JPH06502848A - イミドエステル架橋ヘモグロビン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イミドエステル架橋ヘモグロビン組成物発明の背景 本発明は、ヒトおよび動物における輸液用血液代替品として、または酸素輸送流 体として適当な精製架橋ヘモグロビン生成物の新規製法に指向される。本架橋ヘ モグロビン生成物は、含有する細菌エンドトキソンおよびホスホリピドが非常に 低レベルである点で実質的に汚染物が無い。

ヘモグロビンの構造および機能は総括されている（ブン・エイチ・エフおよびビ イ・シイ・フォーゲット（Ｂｕｎｎ、　Ｈ，Ｆ、　、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｇ、　Ｆ ｏｒｇｅｔ）、ヘモグロビン：モレキュラー、ジェネティック・アンド・クリニ カル・アスペクツ（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ）、ダブリュー・ ビイ・ソーンダーズ・カンパニー　（ｆ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ）、フィラデルフィア、６９０頁（１９８６））、哺乳類ヘモグロビンは２つ の異なるタイプのサブユニットαおよびβを各々２つ含有する四量体である。各 サブユニットは分子量約１６０００であって、中央に鉄原子を有するヘム基を含 有する。蛋白部分またはグロビンは該ヘム鉄を第一鉄還元状態に保持するように 機能し、かくして、ヘモグロビン分子は可逆的に酸素に結合できる。

哺乳動物ヘモグロビンは、静的な四量体、すなわち、分子量６４−６８０００の 単一の蛋白種と考えるべきでない。そうではなく、非共有結合によって連結され たサブユニットからなり、単量体−二量体および二量体−四量体相互作用の関与 する動的平衡にて存在する。いずれの時点においても、ヘモグロビンは約１６０ ００の分子量の単量体、分子量３２０００の二量体、および四量体のある割合か らなる。溶液中の単量体、二量体、および四量体種の分布はヘモグロビン濃度、 ヘモグロビンのリガンド状態、ならびにそれが含まれる溶液のｐＨおよび塩組成 に依存する。

哺乳動物ヘモグロビンは赤血球細胞内に含有されている。哺乳動物では、この特 殊化細胞は成熟の過程でその核を喪失し、非常に低濃度の他の蛋白を含有するヘ モグロビンの檜にすぎない。ヘモグロビンはいくつかの理由で循環赤血球に含ま れる。とりわけ、もしヘモグロビンが細胞中になくて溶液中で自由に循環される ならば、毛細血管壁、腎臓および他の部位を通じる経路によって循環から容易に 排出されてしまうであろう。ある種の無を椎動物はこの問題を、大き過ぎて毛細 血管および腎臓のネフロンを通過できない百方もの分子量を有するポリマーヘモ グロビンをつくることによって解決している。赤血球細胞によって供される他の 機能は、ヘモグロビン分子を蛋白分解性血清蛋白から保護し、ヘモグロビン機能 に適したイオンバランスを維持し、ヘム鉄を還元（機能的）状態に維持する酵素 を供し、およびアロステリックエフェクター分子の存在を制御するために保護環 境を形成している。

ヒトにおける血液代替品輸液用の明確な無間質ヘモグロビン溶液を生産しようと する多（の努力がなされてきた（ペンネル・アール・ビイおよびダブリュー・イ ー・スミス（Ｐｅｎｎｅｌｌ、　Ｒ，Ｂ、　、　ａｎｄ　ｆ、　Ｅ、　５ｗ１ｔ ｈ）、ヘモグロビンの安定化溶液の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔ ａｂｉｌｉｚｅｄ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｅ＋＊ｏｇｌｏｂｉｎ）、ブ ラッド（Ｂｌｏｏпj ４　：　３８０−３８５　（１９４９）；ラビネール・ニス・エフ、ヘルパート ・ジェイ・アール、ロバス・エイチ、およびエル・エイチ・フリートマン（Ｒｅ ｂｉｎｅｒ、　Ｓ。

Ｆ、　、　ｌ１ｅｌｂｅｒｔ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｌｏｐａｓ、■、　、　ａｎｄ　 Ｌ、　Ｈ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ）、血漿展剤として用いる無間■w モグロビン溶液の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｔｒｏｍ−ｆｒｅ ｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｆｏｒｕｓｅ　ｏｆ　ａｓ　 ａ　ｐｌａｓｍａ　ｅｘｐａｎｄｅｒ）　、ジャーナル・オブ・エクスペリメン タル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｌ１ｅｄ、　）、１２６　：１１２７−１ １４２　（１９６７）；クリステンセン・ニス・エム、メディナ・エフ、ウィン スロウ・アール・ダブリュー、スネル・ニス・エム、ゼグナ・エイ、およびエム ・エイ・マリニ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｓ。

Ｍ、　、　Ｍｅｄｉｎａ、　Ｆ、　、　Ｗｉｎｓｌｏｗ、　Ｒ，Ｗ、　、　５ｎ ｅｌｌ、　Ｓ、麗、　、　Ｚｅｇｎａ、　Ａ、　、　ａｎｄA　１．＾」ａｒｉ ｎｉ）　、血液代替 品として使用可能なヒト・ヘモグロビンＡＯの調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ｈｕｍａｎｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ６　ｆｏｒ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｕ ｓｅ　ａｓ　ａ　ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）、ジャーナルφオブ傷バ イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・メソッズ（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１１ｅｔｈ、　）　１ヱ：１４３−１５４　（１９８８）；およびフエオラ・エ ム、ゴンザレス・エイチ、カニザロ・ビイ・シイ、ビンガム・ディおよびビイ・ ペリマン（Ｆｅｏｌａ。

麗、　Ｇｏｎｚａｌｅｓ、　［１，、Ｃａｎ１ｚａｒｏ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｂｉｎ ｇｈａｍ、　Ｄ、　、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｐｅｒｉｍａｎ）、潔t代替品として のウシ無間質ヘモグロビン溶液の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｂ ｏｖｉｎｅ　ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ ｓ　ａｓ　ａ　ｂｌｏｒｘｌ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）、サージ・ギン・オブス ト（Ｓｕｒｇ。

Ｇｙｎ、０ｂｓｔ、）１５７　：　３９９−４０８　（１０８３）　）　、これ らの溶液はヘモグロビンを無修飾状態で含有し、該ヘモグロビンはそのサブユニ ットに自由に解離する。

無修飾ヘモグロビンの注入は循環からのヘモグロビンの急速な排出に導く。加え て、無修飾ヘモグロビンの注入は腎毒性を含めた身体内の不都合な影響を宿主に 与えると報告されている。無修飾ヘモグロビンに関連する腎毒性は、米国食糧お よび医薬品局の生物学的評価および調査センターをして、無修飾ヘモグロビンは ヘモグロビンベースの酸素担体に存在させるべきでないと表明させしめた。

ヘモグロビンのポリペプチド鎖間に共有結合化学架橋を形成させることによって ヘモグロビン溶液を安定化させることを記載する多くの報告がある（ラウシュ・ シイ・ダブリューおよびエム・フェオラ（Ｒａｕｓｃｈ、　Ｃ，Ｌ　、　ａｎｄ 　Ｍ、　Ｆｅｏｌａ）、過剰純粋半合成血液代替品（Ｅｘｔｒａ　ｐｕｒｅ　ｓ ｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）、国際特許 出願ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２９６７、国際公開番号ＷＯ／８８１０３４０８．１ ９８８年５月１９日：ポンハード、ケイ、およびエフ・コセ（Ｂｏｎｈａｒｄ、 　Ｋ、　、　ａｎｄ。

Ｎ、　Ｋｏｔｈｅ）、延長された貯蔵期間および高酸素輸送能力を有する架橋ヘ モグロビンおよびその製法（Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｅｃｌ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉ ｎ　ｏｆ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　５ｈｅｌｆ　１ｉｆｅ　ａｎｄ　ｈｉｇ■ ｏｘｙｇｅｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓ ｓ　ｆｏｒ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｓａ＋＊ｅ）、米国特許謔S ７７７２４４号：ブッキイ・イー、ラジンス力・エイ、ウルバイティス、ビイ。

およびシイ・フロンティセル（Ｂｕｃｃｉ　Ｅ、　、　Ｒａｚｙｎｓｋａ、　Ａ 、　、　Ｕｒｂａｉｔｉｓ、　Ｂ、　、　ａｎｄ　Ｃ。

Ｆｒｏｎｔｉｃｅｌｌｉ）、モノ−（５，５−ジブロモサリチル）フマラートを 持つヒト・ヘモグロビンの偽架橋（Ｐｓｅｕｄｏ　ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋ　ｏｆ 　ｈｕａ＋ａｎ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏ−（３，５−ｄｉ ｂｒｏ＋ｍｏｓａｌ　１ｃｙｌ　）ｆｕｍａｒａｔｅ）、ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリ第４００１２００号）。

情報の開示 架橋ヘモグロビン組成物は米国特許第４００１．２００号；第４０１１４０１号 ：第４０５３５９０号；および第４０６１７３６号に記載されている。引き続い ての精製により工夫を凝らした形態の架橋ヘモグロビンは米国特許第４８５７３ ６３６号に開示されている。

ウシ・ヘモグロビンの調製および架橋はフエオラ・エム、ゴンザレス・エイチ、 カニザロ・ビイ・シイ、ビンガム、ディおよびビイ・ペリマン（Ｆｅｏｌａ、　 Ｍ、　。

Ｇｏｎｚａｌｅｓ、　Ｈ，、Ｃａｎ１ｚａｒｏ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｂｉｎｇｈａｍ 、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｐｅｒｉｍａｎ）、血液代替品と■■■E シ無間質ヘモグロビン溶液の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｏｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｂｏ ｖｉｎｅ　ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ 　ａｓ　ａ　ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）、サージ・ギン・オブスト（ Ｓｕｒｇ。

Ｇｙｎ、　０ｂｓｔ、　）　１５ユニ３９９−４０８　（１０８３）および国際 特許出願Ｐ　ＣＴ／ＵＳ　８７１０２９６７、国際公開番号ＷＯ／　８８　／　 ０３４０８．１９８８年５月１９日。

正常ヒト・ヘモグロビン（ＨｂＡ）および鎌状細胞ヘモグロビン（ＨｂＳ）との ジメチルアシビミダートの反応はプレセ・シイ・エフおよびイー・エル・アマ（ Ｐｌｅｓｅ、　Ｃ，Ｆ、　、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｌ、＾＋ｕａ）、ヘモグロビンお よび修飾ヘモグロビンにおけるアロステリックＲ−Ｔ変換のプローブとしての円 二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ　ａｓａ　ｐｒｏｂｅ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ　Ｒ−Ｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ 　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ　ａｎｄ@ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ）　（１９７７）　）　ｏ米国特許第３９２５３４４号 （１９７５）は、血漿蛋白物質または血漿展剤を調製するためのイミドエステル での架橋ヘモグロビンを開示しているが、この物質は酸素輸送流体としては適当 でない。ペンナスールーダス、アール、ヘス、アール・エイチ、メンツアー、ダ ブリュー・シイ。

およびビイーｚイチ・ルピン（Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ−Ｄａｓ、　Ｒ，、Ｅｌｅａ ｔｈ、　Ｒ，Ｈ，、１ｌｅｎｔｚｅｒ、　ｆ、　Ｃ，、ａｎ■ Ｂ、　Ｈ，Ｌｕｂｉｎ）　ｒヘモグロビンＳのジメチルアジピミダートでの修飾 、性質を変化させる個々の反応サブユニー７トの寄与（Ｍｏｄｉｃａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ｓ　ｗｉｔｈｄｉｍｅｔｈｙｌ　ａｄｉｐｉｍｉ ｃａｔｅ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｒｅａｃ ｔｅｄ　５ｕｂｕｎｉｔ刀@ｔ。

ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）Ｊ　、ビオノミ力・工・ビオフ ィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｉ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）７０４　：　３８９　３９７（１９８２）によって 報告されているごとく、イミドエステル（ＤＭＡ）での架橋は、酸素輸送および その放出を不適当にし、ているヘモグロビンの酸素親和性を増大させた。ペンナ スールーダス、アール。

ピッケリー・エル・イー、メンツェル、ダブリュー、およびビイ・エイチ・ルピ ン（Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ−Ｄａｓ、　Ｒ，、Ｖｉｅｋｅｒｙル、Ｅ、　、　Ｍｅ ｎｔｚｅｒ、　Ｗ、　、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｈ，Ｌｕｂｉｎ）Aヘモグロビ ンＡのジメチルアシビミダートでの修飾、酸素親和性を変化させる個々の反応サ ブユニットの寄与（Ｍｏｄｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ　 ｗｉｔｈ　ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ａｄｉｐｉｍｉｃａｔｅＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏ ｎ　ｏｆ　１ｎｄｉｖｉｄｕａ１．　ｒｅａｃｔｅｄ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　ｔｏ 　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｏｘｙｇ■■ かくして、ヘモグロビンを安定にし、四量体形態または四量体多重体が優位であ るが、有効に酸素を輸送し次いでそれを生きている生物体の細胞に効果的に放出 するのに十分なほど低いｐ５０または酸素親和性をなお有する架橋ヘモグロビン の製法を見い出すのが望ましい。また、分子量は優位にヘモグロビンの四量体形 態である少なくとも６４０００で、６４０００未満、すなわち二量体または単量 体形態がほとんどないし全くなく、哺乳動物生物体でコンブリメント（ｃｏｍｐ ｌｉ＋ｅｅｎｔ）活性化を引き起こすのに十分なくらい大きな分子となり得る６ ４０００を大きく超えるのがほとんどないしは全くないことが重要である。従っ て、かかる重合法の開発は、酸素輸送代替品を首尾よ（見付は出すために非常に 望ましい。

発明の概要 第１の態様において、本発明は、酸素を生細胞に輸送および放出できる安定な架 橋ヘモグロビン組成物である。該ヘモグロビンは実質的に不純物がなく、イミド エステルで架橋しており、それにより、該ヘモグロビンは優位に四量体およびよ り大きな形態で存在する。ヘモグロビンを架橋させるのに好ましいイミドエステ ルはジメチルアシビミダートまたはジメチルスペルイミダートである。優位に四 量体またはより大きな形態であるヘモグロビンは、架橋ヘモグロビンの少なくと も８０％が少なくとも６４０００ダルトンの分子量を有し、より好ましくは架橋 ヘモグロビンの少な（とも９０ないし９５％が少なくとも６４０００ダルトンの 分子量を有すると解釈できる。加えて、イミドエステル架橋ヘモグロビンは通常 の架橋法と比べてメトヘモグロビンに対して非常に安定で、少なくとも１３＋＋ ａＨｇの酸素親和性ｐ５０を有する。

また、該架橋ヘモグロビン組成物は治療されるべき哺乳動物への輸液または注射 を容易とするための、または分析、移植または実験室で用いる酸素担持流体とし て使用するための医薬上許容される担体媒質を包含できる。典型的な医薬上許容 される担体媒質は精製水または生理食塩水を包含し得る。

もう１つの態様において、本発明は、ａ）＠乳動物血液を収集し、ｂ）赤血球細 胞を収集血液から分離し、赤血球細胞を洗浄し、Ｃ）洗浄赤血球細胞を溶解し、 ｄ）該溶解血液細胞を遠心してヘモグロビンの溶解物を得、ｅ）陰イオンまたは 陽イオン交換クロマトグラフィーによって該溶解物を精製し、ｆ）クロマトグラ フィーから得られた溶出溶解物を限外濾過またはミクロ濾過を行い、次いでｇ） イミドエステルで精製ヘモグロビンを架橋して優位に四量体形態で存在するヘモ グロビンを得ることを特徴とする架橋ヘモグロビン組成物の製法である。

赤血球細胞の溶解は低浸透圧ショックで行うことができる。限外濾過は、典型的 には、３０００００分子量膜で行い１ミクロ濾過は、典型的には、約０．０２５ ないし約０．０４０ミクロンのフィルターで行う。別法として、イミドエステル での架橋工程（ｇ）は、工１１　（ｄ）で得られたヘモグロビンの溶解の後に行 うことができ、それにより、工程（ｅ）は架橋ヘモグロビンの精製で始まる。該 方法はさらに、精製した架橋ヘモグロビンをサイズ排除に付して低分子量ヘモグ ロビン−（６４０００ダルトン未満）を除去する工程（ｈ）を包含することがで きる。

典型的には、該サイズ排除は低圧サイズ排除クロマトグラフィーによる。

従って、本発明は、実質的にいずれの不純物も無く、かつ優位に四量体またはよ り大きな形態で存在し、それにより、グルタルアルデヒドを用いたごときより伝 統的な形態の架橋ヘモグロビンよりも改良された対酸化安定性を有するイミドエ ステル架橋ヘモグロビン組成物を記載する。該ヘモグロビン組成物は少な（とも ６４０００ダルトンの優位分子量を有し、改善された架橋安定性を有する。該ヘ モグロビンは哺乳動物用の血液酸素輸送代替品として、あるいは一般的に酸素輸 送流体として使用するのに適する。

発明の詳細な記載 本発明は、輸液治療剤として使用するのにヘモグロビンを架橋するのに使用され たことがないある種のイミドエステルにてヘモグロビンを精製し架橋する方法を 記載する。これらの二官能性イミドエステル架橋剤は、とりわ広ジメチルアジピ ミダートおよびジメチルスペルイミダートを包含する。過去に使用されてきたヘ モグロビン架橋剤よりもこれらの架橋剤を用いるのは有利である。狭い分子量分 布および酸素の適当な輸送を実現する特定の反応条件が見い出された。

ノメチルアジピミダートおよびジメチルスペルイミダートのごときイミドエステ ルは、温和な条件下で蛋白と特異的かつ迅速に反応する二官能性架橋剤である。

安定なアミジンアダクツはりシン残基のイプシロン−アミノ基とポリペプチド鎖 のアミノ末端アミンとで形成される（ウォルド・エフ（Ｖｏｉｄ、　Ｆ、　Ｘ　 １９７２　）、二官能性試薬（Ｂｉｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ） 　：メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ、）２ ５：６２３−６５１　；ペーターズ、ケイ、およびエフ・エム・リチャーズ（Ｐ ｅｔｅｒｓ、　Ｋ、　、　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｓ）　（ｉ　９７７　）、化学 架橋剤および膜構造の研究における問題点（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｒｏｓｓ−１ ｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｉｎ　５ｔｕｄｉｅｓ 　ｏ■ ｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）、アヌ瞭しブーくイオケム（＾ｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　４６　：　５２３−５５１）。典型的には 、架橋剤はヘモグロビンサブユニット当たり１−２７ミノ基と反応する。ヒト・ ヘモグロビンの四量体形態を安定化させる２つのベータ鎖リシン残基（ベーター ８２）の間でいくらかの架橋が起こる。ジメチルアジピミダートはヘモグロビン Ｓについての抗鎌状赤血球化剤として研究されてきた（ルピン・ビイ・エイチ、 ベナ・ブイ、メンツェル、ダブリュー・シイ、ブムン・イー、ブラッドレイ、テ ィ・ビイ、およびエル・バッカー（Ｌｕｂｉｎ、　Ｂ、　Ｂ、　、　Ｐｅｎａ。

Ｖ、、１１ｅｎｔｚｅｒ、　Ｗ、Ｃ，、Ｂｙｍｕｎ、　Ｅ、　、　Ｂｒａｄｌｅ ｙ、Ｔ、　Ｂ、、ａｎｄ　Ｌ、Ｐａｅｋｅｒ）　（１９７５jジメチル アジピミダート　新しい抗鎌状赤血球化剤、ブロンーディングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、）ＵＳＡ７２　：　４３−４６）。ベーター８２リシンの修飾はＨｂＳの 脱酸素形態のコンフォメーンヨンを変化させ、か（して、その結晶化またはゲル 化を妨げる。結晶化は、害化された赤血球細胞で観察される鎌状赤血球化現象に ついての分子の基礎となる。架橋剤によるベーター８２リジンの修飾には鎌状赤 血球化を妨げる必要があるが、ヘモグロビン四量体内では２つのベーター８２リ シンの現実の架橋はない。本発明では、ベータ−８２リジン間にサブユニット間 架橋を導入することによって引き起こされる安定化された四量体、および別々の 安定化されたヘモグロビン四量体のイプシロン−アミノ基間に分子間架橋を導入 することによって引き起こされた安定化された四量体の高分子量集合体を共に形 成させることを意図して、ウシ・ヘモグロビンに対してジメチルアシビミダート を用いる。

イミドエステル、特にジメチルアジピミダートでのヘモグロビン架橋には利点が ２つあり：まず、架橋は分子量６４０００の四量体ヘモグロビンの３２０００分 子量二量体へ０解離を遅延させる。非修飾ヘモグロビンにおいて、四量体および 二量体種は動的平衡にある。イミドエステルでの架橋による四量体ヘモグロビン の安定化は、実質的に、糸球体嚢の膜を横切る濾過を妨げることによって、ヘモ グロビンが細尿管に入って行くのを減少させる。

第２に、架橋の結果、ヘモグロビン四量体の高分子量オリゴマーが形成され、こ れは、腎濾過に対して極度に抵抗性であり、非修飾ヘモグロビンまたは架橋剤グ ルタルアルデヒドで修飾したヘモグロビンいずれよりも生理学的温度における酸 化に対してより安定である。

ジメチルアジビミダートは比較的安価な試薬であり、大量に入手可能である。

ジメチルアジビミダートを利用する架橋プロセスは、スケールアップの助けとな る。

種々の形態のウシ・ヘモグロビンの酸素結合特性を測定し、表Ｉに掲げる。

Ｐ２Ｏは利用可能なサイトの５０％が結合酸素を有する時点での酸素分圧である 。

ヒル係数またはｎ値は、酸素結合サイト間の協同性を表示し、高ｎ値は高協同性 を示す。Ｐ２Ｏ値はヘモグロビン溶液の酸素添加の間および脱酸素の間に測定し た。平均Ｐ２Ｏ値は、ジメヂルアジピミダート架橋ヘモグロビン（：ついては１ ３゜５１１ＩＭＩｌ１ｇ１グルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンについては１４ ．２５ｍＭ　［ｊｇ、非修飾ウソ・ヘモグロビンについては２３．７５ＤＩＭ　 ｊｉｇであった。イミドエステルまたはグルタルアルデヒドで過度の架橋が行わ れた場合は、二わらのヘモグロビンについてのｐ５０値は大いに増大した。また 、イミドエステルおよびグルタルアルデヒド双方につき、ヘモグロビンの架橋は その協同性を減少させ、グルタルアルデヒド処理試料ではより大きな減少が観察 された。

種々の架橋ヘモグロビンの安定性を比較したところ、複数のイミドエステル型が 優れた安定性を有することが示された。従って、後記する適当な架橋手法下では 、安定性および酸素親和性を考慮すると、該・イミドエステルから良好な酸素輸 送ヘモグロビンが得られた。

３６−３７℃のインキュベーションにおいて、ジメチルアジビミダート架橋、グ ルタルアルデヒド架橋、および非修飾ヘモグロビン試料は、インキュベーション の開始時に各々２５％、８．０％および３．５％のメトヘモグロビンを含有して いた。３６−３７℃における５時間後、メトヘモグロビンのバーセン］・は、各 々、ジメチルアシビミダート架橋、グルタルアルデヒド架橋、および非修飾ウシ ・ヘモグロビン試料について８．９％、４４．４％および８％であった。２４時 間後、メトヘモグロビン濃度は、各々、ジメチルアジピミダート架橋、グルタル アルデヒド架橋、および非修飾ウシ・ヘモグロビン試料について２４．１．８７ ．９および４２％であった。４８時間後、ジメチルアジピミダート架橋および非 架橋ウシ・ヘモグロビン試料についてのメトヘモグロビン濃度は、各々、４６． ５％および６８％であった。ジメチルアジピミダート架橋ヘモグロビンは非修飾 ヘモグロビンよりもメトヘモグロビン形成に対して安定であった。文献では、グ ルタルアルデヒド架橋ヒト・ヘモグロビンは非修飾ヒト・ヘモグロビンの４倍の 速度で自動酸化することが報告されたいる。従って、ＤＭＡ架橋ヘモグロビンが 非修飾ヘモグロビンよりも安定であることは予期せぬことであった。

非修飾ウシ・ヘモグロビンの自動酸化に対する安定性ならびにジメチルアシビミ ダート架橋およびグルタルアルデヒド架橋ウシ・ヘモグロビンの自動酸化に対す る安定性も、前記したのと同一のリン酸緩衝液中、４℃にて５２日間インキュベ ーションした後に測定した。２８日後、ジメチルアジピミダート架橋ウシ・ヘモ グロビンでは２．５％から９．６％メトヘモグロビンまで増加した。同期間にわ たって、グルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンでは８．０％から２３．５％メト ヘモグロビンまで増加した。５２日後に測定すると、ジメチルアジビミダート架 橋ヘモグロビンは１４．３％メトヘモグロビンを含有していたのに対し、３７日 後に非修飾ウシ・ヘモグロビンは１６．３％メトヘモグロビンを含有していた。

３７℃インキュベーションにおけるごとく、ジメチルアシビミダート架橋ヘモグ ロビンは、グルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンまたは非修飾ウシ・ヘモグロビ ンよりも有意に安定であった。

１の態様において、本発明は、ジメチルアジビミダートを含めたイミドエステル での架橋後において、ウシ・ヘモグロビンを含めた哺乳動物ヘモグロビンの安定 性増強に関する。本明細書中にて、哺乳動物ヘモグロビンの安定性は、特別の反 応条件下で、イミドエステル、特にジメチルアジビミダートとの反応によって増 強できることを開示する。加えて、精製した哺乳動物ヘモグロビン、特にウシ・ ヘモグロビンの製法も開示する。該ヘモグロビンは実質的に不純物がなく、これ は、いずれの物質も、治療すべき哺乳動物に対していずれかの有害な効果を引き 起こす量で含有しないことを意味する。該ヘモグロビンは、架橋に先立ち、エン ドトキシン（例えば、ヘモグロビンの少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ濃度において０ ．５ＥＵ／ｍ１未満）、ホスホリピド、ウィルス、および他の非ヘモグロビン蛋 白が十分ないようにしておく。しかしながら、溶解ヘモグロビンの収集後にまず ヘモグロビンを架橋し、次いで、架橋ヘモグロビンを精製することも可能であり 、事実、この方法は大規模生産ではより効果的であり得る。精製し架橋したヘモ グロビンはヒトおよび哺乳動物への酸素輸送血液増量剤として適当である。

典型的には、本発明のヘモグロビンは、無菌条件下で哺乳動物血液を収集し、赤 血球細胞を洗浄し、赤血球細胞を溶解し、溶解物を遠心し、少な（とも３０００ ００分子量膜で限外濾過するか、あるいは０．０２５ないし約０．０４０ミクロ ンフィルターでミクロ濾過し、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー によって精製して精製ヘモグロビンを得、次いでイミドエステルで架橋し、所望 により、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外濾過を行っていずれの低分子 量ヘモグロビンも除去することによって調製する。別法として、該ヘモグロビン は遠心し溶解物を収集した後に架橋したものであってもよい。次いで、任意のサ イズ排除工程を含めて精製工程を行うことができる。

か（調製されたヘモグロビンは実質的に不純物がな（、優位に安定化四量体より なる。架橋ヘモグロビンを特徴付けるもう１つの方法は、それが優位に少なくと も６４０００の分子量分布を有すると陳述することである。本明細書中で用いる 「優位に」または「優位である」は、架橋ヘモグロビンの少なくとも８０％、好 ましくは架橋ヘモグロビンの９０ないし９５％を意味する。

本発明の特別の酸素輸送ヘモグロビンを調製するために、種々の架橋反応パラメ ーターが特定化される。まず、塩素イオンおよび／または塩化ナトリウムの濃度 は、１ｍＭトリス−ＨＣｌないし５０ｍＭトリｘ−ＨＣＩ＋２．０Ｍ　ＮａＣ１ の範囲にわたり、ＤＭＡでの（ウシ）ヘモグロビンの架橋度に顕著な効果を有す る。１および１０ｍＭトリス−ＨＣｌにおいては、ＤＭＡの１０回添加後、ヘモ グロビンの（各々）９０．３％および７２．２％は未重合のままであった。この 結果とは対照的に、５０ｍＭｔ−リス−ＨＣｌ＋Ｑ、５．１．０、および２．０ ＭＮａＣ１の存在下では、（各々）２５．８．２４．４、および２０．７％が未 架橋のままであったに過ぎない。未重合ヘモグロビンの着実な減少、および高分 子量（＞４０００００ダルトン）の増加が塩濃度の増加に伴って観察された。６ ４−４０００００範囲におけるヘモグロビンの最高パーセントが、架橋を５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌまたは５０ｍＭトリス−ＨＣ１＋１００ｍＭ　ＮａＣ１いずれ かにて架橋を行ったときに観察された。

第２に、緩衝液のタイプが架橋に強い影響を与えることが示された。例えば、Ｄ ＭＡ架橋反応はグリシン−ＨＣｌ、エタノールアミン−ＨＣｌｌおよびリン酸ナ トリウム＋リジンを含有する溶液では余り進行しなかった。これらの緩衝液のタ イプでは、第一級アミの機能が架橋反応を抑制すると推定され、蛋白のＮ−末端 上のアミノ基およびそのリシン残基に対して第−義的に起こると考えられる。

最大群の架橋が２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝液の存在下で観 察され、ヘモグロビンの２３．４％のみが未架橋のままであった。明らかに、こ の緩衝液は第一級アミノ官能性も有する。ＤＭＡ架橋効率の意味において次の４ 種の緩衝液はトリス（トリス［ヒドロキシメチルコアミノメタン）、炭酸ナトリ ウム、ＣＨＥＳ　（２−［Ｎ−シクロへキシルアミノコエタンスルホン酸）、お よびＣＡＰＳＯ（３−［シクロへキシル−アミノコ−２−ヒドロキシ−１−プロ パンスルホン酸）であり；そのうち３種が第一級アミノ官能性を有する。対照的 に、ＣＡＰＳ　（３−［シクロへキシルアミノコ−１−プロパンスルホン酸）は 架橋反応には良好な緩衝液ではなく、得られた生成物は２７．２％架橋に過ぎな かった。

また、リン酸ナトリウムも架橋反応につき良好な選択でなかった。

第３に、ｐＨはイミドエステル中でヘモグロビンを効果的に重合させるのに重要 な役割を果した。例えば、８．０未満のｐＨ値においてＤＭＡでヘモグロビンを 架橋させる試みは一般に不成功に終わった。ｐＨ８，０では、ＤＭＡの１０回添 加後、ヘモグロビンに対するＤＭＡの最終的な化学量論比は１０に等しく、該ヘ モグロビンは１２２％架橋に過ぎなかった。架橋効率の増加はｐＨ９，０，１０ ，０および１０．５で確認され、各々、５８％、４８％、および５０％のみがＤ ＭＡ添加の最後において未架橋であった。しかしながら、データから、ＤＭＡと ヘモグロビンとの反応には、それを首尾よく行うためには、９またはそれを超え るｐＨが必要なことが明らかであった。

最後に、脱酸素ヘモグロビンは酸素添加ヘモグロビンよりも容易に架橋されるこ とが観察された。最適架橋のための前記重合条件を施した、未架橋ヘモグロビン を濾過するか、あるいはクロマトグラフィーに付して除いて、６４０００または それを超える分子量が得られ、次いで、さらに濾過を行うか、あるいはクロマト グラフィーに付して優位に６４０００分子量を得ることができる。従って、ヘモ グロビンの架橋の最適化は、優位に６４０００ないし３０００００分子量である 本酸素輸送物質の経済的かつ現実的調製を大いに容易とする。

架橋ヘモグロビンを調製した後、典型的には、それを、治療すべき哺乳動物に注 射または注入するのに適した医薬上許容される担体媒質に入れる。典型的な医薬 上許容される担体媒質は、商業的に入手可能な生理食塩水のごとき注射または注 入に適した生理学的に許容される塩溶液を包含できる。医薬上許容される担体は 、架橋ヘモグロビンに対して比較的不活性であり、かつ注射または注入すべき哺 乳動物に有害な効果を有しない種々の流体のいずれのものであってもよい。また 、適当な流体には、天然もしくは合成流体またはフルオロカーボン流体である他 の血液製品を包含させることもできる。一般に、本発明架橋ヘモグロビンは適当 な医薬担体と混合し、それにより、ヘモグロビン濃度は約４０ないし約１４０ｍ ｇ／ｍｌの適当な量で投与できる。

本発明を以下に各種々の工程および前記分子組成につき詳細に記載する。説明の ために精製、架橋および修飾を記載する特定の実施例ではウシ・ヘモグロビンを 使用するが、記載する方法はいずれの哺乳動物ヘモグロビンにも適用される。

しかしながら、ウシ・ヘモグロビンは酸素輸送に適する非常に高いｐ５０値を有 する利点がある。

実施例１　血液の収集および赤血球細胞溶血物の調製アップ・ジョン社農業部門 に属する農場のホルスタン去勢牛から無菌的に血液を採取した。まず、電気バリ カンで各去勢牛の首から毛を剃った。次いで、剃った領域をヨウ素溶液に浸漬し た布タオルで拭い、続いて噴出ビンからの９５％エタノールで洗浄した。エタノ ールを血液採取前に風乾した。滅菌し発熱因子のない０．５−１．０リツトルの 空の血液収集ビンに血液を採取した。適当量の滅菌ヘパリンナトリウム溶液を血 液収集に先立って各ビンに添加した。該ビンを充填後直ちに氷上に置き、氷で冷 しつつ実験室に輸送した。最初の実験では、２．５−５．０リツトルの血液を採 取した。

実験室では、微生物の増殖および汚染発熱因子形成を最少化するために氷上また は４℃いずれかですべての手順を行った。加えて、精製工程は粒子が低含量の濾 過空気を有するクリーン環境で行うべきである。ヘモグロビン精製の最初の工程 は血漿からの赤血球の分離、続いての塩溶液での赤血球の反復洗浄、および赤血 球細胞をベレットとするための遠心を含む。まず、全血を発熱因子のない０．５ リツトル遠心ビンに移し、４００ＯＲＰＭ、４℃にて３０−４０分間遠心した。

赤血球細胞は遠心の間にベレットとなった。上澄み中の血漿を吸引除去した。赤 血球細胞を精製水１リツトル当たり塩化ナトリウム（ＮａＣ１）１６グラムを含 有する水冷溶液に再懸濁した。この溶液を１．６％生理食塩水という。赤血球細 胞を滅菌した発熱因子のないガラスロッドを用いて撹拌するかあるいは遠心ビン を穏やかに反復倒置することによって再懸濁した。赤血球細胞を再懸濁した後、 １１−０００ＯＲＰ、４℃にて３０−４０分間再遠心した。赤血球細胞を１．６ ％生理食塩水に再懸濁し、１１００ＯＯＲＰ、４℃にて３０−４０分間再度遠心 した。赤血球細胞を、赤血球破壊または溶解に先立ち１．６％生理食塩水で合計 ３回洗浄した。

細胞を洗浄した後、低浸透圧ショックによって以下のごとくに赤血球細胞を溶解 した。洗浄し、ベレット化した１容量の赤血球細胞に、水冷０．００２５Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４の４倍容量を添加した。遠心ビンを穏やかに倒置 することによって赤血球細胞をこの希リン酸緩衝液に懸濁した。細胞が完全に懸 濁した後、赤血球細胞懸濁液を０〜４℃で１時間インキュベートし、続いて４℃ にてＩｏｏｏｏＲＰＭで３０−９０分間遠心した。遠心後、吸引によって上澄み 中のヘモグロビンを回収した。ある実験では、該プロトコルを以下のごとくに修 飾した。０〜４℃における０、００２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液での１時間の インキュベーションの後、塩化ナトリウムの２，０Ｍ溶液を添加して、遠心前に 最終濃度０．２Ｍとした。溶液塩化ナトリウムの赤血球溶解物への添加は遠心の 後により清澄な上澄みを与えた。

溶血物を得るための遠心の後に仕上げ工程を含めることができる。セルロース、 ケイソウ土、ポリマー、またはシリカ誘導体いずれかである濾過助剤を撹拌しつ つ遠心溶血物に添加する。次いで、濾過助剤を濾過または遠心によって除去する 。

濾過除去での仕上げ工程の追加は、遠心によって完全には除去されないさらなる 間質断片、かくして、ホスホリピドを除去する。

赤血球細胞を溶解するための低浸透圧ショックに対する別法は、フレンチ・プレ スまたは大規模細胞ホネゲナイザーのごとき機械的破壊である。

４つの加工溶血物の発熱因子含量は、リムラス・アメポサイト・リソセイト（Ｌ ｉｓｕｌｕｓ　Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ）　（ＬＡ　Ｌ）発熱因子 テストによると１ｍｌ当たり０．０５から０，２工ンドトキシン単位（ＥＵ）で 変動した。陰イオン交換または陽イオン交換クロマトグラフィーによる下降プロ セスにより最後の痕跡量エントドトキシンおよびホスホリピドが除去される。

実施例２−ウィルス含量の減少 ウシ血液がウィルスで汚染されている場合、ある量のウィルス負荷は低速度遠心 での赤血球の洗浄の間に除去される。もう１つのパーセントは溶血物の高速度遠 心で除去され、ベレット中に残存する。もう１つのアリコツトは仕上げ工程で除 去される。

ウィルス負荷のさらなる減少はミクロ濾過および／または限外濾過による。

０．０２５−０．０４０ミクロンフィルターでのミクロ濾過はほとんどのウィル スの力価を大いに減少させる。ポール・コーポレイション（Ｐａｉｌ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ）からのウルティポル（Ｕｌｔｉｐｏｒ）　Ｎ　６６ナイロン６ ６ミクロ濾過カートリツジは０．０４ミクロンの多孔度を有し、さらなる下降プ ロセスに先立って溶血物を濾過するのに使用される。加えて、要すれば、フィル トロン・コーポレイション（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの ３０００００分子量カットオフ限外濾過膜が入手可能であり、それは、アミコン ・コーポレイション（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのペリコン （Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）生産規模限外濾過単位に挿入される。ヘモグロビンはこれ らの限外濾過およびミクロ濾過膜のすべてを自由に通過する一方、ある割合のウ ィルスは保持される。従って、これらの２つの濾過膜の組合せでウィルス負荷が 大いに減少される。これらのフィルタータイプの各々は低蛋白リテンシヨンを示 す。

濾過以外に、溶血物または濾過溶血物のウィルス含量は適当な洗剤、エチレンジ ニトリロテトラ酢酸、ＦＤＡ−認可試薬トリニトロブチルホスフェート、または それらの添加物の組合せを添加することによって減少させることができる。

実施例３−ヘモグロビンのイオン交換クロマトグラフィー陰イオン交換クロマト グラフィーは哺乳動物ヘモグロビンの精製で広範囲に使用されてきた（ウィリア ムス・アール・シイ、ケイ・ツァイ（ｆｉｌｌｉａ■ｓ、　Ｒ，Ｃ，、ＬＴｓａ ｙＸ　１９７３　）、エチル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５４ 　：１３７−４５）。

適当なｐＨおよびイオン強度下で、ヘモグロビンは、交換体に結合するように陰 イオン交換体に適用できる。蛋白質性および非蛋白質性不純物はカラム展開の間 にヘモグロビンから除去される。また、ヘモグロビンが選択陰イオン交換樹脂に 対してほとんどまたは全く親和性を有しない条件を選択できる。これらの条件下 、不純物は後にカラムに残る。新たに調製した溶血物に存在する主要汚染物はホ スホリピド、上昇プロセス工程では除去されない可能性として残存するウィルス 、低レベルの細菌エンドトキシン、およびヘモグロビン以外の蛋白である。エン ドトキシン、ホスホリピド、および血漿蛋白はヘモグロビンよりもより負に荷電 しており、選択条件下で陰イオン交換体に高い親和性を呈するはずである。適当 な負荷および溶出条件下、陰イオン交換クロマトグラフィーはこれらの汚染物か らヘモグロビンを分割するのに有用である。加えて、陰イオン交換クロマトグラ フィーはさらにウィルス負荷を減少させる。

本発明者らは、ヘモグロビンの精製について３つの陰イオン交換クロマトグラフ ィーのプロトコルを利用した：上昇したｐＨでの結合および順次低下させるｐＨ グラジェントでの溶出、上昇したｐＨでの結合および低ｐＨの段階的グラジェン トでの溶出、およびヘモグロビンが陰イオン交換体に結合しないでカラムに保持 されなくて通過するｐＨ条件下での負荷。本発明者らの実験のすべてはカラムモ ードで行ったが、はとんど同一の結果を与える同様のバッチ条件が開発できた。

これらの実験で利用する陰イオン交換体はファルマシア（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ ）からのキュー−セファロース・ファスト・フロラ（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　 Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）であったが、これらの手法は、第四級アミンおよびジエチ ルアミノエチル官能性を有するものを含めた蛋白精製で開発された商業的に入手 可能な多数の低圧ないし中圧陰イオン交換体で行えることが予測される。

陽イオン交換クロマトグラフィーもまた哺乳動物ヘモグロビンの精製で広範囲に 利用されてきた（ブッキイ、イー（Ｂｕｃｃｉ、　Ｅ、　Ｘ　１９８１　）、ヒ ト・ヘモグロビンの単離鎖の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｆ　１ｓｏｌａ ｔｅｄ　ｃｈａｉｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、メソッズ ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）ヱ６：　 ９７−１０６）、適当なｐＨおよびイオン強度下で、ヘモグロビンは、交換体に 結合するように陽イオン交換体に適用できる。ホスホリピドおよびエンドトキシ ン、ならびに血漿蛋白はヘモグロビンが結合する条件下では陽イオン交換体に対 してほとんど親和性を有しないであろう。適当な負荷および溶出条件下では、陽 イオン交換クロマトグラフィーはヘモグロビンをこれらの汚染物から分解するの に有用であろう。加えて、陽イオン交換クロマトグラフィーはウィルス負荷にお いてさらに減少を与えるであろう。

ヘモグロビンの精製に２種の陽イオン交換クロマトグラフィー・プロトコルを設 計した。第１のプロトコルにおいて、ヘモグロビンは、それが陽イオン交換体に 結合し、次いで直線ｐＨグラジェントで溶出される条件下で負荷した。第２のプ ロトコルにおいて、ヘモグロビンは、それかが樹脂に結合し、次いで、段階的ｐ Ｈグラジェントで溶出される条件下で負荷した。これらの両プロトコルにおいて 、ホスホリピドおよびエンドトキシンは反応せずに樹脂を通過し、かくして、こ れらの汚染物はヘモグロビンから分割される。多数の商業的に入手可能な陽イオ ン交換体が適当である。好ましくは、ファルマシアからのニス−セファロース・ ファスト・フロラ（Ｓ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）をその優 れた蛋白結合および流動特性の理由で用いた。スルホプロピル−またはカルボキ シメチル−官能性を持つ他の低−中圧クロマトグラフィー媒質を入れるもまた必 要な機能を実行できることが予測される。これらの樹脂の規模決定は経済的であ る。

実施例３Ａ−直線ｐＨグラジェントでの陰イオン交換クロマトグラフィ一本実験 は、ウシ・ヘモグロビンが交換体に負荷され、次いで、直線ｐＨグラジェントで 溶出暴れる陰イオン交換クロマトグラフィー条件を説明する。

Ｑ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆｓｔ　Ｆｌｏｗの２．５　Ｘ　５．５ｃｍカラム を調製し、０．５Ｍ　ＮａＯＨへの一昼夜暴露によって洗浄した。該カラムを１ ００ｍＭトリスｐＨ８，５でカラム溶出液のｐＨが８．５になるまで洗浄した。

次いで、５０ｍＭ０ｍＭトリスル、５で該カラムを平衡化した。ヘモグロビン約 ３５０ｍｇ含有する新たに調製したウシ・赤血球溶血物試料５ｍｌを１００ｍＭ トリスｐＨ８，５でｌＱｍｌまで希釈し、１分当たり２．５ｍｌにてＱ　−５ｅ ｐｈａｒｏｓｅカラムに負荷した。負荷に続き、該カラムを５ＱｍＭ）リスｐＨ ８，５でカラム溶出液の吸収がベースラインに返るまで洗浄した。次いで、該カ ラムを出発緩衝液−５ＱｍＭトリスｐＨ６，５よりなる直線グラジェントにて１ ０倍カラム容量にわたって溶出させた。ヘモグロビンは実質的に単一の主要ピー クとして溶出し、この前後で溶出するいくつかの従たるピークを伴っていた。該 単−の主要ピークは該カラムに負荷したヘモグロビンの９５％であった。クロマ トグラフィー手法のすべては５℃で行った。

実施例３Ｂ一段階ｐＨグラジェントでの陰イオン交換クロマトグラフィ一本実験 は、ウシ・ヘモグロビンが交換体に負荷され、次いで、単一のｐＨ段階グラジェ ントで溶出される陰イオン交換クロマトグラフィー条件を説明する。

Ｑ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗの２．２Ｘ５．５ｃｍカラムを 実施例３Ａのごとくに調製し洗浄した。ヘモグロビン約４００ｍｇを含有するウ シ赤血球細胞溶血物試料８ｍｌを５０ｍＭｈリスｐＨ８，５で１６ｍ１まで希釈 し、１分当たり２．７ｍｌでカラムに負荷した。負荷に続き、該カラムを５０ｍ ＭｈリスｐＨ８，５で溶出液の吸収がベースラインに返るまで洗浄した。次いで 、該カラムを５０ｍＭ）リスｐＨ７，４で展開し、ヘモグロビンは実質的に単一 のピークとして該カラムから溶出した。富Ｑ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ画分に存在 するヘモグロビンの量はカラムに負荷したのとほとんど同一であり、この工程に わたるほとんど定量的な回収を示す。

実施例３Ｃ−ヘモグロビンが保持されない陰イオン交換クロマトグラフィ一本実 験は、ウシ・ヘモグロビンが陰イオン交換体に結合しないで保持されずにカラム 通過する陰イオン交換クロマトグラフィー条件を説明する。Ｑ−３ｅｐｈａｒｏ ｓｅＦａｓｔ　Ｆｌｏｗの２．２Ｘ５．５ｃｍカラムを０．５Ｍ　ＮａＯＨへの 一昼夜暴露によって調製洗浄した。該カラムを１００ｍＭｔ−リスｐＨ７，４で カラム溶出液のｐＨが７．４に測定されるまで洗浄した。ヘモグロビン８８０ｍ ｇを含有する新たに調製したウシ赤血球細胞溶血物］、Ｏｍｌを５０ｍＭ０ｍＭ トリスル８フ、０ｍ１まで希釈し、３５ｍ１を１分当たり２．５ｍｌにて該カラ ムに負荷した。負荷に続き、該カラムをヘモグロビンがカラム溶出し終わるまで ５部ｍＭＩ−リスｐＨ７，４で洗浄した。ヘモグロビンは結合することなくカラ ムを通過し、回収率は８８％であった。

実施例３Ｄ−ヘモグロビンの陰イオン交換クロマトグラフィ一本実験はウシ・ヘ モグロビンが交換体に負荷され、次いで直線ｐＨグラジェントで溶出される陰イ オン交換クロマトグラフィー条件を説明する。Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ 　Ｆｌｏｗの２．５ｘ５．５ｃｍカラムを調製し、０．５Ｍ　ＮａＯＨへの一昼 夜暴露によって洗浄した。該カラムをカラム溶出液のｐＨが６．０に達するまで １００ｍＭビス−トリスｐＨ６，０で洗浄した。次いで、該カラムを５０ｍＭビ ス−トリスｐＨ６，０で平衡化した。新たに調製したウシ赤血球細胞溶血物５ｍ ｌを５０ｍＭビス−トリスｐＨ６，０で１０ｍ１に希釈し、続いて１時間当たり ２，５分にてＳ−８ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに負荷した。負荷に続き、該カラム をカラム溶出液の吸収がベースラインに達するまで５０ｍＭビス−トリスｐ）（ ６，０で洗浄した。次いで、該カラムをカラム緩衝液と５０ｍＭビス−トリスｐ Ｈ８，０との間の直線グラジェントにて１０倍カラム容量にわたり溶出させた。

クロマトグラフィー手順のすべては５℃で行った。

実施例４−ジメチルアジビミダートでのウシ・ヘモグロビンの架橋精製したウシ ・ヘモゾロ１２１フ０ 処理した。架橋反応は１．７５ｍＭまたは１１２ｍｇ／ｍ１のヘモグロビン四量 体濃度で行った。高四量体濃度はヘモグロビン四量体の分子間架橋を促進させる 。

該へそグロビンを４℃にて５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．８の存在下で修飾する 。

該ヘモグロビンを等量（例えば、１．７５ｍＭジメチルアジビミダートおよび１ 、７５ｍＭヘモグロビン四量体ストてジメチルアジビミダートの添加によって修 飾する。ジメチルアジピミダート処理は４℃にて３０分間隔で８回繰り返す。

各適用については、０．０２５Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ９．２５中のジメチルアジ ピミダートの５０ｍｇ／ｍｌ溶液を最終濃度１．７５ｍＭのヘモグロビン溶液に 添加する。該ヘモグロビン溶液を、架橋試薬の添加に間、撹拌し、次いで、氷上 で３０分間インキュベートする。３０分後、０．４ｍｌ試料を取り出し、０．２ ５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０の４ｍｌに添加した。該リン酸緩衝液はイミド エステルの加水分解によって架橋反応をクエンチする。クエンチングは室温で２ 時間にわたり行う。残存するヘモグロビン溶液は架橋剤の新たな溶液に対して反 応させる。８サイクルの反応を３。５時間にわたり行う。本実験では、特異的イ ミドエステルジメチルアジビミダートを用いた。他のイミドエステルも使用でき る。

実施例５−ジメチルアシビミダートで架橋させたヘモグロビンのサイズ排除ＰＬ Ｃ ヘモグロビン濃度は公表吸光係数（ベネノユ・アール・イー、ベネンユ・アール 、ニス・ヤング（Ｂｅｎｅｓｃｈ．Ｒ．Ｅ，、Ｂｅｎｅｓｃｈ　Ｒｏ，Ｓ．Ｙｙ ｕｎｇ）（１　９　７３）、ヘモグロビン混合物の分光分析についての方程式（ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅｓ）、アナリ テイカル＋／’ｔセイオケミストリ−（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）５　 ５　：　２　４　５−４　８）を用いて分光的に測定した。反応生成物はサイズ 排除ＨＰＬＣ　（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用い架橋剤の各添加の後にモニターした 。クエンチした反応生成物を０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０中、１ｍｌ当 たり１ｍｇヘモグロビン四量ストで希釈した。希釈した生成物を５ＥＣ−ＨＰＬ Ｃによって２つの別々のモードで分析した。第１のものは、０．２Ｍリン酸ｐＨ ７．０で平衡化し、１ｍｌ／分で運転したＺｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０　ＳＥＣ カラム（デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））であった。第２のものは、０．１Ｍリン酸 ナトリウムｐＨ７．０で平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ　１　２　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））であった。

両力ラムは既知分子量の蛋白で検量したものであった。

ジメチルアジビミダートでの架橋の連続的反復により、重合体化した四量体の安 定化ヘモグロビンの量を暫時増大させた。分子量範囲は５ｕｐｅｒｏｓｅ　ｌ　 ２ＳＥＣ−ＨＰＬＣにて以下のごとくに明確化できた＝１）に＞４０００００ダ ルトン、２）％〉６４０００ダルトンおよび＜４０００００ダルトン、および３ ）％＜６４０００ダルトン。架橋の４回反復後、相対パーセント値は１）０％、 ２）４０．６４％、３）５９　３６％であった。７回反復後、該パーセントは１ ）４．１％、２）５０、４％、および３）４５．５％であった。８回反復の後、 該パーセント値は１）７．５％、２）５０．６％、および３）４１．９％であっ た。分子量値６４０００ダルトン未満のクラス３ピークは３００００ダルトンの 分子量の単一の対称なピークよりなるものあった。この両分は未修飾ウシ・ヘモ グロビンと共溶出し、主としてヘモグロビン混合物よりなると考えられる。架橋 の７回反復の後のヘモグロビンのメトヘモグロビン含量は＜２．５％であった。

架橋ヘモグロビンの可視スペクトルは非修飾ウシ・ヘモグロビンのそれに似てい た。

実施例６−架橋ヘモグロビンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ドデシル 硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を記載したご とき架橋および非架橋ヘモグロビン試料について行った。ヘモグロビン試料を０ ．　０　０　５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣ１中２ｍｇ／ ｍ１まで希釈し、希釈試料を標準的な５ＤＳ−ゲル緩衝液の３部と混合し、続い て３７℃で３時間インキュベートした。試料は非還元形態にて１０−２０％ＩＳ Ｓミニーゲルで泳動させた。架橋７回反復後の架橋ヘモグロビンの５ＤＳ−ＰＡ ＧＥは、試料の８０％がサブユニット間で架橋したことを示した。ザブユニット 分子量の少なくとも８倍が存在し、すべてほぼ同等の割合であった。

実施例７−架橋および非架橋ウシ・ヘモグロビンの酸素平衡酸素平衡測定は、Ｔ ＣＳメディカル・インダストリーズ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｓ）か らのへモックスアナライザー（Ｈｅｍｏｘａｎａｌｙｚｅｒ）装置を用い、架橋 および非架橋ウシ・ヘモグロビンにつき行った。ジメチルアシビミダートとの反 応での７回反復の後、架橋ヘモグロビン試料をリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７． ４中１．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、分析に付した。また、同一条件下で、非架橋 ウシ・ヘモグロビン試料、および記載されている方法（ギロチョン・ディ（Ｇｕ ｉｌｌｏｃｈｏｎ．　Ｄ．　）ら、（１９８６）、グルタルアルデヒドがヘモグ ロビンに与える効果（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ｏｎ 　ｈｅ＋＊ｏｇｌｏｂｉｎ）、バイオケム・ファルム（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈ ａｎ＋．　）　３　５@： ３１７−２３）を用いてグルタルアルデヒドで実験室にて架橋させたウシ・ヘモ グロビン試料を分析した。ヘモグロビン種についてのＰ２Ｏ　（半飽和における 酸素分圧）は、ジメチルアジピミダート架橋ヘモグロビンについてはｉ３．５ｍ ｍＨｇ１グルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンについては１４．２５ｍｍ　Ｈｇ １および非修飾ウシ・ヘモグロビンについては２３．７５ｍｍ　Ｈｇであった。

実施例８−架橋および非架橋ウシ・ヘモグロビンについての安定性実験ジメチル アジビミダートでの架橋の７回反復に付したウシ・ヘモグロビン、非修飾ウシ・ ヘモグロビン、およびグルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンを０、１２５Ｍリン 酸ナトリウムｐＨ７．１中３６−３７℃でインキュベージコンに付した。ヘモグ ロビン濃度はジメチルアジピミダート架橋ウソ・ヘモグロビンおよび非修飾ウシ ・ヘモグロビンについては４０ｍｇ／ｍＬおよびグルタルアルデヒド架橋ウシ・ ヘモグロビンについては２８ｍｇ／ｍｌであった。ある時間間隔で、各ヘモグロ ビン種の試料を取出し、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３中で１／ １００に希釈し、島原モデル１６０ＵＶ−可視スキャンニング分光計にて６８０ ｎｍおよび４５０ｎｍ間をスキャンした。メトヘモグロビン含量は、公表された 方程式（ベネンユ、アール・イー（Ｂｅｎｅｓｃｈ、　Ｒ，Ｅ、　）ら、（１９ ７３）、ヘモグロビン混合物の分光分析のための方程式（Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ　 ｆｏｒｔｈｅ　５ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｓｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏ ｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅｓ）、エチル・バイオケム（＾ｎａ １．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５５　：　２４５−４８）を用い各スペクトルの分析に よって決定した。スペクトルは２２℃でとった。

また、ジメチルアジビミダート架橋ヘモグロビンおよびグルタルアルデヒド架橋 ヘモグロビンをより長時間にわたって４℃でインキュベートした。試料は時間間 隔を置いて採取し、メトヘモグロビン含量は前記したごと（に決定した。

３６−３７℃のインキュベーションにおいて、ジメチルアシビミダート架橋、グ ルタルアルデヒド架橋、および非修飾ヘモグロビン試料はインキュベーションの 開始時に各々２．５％、８．０％、および３．５％のメトヘモグロビンを含有し ていた。３６−３７℃における５時間後、メトヘモグロビンのパーセントは、各 々、ジメチルアジピミダート架橋、グルタルアルデヒド架橋、および非修飾ヘモ グロビン試料につき８．９％、４４．４％、および８％であった。２４時間後、 各々、ジメチルアシビミダート架橋、グルタルアルデヒド架橋、および非修飾ウ シ・ヘモグロビン試料につきメトヘモグロビン濃度は２４．１８７．９、および ４２％であった。４８時間後、ジメチルアジビミダート架橋および非修飾ウシ・ ヘモグロビン試料におけるメトヘモグロビン濃度は各々４６．５％および６８％ であった。ジメチルアシビミダート架橋ヘモグロビンは３６−３７℃にて非修飾 ウソ・ヘモグロビンよりもメトヘモグロビン形成に対してより安定であった。文 献は、グルタルアルデヒド架橋ヒト・ヘモグロビンは非修飾ヒト・ヘモグロビン のそれの４倍の速度で自動酸化することを教示している（ギロチョン・ディ（Ｇ ｕｉｌｌｏｃｈｏｎ。

Ｄ、）ら、（１９８６）、ヘモグロビンに対するグルタルアルデヒドの効果（Ｅ ｆｆｅｃｔｏｆ　ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ｏｎ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ）、バイオケム静ファルム（Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｐｈａｒｍ、　）３５：３１７− ２３）。ジメチルアジビミダート架橋ウシ・ヘモグロビンは自動酸化に対して非 修飾ウシ・ヘモグロビンよりも安定であることは予測し得ぬことであった。

自動酸化に対するジメチルアジピミダート架橋およびグルタルアルデヒド架橋ウ シ・ヘモグロビンの安定性は前記したのと同一のリン酸緩衝液中にて４℃で２８ 日間のインキュベーションの後に測定した。２８日後、ジメチルアジピミダート 架橋ウシ・ヘモグロビンは２．５％から９．６％メトヘモグロビンに増加した。

同一期間にわたり、グルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンは８．０％から２３． ５％メトヘモグロビンまで増加した。

実施例９−ジメチルアジビミダート架橋ウシ・ヘモグロビンの分取用サイズ排除 クロマトグラフィー 分取用サイズ排除クロマトグラフィーを用いてジメチルアジビミダート架橋ウシ ・ヘモグロビンから低分子量種、すなわち、＜６４０００ダルトンを除去した。

４℃にて０．０２５Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４中 で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア（Ｐｈａｎａ ａｃｉａ））の２．５×１０ｃｍカラムにジメチルアジピミダート架橋ヘモグロ ビン４０ｍｇ／ｍｘを適用した。負荷容量はカラムベッド容量の１％で、液速は ０．４５ｍ１／分であった。クロマトグラフィーからのピークをプールし、プル した試料を５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（前記）上の５ＥＣ−ＨＰＬＣによっ て分析してそれらのうちのヘモグロビン種の分子量分布を決定した。プレーカラ ムまたは負荷試料もまた５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムで分析した。

分取用サイズ排除クロマトグラフィーはＤＭＡ架橋ヘモグロビンを２つの主要画 分に分離した。画分１はより高分子量の架橋ヘモグロビン種を含有し、合計５１ ．３％の回収ヘモグロビンを示した。画分２は６４０００未満の分子量の架橋ヘ モグロビンを含有した。ブｌノーカラム架橋ヘモグロビン画分の５ＥＣ−ＨＰＬ Ｃは、それが、＞４０００００ダルトンとして２６％、＞６４０００ダルトンと して４７２％、および＜６４０００ダルトンとして５０．２％含有することを示 した。分析５ＥＣ−ＨＰＬＣより、分取用サイズ排除クロマトグラフィーからの 画分１は＞４０００００ダルトンとして４．７％、＞６４０００ダルトンとして ９２７％、および＜６４０００ダルトンとして２．６％含有した。本性は低分子 量ヘモグロビン種を除去するのに成功した。

国際調査報告 、、１．＆ｌ−Ｎ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０７１５５国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ 、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、 　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、 　ＳＵ、　ＵＳ （７２）発明者　ライル、ステイーブン・バーカーアメリカ合衆国ミシガン州４ ９００１、カラマズー、ウェスト・コルク・ストリート３９番

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．イミドエステルで架橋され、それにより優位に四量体形態で存在し、かつ少 なくとも１３ｍｍ　ＨｇのＰ５０を有する実質的に不純物のないヘモグロビンよ りなる、生細胞に酸素を輸送するのに有用な架橋ヘモグロビン組成物。
2. ２．該イミドエステルがジメチルアジピミダートまたはジメチルスベルイミダー トである請求の範囲第１項記載の架橋ヘモグロビン組成物。
3. ３．該架橋ヘモグロビンの少なくとも８０％が少なくても６４０００の分子量を 有する請求の範囲第１項記載の架橋ヘモグロビン組成物。
4. ４．該架橋ヘモグロビンの少なくても９５％が少なくとも６４０００の分子量を 有する請求の範囲第１項記載の架橋ヘモグロビン組成物。
5. ５．医薬上許容される担体媒質を包含する請求の範囲第１項記載の架橋ヘモグロ ビン組成物。
6. ６．該医薬上許容される担体媒質が精製水または生理食塩水である請求の範囲第 ５項記載の架橋ヘモグロビン組成物。
7. ７．トリスーＨＣ１緩衝液よりなる重合溶液中にて少なくても８．０のｐＨでイ ミドエステルで精製ヘモグロビン溶解物を架橋させ、それにより、該架橋ヘモグ ロビンは優位に６４０００の分子量および少なくても１３のＰ５０を有すること を特徴とする酸素輸送に有用な架橋ヘモグロビン組成物の製法。
8. ８．該重合溶液がＮａＣｌを包含する請求の範囲第７項記載の製法。
9. ９．該ｐＨが８．０ないし約１２．０である請求の範囲第７項記載の製法。
10. １０．該重合溶液が５０ｍＭトリスーＨＣｌおよび約０．１ないし約２．０ＭＮ ａＣｌを含有する請求の範囲第７項記載の製法。
11. １１．該精製ヘモグロビン溶解物が脱酸素したものである請求の範囲第７項記載 の製法。
12. １２．サイズ排除による低分子量ヘモグロビンの除去を含む請求の範囲第７項記 載の製法。
13. １３．該サイズ排除をクロマトグラフィーで行う請求の範囲第１２項記載の製法 。
14. １４．該イミドエステルがジメチルアジピミダートまたはジメチルスベルイミダ ートである請求の範囲第７項記載の製法。
15. １５．該重合を、等量の該イミドエステルでの該精製ヘモグロビンの反復処理に よって行う請求の範囲第７項記載の製法。