съда 1 се промиват (диафилтрират) с около 2,5 обема WFI. Тези 2,5 обема промивен разтвор се добавят в съд 2. Останалият в съд 1 материал след това се концентрира до около 201, а филтратът се прехвърля в съд 2. Полученият обем в съд 2 е приблизително 280 1 от 3,3% разтвор на общия хемоглобин.

Полученият разтвор на лишен от строма хемоглобин се обработва топлинно в съд 2 при температура от около 60-62°С за период от около 10 h. През това време разтворът се разбърква със средна скорост. Когато разтворът се загрее и премине температурата от около 55°С, се образува утайка.

Полученият3,3% ТНЬ (тегло/обем), лишен от строма топлинно обработен разтвор, след това се филтрира през 0,2 μ филтър 30, следван от 0,1 μ филтър 32 се прехвърля в съд 3. Филтрираният хемоглобинов разтвор се концентрира, след това, приблизително до 18% ТНЬ с последващо промиване и диафилтриране с 4 обема WFI (180 L). Концентрирането и диафилтрирането се реализират чрез използване на ултрафилтър 34 за 10 kDa молекулно тегло. Канала 35, свързан с ултрафилтър 34, получава филтрата. В тази позиция посочените

1 18% от общия хемоглобинов разтвор съдържат по-малко от 50 ng фосфолипид на грам хемоглобин, по-малко от 2 ng гликолипид на грам хемоглобин, по-малко от 1% метхемоглобин, по-малко от около 0,03 ендотоксинови единици ендотоксин на милилитър и pH около 6 до 6,5. Този хемоглобин в разтвора е карбоксихемоглобин.

Полученият разтвор на карбоксихимоглобин след това се прехвърля в съд 4, където карбоксихимоглобинът първо се окислява, а след това се дезоксигенира. Съдът 4 се пълни с разпръскващ газ пръстен, свързан с линии за газ кислород и азот, като пълнежът е разположен от дъното на съда към устройството за измерване на впръскването при върха на съд 4, и колектор за преливаща пяна, свързан с бидона за пяна 1, така че пяната, образувана в съд 4, се пълни в бидона за пяна 36, където пяната кондензира в течност и обратно се пълни в съд 4. Съд 4 включва освен това набор от Pall Rings, заемащи приблизително една трета от обема на съда. Бидонът за пяна 36 включва отвор за отделяне на газа. Разтворът в съд 4 е 13% разтвор на общия хемоглобин.

По време на първия етап на окисление кислородът се впръсква в разтвора със скорост, достатъчна за получаване на еднородна дисперсия на газа в съда. В съда с обем 200 I се впръсква газ със скорост около 25 1/min. Окислението на карбоксихемоглобина се извършва за период от 16 h, така че полученият разтвор да съдържа по-малко от 5% карбоксихемоглобин по отношение на теглото на общия хемоглобин. Окислението се провежда при температура от около 10°С. Образуваната пяна в съд 4 се събира в бидона за пяна 36 и след утаяване, полученият разтвор отново се връща в съд 4.

След окислението в разтвора се впръсква подобен поток азот за около 6 h или докато в разтвора остане по-малко от 10% хемоглобин по отношение на теглото на общия хемоглобин. Впръсканият в тръбопровода азот се придвижва при температура от около 10°С и при pH от около 6 до 6,5. Алтернативно карбоксихемоглобинът може да се конвертира до дезоксихемоглобин при използване на мембранен обменник. Трябва да се отбележи, че по същество няма денатурация на хемоглобина, както може нормално да се очаква от етапа на образуване на пяна. Полученият дезоксигениран разтвор вече е подготвен за химична модификация.

Както е показано на фиг.2, разтворът на дезоксихемоглобина се прехвърля в съд 5 за химична модификация. Към съд 5, който съдържа разтвор на дезоксихемоглобин, при приблизително 4°С се добавя воден разтвор на пиридоксил-5-фосфат (Р5Р) (93,75 g/L) в моларно отношение 1:1 до 3:1 Р5Р към хемоглобина. Пиридоксилирането се провежда при приблизително 4°С. Разтворът на Р5Р характерно се добавя над около 1 min и се разбърква приблизително 15 min, след което към разтвора на хемоглобин се прибавя разтвор на натриев борохидрид/натриев хидроксид при моларно отношение на борохидрида към хемоглобина 20:1. Подходящ разтвор на натриев борохидрид/натриев хидроксид съдържа 0,8 g натриев хидроксид на 2 1 и 90,8 g натриев борохидрид на 2 1 . Разтворът на борохидрида се прибавя възможно най-бързо за период от около 1 min, след това се разбърква в продължение на 1 h. Полученият 50 1 разтвор на пиридоксилиран хемоглобин след това се диафилтрира, при използване на 10 kDa ултрафилтър 38 за отстраняване на реагентите в излишък, с 4 обема WFI. Отводнителният канал 40, свързан с ултрафилтър 38, събира филтрата от филтър 38.

След диафилтрирането с 4 обема, т.е. 200 1 WFI, хемоглобинът се полимеризира. Достатъчно количество WFI се добавя към съд 5, който съдържа пиридоксилиран хемоглобин, за да се приготви 4,5% разтвор от общия хемоглобин (приблизително 175 1 хемоглобинов разтвор). Към разтвора на глутаралдехид при моларно отношение на глутаралдехида към хемоглобина от 24:1. Разтворът на глутаралдехид по известен начин се добавя за период от около 2,5 h към хемоглобиновия разтвор чрез измервателна помпа. Реакцията на полимеризация се оставя да се осъществи за около 18 h. Желаното разпределение на молекулните тегла е около 75% полимер и 25% тетрамер. Желаният полимер е с молекулно приблизително тегло от 100 000 до 350 000.

Когато реакцията на полимеризация достигне желаното разпределение на молекулните тегла (след около 18 h), към хемоглобиновия разтвор се добавя воден глицин (около 166 g/L) (за прекъсване на реакцията) при моларно отношение 140:1 глицин към хемоглобин. Виж фиг.З, която представлява ВЕТХ за получения полимеризиран, прекъснат с глицин, хе моглобинов продукт. Полученият разтвор след това се разпръсква за около 10 min, след което към хемоглобиновия разтвор се прибавя разтвор натриев борохидрид/натриев хидроксид. Получената смес се разбърква в продължение на 11. Разтворът се концентрира след това -за около 501, (ултрафилтър 38) и се промива с 4 обема (200 I) WFI. Към концентрирания разтвор се добавя допълнително аликвотно количество натриев борохидрид при същото моларно съотношение, както е посочено по-горе, като отново се разбърква за 1 h. Полученият разтвор се промива с 4 обема WFI (2001), получен като полимеризиран, пиридоксилиран, лишен от строма, топлинно обработен хемоглобин.

Полученият разтвор се окислява, като разтворът се оставя на стенд, в кислородна атмосфера, след което се прехвърля в система за пречистване 42. Пречистването може да се осъществи чрез колонна хроматография, филтрация, за предпочитане мембранна филтрация (диафилтрация), или комбинация от филтрация и колонна хроматография.

При един вариант на изпълнение съгласно изобретението разтворът се прехвърля в запълнен за хроматографски съд, съд 6, както е показано на фиг.5. При този вариант на изпълнение полученият разтвор на оксихемоглобин се разрежда след това до около 200 1 (4% от общия хемоглобин) в съд 6 и концентрацията на хлорида се нагласява на 22 шМ с разтвор на натриев хлорид. Не е необходимо нагласяване на концентрацията на натрий.

Пет 40- литрови аликвотни части от получения хемоглобинов разтвор се хроматографират след това на колона 44. Колона 44 съдържа афинитетен гел, който е агаров гел, модифициран с жълто багрило (достъпно в търговската мрежа от Affinity Chromatography, Ltd., под името Mimetric Yellow No.l), който е с повисок афинитет към полимера, отколкото към тетрамера.

Хроматографията се провежда, както следва. 401 окислен, полимеризиран, пиридоксилиран, лишен от строма хемоглобинов разтвор, се зарежда в колона 44. Колоната се промива с 15 обема на колоната (около 750 1) 30 тМ воден NaCl буфер, за отстраняване на тетрамера. След това колоната се промива с около 250 1 300 тМ воден NaCl буфер, за отстраняване на тетрамера. След това колоната се промива с около 250 1 300 тМ натриево10 хлориден буфер, за да се отстрани полимерът. Фракциите на полимера се събират в съд 7. Нежеланите фракции се изпращат в канал 46. След отстраняването на всяка аликвотна част колоната се регенерира с 15 шМ разтвор на НС1 (150 1), отново се уравновесява с 30 шМ воден NaCl (250 1), като на колоната отново се зарежда друга аликвотна част от подхранващия разтвор (401). Колоната отново се промива с 30 mM NaCl, последвано от 300 mM NaCl. 40 1 аликвотни части хемоглобинов разтвор се прибавят към колоната и се хроматографират до изпразване на съд 6.

Получените фракции в съд 7 се подлагат на ултрафилтрация (концентриране) чрез използване на филтър 48, свързан с канал 50, до постигане на обем от около 40 1 (6% от общия хемоглобин). Концентрираният хемоглобинов разтвор след това се прехвърля в газообменен съд 8 за дезоксигениране.

Алтернативно разтворът се прехвърля в съд 10 за рециклиране на филтрата, както е показано на фиг.6. След това хемоглобинът се разрежда до около 4% ТНЬ в съд 10. След това 4% ТНЬ разтвор се подлага на диафилтрация чрез използване на 10 mM NaCl и 300 000 молекулно тегло филтър 52, достъпен от търговската мрежа от Pall-Filtron. Филтрацията продължава и в съд 11, докато около 97% от хемоглобиновия материал премине през филтъра. (Приблизително 3% от материала, т.е полимерът с високо молекулно тегло се задържа в съд 10). Количеството на хемоглобина се определя спектрофотометрично, при използване на кооксиметър (устройство за измерване на кислорода).

Полученият материал в съд lie около 2 4% ТН6 и съдържа около 7-10% тетрамер по отношение на ТНЬ. 2-4% ННЬ след това се диафилтрира чрез използване на 10 mM NaCl и филтър 54 за 100 000 молекулно тегло, наличен в търговската мрежа от Pall-Fitron, съединен с отточен канал или сифон 56. Филтрацията продължава, докато нивото на тетрамера, както е определено чрез гелна хроматография, при използване на BioSep SEC - S3 000 600 х 7,8 mm колона до достигане на по-малко от 0,8% от масата на хемоглобина, по отношение на теглото. Полученият разтвор на пречистен хемоглобин остава първоначално в съд 11, като след това се прехвърля в съд 8 за газов обмен за дезоксигениране.

Съдът за газов обмен може да е същият съд, като съд 4, или за предпочитане, отделен съд. Съд 8 за газов обмен е снабден по същество по същия начин, като съда за газов обмен 4, от фиг.1, и се прикрепва към бидона за пяната 58 по идентичен начин, както съд 4 и съд 36 за пяната. Дезоксигенирането се провежда за около 2,5 h с впръскване на азот при около 10°С и разтвор с pH около 7,5. Впръскването на азота продължава, докато остане в разтвора около 16% оксихемоглобин по отношение на теглото на общия хемоглобин. Полученият разтвор на оксихемоглобин след това се прехвърля в съд 9 за приготвяне на лекарствена форма.

В съд 9 за приготвянето на лекарствените форми разтворът първо се концентрира до около 7% от общия хемоглобин и pH се докарва до около 8,8 до 9,0 при 4°С. pH се коригира чрез използване на 0,2 М NaOH. Електролитните разтвори се прибавят след това към разтвора на хемоглобин с pH 8,8 до 9,0. Прибавят се глюкоза и глицин до достигане на крайна концентрация от около 5 g/Ι и 1,75 g/1, съответно. Към разтвора се прибавя калиев хлорид до достигане на концентрация на калий от около 3,5 до 4,5 mM. След това се прибавя ЗМ натриев хлорид до получаване на 85 - 110 шМ концентрация на хлорида. След това се прибавя натриев лактат до получаване на 135 - 155 шМ концентрация на натриевия йон. Най-накрая се прибавя 0,45 моларна аскорбинова киселина за повишаване на концентрацията на аскорбинова киселина до около 1 000 mg/ΐ. Аскорбиновата киселина се прибавя като консервант/антиоксидант при съхранението. Полученият разтвор на хемоглобина е с крайна осмотичност от около 280 - 360 mmol на килограм.

Лекарствената форма на хемоглобиновия разтвор след това се концентрира до около 10% от общия хемоглобин чрез използване на филтър 60, свързан със сифон 62, а 10% хемоглобинов разтвор след това се стерилизира чрез филтриране с филтър 64 и асептично се пълни в предварително стерилизирани банки.

Характеристиките на получения в този пример продукт, партида А, са показани на таблица 1. В допълнение, характеристиките на партиди В и С, и двете приготвени по технологията, посочена по-горе за партида А, са показани на таблица 1.

Тест

A

В С

Хемоглобин, g/dL	10,4	10,2	10,2
Метхемоглобин, %	4,6	6,0	5,6
Карбоксихемоглобин, %	0,2	1,4	1,5
Р50 (Tott.pH 7,35-7,45, рСО2 35-40 torr)	28,5	26,8	27,0
осмотичност, mmol/KG	318	320	317
натрий, mmol/L	142	144	142
калий, mmol/L	4,0	4,0	4,0
хлорид, mmol/L	98	99	94
свободно желязо, ppm	0,7	1,2	1,0
разпределение на мол.	128:16	128:16	128:16
тегло,% при всеки MW	192:26	192:23	192:26
(Kd)	2568:58	2568:66	2568:58
тетрамер, %	0,4	0,3	0,4
ендотоксин, EU/ml	<0,03	<0,03	<0,03

Материалът включва също така малко количество материал с високо молекулно тегло.

Предоставеното подробно описание на предпочитания вариант за изпълнение на настоящото изобретение го илюстрира, без да го ограничава. Трябва да се разбира, че всички други модификации, разклонения и еквиваленти, очевидни за специалистите в областта, основаващи се на настоящото описание, се считат в обхвата на изобретението, за което се претендира.

Claims (7)

Патентни претенции

1. Неклетъчен заместител на червените кръвни клетки, характеризиращ се с това, че представлява воден разтвор на полимеризиран хемоглобин, който съдържа от 10 до 24% от общия хемоглобин - хемоглобинов полимер с молекулно тегло от около 128, от 18 до 30% от общия хемоглобин - хемоглобинов полимер с молекулно тегло от около 192 и от 45 до 70% от общия хемоглобин - хемоглобинов полимер с молекулно тегло от около 256.

2. Воден разтвор на пиридоксилиран, полимеризиран хемоглобин, характеризиращ се с това, че съдържа следните ингредиенти:

а) общ хемоглобин приблизително от 9,5 до 12,0 g/dl;

б) общ метхемоглобин, по-малко от 8% от общия хемоглобин;

в) общ карбоксихемоглобин по-малко от ²⁰ 5% от общия хемоглобин;

г) концентрация на натрий от 135 до 155 mmol/kg

д) концентрация на калий от 3,5 до 4,5 mmol/kg;

25 е) концентрация на хлорид 85 до

110 mmol/kg.

3. Воден разтвор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържанието на общо свободно желязо е по-малко от 2.0 ррш; на общ тетрамер е по-малко от 0,8%; и на ³⁰ ендотоксин е по-малко от 0,03 EU/ml.

4. Воден разтвор съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съдържанието на фосфолипиди е по-малко от 50 ng/Hb; и на гликолипиди е по-малко от 2 ng/Hb.

35

5. Воден разтвор съгласно претенция 2, характеризиращ се с осмотичност от 280 до 360 mmol/kg.

6. Воден разтвор съгласно претенция 2, характеризиращ се с кислород-хемоглобинова дисоциация от 23 до 32 tor.

4θ

7. Използване на воден разтвор на пиридоксилиран, полимеризиран хемоглобин съгласно претенциите от 1 до 6 като трансфузионно средство.