PL167340B1 - Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny PL - Google Patents
Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny PLInfo
- Publication number
- PL167340B1 PL167340B1 PL91299380A PL29938091A PL167340B1 PL 167340 B1 PL167340 B1 PL 167340B1 PL 91299380 A PL91299380 A PL 91299380A PL 29938091 A PL29938091 A PL 29938091A PL 167340 B1 PL167340 B1 PL 167340B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hemoglobin
- cross
- linked
- linking
- column
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 266
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 266
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 40
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 29
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 29
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 16
- -1 imide ester Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 46
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 29
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 9
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 8
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 5
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVNWZKBFMFUVNX-UHFFFAOYSA-N Adipamide Chemical compound NC(=O)CCCCC(N)=O GVNWZKBFMFUVNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 108010016797 Sickle Hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000019300 CLIPPERS Diseases 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 108010081925 Hemoglobin Subunits Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940124574 antisickling agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003939 antisickling agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 208000021930 chronic lymphocytic inflammation with pontine perivascular enhancement responsive to steroids Diseases 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940021317 other blood product in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229940056345 tums Drugs 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny nadajacej sie do transportu tlenu, przez sieciowanie imidoestrem, znamienny tym, ze oczyszczony lizat hemoglobiny sieciuje sie za pomoca adypimidanu dimetylu lub suberimidanu dimetylu przy pH przynajmniej 8,0, w roztworze do polimeryzacji zawierajacym bufor Tris-HCl, po czym hemoglobine o niskiej masie czasteczkowej usuwa sie przez ekskluzje ze wzgledu na wielkosc czasteczek, uzyskujac usieciowana hemoglobine, której co najmniej 80% ma mase czasteczkowa co najmniej 64 000 i P50 przynajmniej 13. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny, która nadaje się do stosowania jako środek zastępujący krew do transfuzji u ludzi i zwierząt lub jako płyn transportujący tlen. Wytworzony produkt, usieciowana hemoglobina, jest w sposób istotny wolny od zanieczyszczeń, zawiera bardzo niski poziom bakteryjnych andotoksyn i fosfolipidów.
Strukturę i funkcję hemoglobiny przedstawiono w pracy przeglądowej H.F. Bunn i B.G. Forget, Hemoglobin : Μοίβουί,,, Genetic and Clinicy 1 Aspedy, IB. Saunders Coi^my, Filadelfu, sty. 690 (1986). Hemoglobina ssaków jest tetramerem, zawierającym po dwie podjednostki z dwóch różnych typów, alfa i beta. Każda z podjednostek ma masę cząsteczkową około 16 000 i zawiera grupę hemową z centralnym atomem żelaza.
Funkcją części białkowej, czyli globinowej, jest utrzymywanie żelaza hemowego w stanie zredukowanym lub na niższym stopniu utlenienia (żelazawym), co pozwala cząsteczce hemoglobiny na odwracalne wiązanie tlenu.
Hemoglobiny ssaków nie powinno się uważać za statyczny tetramer, to znaczy za pojedynczy rodzaj białka o masie cząsteczkowej 64 - 68 000. Składa się ona bowiem z podjednostek połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi i istnieje w dynamicznym stanie równowagi, obejmującym interakcje monomdr-diyer i dimer-tetramer. W każdym momencie hemoglobina składa się z pewnych ilości monomerów o masie cząsteczkowej około 16 000, dimerów o masie cząsteczkowej 32 000 i tetramerów. Rozkład monomerów, dimerów i tetramerów w roztworze zależy zarówno od stężenia hemoglobiny, stanu ligandu hemoglobiny, jak i pH i składu soli w roztworze, w którym się znajduje.
Hemoglobina ssaków znajduje się w czerwonych komórkach krwi, czyli erytrocytach. U ssaków te wyspecjalizowane komórki tracą swoje jądra podczas dojrzewania i stają się po prostu woreczkami z hemoglobiną, zawierającymi bardzo niskie stężenia innych białek. Hemoglobina
167 340 znajduje się w krążących erytrocytach z kilku powodów. Przede wszystkim, gdyby hemoglobina nie znajdowała się w komórkach, lecz zamiast tego krążyła w stanie wolnym w roztworze, byłaby łatwo usuwana z obiegu podczas przechodzenia przez ściany naczyń kapilarnych, nerki i inne miejsca. Pewne organizmy bezkręgowe rozwiązały ten problem przez wykształcenie hemoglobin o strukturze polimerycznej o masie cząsteczkowej rzędu milionów, które są za duże, aby przechodzić przez naczynia kapilarne i kanaliki nerkowe. Innymi funkcjami spełnianymi przez czerwone ciałka są: dostarczenie środowiska chroniącego cząsteczkę hemoglobiny przed proteolitycznymi białkami surowicy, utrzymanie równowagi jonowej odpowiedniej do pełnienia swoich funkcji przez hemoglobinę, dostarczenie układu enzymów, które utrzymują żelazo hemowe w stanie zredukowanym (funkcjonalnym) i kontrola obecności allosferycznych cząstek o działaniu regulatorowym .
Podejmowano liczne próby wytworzenia oczyszczonych roztworów hemoglobiny wolnych od zrębu w celu użycia ich do transfuzji jako środka zastępującego krew (R.B. Pennel, i W.E. Smith, Preparation od stabilized solutions of hemoglobin, 4: 380-385, (1949); S.F. Rabiner, J.R. Helbert, H. Lopas i L.H. Friedman, Evaluation of a strom-free hemoglobin solution for use as a plasma expander, J.Exp.Med., 126: 1127-1142 (1967); S.M. Christensen, F. Medina, R.W. Winslow, S.M. Snell,
A. Zegna i M.A. Marini, Preparation of human hemoglobin Ao for possible use as a blood substitute. J. Biochem. Biophys. Meth., 17: 143-154 (1988); i M. Feola, H. Gonzales, P.C. Canizaro,
D. Bingham i P. Periman , Development of bivine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surg. Gyn. Chet 157: 399-408 (1983)). Roztwory te zawierają hemoglobinę w niezmodyfikowanej postaci i hemoglobina ta może swobodnie rozpadać się na podjednostki. Infuzja niezmodyfikowanej hemoglobiny doprowadza do szybkiego wyłączenia hemoglobiny z obiegu. Dodatkowo infuzja niezmodyfikowanej hemoglobiny doprowadza do szkodliwych efektów w organiźmie biorcy z powodu toksyczności dla nerek. Toksyczność dla nerek, związana z niezmodyfikowaną hemoglobiną doprowadziła do decyzji Center for Biologics Evaluation and Research of the U.S. Food nad Drug Admiaistratioa, według której niezmodyfikowana hemoglobina nie powinna być obecna w nośnikach tlenu opartych na hemoglobinie.
W licznych doniesieniach opisywano stabilizację roztworów hemoglobiny przez tworzenie kowalencyjnych chemicznych wiązań sieciujących między łańcuchami polipeptydowymi hemoglobiny (C.W. Rausch i M. Feola, Extra pure semi-synthetic blood substitute, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/US87/02967, międzynarodowa publikacja nr WO/8803408 19 maja 1988;
K. Bonhard i N. Kothe Cross-linked hemoglobin of extended shelf life an high oxygen transport capacity and process for preparing same; opis patentowy USA nr 4 777 244; E. Bucci, A. Razynska,
B. Urbaitis i C, Fronticellń, Pseudo cross-link of human hemoglobin with rnono-(3,5-dibromosalicyl)fumarate, J.Biol.Chem. 264: 6191-6195 (1989) i opis patentowy USA nr 4 001 200).
Kompozycje usieciowanej hemoglobiny opisano w opisach patentowych USA nr nr 4 001 200;
011 401; 4 053 590 i 4 061 736. Udoskonalone formy usieciowanej hemoglobiny do dalszego oczyszczania opisano również w opisie patentowym USA nr 4 857 636.
Przygotowanie i usieciowanie hemoglobiny wołowej opisano również w publikacji M. Feola, H. Gonzales, P.C. Canizaro, D. Bingham i P. Periman, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute Surg.Gyn. Obst. 157; 399-408 (1983) i międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/US87/02967, międzynarodowa publikacja nr WO/88/03408 19 maja, 1988.
Reakcje adypimidanu dimetylu z normalną ludzką hemoglobiną i hemoglobiną z sierpowatych krwinek (HbS) opisano w publikacji C.F. Plese. i- E.L. Amma, Circular dichroism as a probe of the allosteric R-T transformation in hemoglobins and modified hemoglobina (1977). W opisie patentowym USA nr 3 925 344 (1975) opisane jest użycie usieciowanej za pomocą imidoestrów hemoglobiny do przygotowywania białek osocza lub ekspandera osocza, jednakże materiał ten nie jest odpowiedni jako płyn przenoszący tlen. Jak donoszą R. Pennathur-Das, R.H. Heath, W.C. Mentzer i B.H. Lubin Modification of hemoglobin S with dimethyl adipimidate. Contribution of individual reacted subunits to changes in properties. Biochim. Biophys. Acta 704; 389-397 (1982), sieciowanie za pomocą imidoestrów (DMA) zwiększa powinowactwo hemoglobiny do tlenu, co czyni ją nieodpowiednią do transportu tlenu i jego uwalniania. R. Pennathur-Das, L.E. Vickery, W. Mentzer i B.H. Lubin, Modification of hemoglobin A with dimethyl adipimidate. Contribution of individual reacted subunits to changes in oxygen affinity; Biochim, 8iophys. Acta, 580: 356-365 (1979).
167 340
Zatem pożądane jest znalezienie metody usieciowania hemoglobiny, dzięki któremu hemoglobina będzie stabilna i w przeważającej ilości będzie występować w formie tetrameru lub wielokrotnego tetrameru, lecz ciągle będzie miała p50 lub powinowactwo do tlenu, na tyle niskie, aby zapewniało wydajny transport tlenu, a następnie uwolnienie go do komórek żywego organizmu. Również ważne jest, żeby masa cząsteczkowa wynosiła w przeważającym stopniu przynajmniej 64 000, co świadczy o tym, że cząsteczka ta jest formą tetrameryczną hemoglobiny i zawiera niewiele lub nie zawiera w ogóle formy poniżej 64 000, tj. formy dimeru lub monomeru i niewiele lub w ogóle formy o masie powyżej 64 000, które mogą być cząstkami wystarczająco dużymi do spowodowania aktywacji dopełniacza w organizmach ssaków. Udoskonalenie takiej metody polimeryzacji jest zatem bardzo pożądane w celu znalezienia środka zastępczego transportującego tlen. Stabilna usieciowana hemoglobina wytworzona sposobem według wynalazku zdolna jest do transportu i uwalniania tlenu w żywych komórkach. Hemoglobina ta jest zasadniczo wolna od zanieczyszczeń i jest usieciowana imidoestrem takim jak adypimidian dimetylu lub suberimidan dimetylu co sprawia, że występuje ona w przeważającej części w postaci tetrameru lub w większych formach. Przez określenie hemoglobina w przeważającej formie tetrameru lub w większej formie należy rozumieć taką hemoglobinę, w której przynajmniej 80% usieciowanej hemoglobiny ma masę cząsteczkową przynajmniej 64 000, a korzystniej przynajmniej 90 do 95% usieciowanej hemoglobiny ma masę cząsteczkową przynajmniej 64 000. Ponadto, usieciowana imidoestrem hemoglobina jest bardzo odporna na tworzenie methemoglobiny w porównaniu z hemoglobiną' sieciowaną konwencjonalnymi środkami i posiada powinowactwo do tlenu P50, przynajmniej 13 mm Hg.
Usieciowana hemoglobina może być zmieszana z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem dla udogodnienia transfuzji lub wstrzykiwania przy podawaniu ssakom lub w celu użycia jej jako płynu transportującego krew w celach analitycznych, transplantacyjnych lub laboratoryjnych. Typowym dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem może być oczyszczona woda lub roztwór soli fizjologicznej.
Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny według wynalazku obejmuje a) pobranie krwi ssaka, b) wydzielenie czerwonych krwinek z pobranej krwi i przemycie czerwonych ciałek krwi, c) liza przemytych czerwonych krwinek, d) odwirowanie zlizowanych komórek krwi w celu otrzymania lizatu hemoglobiny, e) oczyszczenie lizatu za pomocą chromatografii aniono- lub kationowymiennej, f) przeprowadzenie ultrafiltracji lub mikrofiltracji wyeluowanego lizatu otrzymanego z chromatografii, dzięki czemu otrzymuje się oczyszczoną hemoglobinę i g) usieciowanie oczyszczonej hemoglobiny imidoestrem z wytworzeniem hemoglobiny, występującej przeważnie w formie tetrameru.
Lizę czerwonych krwinek można przeprowadzić stosując szok hipoosmotyczny. Typowo ultrafiltrację przeprowadza się stosując błonę dla masy cząsteczkowej 300 000, a mikrofiltrację przeprowadza się na filtrach o rozmiarach porów od około 0,025 do około 0,040 pm. Alternatywnie, sieciowaniu za pomocą imidoestru w etapie (g) można poddać lizat hemoglobiny otrzymany w etapie (d) i wówczas (e) zaczyna się od oczyszczenia usieciowanej hemoglobiny. Metoda może obejmować również dodatkowy etap (h), w którym oczyszczoną, usieciowaną hemoglobinę poddaje się ekskluzji w celu usunięcia niskocząsteczkowej hemoglobiny poniżej 64 000. Typowo ekskluzję przeprowadza się za pomocą niskociśnieniowej chromatografii ekskluzyjnej (ang. size exclusion chromatography).
Hemoglobina usieciowana za pomocą imidoestru sposobem według wynalazku zasadniczo jest wolna od jakichkolwiek zanieczyszczeń i występuje w przeważającej ilości w formie tetramerów lub większych form, wykazuje podwyższoną odporność na utlenianie w porównaniu do bardziej tradycyjnych form usieciowanej hemoglobiny jak hemoglobina usieciowana aldehydem glutarowym. Hemoglobina ma głównie masę cząsteczkową przynajmniej 64 000 i podwyższoną stabilność usieciowania. Hemoglobina jest odpowiednia do użycia dla ssaków jako środek zastępczy transportujący tlen we krwi lub ogólnie jako płyn transportujący tlen.
Niniejszy wynalazek opisuje metodę oczyszczania i usieciowania hemoglobiny za pomocą pewnych imidoestrów, które nie były używane do sieciowania hemoglobiny przeznaczonej do transfuzji. Te dwufunkcyjne sieciujące imidoestry obejmują adypimidan dimetylu i suberimidan dimetylu. Istnieją korzyści związane z użyciem tych czynników sieciujących zamiast czynników sieciujących hemoglobinę, których używano w przeszłości. Opracowano szczegółowe warunki reakcji, które zapewniają wąski rozkład masy cząsteczkowej i odpowiedni transport tlenu.
167 340
Imidoestry takie jak adypimidan dimetylu i suberimidan dimetylu są dwufunkcyjnymi czynnikami sieciującymi, reagującymi specyficznie i szybko z białkami w łagodnych warunkach. Stabilne, amidynowe addukty tworzą się między grupami aminowymi-epsilon reszt lizynowych i grupami aminowymi na aminowym końcu łańuchów polipeptydowych (F. Wold, (1972) Bifunctional reagents, Methods in Enz. 25: 623-651; K. Peters i F.M. Richards (1977) Chemical cross-linking; reagents and problems in studies of membrane structure, Ann. Rev. Biochem. 46: 523-551. Odczynniki sieciujące reagują na ogół z jedną do dwóch grup aminowych na podjednostkę hemoglobiny. Niektóre wiązania sieciujące występują pomiędzy dwoma łańcuchami beta reszt lizynowych (beta-82), które stabilizują tetrameryczną formę ludzkiej hemoglobiny. Badano adypimidan dimetylu jako czynnik przeciwko sierpowatości hemoglobiny S, (B.H. Lubin, V. Pena, W.C. Mentzer,
E. Bymun, T.B. Bradley i L. Packer (1975) Dimethyl adipimidate: a new antisickling agent, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A, 72: 43-456). Modyfikacje lizyn beta-82 zmieniają konformację odtlenionej formy HbS i również zapobiegają jej krystalizacji lub żelowaniu. Krystalizacja jest molekularną podstawą zjawiska sierpowatości obserwowaną w chorych czerwonych krwinkach. Chociaż modyfikacja lizyny beta-82 przy pomocy czynnika sieciującego jest wymagana do zabezpieczenia przed sierpowatością, to faktyczne usieciowanie dwóch lizyn beta-82 w tetramerze hemoglobiny nie jest wymagane. W sposobie według wynalazku stosuje się adypimidan dimetylu do hemoglobiny wołowej w celu utworzenia zarówno stabilizowanych tetramerów dzięki wprowadzeniu międzypodjednostkowych wiązań sieciujących między lizynami beta-82 jak i agregatów stabilizowanych tetramerów o dużej masie cząsteczkowej, dzięki wprowadzeniu międzycząsteczkowych wiązań sieciujących między grupami aminowymi epsilon w oddzielnych, stabilizowanych tetrametrach hemoglobiny.
Zalety hemoglobiny usieciowanej za pomocą imidoestrów, a korzystnie adypimidanu dimetylu, są dwojakiego rodzaju. Po pierwsze, usieciowanie będzie opóźniało dysocjację tetramerycznej hemoglobiny o masie cząsteczkowej 64 000 na dimery o masie 32 000. W niezmodyfikowanej hemoglobinie formy tetramerów i dimerów istnieją w dynamicznej równowadze. Stabilizacja hemoglobiny tetramerycznej przez usieciowanie za pomocą imidoestrów będzie w sposób zasadniczy zmniejszała przechodzenie hemoglobiny do kanalików nerkowych przez zapobieganie przesączaniu przez błony torebek kłębka nerkowego.
Po drugie, usieciowanie będzie powodowało tworzenie się oligomerów o dużej masie cząsteczkowej z tetramerów hemoglobin, które byłyby wyjątkowo odporne na filtrację nerkową i bardziej odporne na utlenienie w temperaturach fizjologicznych niż zarówno niezmodyfikowana hemoglobina, jak i hemoglobina zmodyfikowana za pomocą aldehydu glutarowego jako czynnika sieciującego.
Adypimidan dimetylu jest stosunkowo tanim odczynnikiem i jest osiągalny w ilościach handlowych. Proces sieciowania z użyciem adypimidanu dimetylu nadaje się do stosowania w dużej skali.
Zmierzono właściwości wiązania tlenu przez różne formy hemoglobiny wołowej i pokazano je w tabeli 1. P50 jest parcjalnym ciśnieniem tlenu, przy którym 50% dostępnych miejsc związało tlen. Współczynnik Hilla lub wartość n wyraża współdziałanie między miejscami wiążącymi tlen, przy czym wysokie wartości n oznaczają duże współdziałanie. Wartości P50 mierzono zarówno podczas natlenowania jak i odtleniania w roztworze hemoglobiny, średnie wartości P50 są następujące: 13,5 mm Hg dla hemoglobiny usieciowanej adypimidanem dimetylu, 14,25 mm Hg dla hemoglobiny usieciowanej aldehydem glutarowym i 23,75 mm Hg dla niezmodyfikowanej hemoglobiny wołowej. Gdy przeprowadzono ekstremalne usieciowanie za pomocą imidoestrów lub aldehydu glutarowego, to wartości P50 dla tych hemoglobin znacznie spadały. Również usieciowanie hemoglobiny zarówno imidoestrami jak i aldehydem glutarowym zmniejszało jej współdziałanie, przy czym większe zmniejszenie obserwowano w próbkach, na które działano aldehydem glutarowym.
167 340
Tabela 1
| Próbka hemoglobiny | P50 natlenowana | P50 odtleniona | n |
| Hemoglobina wołowa | 24,00 | 23,75 | 2,1-2,4 |
| Usieciowana aldehydem glutarowym | 15,00 | 13,50 | 1,2 |
| Usieciowana DMA | 14,00 | 14,25 | 1,6 |
| Nadmiar aldehydu gUutαoowmgo | 7,00 | 6,50 | 1,1 |
| Nadmiar DMA | 10,00 | 9,00 | 1,5 |
Porównano stabilność hemoglobin usieciowanych w różny sposób i pokazano, że wersja z imidoestrem ma większą stabilność. Zatem, imidoester w odpowiednich warunkach sieciowania, opisanych niżej, daje lepszą hemoglobinę transportującą tlen, jeżeli wziąć pod uwagę stabilność i powinowactwo do tlenu.
Podczas inkubacji w 36-37’C próbki hemoglobiny usieciowanej adypimidanem dimetylu, aldehydem glutarowym i niezmodyfikowanej zawierały odpowiednio 2,5%, 8,0% i 3,5% methemoglobiny na początku inkubacji. Po 5 godzinach w 36-37’C procent methemoglobiny wynosił 8,9%, 44,4% i 8% odpowiednio dla próbek hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu, aldehydem glutarowym i niezmodyfikowanej. Po 24 godzinach stężenia methemoglobiny wynosiły 24,1%, 87,9% i 42% odpowiednio dla próbek hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu, aldehydem glutarowym i niezmodyfikowanej. Po 48 godzinach stężenia methemoglobiny w próbkach hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu i nieusieciowanej wynosiły odpowiednio 46,5% i 68%. Hemoglobina usieciowana adypimidanem dimetylu była bardziej stabilna niż hemoglobina niezmodyfikowana pod względem tworzenia methemoglobiny. Dane literaturowe wskazują na to, że ludzka hemoglobina usieciowana aldehydem glutarowym podlega procesowi samoutlenienia cztery razy szybciej niż niezmodyfikowana ludzka hemoglobina. Zatem nie oczekiwano, żeby hemoglobina usieciowana DMA była bardziej stabilna niż hemoglobina niezmodyfikowana.
Zmierzono również odporność niezmodyfikowanej hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu i aldeeydem gluttaowym na samoijtlenianie po inkubacji przez 552 dni w 4’C w tym samym buforze fosforanowym jaki piisnoo wyżej. Po 22 ddaich wołowa hhmoglobina usieciowana adypimidanem iimmtyUt wykazała wzrost methemoglobiny z 2,5% do 9,6%. Przez ten sam czas hemoglobina usiecioyaaa aldehydem glutarowym dała wzrost methemoglobiny z 8,0% do 23,5%. Pomiar przeprowadzony po 52 dniach wykazał, że hemoglobina usieciowana adypimidanem diomtyUu zawierała 14,3% methemoglobiny, podczas gdy po 37 dniach niezmodyfikowana hemoglobina wołowa zawierała 16,3% methemoglobiny. Jak w inkubacji w 37’C, hemoglobina usieciowana adypimidanem dimetylu była w sposób znaczący bardziej stabilna niż hemoglobina usiłowana aldehydem glutarowym lub aiezmoiyfikowaaa hemoglobina wołowa.
Wynalazek pozwala na zwiększenie stabilności hemoglobin ssaków łącznie z hemoglobiną wołową po usieciowaniu imidoestrarni. Stwierdzono, że stabilność hemoglobin ssaków może być zwiększona przez reakcję z ioidomstrami, zwłaszcza z aiypioiianeo dimetylu w specyficznych warunkach reakcji. Dodatkowo odkryto metodę wytwarzania oczyszczonej hemoglobiny ssaków, zwłaszcza hemoglobiny wołowej. Hemoglobina musi być w sposób zasadniczy wolna od zanieczyszczeń, co oznacza, że nie może ona zawierać żadnych materiałów w ilościach, które mogłyby powodować jakieś szkodliwe efekty u ssaków, którym ją podawano. Hemoglobina musi być przed usiłowaniem wystarczająco wolna od endotoksyny (na przykład, mniej niż 0,5 EU/ml przynajmniej przy stężeniu hemoglobiny 40 mg/ml), fosfolipidów, wirusów i innych białek niehemoglobiaoyycy. Jednakże jest również moUiymo uuieiowanie hhmoglobiny nnapierw zzaaz po zebraniu lizatów hemoglobiny, a następnie oczyszczenie usieciowanej hemoglobiny. Faktycznie, metoda
167 340 ta może być bardziej wydajna dla dużej skali produkcyjnej. Oczyszczona i usieciowana hemoglobina może być odpowiednia jako płyn krwiozastępczy służący do transportu tlenu u ludzi i zwierząt.
Według niniejszego wynalazku hemoglobinę wytwarza-się przez pobieranie krwi zwierząt w jałowych warunkach, przemycie czerwonych krwinek, lizę czerwonych krwinek, odwirowanie lizatu, a następnie ultrafiltrację przez błony dla masy-cząsteczkowej przynajmniej 300 000 lub mikrofiltrację przez filtry 0,025 do około 0,040 pm, oczyszczenie przez chromatografię aniono- lub kationowymienną w celu otrzymania oczyszczonej hemoglobiny, a następnie usieciowanie imidoestrem i ewentualne przeprowadzenie chromatografii ekskluzyjnej luo ultrafiltracji w celu usunięcia hemoglobiny o niższej masie cząsteczkowej. Alternatywnie, hemoglobinę można sieciować po odwirowaniu i zebraniu lizatu, a następnie przeprowadzić etapy oczyszczania włącznie z ewentualnym etapem ekskluzji.
Tak przygotowana hemoglobina byłaby zasadniczo wolna od zanieczyszczeń, składałaby się w przeważającym stopniu ze stabilnego tetrameru. Innym sposobem scharakteryzowania usieciowanej hemoglobiny byłoby stwierdzenie, że rozkład jej masy cząsteczkowej w sposób przeważający wynosi przynajmniej 64 000. Terminy przeważnie lub przeważający używane tutaj oznaczają przynajmniej 80% usieciowanej hemoglobiny, najkorzystniej 90 do 95% usieciowanej hemoglobiny.
W celu przygotowania niniejszej hemoglobiny wyspecjalizowanej w transporcie tlenu, określono różne parametry reakcji sieciowania. Po pierwsze, stężenie jonów chlorkowych i/lub chlorku sodu aiało znaczny wpływ na stopień usieciowania (wołowej) hemoglobiny za pomocą DMA w zakresie od 1 mM Tris-HCl do 50 mM Tris-HCl z dodatkiem 2,0 M NaCl. W 1 i 10 mM Tris-HCl, po 10 dodaniach DMA, 90,3% i 72,2% (odpowiednio) hemoglobiny pozostawało niespolimeryzowanych. W przeciwieństwie do tego wyniku, w obecności 50 mM Tris-HCl i 0,5; 1,0 i 2,0 M NaCl, tylko 25,8; 24,4 i 20,7% pozostawało nie usieciowanych (odpowiednio). Silny spadek niespolimeryzowanej hemoglobiny i wzrost dużej masy cząsteczkowej ( > 400 000) obserwowano, gdy wzrastało stężenie soli. Największy procent hemoglobiny w zakresie 64 000 - 400 000 obserwowano, kiedy sieciowanie przeprowadzono albo w 5 mM Tris-HCl albo w 50 mM Tris-HCl z dodatkiem 100 mM NaCl.
Po drugie, pokazano, że typ buforu ma silny wpływ na sieciowanie. Na przykład, reakcja sieciowania za pomocą DMA zachodzi źle w chlorowodorku glicyny, w chlorowodorku etanoloaminy i w roztworze zawierającym fosforan sodu i lizynę. Przypuszcza się, że w tych typach buforów pierwszorzędowe funkcyjne grupy aminowe hamowały reakcję sieciowania, która, jak się uważa, zachodzi głównie na grupach aminowych na N-końcu białka i na jego resztach lizynowych. Największą ilość usieciowań obserwuje się w obecności buforu 2-amino-2-metylo-1-propanolowego, gdy tylko 23,4% hemoglobiny pozostaje nieusieciowanej. Bufor ten oczywiście ma również pierwszorzędowe funkcyjne grupy aminowe. Następnymi czterema buforami pod względem wydajności sieciowania DMA są Tris (Tris[ hydroksymetylojaminometan), węglan sodowy, CHES (kwas 2-^N-cykloheksyloamino]-etanosulfonowy) i CAPSO (kwas 3-[ cykloheksyloamino 7-2-hydroksy-l-propanosulfonowy); trzy z nich mają pierwszorzędowe aminowe grupy funkcyjne.
CAPSO (kwas 3-fcykloheksyloamino^-1-propanosulfonowy) nie jest dobrym buforem do reakcji sieciowania i produkt końcowy jest usieciowany tylko w 27,2%. Fosforan sodu nie jest również dobrym wyborem do reakcji sieciowania.
Po trzecie, pH odgrywa ważną rolę w wydajnej polimeryzacji hemoglobiny za pomocą imidoestrdw. Na przykład, próby usieciowania hemoglobiny za pomocą DMA przy wartościach pH niższych niż 8,0 były generalnie nieudane. Przy pH 8,0 po 10 dodaniach DMA i końcowym stosunku stechiometrycznym DMA do hemoglobiny równym 10, hemoglobina bały usieciowana tylko w 12,2%. Wzrost wydajności sieciowania udowodniono przy pH 9,0; 10,0 i 10,5, gdzie tylko odpowiednio 58%, 48% i 50% pozostawało nieusieciowanych na końcu dodawania DMA. Na podstawie danych widoczne jest, że reakcja DMA z hemoglobiną wymaga pH 9 lub wyższego, aby była udana.
W końcu zaobserwowano, że odtleniona hemoglobina łatwiej podlega sieciowaniu niż hemoglobina natlenowana. Po zapewnieniu wyżej opisanych warunków polimeryzacji dla optymalnego usieciowania, hemoglobinę nieusieciowaną można usunąć przez filtrowanie lub chromatografię w celu uzyskania masy cząsteczkowej 64 000 lub wyższej, a następnie można znów filtrować lub poddawać chromatografii w celu otrzymania w przeważającym stopniu masy cząsteczkowej 64 000. Zatem optymalizacja sieciowania hemoglobiny znacznie ułatwia ekonomiczne i praktyczne przy8
167 340 gotowanie niniejszego materiału przenoszącego tlen, który przeważnie ma masę cząsteczkową 64 000 do 300 000.
Po wytworzeniu usieciowanej hemoglobiny typowo umieszcza się ją w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, odpowiednim do wstrzykiwania lub wlewów ssakom, którym ma być podawana. Typowy dopuszczalny farmaceutycznie nośnik może zawierać fizjologicznie dopuszczalne roztwory soli odpowiednie do wstrzyknięć lub wlewów, takie jak roztwory solanki, które są handlowo dostępne. Farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem mógłby być każdy z różnych płynów, które byłyby obojętne w stosunku do usieciowanej hemoglobiny i nie miałyby szkodliwego wpływu na ssaki, którym byłyby podawane drogą wstrzyknięcia lub wlewów. Odpowiednie płyny mogłyby również zawierać inne produkty krwi, zarówno naturalne jak i syntetyczne lub płyny fluorowęglowe.
Zazwyczaj usieciowaną hemoglobinę miesza się z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym, za pomocą którego stężenie hemoglobiny mogłoby być odpowiednio ustawiane w zakresie od około 40 do około 140 mg/ml.
Każdy etap niniejszego wynalazku opisano szczegółowo poniżej. Opisane metody stosuje się do każdej hemoglobiny pochodzącej od ssaka, nawet jeśli w konkretnych przykładach, w których opisano oczyszczanie, sieciowanie i modyfikację, użyto hemoglobiny wołowej. Jednakże hemoglobina wołowa ma tę zaletę, że ma bardzo wysoką wartość P50, odpowiednią do transportu tlenu.
Przykład I. Pobieranie krwi i przygotowywanie lizztów z czerwonych krwinek
Krew pobierano jałowo z wołów rasy Holstein z farmy należącej do The Upjohn Company Agricultural Divżsżon. Najpierw golono sierść na szyi każdego wołu maszynką do strzyżenia. Ogoloną powierzchnię wycierano półciennym ręcznikiem umoczonym w roztworze jodyny, a następnie przemywano 95% etanolem z tryskawki. Przed pobraniem krwi pozwolono, aby etanol wysechł na powietrzu. Krew pobierano do odpowietrzonych butelek o pojemności 0,5-1,0 litra, służących do przechowywania, które były sterylne i wolne od pirogenów. Do każdej butelki przed pobraniem krwi dodawano odpowiednią ilość jałowego roztworu soli sodowej heparyny. Butelki umieszczano w lodzie natychmiast po napełnieniu i również w lodzie transportowano do laboratorium. Dla początkowych badań pobrano 2,5-5,0 litrów krwi.
W laboratorium wszystkie procesy przeprowadzano w lodzie lub w 4’C w celu zminimalizowania wzrostu mikroorganizmów i towarzyszącego mu tworzenia się pirogenów. Dodatkowo etapy oczyszczania powinny być przeprowadzane w czystym środowisku z filtrowanym powietrzem o niskiej zawartości cząstek stałych. Pierwszy etap oczyszczania hemoglobiny obejmuje oddzielenie czerwonych krwinek od osocza krwi, a następnie powtarzane przemywania czerwonych krwinek roztworem soli i odwirowanie osadu czerwonych krwinek. Najpierw całą krew przenosi się do wolnych od pirogenów probówek wirówkowych o pojemności 0,5 litra i wiruje się ją przez 30-40 minut przy 4000 obrotów na minutę w 4‘C. Czerwone krwinki podczas wirowania osiadają na dnie. Osocze krwi w nadsączu usuwa się przez odsysanie. Czerwone krwinki lub erytrocyty ponownie zawiesza się w schłodzonym w lodzie roztworze zawierającym 16 g chlorku sodu (NaCl) w litrze oczyszczonej wody. Roztwór ten określa się jako 1,6% solankę. Czerwone krwinki zawiesza się przez mieszanie sterylną i wolną od pirogenów szklaną pałeczkę lub przez delikatne kilkakrotne odwracanie probówki do góry dnem. Po zawieszeniu czerwonych krwinek, odwirowuje się je przy 10 000 obrotów na minutę przez 30-40 minut w 4’C. Następnie czerwone krwinki ponownie zawiesza się w 1,6% solance i znów odwirowuje przy 10 000 obrotów na minutę w 4’C. Tak więc czerwone krwinki przemywa się trzykrotnie 1,6% solanką przed ich rozbiciem lub lizą.
Po przemyciu komórek, czerwone krwinki lizowano za pomocą szoku hipoosmotycznego w następujący sposób. Do jednej objętości przemytych, osadzonych czerwonych krwinek dodawano cztery objętości schłodzonego w lodzie 0,0025 M fosforanu sodu jako buforu, pH 7,4. Czerwone krwinki zawieszano w tym rozcieńczonym buforze fosforanowym przez delikatne odwracanie probówek wirówkowych. Po zupełnym zawieszeniu komórek, zawiesinę czerwonych krwinek inkubowano w 0-4’C przez jedną godzinę, a następnie odwirowywano przy 10 000 obrotów na minutę przez 30-90 minut w 4’C. Po odwirowaniu hemoglobinę z nadsączu odzyskiwano przez odsysanie. W pewnych doświadczeniach przepis zmieniano w następujący sposób. Po jednej godzinie inkubacji w 0,0025 M buforze fosforanowym w 0-4’C dodawano 2,0 M roztworu chlorku sodu do końcowego stężenia 0,2 M przed wirowaniem. Dodanie chlorku sodu do lizatu czerwonych krwinek zapewniało uzyskanie czystego nadsączu po wirowaniu.
167 340
Etap oczyszczania można przeprowadzić po odwirowaniu w celu wytworzenia hemolizatu. Pomagają w tym filtry takie jak celulozowe, ziemia okrzemkowa, polimery, lub pochodne krzemionki, które można dodawać do odwirowanego yeooUizatu i wytrząsać. Następnie materiał filtrujący można usuwać przez filtrację lub wirowanie. Dodanie filtru podczas etapu oczyszczania mogłoby usuwać dodatkowe fragmenty zrębu, na przykład fosfolipidy, które mogłyby pozostawać po wirowaniu.
Alternatywą szoku yipooiootycznmgo jest mechaniczne rozbicie komórek za pomocą prasy Frencha lub dużego homogeniza^^ komórek.
Zawartość pirogmaóy w czterech yemoUizatach, oznaczona testem pirogmaaości Limulus Amoebocyte Lysate (Lizat z amebocytów skrzypłocza) (LAL), była różna - od 0,05 do 0,2 jednostek endotoksyny (EU) na ml. Końcowy etap, obejmujący chromatografię anionowymimaaą lub chromatografię katioaoyyoimnaą usuwałby wszystkie ślady endotoksyn i fosfolipidów.
Przykład II. Obniżanie zawartości wirusów
Jeżeli krew wołowa jest zanieczyszczona wirusami, pewne ilości wirusów można usunąć podczas przemywania czerwonych krwinek, połączonego z wirowaniem przy niskich obrotach. Pozostałą zawartość wirusów można usunąć przez wysokoobootowm wirowanie ymmolizatu, co spowoduje osadzenie wirusów. Następne pozostałości można usunąć na etapie dokładnego oczyszczania.
Dalszą redukcję zanieczyszczeń wirusowych można przeprowadzić za pomocą mikoofiltracji i/lub uUtoαfiltoacji. Mikrofil^a^a z zastosowaniem filtru, o rozmiarach 0,025-0,040 μιό znacznie zredukuje miano większości wirusów. Wsad do mikrofiUtrαcji Ultipor N66 nylon 66 z Pall Corporation ma średnicę porów 0,04 pm i może być używany do filtrowania hemolizatu przed przeprowadzeniem następnych etapów. Dodatkowo, jeżeli istnieje taka potrzeba, można skorzystać z błony do ultrafiltracji, usuwającej cząstki o masie cząsteczkowej 300 000 dostępnej razem z wkładami w zestawie do ultrafiltracji na skalę produkcyjną Pellicon z Amion Corporation. Hemoglobina przechodzi swobodnie przez te błony do ultra- i mikrofiltracji, podczas gdy część wirusów jest zatrzymywana. Zatem, połączenie dwóch błon do filtracji może znacznie redukować zawartość wirusów. Każdy z tych rodzajów filtrów wykazuje niski stopień zatrzymywania białek.
Dodatkowo, w połączeniu z filtracją, zawartość wirusów w ymoolizacie lub filtrowanym yemolizacie, można obniżać przez dodanie odpowiednich detergentów, kwasu mtylenoiinitrylotetraoctowego, zatwierdzonego przez FDA odczynnika fosforanu triaitrobutylu lub połączenia tych dodatków.
Przykład III. Jonowymienna chromatografia hemoglobiny
Anionowymieaaą chromatografię hemoglobiny można szeroko stosować w oczyszczaniu hemoglobin ssaków (R.C. Williams, K. Tsay (1973) Anal. Biochem, 54: 137-145). W odpowiednich warunkach pH i mocy jonowej, hemoglobina wiąże się do wymieniacza anionów. Zanieczyszczenia białkopochodne i nie-białkoiochoinm można usuwać z hemoglobiny podczas rozwijania kolumny. Można również dobrać takie warunki, w których hemoglobina na niskie lub nie ma żadnego powinowactwa do wybranej żywicy anionowyrniennej. W tych warunkach zanieczyszczenia pozostają poza kolumną. Zasadniczymi zanieczyszczeniami, obecnymi w świeżo przygotowanym heimo^zac^ są fosfolipidy, potencjalnie obecne wirusy, które nie zostały usunięte w poprzednich etapach, niski poziom endotoksyn bakteryjnych i białek innych niż hemoglobina. Endotoksyny, fosfolipidy i białka osocza są bardziej ujemnie naładowane niż hemoglobina i powinny przejawiać silniejsze powinowactwo do wymieniacza anionowego w wybranych warunkach. W odpowiednich warunkach ładowania i wymywania kolumny, chromatografia aaionowyoienna może być bardzo przydatna do uwolnienia hemoglobiny od tych zanieczyszczeń. Dodatkowo, chromatografia anionowymienna może dalej zmniejszać zawartość wirusów.
Zastosowano trzy rodzaje chromatografii anioaoyymimnnej do oczyszczenia hemoglobiny: wiązanie przy podwyższonym pH i wymywanie opadającym gradientem pH, wiązanie przy podwyższonym pH i wymywanie schodkowym gradientem niższego pH i ładowanie w takich warunkach pH, w których hemoglobina nie wiąże się do wymieniacza anionowego, lecz przechodzi nie zatrzymywana przez kolumnę. Wszystkie nasze eksperymenty przeprowadzano w procesie kolumnowym, lecz można oczekiwać, że dobranie podobnych warunków w procesie periodycznym,dałoby prawie identyczne
167 340 wyniki. Wymieniaczem anionowym używanym w tych doświadczeniach była O-Sepharose Fast Flow z firmy Pharmacia, lecz można oczekiwać, że metody te działałyby również z wieloma dostępnymi handlowo wymieniaczami anionowymi do nisko- do śrdłniociśnieniowej chromatografii, które· są przystosowane do oczyszczania białek i obejmują czwartorzędowe grupy aminowe- i dietyloaminoetylowe grupy funkcyjne.
Chromatografię kationowymienną można szeroko stosować do oczyszczania hemoglobin ssaków (E. Bucci, (1981) Preparation of isolated chains of human hemoglobin, Meth. in Enzymol. 76: 97-106). W odpowiednich warunkach pH i siły jonowej, hemoglobina wiąże się do wymieniacza kationowego. Fosfolipidy i endotoksyny, a także białka osocza powinny mieć niskie powinowactwo do wymieniacza kationowego w warunkach, w których wiąże on hemoglobinę. W odpowiednich warunkach ładowania i elucji, chromatografia kationowymienna mogłaby być stosowana do oczyszczania hemoglobiny z tych zanieczyszczeń. Ponadto, chromatografia kationowymienna mogłaby powodować dodatkowe zmniejszenie zanieczyszczeń wirusowych.
Do oczyszczania hemoglobiny zastosowano dwie metody chromatografii kationowymi-ennej.
W pierwszej metodzie hemoglobinę nakładano w warunkach, w których wiąże się ona do wymieniacza kationowego, a następnie wymywano ją liniowym gradientem pH. W drugiej metodzie hemoglobinę nakładano w warunkach, w których wiąże się ona do żywicy, a następnie wymywano skokowym gradientem pH. W obu tych metodach fosfolipidy i endotoksyny przechodziły nie zatrzymywane przez żywicę, co usuwało te zanieczyszczenia z hemoglobiny. Odpowiednie byłyby liczne handlowo dostępne wymieniacze kationowe. Korzystne jest zastosowanie S-Sepharose Fast Flow z firmy Pharmacia ze względu na jego doskonałe wiązanie białka i charakterystykę przepływu. Oczekuje się, że.inne złoża chromatograficzne do nisko- do średniociśnieniowej chromatografii z sulfopropylowymi lub karboksymetylowymi grupami funkcyjnymi również dobrze spełniałyby te zadania. Zastosowanie tych żywic jest ekonomiczne.
Przykład IIIA. Chromatografia anionoeyyienna z liniowym gradientem pH
Eksperyment ten służył pokazaniu warunków chromatografii anionoenyiennej, w których hemoglobinę wołową nakładano na wymieniacz i następnie wymywano liniowym gradientem pH. Przygotowywano kolumnę z O-Sepharose Fast Flow wielkości 2,5 x 5,5 cm i oczyszczono ją działając 0,5 M NaOH przez noc. Następnie kolumnę przemywano 100 mM Tris, pH 8,5, dopóki pH wypływu z kolumny nie osiągnęło 8,5. Następnie kolumnę równoważono 50 mM Tris, pH 8,5. Pięć ml próbki świeżo przygotowanego hemolizatu czerwonych krwinek, zawierającego około 350 mg hemoglobiny, rozcieńczono do 10 ml 100 mM Tris, pH 8,5, i ładowano na kolumnę z Q-Sepharose w ilości
2,5 ml na minutę. Po załadowaniu kolumnę przemywano 50 mM Tris, pH 8,5 aż absorbancja wypływu z kolumny powróciła do poziomu podstawowego. Następnie kolumnę przemywano liniowym gradientem, zawierającym wyjściowy bufor do 50 mM Tris, pH 6,5, ponad dziesięcioma objętościami kolumny. Hemoglobinę wymywano głównie jako pojedynczy główny pik z kilkoma mniejszymi pikami wymywania przed i po nim. Obliczono, że w pojedynczym głównym piku znajduje się 95% hemoglobiny wprowadzonej do kolumny. Wszystkie procesy chromatograficzne przeprowadzano w 5’C.
Przykład IIIB. Chromatografia anionoeyyidnna ze skokowym gradientem pH
Doświadczenie to służyła pokazaniu warunków chromatografii anionowymidnndj, w których hemoglobinę wołową nakładano na wymieniacz i następnie wymywano ją pojedynczym skokowym gradientem pH. Przygotowano kolumnę z O-Sepharose Fast Flow o wymiarach 2,5 x 5,5 cm i oczyszczono ją jak w przykładzie IIIA. 8 ml próbki hdyolizatu czerwonych krwinek z wołu, zawierającego około 400 mg hemoglobiny, rozcieńczono do 16 ml 50 mM Tris, pH 8,5 i załadowano do kolumny z prędkością 2,7 ml na minutę. Następnie kolumnę płukano 50 mM Tris, pH 8,5, dopóki absorbancja wypływu nie powróciła do wartości podstawowej. Następnie kolumnę rozwijano 50 mM Tris, pH 7,4 i hemoglobinę wymywano z kolumny zasadniczo jako jeden pik. Ilość hemoglobiny obecnej w bogatej frakcji Q-Sepharose była prawie taka sama jak ilość wprowadzona do kolumny, co wskazywało na prawie ilościowe odzyskanie podczas tego etapu.
Przykład IIIC. Chromatografia anionowymienna, w której hemoglobina nie jest zatrzymywana
Eksperyment ten był demonstracją warunków chromatografii anionoenyidnndj, w których hemoglobina wołowa nie wiąże się do wymieniacza anionowego, lecz przechodzi przez kolumnę nie
167 340 zatrzymywana. Przygotowano kolumnę z Q-Sepharose Fast Flow o wymiarach 2,5 x 5,5 cm i oczyszczono ją działając 0,5 M NaOH przez noc. Kolumnę płukano 100 mM Tris, pH 7,4, dopóki pH wypływu z kolumny nie osiągnęło 7,4. 10 ml świeżo przygotowanego hemolizatu czerwonych krwinek wołowych, zawierających 880 mg hemoglobiny rozcieńczano do 40 ml 50 mM Tris, pH 7,4, i 35 ml wprowadzono do kolumny po 2,5 ml na minutę. Po wprowadzeniu kolumnę płukano 50 mM Tris, pH 7,4, dopóki nie wymyto z niej całkowicie hemoglobiny. Hemoglobina przechodziła przez kolumnę bez wiązania i jej odzysk wynosił 88%.
Przykład IIID. Kationowymienna chromatografia hemoglobiny
Doświadczenie to pokazuje warunki chromatografii kationowymiennej, w których hemoglobinę wołową załadowano do kolumny z wymieniaczem i wymywano liniowym gradientem pH. Przygotowano kolumnę o wymiarach 2,5 x 5,5 cm z S-Sepharose Fast Flow i oczyszczono ją przez działanie 0,5 M NaOH przez noc. Kolumnę przemywano 100 mM Bis-Tris, pH 6,0, aż pH wypływu z kolumny osiągnęło 6,0. Następnie kolumnę zrównoważono 50 mM Bis-Tris, pH 6,0. 5 ml próbki świeżo przygotowanego hemolizatu rozcieńczono do, 10 ml 50 mM Bis-Tris, pH 6,0, a następnie wprowadzono do kolumny z S^rpharose po 2,5 ml na godzinę. Po wprowadzeniu kolumnę płukano 50 mM Bis-Tris, pH 6,0 dopóki absorbancja wypływu z kolumny nie osiągnęła poziomu podstawowego. Kolumnę następnie wypłukiwano liniowym gradientem między buforem kolumny i 50 mM Bis-Tris, pH 8,0, ponad dziesięcioma objętościami kolumny. Wszystkie procesy chromatograficzne przeprowadzano w 5 *C.
Przykład IV. Sieciowanie hemoglobiny adypimidanem dimetylu
Próbkę, zawierającą 170 mg/ml oczyszczonej hemoglobiny wołowej traktowano następująco. Reakcję sieciowania przeprowadzono przy stężeniu tetrameru hemoglobiny 1,75 mM lub 112 mg/ml. Wysokie stężenie tetrameru ułatwiało międzycząsteczkowe usieciowanie tetramerów hemoglobiny. Hemoglobinę modyfikowano w obecności 50 mM buforu Tris; pH 8,8 w 4’C. Hemoglobinę modyfikowano przez dodanie adypimidanu dimetylu w ilościach równomolowych (to znaczy 1,75 mM adypimidanu dimetylu i 1,75 mM tetrameru hemoglobiny). Działanie adypimidanem dimetylu powtarzano osiem razy w 30 minutowych odstępach w 4°C. W każdym powtórzeniu do roztworu hemoglobiny dodawano roztworu adypimidanu dimetylu o stężeniu 50 mg/ml w 0,025 M węglanie sodu, pH 9,25, do końcowego stężenia 1,75 mM. Podczas dodawania odczynnika sieciującego roztwór hemoglobiny energicznie mieszano, a następnie inkubowano w lodzie przez 30 minut. Po 30 minutach pobierano 0,4 ml próbki i dodawano do 4 ml 0,25 M fosforanu sodu, pH 7,0. Bufor fosforanowy hamował reakcję sieciowania przez hydrolizę imidoestrów. Hamowanie przeprowadzano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzano reakcję pozostałego roztworu hemoglobiny ze świeżym roztworem odczynnika sieciującego. Osiem cykli reakcji przeprowadzano przez ponad
3,5 godziny. W tym doświadczeniu używano określonego imidoestru - adypimidanu dimetylu. Można używać również innych imidoestrów.
Przykład V. Chromatografia ekskluzyjna HPLC hemoglobiny usieciowanej adypimidanem dimetylu
Stężenie hemoglobiny określano spektrofotometrycznie używając opublikowanych współczynników ekstynkcji (R.E. Benesch, S. Yung, (1973) Equations for the spectrofotometric analysis of hemoglobin mixtures, Analyt. Biochem. 55: 245-48). Produkty reakcji badano po każdym dodaniu związku sieciującego, stosując chromatografię ekskluzyjną HPLC (SEC-HPLC). Produkt po zahamowaniu reakcji rozcieńczano do 1 mg tetrameru hemoglobiny na ml w 0,2 M fosforanie sodu, pH 7,0. Rozcieńczony produkt analizowano za pomocą SEC-HPLC na dwa oddzielne sposoby. Pierwszym była kolumna Zorbax GF-250 SEC (Dupont) zrównoważona 0,2 M fosforanem sodu jako buforem pH 7,0 i pracująca przy przepływie 1 ml/min. Drugim była kolumna Superose 12 FPLC (Pharmacia) zrównoważona 0,1 M buforem fosforanowym, pH 7,0. Obie kolumny kalibrowano białkami o znanej masie cząsteczkowej.
Kolejne powtarzanie sieciowań adypimidanem dimetylu powodowało wzrost ilości spolimeryzo wanej, ustabilizowanej tetramerami, hemoglobiny. Zakresy masy cząsteczkowej można zdefiniować za pomocą Superose 12 SEC-HPLC następująco.· 1) % > 400 000, 2) % >t ćt 00t i < 40t 00t i 3) % < 64 000. Po pięciu powtórzeniach sieciowania względne wartości procentowe wynoszą 1) 0% 2) 40,64%, 3) 59,36%. Po siedmiu powtórzeniach wartości procentowe wynoszą 1) 4,1%, 2) 50,4%
167 340 i 3) 45,5%. Po ośmiu powtórzeniach wartości procentowe wynoszą 1) 7,5%, 2) 50,6% i 3) 41,9%. Klasa trzech pików o masie cząsteczkowej mniejszej niż 64 000 składa się z pojedynczego symetrycznego piku o masie cząsteczkowej 30 000. Frakcja ta wymywała się razem z niezmodyfikowaną hemoglobiną wołową, o której sądzono, że składa się głównie z dimeru hemoglobiny. Udział methemoglobiny po siedmiu powtórzeniach sieciowania wynosił <0 2,5%. Widcczne widmo ssieciowanej hemoglobiny przypominało ziecmoiyfikdwaną hemoglobinę wołową.
Przykład VI. Elektroforeza usśneSdwaznj hemoglobiny w żelu polSakryladSidwyd z dodatkiem S1S
Elektroforezę w żelu polSakryladidowym z dodatkiem dodncyldsSarczanu sodu (S1S-PAGE) przeprowadzano na próbkach usSncSowaznj i zSeusSncidwazej hemoglobiny jak opisano niżej. Próbki hemoglobiny rozcieńczano do 2 mg/ml w 0,005 M fosforanie sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl i rozcieńczone próbki mieszano z trzema objętościami standardowego buforu do żelu S1S, a następnie inkubowano w 37°C przez 3 godziny. Próbki w formie zSezreiukowannj poddawano elektroforezie w 10-20% miniże^^ ISS. Elektroforeza S0S-PAGE usSecSowannj hemoglobiny po 7 powtórzeniach wskazywała na to, że 80% próbki ma wiązania sieciujące między podjednostkami. Stwierdzono obecność przynajmniej ośmiu multimerów między podjednostkami cząstek, wszystkie w przybliżeniu w równych proporcjach.
Przykład VII. Równowaga tlenowa w usSecSdwazej i zinusieciowaznj hemoglobinie wołowej
Pomiar równowagi tlenowej wykonano na usineiowazej i zieusieeidwazej hemoglobinie wołowej używając przyrządu Hemoxazalyznr z TCS Medical Industries. Po siedmiu powtórzeniach reakcji z adypimSdazem dimetylu próbkę usSncidwannj hemoglobiny rozcieńczano do stężenia
1,5 mg/ml w soli zbuforowanej fosforanem, pH 7,4, i poddawano analizie. W takich samych warunkach analizowano próbkę zincdddyfikdwaznj hemoglobiny wołowej i próbkę hemoglobiny wołowej, którą poddawano sSncSdwaziu aldehydem glutarowym w naszym laboratorium, stosując metodę zgodną z opisem (0. GuCIIo^o^ i wsp., (1986) Effect of glutaraldehyde on hemoglobin, Biochem. Pharm. 35: 317-23). Wartości P50 (ciśnienia parcjalne tlenu przy połowicznym nasyceniu) dla różnych rodzajów hemoglobiny były następujące: 13,5 mm Hg dla hemoglobiny usSecSdwaznj adypimSdaznd ^metylu, 14,25 mm Hg dla hemoglobiny usSeeSmwaznj aldehydem glutarowym i 23,75 mm Hg dla niecdodyfSkdwanej hemoglobiny wołowej.
Przykład VIII. Badanie stabilności usSeeiowannj i zSeusSneSdwaznj hemoglobiny wołowej
Hemoglobinę wołową, poddaną siedmiokrotnemu sieciowaniu adypimidanem dimetylu, ninzmodyo fikowaną hemoglobinę wołową i hemoglobinę usiecSdwaną aldehydem glutarowym poddawano inkubacji w 36-37’C w 0,125 M buforze fosforanowym, pH 7,1. Stężenia hemoglobiny wynosiły 40 mg/ml dla hemoglobiny wołowej usiecSowannj adypididanem dimetylu i niezmddyfikdwannj hemoglobiny wołowej i 20 mg/ml dla hemoglobiny wołowej usiecidwanej aldehydem glutarowym. W pewnych przedziałach czasowych pobierano próbki każdego rodzaju hemoglobiny, rozcieńczano 1/100 w 0,25 M buforze fosforanowym, pH 7,3, i mierzono między 680 nm i 420 nm w skaningowym spektrofotometrze dla światła UV i widzialnego Shimadzu Model 160. Zawartość methemoglobiny określano dla każdego widma stosując równania według publikacji R.E. Benesch i wsp., (1973) Eguations for the spe^^^^metric analysis hemoglobin mi/tums, Anal. Biochem. 55: 245-48). Widma mierzono przy 22°C.
Hemoglobinę wołową usSneSdwazą aiypSdSdazed dimetylu i hemoglobinę usSeeSdwaną aldehydem glutarowym Snkubowazd również w 4° w dłuższym czasie. Co pewien czas pobierano próbki i zawartość methemoglobiny określano jak opisano wyżej.
Przy inkubacji w 36-37°C próbki hemoglobiny usSncidwannj adypididazed dimetylu, aldehydem glutarowym i nincdodyfikowanej zawierały odpowiednio 2,5%, 8,0% i 3,5% methemoglobiny na początku inkubacji. Po 5 godzinach w 36-37’C procent methemoglobiny wynosił 8,9%, 44,4% i 8% odpowiednio dla próbek hemoglobiny usineiowannj adypimidanem ^metylu, aldehydem glutarowym i ziecmddyfikowanej hemoglobiny wołowej. Po 24 godzinach, stężenia methemoglobiny wynosiły 24,1, 87,9 i 42% odpowiednio dla próbek hemoglobiny wołowej usSnciowazej adypSmidaned dimntylu, aldehydem glutarowym i nincmddyfikowanej. Po 48 godzinach stężenia methemoglobiny
167 340 w próbkach hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu i nieusieciowanej wynosiły odpowiednio 46,5% i 68%. Hemoglobina usieciowana adypimidanem dimetylu jest bardziej odporna na tworzenie methemoglobiny niż niezmodyfikowana hemoglobina wołowa w 36-37’C. Z literatury wiadomo, że ludzka hemoglobina usieciowana aldehydem glutarowym samoutlenia się w tempie czterokrotnie wyższym niż niezmodyfikowana hemoglobina ludzka (D. Guillochon i wsp., (1968) Effect of glutaraldehyde on hemoglobin Biochem. Pharm. 35: 317-23). Nieoczekiwanie okazało się, że hemoglobina wołowa usieciowana adypimidanem dimetylu jest bardziej stabilna niż niezmodyfikowana hemoglobina wołowa jeśli chodzi o samoutlenianie.
Odporność hemoglobiny usieciowanej adypimidanem dimetylu i aldehydem glutarowym na samoutlenianie mierzono również po inkubacji przez 28 dni w 4°C w tym samym buforze fosforanowym jak opisano powyżej. Po 28 dniach w hemoglobinie wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu wzrósł poziom methemoglobiny z 2,5% do 9,6%, a przez ten sam okres w hemoglobinie usieciowanej aldehydem glutarowym poziom methemoglobiny wzrósł z 8,0% do 23,5%.
Przykład IX. Preparatywna chromatografia ekskluzyjna hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu
Preparatywną chromatografię ekskluzyjną stosowano w celu usunięcia cząstek o niskiej masie cząsteczkowej, to znaczy < 64 000, z hemoglobiny wołowej usieciowanej adypimidanem dimetylu. Hemoglobinę usieciowaną adypimidanem dimetylu, 40 mg/ml, wprowadzono do kolumny
2,5 x 90 cm z Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) zrównoważoną 0,025 M fosforanem sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,4 w 4°C. Objętość nakładana stanowiła 1% objętości złoża kolumny, a szybkość przepływu wynosiła 0,45 ml/min. Piki chromatograficzne łączono i połączone próbki analizowano za pomocą SEC-HPLC na kolumnie z Superose 12 (jak opisano wyżej) w celu określenia w nich rozkładu rodzajów hemoglobiny o różnych masach cząsteczkowych. Próbkę przed wprowadzeniem do kolumny lub próbkę wprowadzaną analizowano również na kolumnie z Superose 12.
Metodą preparatywnej chromatografii ekskluzyjnej rozdzielono hemoglobinę sieciowaną DMA na dwie główne frakcje. Frakcja 1 zawierała usieciowane rodzaje hemoglobiny o większej masie cząsteczkowej i reprezentowała 51,3% całkowitej odzyskanej hemoglobiny. Frakcja 2 zawierała usieciowaną hemoglobinę o masie cząsteczkowej mniejszej niż 64 000. Analiza za pomocą SEC-HPLC frakcji usieciowanej hemoglobiny przed wprowadzeniem do kolumny wskazywała, że zawiera ona 2,6% cząsteczek o masie cząsteczkowej > 40 000, 47,2% >.64 000 i 50,2%<2 64 000. Analiza SEC-HPLC wskazywała na to, że oczyszczona frakcja 1 z preparatywnej chromatografii ekskluzyjnej zawierała 4,7% cząstek o masie cząsteczkowej > 400 000, 92,7% > 64 000 i 2,6% <£. 64 000. Mttoda ta sprawdza się przy usuwaniu rodzajów hemoglobiny o niższej masie cząsteczkowej.
167 340
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 1,50 zł
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny nadającej się do transportu tlenu, przez sieciowanie imidoestrem, znamienny tym, że oczyszczony lizat hemoglobiny sieciuje się za pomocą adypimidanu dimetylu lub suberimidanu dimetylu przy pH przynajmniej 8,0, w roztworze do polimeryzacji zawierającym bufor Tris-HCl, po czym hemoglobinę o niskiej masie cząsteczkowej usuwa się przez ekskluzję ze względu na wielkość cząsteczek, uzyskując usieciowaną hemoglobinę, której co najmniej 80% ma masę cząsteczkową co najmniej 64 000 i P50 przynajmniej 13.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór do polimeryzacji zawierający NaCl.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sieciowanie prowadzi się przy pH od 8,0 do około 12,0.
- 4. Sposób wedłłu zastrz. JL, znamienny tym, te stosuje sią roztwór do polimeryzacji zawierający 50 mM Tris-HCl i od około 0,1 do około 2,0 M NaCl.
- 5. Sposób według zastrz. 1 , znamienny ty,, że stosuje się oczyszczony lizat hemoglobiny, który jest ocieniony.
- 6. Sposób wedł:ug zastrz. , , znamienyy tym , te ekskluzję przeprowadza się chromatograficznie.
- 7. Sposób według zastrz. , , znamienyy t m m , że polimeryzację przeprowadza się działając kilkakrotnie na oczyszczoną hemoglobinę równomolowymi ilościami imidoestru.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61984090A | 1990-11-29 | 1990-11-29 | |
| PCT/US1991/007155 WO1992009630A1 (en) | 1990-11-29 | 1991-10-03 | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL167340B1 true PL167340B1 (pl) | 1995-08-31 |
Family
ID=24483529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91299380A PL167340B1 (pl) | 1990-11-29 | 1991-10-03 | Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny PL |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5362855A (pl) |
| EP (1) | EP0559655B1 (pl) |
| JP (1) | JPH06502848A (pl) |
| AT (1) | ATE119917T1 (pl) |
| AU (1) | AU650287B2 (pl) |
| CA (1) | CA2093650A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ281912B6 (pl) |
| DE (1) | DE69108258T2 (pl) |
| DK (1) | DK0559655T3 (pl) |
| ES (1) | ES2069908T3 (pl) |
| FI (1) | FI932461A (pl) |
| HU (2) | HUT64571A (pl) |
| IE (1) | IE914144A1 (pl) |
| IL (1) | IL99785A (pl) |
| MX (1) | MX9102239A (pl) |
| NO (1) | NO931956L (pl) |
| NZ (1) | NZ240377A (pl) |
| PL (1) | PL167340B1 (pl) |
| PT (1) | PT99666A (pl) |
| SK (1) | SK54993A3 (pl) |
| WO (1) | WO1992009630A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA918348B (pl) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994021682A1 (en) * | 1993-03-16 | 1994-09-29 | Hemosol Inc. | Selective crosslinking of hemoglobins by oxidized, ring-opened saccharides |
| US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| DE4418973A1 (de) * | 1994-05-31 | 1995-12-14 | Barnikol Wolfgang | Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| US6150507A (en) * | 1995-03-23 | 2000-11-21 | Biopure Corporation | Method for producing a purified hemoglobin product |
| US5981716A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Gruppo Lepettit, S.P.A. | Process for the purification of proteins |
| FR2736930B1 (fr) * | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
| US5872015A (en) * | 1996-05-10 | 1999-02-16 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Molecular diversity screening method |
| US7282220B1 (en) | 1996-11-05 | 2007-10-16 | Hsing-Wen Sung | Genipin-crosslinked gelatin microspheres as drug carrier |
| EP0941130B1 (en) * | 1996-11-05 | 2003-03-26 | Challenge Bioproducts Co., Ltd. | Chemical modification of biomedical materials with genipin |
| US6949384B2 (en) * | 2001-12-21 | 2005-09-27 | Spectromedical Inc. | Method for monitoring degradation of Hb-based blood substitutes |
| US7449339B2 (en) * | 1999-11-23 | 2008-11-11 | Nir Diagnostics Inc. | Spectroscopic method and apparatus for total hemoglobin measurement |
| MXPA05007885A (es) * | 2003-01-29 | 2005-09-21 | Northfield Lab | Soluciones de hemoglobina polimerizada que tienen cantidad reducida de tetramero y metodo para prepararlas. |
| US7135554B1 (en) | 2004-01-27 | 2006-11-14 | Biopure Corporation | Method of forming a polymerized hemoglobin solution from stabilized hemoglobin |
| DE102011105525B4 (de) * | 2011-06-24 | 2015-03-26 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Biopolymer-Aggregaten und Viren aus einem Fluid |
| EP3655019A4 (en) | 2017-07-18 | 2021-04-21 | Virtech Bio, Inc. | BLUTER SUBSTITUTES CONTAINING HEMOGLOBIN AND PROCESS FOR THEIR PRODUCTION |
| US20200393472A1 (en) * | 2018-04-18 | 2020-12-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Haemoglobin analysis method |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3925344A (en) * | 1973-04-11 | 1975-12-09 | Community Blood Council | Plasma protein substitute |
| US4001401A (en) * | 1975-02-02 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin |
| US4061736A (en) * | 1975-02-02 | 1977-12-06 | Alza Corporation | Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4001200A (en) * | 1975-02-27 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4053590A (en) * | 1975-02-27 | 1977-10-11 | Alza Corporation | Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin |
| DE3144705C2 (de) * | 1981-11-11 | 1983-12-08 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat |
| US4600531A (en) * | 1984-06-27 | 1986-07-15 | University Of Iowa Research Foundation | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield |
| US4711852A (en) * | 1984-11-05 | 1987-12-08 | Akzo N.V. | Control for blood gas analyzers and hemoglobin analysis |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| AU622610B2 (en) * | 1986-11-10 | 1992-04-16 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| GB8710598D0 (en) * | 1987-05-05 | 1987-06-10 | Star Medical Diagnostics Ltd | Hemoglobin based blood substitute |
| IL87708A (en) * | 1988-09-08 | 1994-04-12 | Technion Inst For Research And | Hemoglobin-based blood substitute possessing a colloid oncotic pressure substantially similar to human blood and method for the preparation thereof |
-
1991
- 1991-10-03 HU HU9301563A patent/HUT64571A/hu unknown
- 1991-10-03 AT AT91917174T patent/ATE119917T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-03 DK DK91917174.4T patent/DK0559655T3/da active
- 1991-10-03 SK SK54993A patent/SK54993A3/sk unknown
- 1991-10-03 ES ES91917174T patent/ES2069908T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 CZ CZ93854A patent/CZ281912B6/cs unknown
- 1991-10-03 DE DE69108258T patent/DE69108258T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-03 WO PCT/US1991/007155 patent/WO1992009630A1/en active Search and Examination
- 1991-10-03 EP EP91917174A patent/EP0559655B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 AU AU85466/91A patent/AU650287B2/en not_active Ceased
- 1991-10-03 JP JP3516187A patent/JPH06502848A/ja active Pending
- 1991-10-03 CA CA002093650A patent/CA2093650A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-03 PL PL91299380A patent/PL167340B1/pl unknown
- 1991-10-18 IL IL9978591A patent/IL99785A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-18 ZA ZA918348A patent/ZA918348B/xx unknown
- 1991-10-29 NZ NZ240377A patent/NZ240377A/xx unknown
- 1991-11-27 MX MX9102239A patent/MX9102239A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 IE IE414491A patent/IE914144A1/en unknown
- 1991-11-29 PT PT99666A patent/PT99666A/pt not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-05-20 US US08/065,170 patent/US5362855A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-28 NO NO93931956A patent/NO931956L/no unknown
- 1993-05-28 FI FI932461A patent/FI932461A/fi unknown
-
1994
- 1994-06-15 US US08/260,173 patent/US5521154A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00661P patent/HU211703A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69108258T2 (de) | 1995-08-10 |
| DE69108258D1 (de) | 1995-04-20 |
| SK54993A3 (en) | 1993-10-06 |
| AU650287B2 (en) | 1994-06-16 |
| FI932461A0 (fi) | 1993-05-28 |
| ES2069908T3 (es) | 1995-05-16 |
| CA2093650A1 (en) | 1992-05-30 |
| US5362855A (en) | 1994-11-08 |
| WO1992009630A1 (en) | 1992-06-11 |
| JPH06502848A (ja) | 1994-03-31 |
| ZA918348B (en) | 1993-04-19 |
| EP0559655B1 (en) | 1995-03-15 |
| US5521154A (en) | 1996-05-28 |
| CZ85493A3 (en) | 1994-02-16 |
| ATE119917T1 (de) | 1995-04-15 |
| HU211703A9 (en) | 1995-12-28 |
| HU9301563D0 (en) | 1993-09-28 |
| IL99785A0 (en) | 1992-08-18 |
| NZ240377A (en) | 1993-01-27 |
| DK0559655T3 (da) | 1995-07-24 |
| CZ281912B6 (cs) | 1997-03-12 |
| IE914144A1 (en) | 1992-06-03 |
| FI932461A (fi) | 1993-05-28 |
| IL99785A (en) | 1996-05-14 |
| EP0559655A1 (en) | 1993-09-15 |
| NO931956D0 (no) | 1993-05-28 |
| MX9102239A (es) | 1992-07-08 |
| NO931956L (no) | 1993-05-28 |
| PT99666A (pt) | 1992-10-30 |
| HUT64571A (en) | 1994-01-28 |
| AU8546691A (en) | 1992-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL167340B1 (pl) | Sposób wytwarzania usieciowanej hemoglobiny PL | |
| EP0231236B1 (en) | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography | |
| CZ287589B6 (en) | Process of separating a preselected hemoglobin species from a crude solution thereof | |
| FR2461500A1 (fr) | Procede de production d'une substance capable de stimuler la proliferation et la differenciation des cellules souches granulopoietiques humaines | |
| EP0140386B1 (en) | Method for the purification of lpf-ha | |
| CN1015512B (zh) | 切向流亲合超滤法 | |
| Winslow et al. | [1] Pilot-scale preparation of hemoglobin solutions | |
| EP0239565B1 (en) | Method of separating proteins | |
| Shichi et al. | GTP binding protein: properties and lack of activation by phosphorylated rhodopsin | |
| WO2006110339A1 (en) | CELLULAR STANDARDS FOR GLYCATED HEMOGLOBIN AlC DETERMINATION | |
| CA1338244C (en) | Purification of hemoglobin and methemoglobin by bioselective elution | |
| Hayette et al. | A deletional frameshift mutation in protein 4.2 gene (allele 4.2 Lisboa) associated with hereditary hemolytic anemia | |
| Fronticelli et al. | [10] Conformational and functional characteristics of bovine hemoglobin | |
| US5334705A (en) | Benzenetricarboxylate derivative-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin | |
| KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
| Roth et al. | The conformational requirements for the mechanical precipitation of hemoglobin S and other mutants | |
| Chapman et al. | Pilot scale production of pyrogen-free human hemoglobin for research | |
| Hamberger et al. | The cerebellar glomerulus: isolation and metabolic properties of a purified fraction | |
| Lundahl et al. | Water-soluble proteins do not bind octyl glucoside as judged by molecular sieve chromatographic techniques | |
| Whittaker et al. | Analysis of self-association of bovine neurophysins by gel chromatography | |
| Vadlamudi et al. | Differential solubilization of human erythrocyte cell membrane proteins by maleic anhydride | |
| Acharya et al. | Reductive hydroxyethylation of the α-amino groups of amidated hemoglobin S | |
| Morle et al. | A deletional frameshift mutation in protein 4.2 gene (allele 4.2 Lisboa) |