CN100431602C - 具有低量四聚体的聚合血红蛋白溶液及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基本不含四聚体的血红蛋白溶液，以及制造基本不含四聚体的血红蛋白溶液的方法。该方法包括将血红蛋白溶液聚合，处理聚合的血红蛋白溶液从而将聚合物部分降解为四聚体，以及从血红蛋白溶液中除去四聚体。

Description

具有低量四聚体的聚合血红蛋白溶液及制备方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年1月29日提交的美国临时申请No.60/443,436的优先权。
技术领域
本发明涉及稳定的载氧溶液。更具体地说，涉及经过处理以提高聚合物键稳定性并除去滋生的四聚体的血红蛋白溶液。
背景技术
由于日益增长的外科和创伤负荷，对于现成的血液制品存在着持续需求，以补充血库短缺。对于需要增加载氧能力的患者来说，载氧溶液，如血红蛋白衍生溶液可以用来代替全血或红血细胞。由于它们不取决于捐献者的可获量，因此这样的溶液在紧急情况下或血库短缺时可以很容易地获得。此外，由于输血带来的血原性病原体感染的风险，患者输血时可能宁可用血红蛋白衍生溶液来代替全血或红血细胞。详细地说，这样的溶液包括但不限于氧载体、血液替代品、和例如美国专利No.6,498,141、6,133,425、5,464,814、5,438,041、5,217,648、5,194,590、5,061,688和4,826,811中公开的血红蛋白衍生组合物，其全部内容在此引入作为参考。
在本领域中已知不含基质的血红蛋白具有氧传输和可逆氧(或配体)结合能力。然而，血红蛋白溶液尽管能够载有维持生命足量的氧，却面临着几种有害副作用的挑战，例如肾功能的降低。人们认为这些作用是由于存在未从溶液中除去的有害污染物而引起的，例如细菌内毒素或红细胞膜片断(基质)。虽然这些污染物确实能够造成肾的改变，基本不含这些污染物的血红蛋白溶液仍造成相当大的肾功能紊乱。肾功能紊乱的原因之一可以归咎为含有生理上不可接受量的未聚合的血红蛋白四聚体。
基本上不含四聚体的血红蛋白溶液可以用来补充人类患者的基本所有血量，而不会导致血管收缩、肾中毒、血红蛋白尿或其它与合成或半合成氧载体及血液替代品的静脉用药有关的问题。尽管这些溶液提供优异的效力，由于已知血红蛋白聚合物随时间缓慢降解为四聚体单元，产品的保存期有限。因此，需要一种方法长时间维持溶液中基本不含四聚体，从而提高溶液的保存期限。
发明内容
一方面，本发明提供了生产基本不含四聚体的血红蛋白溶液的方法，包括在溶液中将血红蛋白聚合，处理聚合的血红蛋白以滋生四聚体，以及将四聚体从聚合的血红蛋白溶液中除去。
另一方面，本发明涉及通过血红蛋白溶液的聚合，对聚合的血红蛋白溶液进行热处理以滋生四聚体，以及将四聚体从聚合的血红蛋白溶液中除去，而生产的基本不含四聚体的血红蛋白溶液。
更进一步，本发明涉及稳定聚合的血红蛋白溶液的方法，包括对聚合的血红蛋白溶液进行处理以将聚合的血红蛋白部分降解为四聚体，并将四聚体从溶液中除去。
又一方面，本发明提供制造稳定的聚合血红蛋白溶液的方法。该方法包括制造聚合的血红蛋白溶液，将四聚体从聚合血红蛋白溶液中除去以生成基本不含四聚体的聚合血红蛋白溶液，陈化聚合血红蛋白溶液以容许四聚体的滋生，以及将滋生的四聚体除去。陈化可以包括将血红蛋白溶液保存到四聚体的浓度大于总血红蛋白的约1.0％，例如一年以上。
血红蛋白可以来自哺乳动物血液，如人血或牛血。血红蛋白可以与戊二醛聚合。可以通过过滤来除去四聚体。可以通过在大约45℃以上的温度，将溶液加热至少约24小时，来实现聚合溶液的处理以滋生四聚体。除去四聚体之后，四聚体的浓度可以为低于溶液中总血红蛋白的约1.0％，或低于溶液中总血红蛋白的约0.3％。
附图说明
图1显示了在2-8℃下保存的血红蛋白溶液中四聚体的滋生量。
图2显示了在23-27℃下保存的血红蛋白溶液中四聚体的滋生量。
图3比较了在2-8℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与再处理陈化的血红蛋白溶液中的四聚体滋生。
图4比较了在23-27℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与再处理陈化的血红蛋白溶液中的四聚体滋生。
图5比较了在2-8℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与热淬灭溶液中的四聚体滋生。
图6比较了在23-27℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与热淬灭溶液中的四聚体滋生。
图7比较了在2-8℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与预滋生溶液中的四聚体滋生。
图8比较了在23-27℃下保存的新处理的血红蛋白溶液与预滋生溶液中的四聚体滋生。
图9是纯化的聚合血红蛋白溶液的HPLC谱图。聚合血红蛋白由RT 15.19、16.01、17.16和18.79的峰指示。四聚体由RT 21.22和21.83的峰指示。
图10是纯化之前用甘氨酸处理过的聚合血红蛋白溶液的HPLC谱图。聚合血红蛋白由保留时间(RT)14.62、15.44、16.60和18.24的峰表示。四聚体由RT 20.71的峰表示。聚合物约占该材料的75％。
图11是说明用来制造脱氧血红蛋白溶液以准备进行吡哆醛化和聚合的这部分工艺和设备的示意图。
图12是说明从吡哆醛化和聚合开始，制造脱氧的、纯化的、吡哆醛化的聚合血红蛋白产品的这部分工艺和设备的示意图，以及配制具有生理水平电解质的最终血红蛋白产品的这部分工艺和设备的示意图。
图13是说明本发明采用的柱色谱纯化工艺的示意图。
图14是说明本发明采用的膜滤法纯化工艺的示意图。
具体实施方式
本发明提供了包含基本无四聚体的交联聚合血红蛋白的载氧溶液，它基本不含基质，基质污染物及其它污染物。
在详细说明本发明之前，将定义一些术语。本文使用的专用名词应该理解为仅仅为了描述特定的实施方式，而不起限定作用。本文使用的单数形式“一个”、“一种”、和“该”包括复数的对象，除非上下文另有明确的指示。
“血红蛋白”指来自任何来源的血红蛋白。血红蛋白可以来自包括人类、牛、猪、羊在内的哺乳动物，或来自其它来源，例如生物技术(BIO/TECHNOLOGY)，12：55-59(1994)中说明的转基因产生的血红蛋白，以及重组生成的血红蛋白，例如自然(Nature)，356：258-260(1992)中说明的重组产生的血红蛋白。本文所用的总血红蛋白百分比(THb)定义为每100mL溶液中的血红蛋白克数。
“血红蛋白溶液”是指四聚或聚合的血红蛋白分子的溶液，其中的分子不包含在红血细胞内。该溶液不需要是不含或基本不含红血细胞基质或基质污染物的。然而，在本发明的一方面中，聚合血红蛋白溶液是基本不含红血细胞基质或基质污染物的。
“交联的”是指为了改变分子的形状、尺寸、功能或物理性质而在分子内或分子上，或者分子间以化学方法放置的分子“桥”。交联分子可以是聚合的或非聚合的，即，交联分子可以是四聚的。
“四聚体”或“四聚的”是指分子量约64Kd的血红蛋白分子；即，该术语指天然的和分子内交联的血红蛋白分子。本文所用的四聚体百分比是指四聚体的含量在溶液中占总血红蛋白(THb)的百分含量。例如，含有10％THb和1％四聚体的100mL血红蛋白溶液中，含有0.1g四聚体。
“基本不含四聚体”表示四聚体污染物的纯度水平，在此水平下对哺乳动物所施用的四聚体的某种生物响应不再存在。主要指标是当注入药学有效量时肾功能不发生改变，即，具有约99％或更好的纯度水平(四聚体含量约低于1％)。本发明方法生产的优选产品含有基于总血红蛋白(THb)的重量不超过0.8％的四聚体。换句话说，根据本发明的基本无四聚体的产品，含有不超过生理上可接受量的非聚合的血红蛋白四聚体。本发明特别优选的产品含有低于约0.5％的四聚体；本发明最优选的产品含有约0.3-0.4％的四聚体。已发现这种含量的四聚体在生理上可以接受。
“滋生”或“四聚体滋生”是指由于多聚血红蛋白分解为四聚体，引起溶液中四聚体含量的增加。聚合物的降解可以是化学处理、温度、时间及其相结合的结果。通常，四聚体的滋生通过加热或聚合溶液陈化进行。因此在溶液的保存过程中，四聚体的百分含量增加。通过加热聚合血红蛋白溶液可以加速四聚体的滋生。溶液中任何四聚体含量的增加都称作已发生了滋生。本文所用的聚合血红蛋白的部分降解，是指溶液中某些、但非全部的聚合物降解为四聚体。
“陈化”血红蛋白溶液是指在任何温度下将溶液保存任意时间。较高的温度加速了陈化对血红蛋白溶液的影响。“陈化的”血红蛋白溶液已经保存到滋生了四聚体。
“预滋生”或“四聚体预滋生”是指应用热处理促进四聚体滋生的技术。
“热淬灭”是指涉及在聚合淬灭反应中加热溶液以推动反应完成的加工技术。
“聚合”或“聚合的”是指在分子间或四聚体亚单元之间放置分子桥的过程或结果，其中生成的聚合分子的大小和重量相对于天然或四聚的血红蛋白有所增加。如本领域技术人员所知，聚合可以用各种聚合试剂在生化上合适的载体中实现，该聚合试剂包括戊二醛、亚氨酸酯、或其它试剂。
“吡哆醛化的”或“吡哆醛化”是指通过将血红蛋白分子与吡哆醛-5’-磷酸酯(“P5P”)或2-降-甲酰吡哆醛-5’-磷酸酯反应，将含吡哆醛-5’-磷酸酯的分子结合到血红蛋白分子上的方法或结果。已显示吡哆醛化有利于改变可逆的氧结合能力，即，增加某些哺乳动物血红蛋白，例如人血红蛋白的P50值。
“稳定的”或“稳定”是指抗降解并且保存期限长于非稳定溶液的血红蛋白溶液的状态或特征。例如，与不是根据本发明制备的溶液相比，根据本发明稳定化的血红蛋白溶液在溶液保存过程中滋生的四聚体更少或更低。血红蛋白溶液的稳定性取决于一些独立于四聚体滋生的其它因素，包括例如还原血红蛋白转化为氧合血红蛋白或高铁血红蛋白的速率。这一因素可以通过许多方式控制，其中一种方式是在保存时阻止氧气进入封装的溶液。稳定的血红蛋白溶液仍然可能降解，但是降解速率低于非稳定的溶液。
本发明提供了基本不含四聚的(天然的或分子内交联的)血红蛋白，基质或各种其它污染物的聚合血红蛋白溶液。该溶液在生理上和治疗上均可接受，并且具有临床应用价值。该产品具有氧传输性能所必需的可逆氧结合能力。该产品表明了使用时极好的载氧和去氧特征，这相关于其具有与全血相似的氧-血红蛋白解离曲线(P50)。该产品通过肺部与毛细血管中的氧以高亲和力结合，然后将氧充分释放到体内的组织。该产品也不需要研究与受血者的兼容性。
一方面，当产品注射入人体时其也有至少15小时的半衰期。另一方面，半衰期大于约24小时。血红蛋白产品可以用来补充人类患者的基本所有血量，而不会导致血管收缩、肾中毒、血红蛋白尿或其它与合成或半合成的氧载体及血液替代品的静脉用药有关的问题。
本发明得到的产品的半衰期在例如人类的哺乳动物体内测定。典型地，在哺乳动物注射该产品一段时间之后，将血液样品从哺乳动物中除去。然后通过离心血液样品，压出血浆部分，分光光度测定血浆血红蛋白水平，来测定产品的量，随后将保留在哺乳动物体内产品的量与产品的半衰期相关联。
本发明的方法产生保存期限延长的稳定的聚合血红蛋白溶液。通常，四聚体在聚合血红蛋白溶液陈化时滋生。滋生的四聚体可以通过本发明的方法从陈化的血红蛋白溶液中除去。与新处理(未经陈化)的血红蛋白溶液相比，经过处理而将四聚体去除的陈化的血红蛋白溶液，在进一步保存时表现出更低的四聚体滋生。因此，根据本发明处理的血红蛋白溶液在四聚体滋生方面比新处理的溶液显示更强的稳定性。
通常，已经发现生理上和临床上有用的血红蛋白溶液含有低于1.0％的四聚体。因此，由于在保存时四聚体随时间滋生，为使血红蛋白溶液具有合理的保存期限，希望新处理的血红蛋白溶液中含有低于约0.3％的四聚体，以期望尽管四聚体在溶液中滋生，但是溶液保持在生理上有用直至四聚体达到1.0％。图1显示了在2-8℃下保存的血红蛋白溶液的典型的四聚体滋生量。在起始四聚体水平约为0.5％的溶液中，约18个月后四聚体水平升高到1.0％以上。图2显示了在23-27℃下保存的血红蛋白溶液的典型的四聚体滋生量。在起始四聚体水平约为0.5％的溶液中，约3-4个星期后四聚体水平升高到1.0％以上。因此，血红蛋白溶液的保存温度升高，令四聚体滋生的速率增加。四聚体溶液的陈化可以仅仅通过将血红蛋白溶液长时间放置来实现。较高温度下血红蛋白溶液的陈化比较低温度下要快。
图3比较了新处理的血红蛋白溶液与根据本发明处理(“再处理”)的“陈化”的血红蛋白溶液中的四聚体滋生。二者均保存在2-8℃下。24个月之后，新的血红蛋白溶液中的四聚体增加了约0.8％，而再处理的溶液中四聚体仅仅增加了约0.3％。36个月之后再处理的溶液中四聚体增加了约0.4％。类似地，图4显示了与保存在23-27℃下的再处理溶液相比，新处理溶液中的四聚体滋生得更快。
一方面，本发明的方法涉及令血红蛋白溶液预滋生来提高溶液稳定性，这是通过将溶液加热而加速四聚体的滋生进行的。滋生的四聚体可以从溶液中除去，以得到在四聚体滋生方面比未经加热处理以加速四聚体滋生的聚合溶液更加稳定的溶液。一旦滋生的四聚体从血红蛋白溶液中除去，进一步的四聚体滋生将会放慢或降低。
加热处理可以在溶液纯化之前或之后进行。如果在处理过程中对溶液进行热处理，这样的热处理应该在溶液的聚合之后进行。然后可以将溶液纯化以除去基本所有的四聚体。如果在纯化之后进行热处理，溶液必须进行再纯化以除去滋生的四聚体。
热处理可以通过将聚合血红蛋白溶液在约45-55℃下经历约20-30个小时来实现。由于已经显示四聚体滋生是时间和温度及其它变量的函数，可以预期其它的处理温度和时间也可能满足四聚体的滋生。
本发明的方法提供了进一步的优势，能够使得最终产品基本不含微生物及病毒抗原和病原。该微生物及病毒的抗原和病原降低到检测不到的水平，即，该产品根据《美国药典》(the United StatesPharmacopoeia)XXIII第71章所公布的分析方法测定是无菌的。该抗原和病原的例子包括例如细菌、立克次氏体、真菌、原生动物、病毒和其它有机体。最重要的是，该方法提供了不含导致肝炎和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病毒的生物产品。
对血红蛋白溶液进行热处理可导致病毒的基本失活。病毒失活热处理可以作为热处理中单独的一步，也可以与去除四聚体的热处理结合进行。通常，为生产操作安全起见，优选在将血红蛋白从红血细胞中除去之后进行减少病毒的热处理。然而，人们期望在聚合之后对溶液进行热处理，也可以实现所需的病毒失活。如果取消聚合前减少病毒的热处理步骤，聚合后令四聚体滋生的热处理温度可以升高到约60-62℃，或其它的合适温度以确保病毒的失活。因此，从某些方面说，聚合后的一个热处理步骤，会实现病毒的减少和四聚体的滋生。
当输入达到至少约10.0L的量时，本发明的生物产品不会导致血管收缩、肾中毒、血红蛋白尿和其它牵涉到含有生理上不良量的四聚血红蛋白的已知血红蛋白溶液的静脉用药问题。通过本文所述的方法生产的产品的静脉用药，不会导致尿生成的明显降低、肾小球滤过率的明显降低、向腹膜腔的明显外渗以及生成的尿颜色的明显变化。
因此，本发明的方法提供了治疗以下病症有用的非细胞性红血细胞替代品，该病症包括创伤、心肌梗死、中风、急性贫血和氧缺乏症，例如由针对全氧合血液的肺损伤或衰竭引起的低氧血、缺氧或末期缺氧。该产品在任何需要复苏液(resuscitative fluid)的疾病或医疗状况(如创伤，特别是出血性休克)，血管内容积扩张或交换输血治疗上同样有用。除医学治疗之外，该产品还可用于移植器官的保存。
一方面，本发明方法的起始原料是人全血或封装红血细胞。通常，要求但并非必需采用保存期不超过血液储存袋上指示的有效期2周的源红血细胞。采用过期2周以上的人全血，会为血红蛋白的提取以及例如基质蛋白和污染物的细胞残余物的除去带来额外的困难。另外，本文所述的方法适用于本技术领域内的所有较小修改的血红蛋白。
如果采用人血作为起始原料，在抽取和过滤红细胞时，在血液中不引入空气的情况下将红血细胞(RBC)从献血袋中无菌吸出，然后经过一系列滤膜得到白血球和血小板含量降低的RBC悬浮液。得到的悬浮液接下来进行细胞清洗/溶解。
用约1％的NaCl溶液在一氧化碳气氛下对该悬浮液进行洗涤，以除去残留的血浆蛋白。接下来用注射用水(“WFI”)处理经洗涤的RBC以将细胞溶解，得到的混合物用错流过滤装置净化。其它本领域技术人员已知的可用于溶解红血细胞的方法包括，例如机械或超声法溶解细胞。净化后的产品其后可以经过热处理来使病毒失活，使额外的基质物质沉淀出来并通过过滤除去。该过程得到的产品为THb约3％(w/v)的不含基质的血红蛋白(SFH)溶液。
在净化之后，优选将含有碳氧血红蛋白的溶液浓缩和脱气，以生成含有还原血红蛋白的不含基质的血红蛋白溶液。脱气首先涉及用氧气对碳氧血红蛋白溶液进行大约16个小时的饱和，以生成氧合血红蛋白和占血红蛋白总重量约7wt.％的碳氧血红蛋白的溶液。接下来，用氮气、氩气或氦气将氧气驱除，以生成含有游离血红蛋白(即，非复合血红蛋白)和占血红蛋白总重量约7wt.％的氧合血红蛋白的溶液。将得到的脱气溶液过滤并将其转移到容器中进行化学改性。
脱气之后，应当以吡哆醛-5’-磷酸酯(P5P)相对于血红蛋白约1∶1到3∶1的摩尔比例，用吡哆醛-5’-磷酸酯对含人血红蛋白的无基质的血红蛋白溶液进行吡哆醛化。或者，可以用2-降-2-甲酰吡哆醛-5’-磷酸酯对不含基质的血红蛋白进行吡哆醛化。将还原剂，例如氰基硼氢化钠或优选的硼氢化钠，加入到吡哆醛化混合物中。通过对不含热原的水的渗析，或优选的WFI的透滤，除去过量的试剂和盐。来自人血以外来源的血红蛋白可能无需吡哆醛化。血红蛋白溶液领域的技术人员很容易理解何时需要进行吡哆醛化。
可以采用任何血红蛋白溶液领域的技术人员已知的方法对不含基质的血红蛋白溶液进行聚合。优选地，戊二醛水溶液用作聚合试剂。聚合时间和加入戊二醛的量取决于血红蛋白溶液的体积、聚合物所需的产率和所需的分子量分布。通常，较长的聚合时间增加了聚合物的产率和分子量分布。16-18个小时可以得到基于血红蛋白总重量约75wt.％的聚合物。优选的聚合终止点定义为，经排阻HPLC监测，溶液中含有的聚合物占血红蛋白总重量约75wt.％的点。或者，终止点定义为，溶液中含有的聚合物占血红蛋白总重量约65wt.％的点，即约2.5小时。
聚合之后，应当用合适的试剂对反应进行淬灭。一方面，通过加入甘氨酸水溶液淬灭聚合反应。甘氨酸应当尽可能迅速地加入。然后通过同样尽可能迅速地加入硼氢化钠水溶液，来稳定交联作用。随后对该聚合溶液进行浓缩并接着透滤。最后向溶液中加水直至溶液中含有约4wt.％的血红蛋白。
另一方面，可以通过将溶液加热到40-50℃至少三小时，同时加入甘氨酸，以推动淬灭反应的完成，从而“热淬灭”溶液。图5比较了新处理的血红蛋白溶液与经过三个小时热淬灭处理的血红蛋白溶液中的四聚体滋生。二者均保存在2-8℃下。10个月以后，新的血红蛋白溶液中四聚体增加了0.4-0.5％，而热淬灭溶液中的四聚体仅增加了约0.4％。图6显示了当保存在23-27℃时，新处理的溶液与热淬灭溶液四聚体滋生的差别。溶液经过更长时间的热淬灭，例如达到24小时，预计溶液的稳定性得到提高。也可采用更高的温度，例如高达约65℃。
根据本发明的聚合导致高产率地获得分子量范围窄的聚合物，如图9及以下实施例所示。
另一方面，淬灭后的聚合溶液可以通过热处理进行预滋生，以滋生四聚体。热处理可以延迟直到纯化后的任何时刻，但是溶液需要再次纯化。可以通过在约45℃以上将溶液加热至少约24小时来实现热处理。如果这时需要使病毒失活，溶液可以加热到约60℃以上。可以加入例如抗坏血酸的抗氧化剂来防止加热处理过程中形成高铁血红蛋白。
图7比较了新处理的血红蛋白溶液与根据本发明处理的预滋生的血红蛋白溶液中的四聚体滋生。二者均保存在2-8℃下。15个月以后，新的血红蛋白溶液中四聚体增加了约0.5％，而预滋生的溶液中四聚体仅增加了约0.4％。同样地，图8显示了当保存在23-27℃时，与预滋生的溶液相比新处理的溶液中四聚体滋生得更快。
接下来对聚合的吡哆醛化血红蛋白溶液进行纯化。一方面，利用柱色谱、例如膜滤的过滤、或二者结合从溶液中除去残留的未聚合(四聚的)血红蛋白，来实现在氧气氛下纯化，以对溶液进行氧合。然后利用超滤装置将纯化的聚合血红蛋白溶液浓缩到约6％，以准备气体交换。
接下来用氮气对浓缩的溶液进行脱氧。在约10-12℃下进行脱氧，直至溶液中的氧合血红蛋白含量占总血红蛋白的约16wt.％以下。
接下来将得到的脱氧、纯化、和聚合的血红蛋白溶液，在冷却容器中用超滤法在氮气氛下进行浓缩。调节pH值至约8.8-9.0，而电解质的含量可以调节为正常血浆中的必要水平。另外，可以任选加入传统的抗氧化剂，例如谷胱甘肽、抗坏血酸或葡萄糖。将溶液浓缩到所需的水平后，优选约10wt.％总血红蛋白，将溶液通过过滤灭菌，并通过无菌转移装置将溶液转移至合适的药学可接受的容器中。
如果血红蛋白溶液先前没有经过促进四聚体滋生的热处理，可以将溶液进行热处理并再次纯化除去滋生的四聚体。如果添加了抗氧化剂和化学制剂，可以在热处理和纯化之前通过透滤法将它们除去。
另外，作为热处理的另一种方案，最终血红蛋白溶液的四聚体滋生可以通过将溶液在适当的温度下陈化来完成。随后将溶液再次纯化而除去滋生的四聚体。通常，期望溶液应陈化到四聚体水平超过约1-3％，因为四聚体的水平越高，除去四聚体而纯化溶液之后其稳定性越强。然而，预期本发明的优势在溶液陈化任何时间的情况下均能实现，只要在溶液陈化后将滋生的四聚体除去。
得到的血红蛋白溶液的特性如图9所示，如下：
总血红蛋白(g/dl)        9.5-10.5
高铁血红蛋白(％总Hb)    ＜8.0
碳氧血红蛋白(％总Hb)    ＜5.0
P50(torr)               26-32
重量渗透压浓度(mmol/Kg) 280-360
钠(mmol/L)              135-155
钾(mmol/L)              3.5-4.5
氯(mmol/L)              85-110
游离铁(ppm)             ＜2.0
分子量分布-128Kd峰(％)  9-23
分子量分布-192Kd峰(％)  16-18
分子量分布-256Kd峰(％)  49-74
四聚体(64K)(％)         ≤1.0
内毒素(EU/mL)           ＜0.03
磷脂(ng/Hb)             ＜50
糖脂(ng/Hb)             ＜2
实施例
以下实施例说明了本发明的某些方面。然而，应当理解这些实施例仅仅为了举例说明，而不是要完全限定本发明的条件和范围。除非特别指出，所有温度均用摄氏度表示。此外应当意识到的是，当给出典型的反应条件(例如温度、反应时间)时，尽管通常不太合宜，该特定范围以上和以下的条件也可以采用。
除非指出与此相反，本发明方法中的所有容器和罐均由316-L不锈钢制成，优选经过高度抛光从而易于迅速清洗的药物级不锈钢。各种连接管道均由相同的不锈钢或药物级聚四氟乙烯或硅树脂管制成。该方法采用的滤膜和膜可以购自密理博公司(Millipore Inc.)、Pall-Filtron、或坤诺公司(Cuno Inc.)。
根据本发明的分析尺寸排阻色谱HPLC按照以下程序进行。用0.1M的磷酸钠缓冲液在约pH 6.9下将样品稀释到0.2g/dl，然后用0.2μ滤膜过滤，并注入由下列部件组成的HPLC系统中(按系统流程顺序)：
1.安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1100 Isocratic Pump
-流动相为约pH 6.9的0.1M磷酸钠
-流速为0.5mL/min
2.45cm PEEK或钛金管，0.010in.I.D.
3.安捷伦1100自动取样器
4.18cm PEEK或钛金管，0.010in.I.D.
5.0.5μ预柱过滤玻璃料
6.9cm PEEK或钛金管，0.010in.I.D.
7.Toso TSK G3000SWXL 40×60mm保护柱
8.24cm PEEK或钛金管，0.010in.I.D.
9.Toso TSK G3000SWXL 300×7.8mm分析柱
10.23cm PEEK或钛金管，0.010in.I.D.
11.安捷伦100可变波长监测器
-波长：280nm
-流通池：体积14μL，10mm径长
-范围：2AUFS
-时间常数：10秒
280nm处的吸收峰由Agilent Chemstation记录，对各峰面积进行积分并计算各个聚合物种的总血红蛋白面积。
实施例1
细胞抽取和过滤
参考图11，过期血液(全血或封装红血细胞)的献血袋20位于合适的无菌抽取装置22上。抽取装置上的针刺穿献血袋，引入约150mL1％(w/v)的氯化钠水溶液，在减压或真空下从献血袋中抽取过期血液。抽取的血液经过白血球吸附深层式滤膜24(leukocyte adsorptiondepth filter)，或者另选地经过系列26中的两个5μ深层式滤膜。当血液通过滤膜时，将白血球从血液中除去。典型地，将约225单位的过期全血抽取、过滤、然后转移到罐1中，如图11所示。随后用约75升1％(w/v)的氯化钠水溶液冲洗滤膜。
实施例2
细胞洗涤和溶解
在将血液引入罐1中之前，向罐1中注入约40-50L 1％的氯化钠水溶液。在将225单位的过期全血全部提取、过滤和转移，并且将滤膜冲洗之后，罐中含有约365-395升4％的总血红蛋白溶液。在抽取和过滤步骤中，罐1保持减压，即，20-28英寸汞柱的真空度。一旦所有的过期血转移到罐1，关闭真空，向罐中引入一氧化碳使得罐中包含一氧化碳气氛。
罐1与0.65μ切向流动性滤膜28相连接，如图11所示。开始时充入的365-395升4％的总血红蛋白溶液，通过切向流动性滤膜微量过滤浓缩为215-225升7％的总血红蛋白溶液。此刻血红蛋白溶液的pH值约为6到6.5。浓缩为7％总血红蛋白之后，通过加入1％(w/v)的氯化钠溶液，以与加入氯化钠溶液相同的速率渗滤和除去滤液来洗涤溶液。215-225L血红蛋白溶液一般用8体积1％的氯化钠溶液(约1,800L)洗涤。洗涤之后，溶液浓缩到约90-95L，即，约16％的总血红蛋白，加入注射用水(“WFI”)使溶液的体积增加到约220L。随着WFI的加入，细胞膨胀并破裂将血红蛋白释放到溶液中。得到的血红蛋白溶液的浓度约为7％总血红蛋白(THb)。
所得的溶液在罐1中时澄清。首先将溶液浓缩到约90L，并将滤液转移到罐2中。当溶液被抽过滤膜时，红血细胞、基质污染物和细胞壁材料残留于滤膜并除去。罐1中剩余的90L溶液用约280L的WFI洗涤(渗滤)，将清洗液加到罐2中。然后将罐1中剩余的物质浓缩到约20L，将滤液加到罐2中。罐2中得到约405-415 L 3.3％的总血红蛋白溶液。
实施例3
任选的用于病毒减量和基质沉淀的热处理
然后，在约60-62℃的温度下，将罐2中得到的不含基质的血红蛋白溶液加热处理约10小时。在此期间适度搅拌溶液。加热溶液并使温度经过约55℃时，产生沉淀。
实施例4
净化及病毒减量
随后，所得3.3％THb无基质、经热处理的血红蛋白溶液，经过0.2μ预过滤器30及随后的0.1μ预过滤器32过滤，接下来经过100kD病毒减量超滤器(未显示)吸入罐3。
实施例5
超滤/浓缩
将过滤后的血红蛋白溶液浓缩到85-105 L(约14％THb)，随后用约4体积的WFI(350L)洗涤和渗滤。浓缩和渗滤采用10kD分子量的超滤器34来完成。排液管35与超滤器34相连并收集滤液。此时，每毫升pH约为6至6.5的14％总血红蛋白溶液含有每克血红蛋白少于约50ng的磷脂，每克血红蛋白少于约2ng的糖酯，少于约1％的高铁血红蛋白，少于约0.03单位的内毒素。溶液中的血红蛋白为碳氧血红蛋白。
实施例6
脱气
随后将得到的碳氧血红蛋白溶液转移到175L的容器(罐4)中，碳氧血红蛋白在这里首先进行氧化，然后脱氧。罐4上装有连接氧气和氮气管线的气体喷射环，从罐底到位于罐4顶部计量喷射装置的进料器，以及连接泡沫罐36的泡沫溢出收集器，它使得罐4中产生的泡沫进入到泡沫罐36中，泡沫在这里凝结为液体并流回罐4。作为泡沫罐36的备选方案，罐4可以装有机械去沫器。罐4进一步包括安装在中央的气体分散搅拌器(gas dispersion agitator)。泡沫罐36包括用于移除气体的排气口。罐4中的溶液为13％的总血红蛋白溶液。
第一步氧化步骤中，氧气以足以令气体在容器中均匀分散的速率喷射入溶液中。容器中的气体喷射速率约为66L/min。碳氧血红蛋白的氧化进行约18小时，使得得到的溶液中含有的碳氧血红蛋白的含量低于血红蛋白总重量的5％。氧化在约10℃的温度下进行。罐4中产生的泡沫收集在泡沫罐36中，澄清后得到的溶液转移回罐4。
氧化之后，用相似的氮气流对溶液喷射大约3-3.5小时，或者直至溶液中剩余的氧合血红蛋白的含量低于血红蛋白总重量的10％。氮气喷射在约10℃的温度下进行，pH值约为6.95-7.10。另外可选地，可以用膜交换器将碳氧血红蛋白转化为还原血红蛋白。特别指出的是，在此基本没有一般预计会在起沫步骤中发生的血红蛋白变性。
实施例7
化学改性
参考图12，将还原血红蛋白溶液转移到罐5中进行化学改性。在含有还原血红蛋白的大约4℃溶液的罐5中，以吡哆醛-5’-磷酸酯(P5P)相对于血红蛋白为1∶1到3∶1的摩尔比例加入P5P的水溶液(93.75g/L)。优选P5P相对于血红蛋白的摩尔比例为2∶1。吡哆醛化在约4℃的温度下进行。P5P溶液一般经过约1分钟加入，并搅拌约15分钟，之后以硼氢化钠相对于血红蛋白约20∶1的摩尔比例，将硼氢化钠/氢氧化钠溶液加入血红蛋白溶液中。合适的硼氢化钠/氢氧化钠水溶液含有每2升0.8g的氢氧化钠和每2升90.8g的硼氢化钠。硼氢化物溶液在约1分钟的时间内，尽可能快地加入，并随后搅拌一小时。
实施例8
反应物的去除
接下来将得到的150L吡哆醛化的血红蛋白溶液用4体积(600L)的WFI，在10kD超滤器38上透滤，以除去过量的反应物。连接在超滤器38上的排液管40收集过滤器38的滤液。
实施例9
聚合
向盛有吡哆醛化血红蛋白的罐5中加入足量的WFI以制备4.5％的总血红蛋白溶液(约265L血红蛋白溶液)。以戊二醛相对于血红蛋白大约24∶1的摩尔比例，将戊二醛溶液加入吡哆醛化血红蛋白溶液中。戊二醛溶液一般通过计量泵经过约2.5小时加入血红蛋白溶液中。聚合反应进行约18个小时。目标分子量分布为大约75％的聚合物和25％的四聚体。目标聚合物的分子量为低于约600,000，主要部分的分子量在100,000-350,000范围内。
当聚合反应达到目标分子量分布时(约18小时后)，以甘氨酸相比于血红蛋白140∶1的摩尔比例，将水相甘氨酸(约166g/L)加入(作为淬灭剂)血红蛋白溶液中。这时，可以将溶液在40-50℃下加热至少三个小时，以推动淬灭反应的完成(“热淬灭”)。
图10是所得甘氨酸淬灭的聚合血红蛋白产品的HPLC谱图。得到的溶液随后搅拌大约10分钟，之后以硼氢化钠相对于血红蛋白为28∶1的摩尔比例，将硼氢化钠/氢氧化钠溶液(浓度同以上相同)加入血红蛋白溶液中。将该所得混合物搅拌大约1小时。然后将溶液浓缩到大约150L(超滤器38)，并用4体积(600L)的WFI洗涤。向浓缩的溶液中加入另一等份摩尔比例与上文相同的硼氢化钠溶液，并再次搅拌1小时。得到的溶液用4体积(600L)的WFI洗涤。
实施例10
任选的四聚体滋生热处理
此时，可以对溶液进行热处理而使四聚体滋生。可以将溶液在45-55℃下加热约20-30小时。如果希望在这一步中令病毒减少，温度可以升高到60℃以上。为了加热溶液，令约80℃的例如丙二醇溶液的加热介质，在罐套筒中循环流动，同时剧烈搅拌Hb溶液。加热后，将血红蛋白溶液冷却到大约2-8℃。
实施例11
纯化
通过使所得溶液置于氧气氛对其进行氧化，随后将溶液转移到纯化系统42中。可以通过柱色谱、过滤、优选膜滤(渗滤)、或者过滤与柱色谱的结合来实现纯化。
在一个实施方式中，将溶液转移到色谱进料容器罐6中，如图13所示。在该实施方式中，在罐6中将得到的氧合血红蛋白溶液稀释到大约200L(4％总血红蛋白)，用氯化钠溶液将氯的浓度调节为22mM。不需要调节钠的浓度。
接下来用柱44对五份40L的所得血红蛋白溶液进行色谱分离。柱44含有亲和凝胶，其为黄色染料(Mimetic Yellow No.1，可购自AffinityChromatography，Ltd.)改性的琼脂糖凝胶，它与聚合物的亲和力大于四聚体。
色谱分离如下实现。将40L氧化的、聚合的、吡哆醛化的、无基质的血红蛋白溶液装入柱44。用15个柱体积(约750L)的30mM水相NaCl缓冲液冲洗柱子以除去四聚体。接下来用大约250L 300mM的氯化钠缓冲液冲洗柱子将聚合物洗脱。聚合物部分收集在罐7中。不需要的部分送到排液管46中。在将每一份洗脱之后，用15mM HCl溶液(150L)对柱子进行再生，用30mM NaCl水溶液(250L)重新达到平衡，然后将另一份进料溶液(40L)装柱。再次用30mM NaCl及随后的300mM NaCl冲洗柱子。将40L的各份血红蛋白溶液装柱并进行色谱分离直至罐6为空。
用连有排液管50的过滤器48将罐7中收集的部分超滤(浓缩)到体积约为40L(6％总血红蛋白)。然后将浓缩的血红蛋白溶液转移到气体交换罐8中进行脱氧。
另外可选地，将溶液转移到滤液回收容器10中，如图14所示。然后在罐10中将血红蛋白稀释到大约4％THb。随后用10mM NaCl和可购自密理博公司的300,000分子量滤膜52，对该4％THb的溶液进行渗滤。将过滤持续到大约97％的血红蛋白物质透过滤膜进入罐11。(大约3％的物质，即，高分子量聚合物保留在罐10中)。血红蛋白的含量采用联合血氧计(cooximeter)光谱光度测定。
罐11中得到的物质是大约4-8％THb，并含有大约占THb的7-10％的四聚体。接下来用10mM NaCl和连有导排液管或存水器56的100,000分子量滤膜54对该4-8％Thb进行渗滤，该滤膜可购自Pall-Filtron。渗滤继续进行到四聚体的水平低于血红蛋白质量的1.0％，四聚体的水平由采用Toso BioSep 300×7.8mm柱子的尺寸排阻色谱测定。所得纯化的血红蛋白溶液最初保留在罐11中，随后转移到气体交换罐8中进行脱氧。
实施例12
脱氧
气体交换罐8可以是与罐4相同的罐，或者优选是不同的罐。气体交换罐8的装备方式与气体交换罐4基本相同，与泡沫罐58连接，或者以与罐4同样的方式装备机械去沫器。脱氧在大约10℃，在氮气喷射下约2.5小时内完成，溶液的pH值约为8.8。氮气喷射继续进行直到保留在溶液中的氧合血红蛋白占总血红蛋白的重量低于约16％。接下来将得到的氧合血红蛋白溶液转移到罐9中进行制剂。
如果将实施例10的热处理步骤推迟，可以在这一阶段进行。如果此时进行热处理的话，应当重复实施例11的纯化过程以及本实施例的脱氧过程。实施例10的加热处理步骤和此时的加热处理步骤是任选的，可以完全省略。
实施例13
制剂
在制剂罐9中，首先将溶液浓缩到大约7％的总血红蛋白，然后在4℃下将pH值调节到大约8.8到9.0。pH值用0.2M NaOH调节。加入葡萄糖和甘氨酸，分别达到约1g/L和3.5g/L的最终浓度。向溶液中加入氯化钾，得到的钾浓度约为3.5到4.5mM。然后加入3M氯化钠，得到85-110mM的氯浓度。接下来加入乳酸钠，得到135-155mM的钠浓度。最后，加入0.45摩尔抗坏血酸溶液直至抗坏血酸的浓度达到约1000mg/L。用0.22M NaOH在10-15℃下将pH值调节为8.7-9.1。生成的血红蛋白溶液的最终重量渗透压浓度为大约每千克280-360毫摩尔。
接下来用与存水器62相连的滤膜60，将制剂后的血红蛋白溶液浓缩到约10％的总血红蛋白。随后将10％血红蛋白溶液通过滤膜64过滤进行灭菌，并且无菌注入预消毒袋中。
实施例14
溶液预滋生
无论加工过程中溶液是否经过热淬灭或任选的热处理步骤来滋生四聚体，均可以在制剂后的任何时刻将溶液加热以滋生四聚体，这是将溶液加热至约45-55℃约20-30小时，或者直至四聚体升到大约1-3％以上。热处理之后应当将溶液如实施例11纯化，并且如实施例13脱气。由于这时溶液已经进行了配制，优选在纯化之前用渗滤法除去实施例12中引入的添加剂，然后在再制剂过程中重新引入。
实施例15
陈化血红蛋白溶液的再处理
过期或陈化的血红蛋白溶液可以如实施例14进行再处理，无需加热处理。一般地，在大约2-8℃保存条件下保存了约12-18个月以上的血红蛋白溶液，其四聚体水平大于约1.0％。该原料可以引入罐5中，并根据实施例11-13进行纯化和再制剂。由于这时溶液已经进行了配制，优选在纯化之前用渗滤法除去实施例13中引入的添加剂，然后在再制剂过程中重新引入。
上文中，仅仅为了说明，提供了本发明优选实施方式的详细描述，而不是为了限制。对于本领域技术人员显而易见的，所有其它基于本公开内容的修改、分支和等价物，均应当理解为是在本发明要求保护的范围之内。

Claims (30)

1.一种制造四聚体浓度低于总血红蛋白的1.0％的血红蛋白溶液的方法，包括：
(a)将溶液中的血红蛋白聚合；
(b)对溶液中聚合的血红蛋白进行热处理；
(c)将溶液中的四聚体从聚合血红蛋白中除去。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述血红蛋白来自哺乳动物血液。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物血液为人血，并且所述血红蛋白经过吡哆醛化。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述血红蛋白来自牛血。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述血红蛋白用戊二醛聚合。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述四聚体通过过滤除去。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述热处理包括将溶液加热至45℃以上至少24小时。
8.如权利要求1所述的方法，其中溶液中四聚体的浓度在步骤(c)完成后低于总血红蛋白的0.3％。
9.如权利要求1所述的方法，除(c)步骤外，进一步包括在热处理之前将四聚体从溶液中除去。
10.如权利要求9所述的方法，其中在热处理之前将四聚体从溶液中除去，直至溶液中四聚体浓度低于总血红蛋白的1.0％。
11.如权利要求10所述的方法，其中热处理之前溶液中四聚体的浓度低于总血红蛋白的0.3％。
12.一种血红蛋白溶液，所述血红蛋白溶液通过权利要求1所述的方法制造。
13.一种使聚合血红蛋白溶液稳定化的方法，所述聚合血红蛋白溶液中四聚体浓度低于总血红蛋白的1.0％，包括对聚合血红蛋白溶液进行处理，从而将聚合血红蛋白部分降解为四聚体，以及将四聚体从溶液中除去。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述处理包括将溶液陈化。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述处理包括将溶液陈化直至溶液中四聚体的浓度高于总血红蛋白的1.0％。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述处理包括将溶液加热。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述处理包括将溶液加热直至溶液中四聚体的浓度高于总血红蛋白的1.0％。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述血红蛋白来自哺乳动物血液。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述哺乳动物血液为人血，并且所述血红蛋白经过吡哆醛化。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述血红蛋白来自牛血。
21.如权利要求13所述的方法，其中所述血红蛋白用戊二醛聚合。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述四聚体通过过滤除去。
23.如权利要求16所述的方法，其中所述加热包括将溶液加热至45℃以上至少24小时。
24.一种制造稳定的聚合血红蛋白溶液的方法，包括：
(a)制备聚合血红蛋白溶液；
(b)将四聚体从聚合血红蛋白中除去，以制成四聚体浓度低于总血红蛋白的1.0％的聚合血红蛋白溶液；
(c)将聚合血红蛋白溶液陈化；和
(d)除去滋生的四聚体。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述陈化包括将血红蛋白溶液储存到四聚体的浓度高于总血红蛋白的1.0％。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述陈化包括将血红蛋白溶液储存到四聚体的浓度高于总血红蛋白的3.0％。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述陈化包括将血红蛋白溶液储存一年以上。
28.一种制造四聚体浓度低于总血红蛋白的1.0％的血红蛋白溶液的方法，包括：
(a)使溶液中的血红蛋白经受包含聚合试剂的聚合反应；
(b)用淬灭剂淬灭聚合反应；
(c)在淬灭中将溶液加热；
(d)将溶液中的四聚体从聚合血红蛋白中除去。
29.如权利要求28所述的方法，其中在所述淬灭过程中将所述溶液在至少40℃下加热至少3小时。
30.如权利要求29所述的方法，其中将所述溶液加热到40-50℃。
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