KR20050095636A - 감소된 양의 테트라머를 지닌 중합된 헤모글로빈 용액 및이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 용액 및 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 헤모글로빈의 용액을 중합시키고, 중합된 헤모글로빈 용액을 처리하여 중합체를 테트라머로 부분적으로 분해시키고, 테트라머를 헤모글로빈 용액으로부터 제거하는 것을 포함한다.

Description

감소된 양의 테트라머를 지닌 중합된 헤모글로빈 용액 및 이의 제조 방법 {POLYMERIZED HEMOGLOBIN SOLUTIONS HAVING REDUCED AMOUNT OF TETRAMER AND METHOD FOR PREPARING}

본 발명은 안정화된 산소 운반 용액에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 중합체 결합 안정성이 향상되고 동화(elaboration)된 테트라머가 제거되도록 처리된 헤모글로빈 용액에 관한 것이다.

계속 증가하는 외과적 및 외상 부담분용으로 및 혈액 은행 부족분을 보충하기 위해 즉시 사용가능한 혈액 생성물이 지속적으로 필요한 실정이다. 헤모글로빈 유래된 용액과 같은 산소 운반 용액이, 증대된 산소 운반 능력을 필요로 하는 환자의 경우에 전혈 또는 적혈구 대신 사용될 수 있다. 이러한 용액은 기증자 이용가능성에 비의존적이므로, 응급 상황 또는 혈액 은행 공급부족 동안 용이하게 이용될 수 있다. 또한, 수혈의 결과로써의 혈액 매개 병원체의 감염 위험으로 인해, 환자는 전혈 또는 적혈구 대신 수혈용의 헤모글로빈 유래된 용액을 선호할 것이다. 특히, 이러한 용액은 산소 운반체, 혈액 대용물, 및 헤모글로빈 유래된 조성물을 포함할 수 있으나 이들에 제한되지 않으며, 이들은, 예를 들어 미국 특허 제 6, 498,141호, 제 6,133,425호, 제 5,464,814호, 제 5,438,041호, 제 5,217,648호, 제 5,194,590호, 제 5,061,688호 및 제 4,826,811호에 기술되어 있고, 이들 특허는 전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.

기질(stroma) 비함유 헤모글로빈은 산소 수송 및 가역적 산소 (또는 리간드) 결합 능력을 지니는 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 그러나, 헤모글로빈 용액은, 생명을 지속시키에 충분한 양의 산소를 운반할 수 있지만, 신장 기능의 감소와 같은 몇몇 바람직하지 못한 부작용으로 인해 난점을 지닌다. 이러한 부작용은 용액으로부터 제거되지 않은 적혈구막 (기질)의 단편 또는 세균 내독소와 같은 원하지 않는 오염물의 존재로 인한 것으로 여겨졌다. 이와 같은 오염물은 실제로 신장기능 변화를 일으킬 수 있지만, 이러한 오염물을 본질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액은 여전히 실질적인 신장 기능장애를 일으킨다. 신장 기능장애는 특히 생리적으로 허용되지 않는 양의 중합되지 않은 헤모글로빈 테트라머에 기인할 수 있다.

테트라머를 본질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액은 혈관수축, 신장 독성, 혈색소뇨증 또는 합성 또는 반합성 산소 운반체 및 혈액 대용물의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 야기하지 않으면서 인간 환자의 혈액 부피의 본질적으로 전부를 다시 채우기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용액은 우수한 효능을 제공하지만, 생성물의 저장 수명은 제한적인데, 이는 헤모글로빈 중합체가 시간이 지남에 따라 테트라머 단위로 서서히 분해하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서, 용액의 저장 수명을 증가시키기 위해 용액을 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 용액으로서 장기간 동안 유지시키는 방법이 필요하다.

도 1은 2 내지 8℃에서 저장된 헤모글로빈 용액 중의 테트라머 동화량을 도시한다.

도 2는 23 내지 27℃에서 저장된 헤모글로빈 용액 중의 테트라머 동화량을 도시한다.

도 3은 2 내지 8℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 재처리되고 숙성된 헤모글로빈 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 4는 23 내지 27℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 재처리되고 숙성된 헤모글로빈 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 5는 2 내지 8℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 고온 켄칭된 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 6은 23 내지 27℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 고온 켄칭된 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 7은 2 내지 8℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 사전 동화(pre-elaboration)된 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 8은 23 내지 27℃에서 저장된 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 사전 동화된 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다.

도 9는 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액의 HPLC 추적(tracing)을 도시한다. 중합된 헤모글로빈은 RT 15.19, 16.01, 17.16 및 18.79에서의 피크에 의해 나타난다. 테트라머는 RT 21.22 및 21.83에서의 피크에 의해 나타난다.

도 10은 글리신 처리 후이지만 정제 전의 중합된 헤모글로빈 용액의 HPLC 추적을 도시한다. 중합된 헤모글로빈은 체류 시간 (RT) 14.62, 15.44, 16.60 및 18.24에서의 피크에 의해 나타난다. 테트라머는 RT 20.71에서의 피크에 의해 나타난다. 중합체는 이러한 물질의 약 75% 이다.

도 11은 피리독실화 및 중합을 위해 준비되는 탈산소화된 헤모글로빈 용액을 생성시키기 위해 사용되는 방법 및 장치의 일부를 도시하는 개략도이다.

도 12는 피리독실화 및 중합에서 출발하여 탈산소화되고 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 생성물을 생성시키기 위한 방법 및 장치의 일부, 및 생리적 수준의 전해질을 지닌 최종 헤모글로빈 생성물을 제형화하기 위한 방법 및 장치의 일부를 도시하는 개략도이다.

도 13은 본 발명에 사용되는 컬럼 크로마토그래피 정제 방법을 도시하는 개략도이다.

도 14는 본 발명에 사용되는 막 여과 정제 방법을 도시하는 개략도이다.

상세한 설명

본 발명은 기질, 기질 오염물 및 그 밖의 오염물을 실질적으로 함유하지 않는, 테트라머를 본질적으로 함유하지 않는 가교되고 중합된 헤모글로빈을 포함하는 산소 운반 용액을 제공한다.

본 발명을 상세히 설명하기 전에, 다수의 용어를 정의한다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 별다른 명확한 표시가 없는 한 단수로 기재되어 있다고 하더라도 복수를 포함한다.

"헤모글로빈"은 임의의 공급원으로부터 유래되는 헤모글로빈을 의미한다. 헤모글로빈은 인간, 축우, 돼지 및 양을 포함하는 포유동물로부터 유래되거나, 문헌 [BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994)]에 기술된 유전자이식기술로 생성된 헤모글로빈 및 네이처[Nature, 356:258-260 (1992)]에 기술된 재조합기술로 생성된 헤모글로빈과 같은 재조합기술로 생성된 헤모글로빈과 같은 그 밖의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용된 % 전체 헤모글로빈 (THb)은 용액 100ml 당 헤모글로빈의 그램으로서 정의된다.

"헤모글로빈의 용액"은 분자들이 적혈구내에 함유되어 있지 않은 테트라머성 또는 중합된 헤모글로빈 분자의 용액을 의미한다. 이러한 용액은 적혈구 기질 또는 기질 오염물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 필요가 없다. 그러나, 본 발명의 한 가지 양태에 있어서, 중합된 헤모글로빈의 용액은 적혈구 기질 및 기질 오염물을 실질적으로 함유하지 않는다.

"가교된"이란 분자의 형태, 크기, 기능 또는 물리적 특징을 변경시키기 위해 분자상으로 또는 분자내로, 또는 분자들 사이에 분자 "다리(bridge)"가 화학적으로 배치됨을 의미한다. 가교된 분자는 중합되거나 중합되지 않을 수 있는데, 즉, 가교된 분자는 테트라머성일 수 있다.

"테트라머" 또는 "테트라머성"이란 약 64Kd의 분자량을 지닌 헤모글로빈 분자를 의미하는데, 즉, 이러한 용어는 천연 헤모글로빈 분자 및 분자내 가교된 헤모글로빈 분자 둘 모두를 의미한다. 본 명세서에 사용된 % 테트라머란 용액 중의 전체 헤모글로빈(THb)의 양의 백분율로서의 테트라머의 양을 의미한다. 예를 들어, 10% THb 및 1% 테트라머를 지닌 100ml 헤모글로빈 용액은 용액 중에 0.1g 테트라머를 지닌다.

"테트라머를 본질적으로 함유하지 않는"이란 포유동물에 투여되는 테트라머에 대한 특정한 생물학적 반응이 더 이상 존재하지 않게 되는 테트라머 오염에 관한 순도의 수준을 의미한다. 주요 기준은 약제학적 유효량, 즉, 약 99% 보다 우수한 순도의 수준 (약 1% 미만의 테트라머가 존재함)으로 주입된 경우에 신장 기능의 변화가 없는 것이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 바람직한 생성물은 전체 헤모글로빈(THb)의 중량을 기준으로 하여 단지 약 0.8% 테트라머를 함유한다. 바꿔 말하면, 본 발명에 따른 테트라머를 본질적으로 함유하지 않는 생성물은 단지 생리적으로 허용되는 양의 중합되지 않은 헤모글로빈 테트라머를 함유한다. 본 발명의 특히 바람직한 생성물은 약 0.5% 미만의 테트라머를 함유하며, 본 발명의 가장 특히 바람직한 생성물은 약 0.3 내지 0.4% 테트라머를 함유한다. 이러한 테트라머의 양은 생리적으로 허용되는 것으로 밝혀졌다.

"동화" 또는 "테트라머 동화"는 중합된 헤모글로빈의 테트라머로의 분해로 인한 용액 중의 테트라머의 양의 증가를 의미한다. 중합체의 분해는 화학물질, 온도, 시간 또는 이들의 조합을 사용한 처리의 결과일 수 있다. 일반적으로, 테트라머는 가열시에 또는 중합된 용액이 숙성됨에 따라 동화된다. 따라서, % 테트라머는 용액의 저장 동안 증가한다. 테트라머 동화는 중합된 헤모글로빈 용액을 가열함으로써 가속될 수 있다. 동화는 용액 중의 테트라머의 양의 임의의 증가 후에 일어나는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 사용되는 중합된 헤모글로빈의 부분적 분해란 용액 중의 중합체의 전부가 아닌 일부가 테트라머로 분해됨을 의미한다.

헤모글로빈 용액을 "숙성"시킨다는 것은 임의의 온도에서 임의의 시간 동안 용액을 저장하는 것을 의미한다. 보다 높은 온도는 헤모글로빈 용액에 대한 숙성의 효과를 가속시킨다. "숙성된" 헤모글로빈 용액은 테트라머가 동화되도록 저장된다.

"사전 동화" 또는 "테트라머 사전 동화"란 테트라머 동화를 촉진시키기 위해 열처리를 이용하는 기술을 의미한다.

"고온 켄칭"이란 반응이 완결되도록 중합 켄칭 반응 동안 용액을 가열하는 것을 포함하는 처리 기술을 의미한다.

"중합" 또는 "중합된"이란 생성된 중합된 분자의 크기 및 중량이 천연 또는 테트라머성 헤모글로빈에 비해 증가된 분자들 또는 테트라머성 서브유닛들 사이의 분자 다리의 배치의 작용 또는 이러한 배치의 결과를 의미한다. 중합된 헤모글로빈은 테트라머성 헤모글로빈이 아니다. 중합은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 생화학적으로 적합한 담체 중에서 글루타르알데히드, 이미도 에스테르, 또는 그 밖의 물질을 포함하는 다양한 중합화제를 사용하여 달성될 수 있다.

"피리독실화된" 또는 "피리독실화"는 분자를 피리독살-5'-포스페이트 ("P5P") 또는 2-노르-포르밀 피리독살-5'-포스페이트와 반응시킴으로써 피리독살-5'-포스페이트 함유 분자를 헤모글로빈 분자에 결합시키는 방법 또는 이러한 결합의 결과를 의미한다. 피리독실화는 가역적 산소 결합 능력을 유리하게 변화시키는 것으로 입증되었는데, 즉, 특정한 포유동물 헤모글로빈, 예를 들어 인간 헤모글로빈의 P₅₀을 증가시킨다.

"안정한" 또는 "안정성"은 분해에 내성이고 안정하지 않은 용액 보다 저장 수명이 긴 헤모글로빈 용액의 상태 또는 특징을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 안정화된 헤모글로빈 용액은, 본 발명에 따라 제조되지 않은 용액과 비교하여, 용액의 저장 동안 테트라머 동화가 덜 일어나거나 느리게 일어난다. 헤모글로빈 용액의 안정성은 예를 들어 데옥시헤모글로빈이 얼마나 신속히 옥시헤모글로빈 또는 메트헤모글로빈으로 전환되는 지를 포함하는 테트라머 동화와 독립적인 수 가지의 다른 파라미터에 의존한다. 이러한 파라미터는 다른 방법들 중에서 산소가 저장 동안 포장된 용액으로 진입하지 못하게 함으로써 조절될 수 있다. 안정화된 헤모글로빈 용액은 여전히 분해될 수 있지만, 안정화되지 않은 용액 보다 느린 속도로 분해된다.

본 발명은 테트라머성 (천연 또는 분자내 가교된) 헤모글로빈, 기질 및 다양한 그 밖의 오염물을 본질적으로 함유하지 않는 중합된 헤모글로빈 용액을 제공한다. 용액은 생리적으로 허용될 뿐만 아니라 치료적 및 임상적으로 유용하다. 생성물은 산소 수송 특성에 필요한 가역적 산소 결합 능력을 지닌다. 생성물은 사용시에 양호한 산소 로딩(loading) 및 언로딩(unloading) 특징을 나타내며, 이는 전혈과 유사한 산소-헤모글로빈 해리 곡선 (P₅₀)을 지니는 것과 관련된다. 생성물은 폐를 통해 모세관에서 높은 친화도로 산소와 결합한 후, 산소를 신체의 조직으로 적절하게 방출시킨다. 또한, 생성물은 수용자와의 적합성 실험을 필요로 하지 않는다.

한 가지 양태에 있어서, 생성물은 인간에게 투여되는 경우에 약 15시간 이상의 반감기를 또한 지닐 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 반감기는 약 24시간 보다 길다. 헤모글로빈 생성물은 혈관수축, 신장 독성, 혈색소뇨증 또는 합성 또는 반합성 산소 운반체 및 혈액 대용물의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 야기하지 않으면서 인간 환자의 혈액 부피의 본질적으로 전부를 다시 채우는데 사용될 수 있다.

본 발명의 생성물의 반감기는 포유동물, 예를 들어 인간에서 생체내에서 측정된다. 전형적으로, 혈액 샘플은 포유동물에 생성물을 주입한 지 일정한 시간 후에 포유동물로부터 채취된다. 그 후, 생성물의 양은 혈액 샘플을 원심분리하고, 혈장 부분을 표출시키고, 혈장 헤모글로빈 수준을 분광학적으로 측정한 후, 포유동물내에 잔류하는 생성물의 양을 생성물의 반감기에 관련시킴으로써 측정된다.

본 발명의 방법은 향상된 반감기를 지닌 안정되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시킨다. 일반적으로, 테트라머는 중합된 헤모글로빈 용액이 숙성됨에 따라 동화된다. 동화된 테트라머는 본 발명의 방법에 의해 숙성된 헤모글로빈 용액으로부터 제거될 수 있다. 테트라머가 제거되도록 처리된 숙성된 헤모글로빈 용액은 추가의 저장시에 새롭게 처리된 (숙성되지 않은) 헤모글로빈 용액과 비교하여 보다 느린 테트라머 동화 속도를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라 처리된 헤모글로빈 용액은 테트라머 동화에 대해 새롭게 처리된 용액 보다 높은 안정성을 나타낸다.

일반적으로, 생리적으로 및 임상적으로 유용한 헤모글로빈 용액은 1.0% 미만의 테트라머를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 테트라머가 저장 동안 시간이 지남에 따라 동화되므로, 헤모글로빈 용액에 대한 합리적인 반감기를 가능하게 하기 위해서는, 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액이 약 0.3% 미만의 테트라머를 함유하는 것이 바람직한데, 용액 중의 테트라머가 동화되지만 용액은 테트라머가 1.0%에 도달할 때까지 생리적으로 유용할 것으로 기대된다. 도 1은 2 내지 8℃에서 저장된 헤모글로빈 용액의 전형적인 테트라머 동화량을 도시한다. 약 0.5%의 테트라머 수준에서 출발하는 용액 중에서, 테트라머 수준은 약 18개월 후에 1.0% 보다 높게 상승한다. 도 2는 23 내지 27℃에서 저장된 헤모글로빈 용액에 대한 전형적인 테트라머 동화량을 도시한다. 약 0.5%의 테트라머 수준에서 출발하는 용액 중에서, 테트라머 수준은 약 3 내지 4주 후에 1.0% 보다 높게 상승한다. 따라서, 증가된 온도에서의 헤모글로빈 용액의 저장은 테트라머 동화 속도를 증가시킨다. 테트라머 용액의 숙성은 단지 헤모글로빈 용액을 장시간 동안 정치시킴으로써 달성될 수 있다. 보다 높은 온도는 보다 낮은 온도 보다 헤모글로빈 용액을 보다 신속히 숙성시킨다.

도 3은 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 본 발명에 따라 처리된 "숙성된" 헤모글로빈 용액 ("재처리") 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다. 둘 모두의 용액은 2 내지 8℃에서 저장되었다. 24개월 후, 테트라머는 새로운 헤모글로빈 용액 중에서 약 0.8% 증가한 반면, 재처리된 용액 중에서 테트라머는 단지 약 0.3% 증가하였다. 36개월에 걸쳐, 재처리된 용액 중의 테트라머는 약 0.4% 증가하였다. 마찬가지로, 도 4는 23 내지 27℃에서 저장된 경우 재처리된 용액과 비교하여 새롭게 처리된 용액에서 테트라머가 보다 신속히 동화됨을 보여준다.

한 가지 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 용액을 가열하여 테트라머 동화를 가속시킴으로써 용액의 안정성을 향상시키기 위해 헤모글로빈 용액을 사전 동화시키는 것을 포함한다. 동화된 테트라머는 테트라머 동화에 대해 테트라머 동화를 가속시키도록 열처리되지 않은 중합된 용액 보다 안정한 용액을 제공하도록 용액으로부터 제거될 수 있다. 동화된 테트라머가 헤모글로빈 용액으로부터 제거된 경우, 추가의 테트라머 동화가 느려지거나 감소된다.

열처리는 용액의 정제 전 또는 정제 후에 일어날 수 있다. 용액이 처리 동안 열처리되는 경우, 이러한 열처리는 용액의 중합 후에 이루어져야 한다. 그 후, 용액은 실질적으로 모든 테트라머가 제거되도록 정제될 수 있다. 정제 후 열처리된 경우, 용액은 동화된 테트라머가 제거되도록 재정제되어야 한다.

열처리는 중합된 헤모글로빈 용액을 약 45 내지 55℃에 약 20 내지 30시간 동안 적용시킴으로써 달성될 수 있다. 그 밖의 처리 온도 및 시간이 테트라머를 동화시키기 위해 충분한 것으로 예상되는데, 이는 테트라머 동화가 다른 것들 중에서 시간 및 온도의 함수인 것으로 밝혀졌기 때문이다.

본 발명의 방법은 이것이 최종 생성물로 하여금 미생물 및 바이러스 항원과 병원체를 실질적으로 함유하지 않게 할 수 있다는 점에서 추가의 이점을 제공한다. 이러한 미생물 및 바이러스 항원과 병원체는 검출가능하지 않은 수준으로 감소되며, 즉, 생성물은 미국 약전 (XXIII Chapter 71)에 제시된 분석에 의해 측정하여 멸균 상태이다. 이러한 항원과 병원체의 예로는 세균, 리케차, 진균, 원생동물, 바이러스 및 그 밖의 생물체가 있다. 가장 중요하게는, 이러한 방법은 간염 및 후천성 면역결필증 (AIDS)을 일으키는 바이러스를 함유하지 않는 생물학적 생성물을 제공한다.

헤모글로빈 용액의 열처리는 바이러스의 실질적인 비활성화를 일으킨다. 바이러스 비활성화 열처리는 별도의 열처리 단계일 수 있거나 테트라머를 제거하기 위한 열처리와 합쳐질 수 있다. 일반적으로, 생산 조작자 안전을 위해, 바이러스 감소용 열처리는 헤모글로빈이 적혈구로부터 제거된 후에 수행되는 것이 바람직하다. 그러나, 중합 후의 용액의 열처리는 또한 요망되는 바이러스 비활성화를 달성하는 것으로 예상된다. 중합 전 바이러스 감소용 열처리 단계가 제거되는 경우, 테트라머를 동화시키기 위한 중합 후 열처리의 온도는 바이러스 비활성화를 보장하도록 약 60 내지 62℃, 또는 그 밖의 적합한 온도로 증가될 수 있다. 따라서, 중합 후의 1회의 열처리 단계는, 특정한 양태에서, 바이러스 감소 및 테트라머 동화 둘 모두를 달성한다.

본 발명의 생물학적 생성물은, 적어도 약 10.0L 이하의 양으로 주입되는 경우, 혈관수축, 신장 독성, 혈색소뇨증 및 생리적으로 바람직하지 못한 양의 테트라머성 헤모글로빈을 함유하는 공지된 헤모글로빈 용액의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 일으키지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 생성물의 정맥내 투여는 소변 생성의 상당한 감소, 사구체 여과 속도의 상당한 감소, 복강내로의 상당한 유출 및 생성된 소변의 상당한 색 변화을 일으키지 않는다.

따라서, 본 발명의 방법은 외상, 심근 경색, 뇌졸중, 급성 빈혈 및 산소 결핍 장애, 예를 들어 혈액을 완전히 산소화시키는데 있어서의 폐의 결함 또는 기능부전으로 인한 저산소혈증, 저산소증 또는 말기 저산소증의 치료에 유용한 무세포성 적혈구 대용물을 제공한다. 또한, 생성물은 소생용 유체 (예를 들어, 외상, 특히 출혈성 쇼크), 혈관내 부피 팽창제 또는 교환 수혈을 필요로 하는 임의의 질병 또는 의학적 질환의 치료에 유용하다. 의학적 치료 이외에, 생성물은 이식을 위해 장기를 보존하는 데에 유용할 수 있다.

한 가지 양태에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서 출발 물질은 인간 전혈 또는 농축 적혈구이다. 일반적으로, 혈액 저장백상에 표시된 만료일을 경과하여 단지 2주 동안 저장된 소스(source) 적혈구를 사용하는 것이 바람직하지만 반드시 그런 것은 아니다. 유효기한이 단지 2주 경과한 인간 전혈을 사용하는 것은 헤모글로빈을 추출하고 기질 단백질 및 오염물과 같은 세포 잔유물을 제거하는 데에 있어서 추가의 어려움을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법은 당업자의 수준에서 중요치 않은 변형을 가하여 모든 헤모글로빈에 적용될 수 있다.

인간 혈액이 출발 물질로서 사용되는 경우, 적혈구 흡인 및 여과 동안, 적혈구 (RBC)는 혈액내로 공기를 도입시키지 않으면서 도너 백으로부터 무균적으로 추출되며, 일련의 필터를 통과하여 감소된 양의 백혈구 및 혈소판을 지닌 RBC 현탁액을 생성시킨다. 그 후, 생성된 현탁액은 세포 세척/용해에 적용된다.

현탁액은 잔류 혈장 단백질을 제거하기 위해 약 1% NaCl을 사용하여 일산화탄소 분위기하에서 세척된다. 그 후, 세척된 RBC는 세포를 용해시키기 위해 주사용수 ("WFI")로 처리되고, 생성된 혼합물은 교차 흐름 (cross flow) 여과 유닛을 사용하여 정화된다. 예를 들어 세포를 기계적으로 또는 초음파로 용해시키는 것을 포함하는 당업자에게 공지된 적혈구를 용해시키는 그 밖의 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 정화된 생성물은 바이러스 비활성화를 위해 및 여과에 의해 제거되는 추가의 기질 물질을 침전시키기 위해 열처리될 수 있다. 이러한 절차의 생성물은 약 3% (w/v)의 THb를 지닌 기질 비함유 헤모글로빈 (SFH) 용액이다.

정화 후, 카르복시헤모글로빈을 함유하는 용액은 바람직하게는 농축되고 탈기되어, 데옥시헤모글로빈을 함유하는 기질 비함유 헤모글로빈 용액을 생성시킨다. 탈기는 먼저 카르복시헤모글로빈 용액을 산소로 약 16시간 동안 포화시켜서 산소화된 헤모글로빈 및 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 7 중량%의 카르복시헤모글로빈의 용액을 생성시키는 것을 포함한다. 후속하여, 산소가 질소, 아르곤 또는 헬륨을 사용하여 제거되어, 유리 헤모글로빈, 즉, 복합체화되지 않은 헤모글로빈 및 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 7 중량%의 옥시헤모글로빈을 함유하는 용액을 형성한다. 생성된 탈기된 용액은 여과되고, 화학적 변형을 위해 용기내로 전달된다.

탈기에 후속하여, 인간 헤모글로빈을 포함하는 기질 비함유 헤모글로빈 용액은 피리독살-5'-포스페이트 (P5P)를 약 1:1 내지 3:1의 피리독살-5'-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 사용하여 피리독실화되어야 한다. 대안적으로 기질 비함유 헤모글로빈은 2-노르-2 포르밀 피리독살-5'-포스페이트를 사용하여 피리독실화될 수 있다. 환원제, 예를 들어 나트륨 시아노보로히드라이드, 바람직하게는 나트륨 보로히드라이드가 피리독실화 혼합물에 첨가된다. 과량의 시약 및 염이 발열원 비함유 물에 대한 투석, 바람직하게는 WFI에 의한 투석여과에 의해 제거된다. 인간 혈액 이외의 공급원으로부터의 헤모글로빈은 피리독실화를 필요로 하지 않을 수 있다. 헤모글로빈 용액의 당업자는 피리독실화가 필요한 경우를 용이하게 이해한다.

기질 비함유 헤모글로빈 용액은 헤모글로빈 용액의 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 중합된다. 바람직하게는, 수성 글루타르알데히드가 중합화제로서 사용된다. 중합 시간 및 첨가되는 글루타르알데히드의 양은 헤모글로빈 용액의 부피, 요망되는 중합체의 수율 및 요망되는 분자량 분포에 좌우된다. 일반적으로, 보다 긴 중합 시간은 중합체의 수율 및 분자량 분포를 증가시킨다. 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 75 중량%의 중합체의 수율이 약 16 내지 18 시간내에 수득된다. 바람직한 중합반응의 종점은 용액이 크기 배제 HPLC에 의해 모니터하여 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 75 중량%의 중합체를 함유하는 시점으로서 규정된다. 대안적으로, 종점은 용액이 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 65 중량%의 중합체를 함유하는 시점, 즉, 약 2.5 시간으로서 규정된다.

중합 후, 반응은 적합한 작용제를 사용하여 켄칭되어야 한다. 한 가지 양태에 있어서, 중합 반응은 수성 글리신을 첨가함으로써 켄칭된다. 글리신은 가능한 한 신속히 첨가되어야 한다. 그 후, 가교는 수성 나트륨 보로히드라이드의 용액을 가능한 한 신속히 재첨가함으로써 안정화된다. 이러한 중합된 용액은 후속하여 농축된 후, 투석여과된다. 용액이 약 4 중량%의 헤모글로빈을 함유할 때까지 물이 최종적으로 용액에 첨가된다.

또 다른 양태에 있어서, 용액은 켄칭 반응을 완료시키기 위해 글리신을 동시에 첨가하면서 용액을 40 내지 50℃로 3시간 이상 동안 가열함으로써 "고온 켄칭"될 수 있다. 도 5는 새롭게 처리된 헤모글로빈 용액 및 3시간 동안 고온 켄칭된 헤모글로빈 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다. 둘 모두의 용액은 2 내지 8℃에서 저장되었다. 10개월 후, 테트라머는 새로운 헤모글로빈 용액에서 0.4 내지 0.5% 증가한 반면, 고온 켄칭된 용액에서 테트라머는 단지 약 0.4% 증가하였다. 도 6은 23 내지 27℃에서 저장된 경우 새롭게 처리된 용액 및 고온 켄칭된 용액 사이의 테트라머 동화의 차이를 도시한 도면이다. 용액의 안정성은 보다 긴 고온 켄칭, 예를 들어 24시간 이하의 고온 켄칭에 용액을 적용시킴으로써 향상되는 것으로 예상된다. 약 65℃ 이하의 보다 높은 온도가 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 중합은 도 9 및 하기 실시예에 나타난 바와 같은 협소한 분자량 범위를 지닌 중합체를 고수율로 생성시킨다.

또 다른 양태에 있어서, 켄칭 후 중합된 용액은 테트라머를 동화시키기 위한 열처리에 의해 사전 동화될 수 있다. 열처리는 정제 후의 임의의 시점까지 지연될 수 있지만, 용액은 재정제를 필요로 할 것이다. 열처리는 용액을 약 45℃ 보다 높게 약 24시간 이상 동안 가열함으로써 달성될 수 있다. 바이러스 비활성화가 이러한 시점에서 요망되는 경우, 용액은 약 60℃가 넘게 가열될 수 있다. 아스코르브산과 같은 산화방지제는 열처리 공정 동안 메트헤모글로빈의 형성을 억제하기 위해 첨가될 수 있다.

도 7은 새롭게 처리된 헤모글로빈 및 본 발명에 따라 처리된 사전 동화된 헤모글로빈 용액 사이의 테트라머 동화를 비교한 도면이다. 둘 모두의 용액은 2 내지 8℃에서 저장되었다. 15개월 후, 테트라머는 새로운 헤모글로빈 용액에서 약 0.5% 증가하였고, 사전 동화된 용액에서 테트라머는 단지 약 0.4% 증가하였다. 마찬가지로, 도 8은 테트라머가 23 내지 27℃에서 저장되는 경우에 사전 동화된 용액과 비교하여 새롭게 처리된 용액에서 보다 신속히 동화됨을 보여준다.

그 후, 중합되고 피리독실화된 헤모글로빈 용액이 정제된다. 한 가지 양태에 있어서, 정제는, 용액으로부터 잔류하는 중합되지 않은 (테트라머성) 헤모글로빈을 제거하기 위해, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 예를 들어 막 여과, 또는 둘 모두를 사용하여 용액을 산소화시키기 위해 산소의 분위기하에서 달성된다. 그 후, 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액은 가스 교환에 대한 준비로 한외여과 장치를 사용하여 약 6%로 농축된다.

그 후, 농축된 용액은 질소를 사용하여 탈산소화된다. 탈산소화는 용액 중의 옥시헤모글로빈의 양이 전체 헤모글로빈의 약 16 중량% 미만이 될 때까지 약 10 내지 12℃에서 일어난다.

그 후, 생성된 탈산소화되고 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액은 냉각된 용기 중에서 질소 분위기하에서 한외여과에 의해 농축된다. pH는 약 8.8 내지 9.0으로 조정되고, 전해질의 양은 필요에 따라 정상 혈장의 수준을 나타내는 수준으로 조정될 수 있다. 또한, 글루타티온, 아스코르베이트 또는 글루코오스와 같은 통상적인 산화방지제가 임의로 첨가될 수 있다. 용액이 요망되는 수준, 바람직하게는 전체 헤모글로빈의 약 10 중량%로 농축된 후, 용액은 여과에 의해 멸균되고, 멸균 전달 장치에 의해 적합한 약제학적으로 허용되는 용기내로 전달된다.

헤모글로빈 용액이 테트라머 동화를 촉진시키도록 사전 열처리되지 않은 경우, 용액은 동화된 테트라머가 제거되도록 열처리되고 재정제될 수 있다. 산화방지제 및 제형화 화학물질이 첨가되는 경우, 이들 물질은 열처리 및 정제 전에 투석여과에 의해 제거될 수 있다.

또한, 열처리에 대한 대안적 방법으로서, 최종 헤모글로빈 용액의 테트라머 동화는 용액을 적합한 온도에서 숙성시킴으로써 달성될 수 있다. 그 후, 용액은 동화된 테트라머가 제거되도록 재정제될 수 있다. 일반적으로, 용액은 테트라머 수준이 약 1 내지 3%를 초과할 때까지 숙성되어야 하는 것으로 예상되며, 보다 높은 테트라머 수준은 용액이 테트라머를 제거하도록 정제된 후에 증가된 안정성 이점을 제공한다. 그러나, 본 발명의 이점은, 동화된 테트라머가 용액의 숙성 후에 제거되기만 하면, 용액이 임의의 기간 동안 숙성되는 경우에 달성되는 것으로 예상된다.

생성된 헤모글로빈 용액의 특징은 도 9에 도시되어 있으며, 다음과 같다:

전체 헤모글로빈 (g/dl) 9.5-10.5

메트헤모글로빈 (전체 Hb의 %) < 8.0

카르복시헤모글로빈 (전체 Hb의 %) < 5.0

P₅₀ (토르) 26-32

삼투몰농도 (mmol/Kg) 280-360

나트륨 (mmol/L) 135-155

칼륨 (mmol/L) 3.5-4.5

염화물 (mmol/L) 85-110

유리 철 (ppm) < 2.0

분자량 분포 - 128 Kd 피크 (%) 9-23

분자량 분포 - 192 Kd 피크 (%) 16-18

분자량 분포 - 256 Kd 피크 (%) 49-74

테트라머 (64K)(%) ≤ 1.0

내독소 (EU/mL) < 0.03

인지질 ng/Hb < 50

당지질 (ng/Hb) < 2

발명의 개요

한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 용액 중의 헤모글로빈을 중합시키고, 중합된 헤모글로빈을 처리하여 테트라머를 동화시키고, 테트라머를 중합된 헤모글로빈 용액으로부터 제거하는 것을 포함하여, 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 헤모글로빈의 용액을 중합시키고, 중합된 헤모글로빈 용액을 열처리하여 테트라머를 동화시키고, 중합된 헤모글로빈 용액으로부터 테트라머를 제거함으로써 생성된 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액에 관한 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 중합된 헤모글로빈 용액을 처리하여 중합된 헤모글로빈을 테트라머로 부분적으로 분해시키고, 테트라머를 용액으로부터 제거하는 것을 포함하여, 중합된 헤모글로빈 용액을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 안정화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키고, 테트라머를 중합된 헤모글로빈 용액으로 제거하여 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키고, 중합된 헤모글로빈 용액을 숙성시켜서 테트라머가 동화되게 하고, 동화된 테트라머를 제거하는 것을 포함한다. 숙성시키는 것은 테트라머 농도가 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 보다 높게 될 때까지 헤모글로빈 용액을, 예를 들어 1년이 넘는 시간 동안 저장하는 것을 포함할 수 있다.

헤모글로빈은 인간 또는 소과동물 혈액과 같은 포유동물 혈액으로부터 유래될 수 있다. 헤모글로빈은 글루타르알데히드에 의해 중합될 수 있다. 테트라머는 여과에 의해 제거될 수 있다. 테트라머가 동화되도록 중합된 용액을 처리하는 것은 용액을 약 45℃ 보다 높게 약 24시간 이상 동안 가열함으로써 달성될 수 있다. 테트라머 제거 후의 테트라머 농도는 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 미만이거나 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 0.3% 미만일 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 특정한 양태들을 예시한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 하며, 본 발명의 조건 및 범위에 대해 전적으로 한정하고자 하는 것이 아니다. 모든 온도는 별다른 명시가 없는 ℃로 표현된다. 또한, 전형적인 반응 조건 (예를 들어, 온도, 반응 시간)이 주어진 경우, 이러한 특정 범위 보다 높거나 낮은 조건이 또한 사용될 수 있지만, 일반적으로 덜 편리한 것으로 인지되어야 한다.

상반된 표시가 없는 한, 본 발명의 방법에 사용되는 모든 용기 및 탱크는 316-L 스테인레스 스틸, 바람직하게는 고도로 연마되어 용이하고 신속하게 세정되는 약제학적 등급의 스테인레스 스틸로 제조된다. 다양한 연결 파이프 및 튜브는 동일한 스테인레스 스틸 또는 약제학적 등급의 테플론 또는 실리콘 튜빙으로 제조된다. 본 발명의 방법에 사용되는 필터 및 막은 밀리포어 인크. (Millipore Inc.), 팔-필트론 (Pall-Filtron) 또는 큐노 인크. (Cuno Inc.)로부터 구입될 수 있다.

본 발명에 따른 분석용 크기 배제 크로마토그래피 HPLC는 하기 절차에 따라 수행된다. 샘플은 약 pH 6.9의 0.1M 인산 나트륨 완충액을 사용하여 0.2 g/dl로 희석되고, 0.2μ 필터를 통해 여과되고, 하기 부품들로 구성된 (시스템 흐름의 순서대로) HPLC 시스템내로 주입된다:

1. 애질런트 테크놀로지스 1110 이소크래틱 펌프 (Agilent Technologies 1100 Isocratic Pump)

- 이동상은 약 pH 6.9의 0.1M 인산 나트륨이고,

- 유속은 분 당 0.5ml 이다.

2. 45cm PEEK 또는 티타늄 튜빙, 0.010 in. I.D.

3. 애질런트 1100 오토샘플러 (Agilent 1100 Autosampler)

4. 18cm PEEK 또는 티타늄 튜빙, 0.010 in. I.D.

5. 0.5μ 전치컬럼(precolumn) 필터 프릿(frit)

6. 9cm PEEK 또는 티타늄 튜빙, 0.010 in. I.D.

7. Toso TSK G3000SWXL 40 x 60 mm 가드(guard) 컬럼

8. 24cm PEEK 또는 티타늄 튜빙, 0.010 in. I.D.

9. Toso TSK G3000SWXL 300 x 7.8 mm 분석용 컬럼

10. 23cm PEEK 또는 티타늄 튜빙, 0.010 in. I.D.

11. 애질런트 100 가변 파장 검출기.

- 파장: 280 nm

- 흐름 셀: 14μL 부피, 10 mm 경로길이

- 범위: 2 AUFS

- 시간 상수: 10초

280nm에서의 피크 흡광도는 애질런트 켐스테이션 (Agilent Chemstation)에 의해 기록되며, 이는 개개의 피크 면적을 적분하고 각각의 중합체 종에 대해 전체 헤모글로빈 면적을 계산한다.

실시예 1

세포 흡인 및 여과

도 11을 참조하면, 유효기한이 경과한 혈액 (전혈 또는 농축 적혈구)의 도너 백(20)을 적합한 무균 흡인 장치(22)에 위치시킨다. 흡인 장치내의 바늘로 도너 백을 천자하고, 약 150ml의 1% (w/v) 염화 나트륨 수용액을 도입시키고, 감압 또는 진공하에서 도너 백으로부터 유효기한이 경과한 혈액을 흡인한다. 흡인된 혈액을 백혈구 흡착 깊이 필터(24) 또는 일련의 두 개의 5μ 깊이 필터(26)를 통과시킨다. 혈액이 필터를 통과함에 따라, 백혈구가 혈액으로부터 제거된다. 전형적으로, 약 225개 유닛의 유효기한이 경과한 전혈은 도 11에 도시된 바와 같이 흡인되고, 여과된 후, 탱크(1)로 전달된다. 그 후, 필터를 약 75 리터의 1% (w/v) 염화 나트륨 수용액으로 헹군다.

실시예 2

세포 세척 및 용해

헐액을 탱크(1)로 도입시키기 전에, 탱크(1)를 약 40 내지 50L의 1% 염화 나트륨 수용액으로 충전시킨다. 모든 225개 유닛의 유효기한이 경과한 전혈을 흡인하고, 여과하고, 전달하고, 필터를 헹군 후, 탱크는 약 365 내지 395 리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액을 함유한다. 흡인 및 여과 단계 동안, 탱크(1)은 감압, 즉, 20 내지 28 인치 Hg로 유지된다. 모든 유효기한이 경과한 혈액이 탱크(1)로 전달되는 경우, 진공이 해제되고, 일산화탄소가 탱크내로 도입되어, 탱크는 일산화탄소의 분위기를 함유한다.

탱크(1)를 도 11에 도시된 바와 같이 0.65μ 접선 흐름 필터(28)에 커플링시킨다. 365 내지 395 리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액의 초기 충전량은 접선 흐름 필터를 통한 미세여과에 의해 약 215 내지 225 리터의 7% 전체 헤모글로빈 용액으로 농축된다. 이러한 시점에서의 헤모글로빈 용액의 pH는 약 6 내지 6.5 이다. 7% 전체 헤모글로빈으로 농축한 후, 1%(w/v) 염화 나트륨 용액을 첨가하고, 투석여과하고, 염화 나트륨 용액이 첨가되는 속도와 동일한 속도로 여액을 제거함으로써,용액을 세척한다. 215 내지 225 L의 헤모글로빈 용액은 전형적으로 약 8 부피의 1% 염화 나트륨 용액 (약 1,800 L)으로 세척한다. 세척에 이어, 용액을 약 90 내지 95 L, 즉, 약 16% 전체 헤모글로빈으로 농축시키고, 주사용수 ("WFI")를 첨가하여 용액의 부피를 약 220 L 이하가 되게 한다. WFI의 첨가시에, 세포는 팽윤되고 파열되어, 헤모글로빈을 용액내로 방출시킨다. 생성된 헤모글로빈 용액의 농도는 약 7% 전체 헤모글로빈 (THb) 이다.

생성된 용액은 여전히 탱크(1)에 보유되어 있는 동안 정화된다. 용액을 먼저 약 90 L로 농축시키고, 여액을 탱크(2)로 전달한다. 용액이 필터를 가로질러 펌핑되는 경우, 적혈구, 기질 오염물 및 세포벽 물질이 필터에 의해 보유되고 제거된다. 탱크(1)내에 남아있는 90 L 용액을 약 280 L의 WFI로 세척 (투석여과)하고, 세척액을 탱크(2)에 첨가한다. 탱크(2)에서 발생되는 부피는 약 405 내지 415 L의 3.3% 전체 헤모글로빈 용액이다.

실시예 3

바이러스 감소 및 기질 침전을 위한 임의적 열처리

그 후, 생성된 기질 비함유 헤모글로빈 용액을 약 60 내지 62℃에서 약 10시간에 걸쳐 탱크(2)에서 열처리한다. 이 시간 동안, 용액은 적당히 교반된다. 용액이 가열되고 약 55℃의 온도를 지나는 경우, 침전물이 형성된다.

실시예 4

정화 및 바이러스 감소

그 후, 생성된 3.3% THb 기질 비함유 열처리된 헤모글로빈 용액을 0.2μ 사전필터(30)에 이어 0.1μ 사전필터(32)를 통해 여과시킨 후, 100 kD 바이러스 감소 울트라필터(ultrafilter) (도시되지 않음)를 통해 탱크(3)내로 펌핑시킨다.

실시예 5

한외여과/농축

그 후, 여과된 헤모글로빈 용액을 85 내지 105 L (약 14% THb)로 농축시킨 후, 약 4 부피의 WFI (350 L)로 세척하고 투석여과시킨다. 농축 및 투석여과는 10kD 분자량 울트라필터(34)를 사용하여 달성된다. 울트라필터(34)와 결합된 배출관(35)은 여액을 수집한다. 이 시점에서, 14% 전체 헤모글로빈 용액은 약 6 내지 6.5의 pH에서 헤모글로빈 그램 당 약 50ng 미만의 인지질, 헤모글로빈 그램 당 약 2ng 미만의 당지질, 약 1% 미만의 메트헤모글로빈, 밀리리터 당 약 0.03 유닛 미만의 내독소를 함유한다. 용액 중의 헤모글로빈은 카르복시헤모글로빈이다.

실시예 6

탈기

그 후, 생성된 카르복시헤모글로빈은 175L 용기 (탱크(4))로 전달되며, 여기서 카르복시헤모글로빈은 먼저 산소화된 후, 탈산소화된다. 탱크(4)는 산소 및 질소 가스 라인에 커플링된 가스 살포 고리, 탱크 하부로부터 탱크(4)의 상부에 위치한 계량식 스프레이 장치로의 공급기, 및 탱크(4)내에서 생성된 포움이 포움 캔(36)내로 공급되어 포움이 액체로 응축되고 탱크(4)로 다시 공급되도록 포움 캔(36)에 연결된 포움 오버플로우(overflow) 수집기를 구비하고 있다. 포움 캔(36)에 대한 대안으로서, 탱크(4)는 기계적 포움 파괴장치를 구비할 수 있다. 탱크(4)는 중심부에 장착된 가스 분산 교반기를 추가로 포함한다. 포움 캔(36)은 가스의 제거를 위한 가스 배출구를 포함한다. 탱크(4)중의 용액은 13% 전체 헤모글로빈 용액이다.

첫 번째 산소화 단계 동안, 산소는 용기내에서의 가스의 균일한 분포를 이루기에 충분한 속도로 용액을 통해 살포된다. 용기에는 약 66L/분의 속도로 가스가 살포된다. 카르복시헤모글로빈의 산소화는 생성된 용액이 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 5% 미만의 카르복시헤모글로빈을 함유하도록 약 18시간 동안 수행된다. 산소화는 약 10℃에서 수행된다. 탱크(4)내에서 생성된 포움은 포움 캔(36)내에 수집되고, 침강된 후, 생성된 용액은 탱크(4)내로 다시 전달된다.

산소화 후, 용액은 약 3 내지 3.5 시간 동안 또는 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 10% 미만의 옥시헤모글로빈이 용액중에 남아있게 될 때까지 유사한 질소의 흐름을 사용하여 살포된다. 질소 살포는 약 10℃ 및 약 6.95 내지 7.10의 pH에서 수행된다. 대안적으로, 카르복시헤모글로빈은 막 교환기를 사용하여 데옥시헤모글로빈으로 전환될 수 있다. 포우밍 단계로부터 일반적으로 예상되는 헤모글로빈의 변성이 실질적으로 없음이 주목된다.

실시예 7

화학적 변형

도 12를 참조하면, 데옥시헤모글로빈 용액은 화학적 변형을 위해 탱크(5)에 전달된다. 그 후, 약 4℃에서 데옥시헤모글로빈 용액을 함유하는 탱크(5)에, 피리독실-5-포스페이트 (P5P) (93.75 g/L)의 수용액을 1:1 내지 3:1의 P5P 대 헤모글로빈 몰비로 첨가한다. 2:1의 P5P 대 헤모글로빈의 몰비가 바람직하다. 피리독실화는 약 4℃에서 수행된다. P5P 용액은 전형적으로 약 1분에 걸쳐 첨가하고, 약 15분간 혼합시킨 후, 나트륨 보로히드라이드/나트륨 히드록시드 용액을 헤모글로빈 용액에 약 20:1의 나트륨 보로히드라이드 대 헤모글로빈의 몰비로 첨가한다. 적합한 수성 나트륨 보로히드라이드/나트륨 히드록시드 용액은 2 리터 당 0.8g의 나트륨 히드록시드 및 2 리터 당 90.8g의 나트륨 보로히드라이드를 함유한다. 보로히드라이드 용액을 약 1분에 걸쳐 가능한 한 신속히 첨가한 후, 1시간 동안 교반시킨다.

실시예 8

반응물 제거

후속하여, 4 부피 (600L)의 WFI를 사용하여 과량의 반응물을 제거하기 위해 생성된 150L의 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 10K 달톤 울트라필터(38)를 사용하여 투석여과시킨다. 울트라필터(38)과 결합된 배출관(40)은 필터(38)로부터의 여액을 수집한다.

실시예 9

중합반응

피리독실화된 헤모글로빈을 함유하는 탱크(5)에, 4.5% 전체 헤모글로빈 용액 (약 265L의 헤모글로빈 용액)을 준비하기에 충분한 WFI를 첨가한다. 글루타르알데히드 용액을 약 24:1의 글루타르알데히드 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독실화된 헤모글로빈 용액에 첨가한다. 글루타르알데히드 용액은 전형적으로 계량 펌프에 의해 약 2.5 시간에 걸쳐 헤모글로빈 용액에 첨가한다. 중합 반응은 약 18 시간 동안 진행시킨다. 표적 분자량 분포는 약 75% 중합체 및 25% 테트라머이다. 표적 중합체는 약 600,000 미만의 분자량을 지니며, 분자량의 유력한 분획은 100,000 내지 350,000 범위에 있다.

중합 반응이 표적 분자량 분포에 도달하는 경우 (약 18시간 후), 수성 글리신 (약 166g/L)을 헤모글로빈 용액에 140:1의 글리신 대 헤모글로빈의 몰비로 첨가한다 (켄칭으로서). 이 시점에서, 용액을 3시간 이상 동안 40 내지 50℃로 가열하여, 켄칭 반응을 완결시킬 수 있다 ("고온 켄칭").

도 10은 생성된 중합되고 글리신 켄칭된 헤모글로빈 생성물의 HPLC 추적을 도시한다. 그 후, 생성된 용액을 약 10분간 혼합한 후, 나트륨 보로히드라이드 나트륨/히드록시드 용액 (상기 확인된 농도를 지님)을 헤모글로빈 용액에 28:1의 나트륨 보로히드라이드 대 헤모글로빈의 몰비로 첨가한다. 이러한 생성된 혼합물을 약 1시간 동안 교반시킨다. 그 후, 용액을 약 150L (울트라필터(38))로 농축시키고, 4부피 (600L)의 WFI로 세척한다. 상기 지시된 몰비와 동일한 몰비로 나트륨 보로히드라이드의 추가의 분취량을 농축된 용액에 첨가하고, 1시간 동안 재혼합한다. 생성된 용액을 4부피의 WFI (600L)로 세척한다.

실시예 10

테트라머 동화를 위한 임의적 열처리

이 시점에서, 용액을 테트라머가 동화되도록 열처리할 수 있다. 용액은 45 내지 55℃에서 약 20 내지 30시간 동안 가열 처리할 수 있다. 바이러스 감소가 이러한 단계 동안 요망되는 경우, 온도는 60℃ 보다 높게 증가될 수 있다. 용액을 가열하기 위해, 가열 매질, 예를 들어 약 80℃의 프로필렌 글리콜 용액을 탱크 재킷을 통해 순환시키며 Hb 용액을 격렬하게 교반시킨다. 가열 후, 헤모글로빈 용액을 약 2 내지 8℃로 냉각시킨다.

실시예 11

정제

생성된 용액은, 용액을 산소 분위기하에서 정치시킴으로써 산소화시킨 후, 정제 시스템(42)로 전달한다. 정제는 컬럼 크로마토그래피, 여과, 바람직하게는 막 여과 (투석여과), 또는 여과 및 컬럼 크로마토그래피의 조합법에 의해 달성될 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 용액은 도 13에 도시된 바와 같이 크로마토그래피 공급 용기인 탱크(6)에 전달된다. 이러한 구체예에 있어서, 생성된 옥시헤모글로빈 용액을 탱크(6)내에서 약 200L (4% 전체 헤모글로빈)으로 희석하고, 염화물의 농도는 염화 나트륨 용액을 사용하여 22mM로 조정한다. 나트륨 농도의 조정은 불필요하다.

그 후, 생성된 헤모글로빈 용액의 5개의 40L 분취량을 컬럼(44)를 사용하여 크로마토그래피한다. 컬럼(44)는 테트라머 보다 중합체에 대해 보다 큰 친화성을 지니는 황색 염료 (어피니티 크로마토그래피, 리미티드 (Affinity Chromatography, Ltd.)에 의해 미메틱 옐로우 넘버 1 (Mimetic Yellow No. 1)으로서 시판됨)로 개질된 아가로오스 겔인 친화성 겔을 함유한다.

크로마토그래피는 다음과 같이 수행한다. 40L의 산소화되고 중합되고 피리독실화된 기질 비함유 헤모글로빈 용액을 컬럼(44)상에 로딩한다. 컬럼을 15 컬럼 부피 (약 750L)의 30mM 수성 NaCl 완충액으로 세척하여 테트라머를 제거한다. 그 후, 컬럼을 약 250L의 300mM 염화 나트륨 완충액으로 세척하여 중합체를 세척 제거한다. 중합체 분획을 탱크(7)에 수집한다. 원하지 않는 분획을 배출관(46)으로 보낸다. 각각의 분취량을 분리한 후, 컬럼을 15mM HCL 용액 (150L)으로 재생시키고, 30mM 수성 NaCl (250L)를 사용하여 재평형을 이루게 하고, 공급 용액의 또 다른 분취량 (40L)을 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 30mM NaCl에 이어 300mM NaCl로 다시 세척한다. 헤모글로빈 용액의 40L 분취량을 컬럼에 첨가하고, 탱크(6)가 비워질 때까지 크로마토그래피한다.

탱크(7)내의 수집된 분획을 배출관(50)과 결합된 필터(48)를 사용하여 약 40L (6% 전체 헤모글로빈)의 부피로 한외여과 (농축)시킨다. 그 후, 농축된 헤모글로빈 용액을 탈산소화를 위해 가스 교환 탱크(8)로 전달한다.

대안적으로, 용액을 도 14에 도시된 바와 같이 여과 재순환 용기(10)에 전달한다. 그 후, 헤모글로빈을 탱크(10)에서 약 4% THb로 희석한다. 그 후, 4% THb 용액을 10mM NaCl 및 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)으로부터 시판되는 300,000 분자량 필터(52)를 사용하여 투석여과시킨다. 여과는 헤모글로빈 물질의 약 97%가 필터를 통해 탱크(11)로 전달될 때까지 지속한다. (물질, 즉, 고분자량 중합체의 약 3%가 탱크(10)에 보유된다). 헤모글로빈의 양은 코옥시미터(cooximeter)를 사용하여 분광학적으로 측정한다.

탱크(11)중의 생성된 물질은 약 4 내지 8% THb이며, THb를 기준으로 하여 약 7 내지 10% 테트라머를 함유한다. 그 후, 4 내지 8% THb를 10mM NaCl 및 배출관 또는 트랩(56)과 결합된 폴-필트론(Pall-Filtron)으로부터 시판되는 100,000 분자량 필터(54)를 사용하여 투석여과시킨다. 여과는 토소 바이오셉(Toso BioSep) 300 x 7.8mm 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하여 테트라머의 수준이 헤모글로빈 중량의 1.0% 미만이 될 때까지 지속한다. 생성된 정제된 헤모글로빈 용액은 처음에는 탱크(11)내에 존재하며, 그 후, 탈산소화를 위해 가스 교환 탱크(8)로 전달된다.

실시예 12

탈산소화

가스 교환 탱크(8)는 탱크(4)와 동일한 탱크이거나, 바람직하게는 상이한 탱크일 수 있다. 가스 교환 탱크(8)는 가스 교환 탱크(4)와 본질적으로 동일한 방식으로 구비되어 있으며, 포움 캔(58)에 부착되어 있거나 탱크(4)의 방식과 동일한 방식으로 기계적 포움 파괴장치를 구비하고 있다. 탈산소화는 약 10℃에서의 질소 살포 및 약 8.8의 용액 pH를 사용하여 약 2.5시간내에 수행된다. 질소 살포는 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 약 16% 미만의 옥시헤모글로빈이 용액중에 남아있을 때까지 지속한다. 그 후, 생성된 데옥시헤모글로빈 용액은 제형화를 위해 탱크(9)로 전달된다.

실시예 10의 열처리 단계가 지연되는 경우, 이는 현 시점에서 수행될 수 있다. 열처리가 현 시점에서 수행되는 경우, 실시예 11의 정제 절차 및 본 실시예의 탈산소화 절차가 반복될 수 있다. 실시예 10의 열처리 단계 및 현 시점에서의 열처리 단계는 임의적이며, 완전히 배제될 수 있다.

실시예 13

제형화

제형화 탱크(9)에 있어서, 용액을 먼저 약 7% 전체 헤모글로빈으로 농축시키고, pH를 4℃에서 약 8.8 내지 9.0으로 조정한다. pH를 0.2M NaOH를 사용하여 조정한다. 글루코오스 및 글리신을 첨가하여 각각 약 1g/L 및 3.5g/L의 최종 농도를 수득한다. 염화 칼륨을 용액에 첨가하여 약 3.5 내지 4.5 mM의 칼륨 농도를 수득한다. 그 후, 3M 염화 나트륨을 첨가하여 85 내지 110mM 염화물 농도를 수득한다. 그 후, 락트산 나트륨을 첨가하여 135 내지 155 mM의 나트륨 이온 농도를 수득한다. 최종적으로, 0.45 몰의 아스코르브산 용액을, 아스코르브산 농도가 약 1000 mg/L에 도달할 때까지 첨가한다. pH는 0.22M NaOH를 사용하여 10 내지 15℃에서 8.7 내지 9.1로 조정한다. 생성된 헤모글로빈 용액은 kg 당 약 280 내지 360 mmole의 최종 삼투몰농도를 지닌다.

그 후, 제형화된 헤모글로빈 용액을 트랩(62)와 결합된 필터(60)를 사용하여 약 10% 전체 헤모글로빈으로 농축시킨다. 그 후, 10% 헤모글로빈 용액을 필터(64)를 통한 여과에 의해 멸균시키고, 사전멸균된 백내로 무균적으로 충전시킨다.

실시예 14

용액 사전 동화

용액이 처리 동안 테트라머를 동화시키기 위해 고온 켄칭에 적용되거나 임의적 열처리 단계에 적용되는지 간에, 용액은 제형화 후의 임의의 시점에서 용액을 약 45 내지 55℃로 약 20 내지 30시간 동안 가열하거나 테트라머가 약 1 내지 3% 보다 높게 증가할 때까지 가열함으로써 테트라머가 동화되도록 가열될 수 있다. 열처리 후, 용액은 실시예 11에서와 같이 정제될 수 있고, 실시예 13에서와 같이 탈기될 수 있다. 이 시점에서 용액은 이미 제형화되었기 때문에, 실시예 12에서 도입된 첨가제는 바람직하게는 정제 전에 투석여과에 의해 제거된 후, 재제형화(re-formulation) 동안 재도입된다.

실시예 15

숙성된 헤모글로빈 용액의 재처리

유효기한이 지났거나 숙성된 헤모글로빈 용액은 열처리없이 실시예 14에서와 같이 재처리할 수 있다. 전형적으로, 약 2 내지 8℃의 저장 조건에서 약 12 내지 18개월 보다 오래된 헤모글로빈 용액은 약 1.0% 보다 높은 테트라머 수준을 지닌다. 이러한 물질은 탱크(5)에 도입될 수 있고, 실시예 11 내지 13에 따라 정제되고 재제형화될 수 있다. 이러한 시점에서 용액은 이미 제형화되었기 때문에, 실시예 13에서 도입된 첨가제는 바람직하게는 정제 전에 투석여과에 의해 제거된 후, 재제형화 동안 재도입된다.

이상과 같이, 본 발명의 바람직한 구체예들의 상세한 설명을 제한이 아닌 예시를 목적으로 제공하였다. 상기 설명을 기초로 하여 당업자에게 자명한 모든 그 밖의 변형, 파생물 및 균등물은 하기 청구의 범위에 속하는 것으로 이해될 것이다.

Claims (32)

1. a) 용액 중의 헤모글로빈을 중합시키고;

   b) 용액 중의 중합된 헤모글로빈을 열처리하고;

   c) 용액 중의 중합된 헤모글로빈으로부터 테트라머를 제거하는 것을 포함하여, 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 헤모글로빈이 포유동물 혈액으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 포유동물 혈액이 인간 혈액이고, 헤모글로빈이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 헤모글로빈이 소과동물 혈액으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 헤모글로빈이 글루타르알데히드에 의해 중합됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 테트라머가 여과에 의해 제거됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 열처리가 용액을 약 45℃ 보다 높게 약 24시간 이상 동안 가열하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 단계 (c)의 완료시의 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 미만임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 단계 (c)의 완료시의 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 0.3% 미만임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 단계 (c) 이외에, 열처리 전에 용액으로부터 테트라머를 제거하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 용액이 테트라머를 본질적으로 함유하지 않을 때까지 테트라머가 열처리 전에 용액으로부터 제거됨을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 열처리 전의 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 미만임을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 열처리 전의 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 0.3% 미만임을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항의 방법에 의해 생성된 헤모글로빈 용액.
15. 중합된 헤모글로빈 용액을 처리하여 중합된 헤모글로빈을 테트라머로 부분적으로 분해시키고, 테트라머를 용액으로부터 제거하는 것을 포함하여, 테트라머를 본질적으로 함유하지 않는 중합된 헤모글로빈 용액을 안정화시키는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 용액을 처리하는 것이 용액을 숙성(aging)시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
17. 제 15항에 있어서, 용액을 처리하는 것이, 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 보다 높게 될 때까지 용액을 숙성시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
18. 제 15항에 있어서, 용액을 처리하는 것이 용액을 가열하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
19. 제 15항에 있어서, 용액을 처리하는 것이, 테트라머 농도가 용액 중의 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 보다 높게 될 때까지 용액을 가열하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
20. 제 15항에 있어서, 헤모글로빈이 포유동물 혈액으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
21. 제 15항에 있어서, 포유동물 혈액이 인간 혈액이고, 헤모글로빈이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.
22. 제 15항에 있어서, 헤모글로빈이 소과동물 혈액으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
23. 제 15항에 있어서, 헤모글로빈이 글루타르알데히드에 의해 중합됨을 특징으로 하는 방법.
24. 제 15항에 있어서, 테트라머가 여과에 의해 제거됨을 특징으로 하는 방법.
25. 제 18항에 있어서, 용액을 가열하는 것이, 용액을 약 45℃ 보다 높게 약 24시간 이상 동안 가열하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
26. a) 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키고;

    b) 중합된 헤모글로빈 용액으로부터 테트라머를 제거하여, 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키고;

    c) 중합된 헤모글로빈 용액을 숙성시키고;

    d) 동화(elaboration)된 테트라머를 제거하는 것을 포함하여, 안정되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 용액을 숙성시키는 것이, 테트라머 농도가 전체 헤모글로빈의 약 1.0% 보다 높게 될 때까지 헤모글로빈 용액을 저장하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26항에 있어서, 용액을 숙성시키는 것이, 테트라머 농도가 전체 헤모글로빈의 약 3.0% 보다 높게 될 때까지 헤모글로빈 용액을 저장하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
29. 제 26항에 있어서, 용액을 숙성시키는 것이 헤모글로빈 용액을 1년 보다 긴 시간 동안 저장하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
30. a) 용액 중의 헤모글로빈을 중합화제를 포함하는 중합 반응에 적용시키고;

    b) 중합 반응을 켄칭제(quenching agent)로 켄칭시키고;

    c) 켄칭 동안에 용액을 가열하고;

    d) 용액 중의 중합된 헤모글로빈으로부터 테트라머를 제거하는 것을 포함하여, 테트라머를 실질적으로 함유하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 용액이 켄칭 동안에 약 40℃ 이상으로 3시간 이상 동안 가열됨을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 용액이 약 40 내지 50℃로 가열됨을 특징으로 하는 방법.