SK54993A3 - Imidoester cross-linked hemoglobin compositions - Google Patents
Imidoester cross-linked hemoglobin compositions Download PDFInfo
- Publication number
- SK54993A3 SK54993A3 SK54993A SK54993A SK54993A3 SK 54993 A3 SK54993 A3 SK 54993A3 SK 54993 A SK54993 A SK 54993A SK 54993 A SK54993 A SK 54993A SK 54993 A3 SK54993 A3 SK 54993A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hemoglobin
- cross
- linked
- molecular weight
- linked hemoglobin
- Prior art date
Links
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 269
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 268
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 19
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 30
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical group COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 abstract description 5
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 46
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 40
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 229940067631 phospholipid Drugs 0.000 description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- PJDINCOFOROBQW-LURJTMIESA-N (3S)-3,7-diaminoheptanoic acid Chemical group NCCCC[C@H](N)CC(O)=O PJDINCOFOROBQW-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethyl Chemical group C[CH]N LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011470 Adenanthera pavonina Nutrition 0.000 description 1
- 240000001606 Adenanthera pavonina Species 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 208000001613 Gambling Diseases 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 101710169603 Hemoglobin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710169609 Hemoglobin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100084404 Mus musculus Prodh gene Proteins 0.000 description 1
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000069444 Tetrameres Species 0.000 description 1
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical class OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- SDIXRDNYIMOKSG-UHFFFAOYSA-L disodium methyl arsenate Chemical compound [Na+].[Na+].C[As]([O-])([O-])=O SDIXRDNYIMOKSG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- AEWOYSOMXYFKAQ-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl carbamate Chemical compound NC(=O)OCO AEWOYSOMXYFKAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- PBOSTUDLECTMNL-UHFFFAOYSA-N lauryl acrylate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOC(=O)C=C PBOSTUDLECTMNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 230000006855 networking Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940021317 other blood product in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical group 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Štruktúra a funkcie hemoglobínu boli súhrnne popísané v [Bunn H.F., Forget B.G. Hemoglobín: Molecular, Genetic and
Clinicai Aspec ts. W.B. Saunders Companv, Ph i 1ade1 ph i a. 690 strán (1986)]. Cicavčí hemoglobín je tetramér obsahujúci každú z dvoch rôznych jednotiek, alfa a beta. Každá jednotka má približnú molekulovú hmotnosť 16000 a obsahuje hemoskupinu (porfyrínovú jednotku) s centrálnym atómom že.leza. Proteínová časť alebo globín udržuje železo v herne v redukovanej či železná tej forme, čo dovoľuje molekule hemoglobínu viazať reverz i b i 1 n e kyslík.
Nie je možné si predstavovať. že cicavčí hemoglobín je statický tetramér, to znamená jednotný proteín $ molekulárnou t: zložený z jednotiek spohmotnosťou 69-68000. Namiesto toho j e n ý ch n e k o v a 1 e n 111 ý m i v a z. b a m i. a ex i i u j o v o y n a m i c k. o j rovnováhe obsahujúcej interakcie m o n o m é r -d i m é r a d i m é r- f e t. r a iné r . V každom okamihu sa hemoglobín skladá z určitého podielu monoméru s molekulovou limo t.no s t on asi 1.()000, dimérov s molekulovou hmotnosťou 82OOÔ a tet ramérov . !.! i s t r i bú c i a monoméru, diméru a tetraméru v roztoku je závislá na koncentrácii hemoglobínu.
.'inop 1 o b í n u . ako i na nli a soľnom zioženi rôz-
| v či z b o v o m | s 1. a v e |
| toku, v k | t o r m |
| C i ľ: a | V é í |
| r eso. e r y | t r o c y |
| s t r á c a j ú | or i d |
ne m o g ! o 6 i. n toeii. ť r.i do z. r i e va n í je o os i aiinut. ý v é e r v c n ý e h krvinkáels eioa'oooh t i, e i. o špeeinl i o v a n e bur. !<y ; v 11 ’ t * J n d ľ-! <
ti I t» j ··.ti ti mi ii c h o !·. n hemoglobínu, obsahujúce veľmi malé koncentrácie iných proteínov. Hemoglobín sa nachádza v obehových erytrocytoch z mnohých dôvodov. Po prvé, pokiaľ by hemoglobín nebol v bunkách, ale voľne obiehal v roztoku, ľahko by sa dostával z obehu prestupom kapilárnymi stenami, obličkami alebo inými miestami. Niektoré bezstavovce vyriešili tento problém vývojom polymérnych hemoglobínov s miliónovou molekulárnou hmotnosťou, ktoré sú príliš objemné, aby prešli kapilárami a obličkovými nefrónmi . Červené krvinky okrem toho zabezpečujú ochranu molekuly hemoglobínu proti proteolytickým sérovým proteínom, udržiavajú rovnováhu iónov charakteristických pre funkciu hemoglobínu, zabezpečujú enzymatický svstéin, ktorý udržuje železo v herne v redukovanom (funkčnom) stave a kontroluje prítomnosť molekúl s alosterickým účinkom.
Existuje rad pokusov pripraviť roztoky hemoglobínu zbavené stromy ako náhrady krvi pri transfúziách [(Pennell R.D., Smith W.E.: Príprava stabilizovaných roztokov hemoglobínu, Blood, 4: 300-385, (1949); Rabiner S.F
H., Friedman L.H.: Hodnotenie roztokov stromy ako doplnku plazmy. J. Exp.
(1967); Cristensen S.M., Medina Marini M.A.: Príprava , Helbert. J.R., Lopas hemoglobínu zbavených Med. 126: 1127-1142
F., Winslow R.W., Snell S.M.,
Zegna A ľudského Ao hemoglobínu ako prípadnej náhrady krvi. J. Biochem. Biophys. Meth. 17: 143-154 (1988) a Feola M., Gonzalez H., Canizaro P.C., Bingham Vývoj roztokov hovädzieho hemoglobínu zbavenénáhrady krvi. Surg. Gvn. Obst. 157:
D., Periman P. ho stromy ako
399-408 ( 1983))]. Tieto roztoky obsahujú nemodi ŕ i kováný hemoglobín, ktorý môže disociovať na svoje jednotky. Infúzia nemodi fikovaného hemoglobínu vedie k rýchlemu odstráneniu hemoglobínu z obehu. Okrem toho je doložené, že infúzia nemodifikovaného hemoglobínu vyvoláva v tele rad škodlivých účinkov vrátane Nefrotoxicita spojená s nemodifikovaným hemopre biologické vyhodnocovanie a výskum US Food and Drug Adini n i. s tra t i on vydať prehlásenie, že nemodi f i kovaný hemoglobín by nemal byť obsiahnutý v prenášači kyslíka založenom na hemoglobíne.
Existujú početné správy popisujúce stabilizáciu roztokov nefrotoxicitv. globínom prinútila Centrum hemoglobínu vytváraním kovalentných chemických priečnych väzieb medzi polypeptidickými reťazcami hemoglobínu [fiausch C.W., Feola M.: Zvlášť čistá semisyntetická náhrada krvi, medzinárodná patentová prihláška číslo PCT/US 87/02967, Int. publikace číslo W0/88/03408 z 19. mája 1988; Bonhard K., Kothe N.: Sieťovaný hemoglobín s predĺženou sk1adovateľnosťou a zvýšenou schopnosťou prenášať kyslík a spôsob jeho prípravy, US patent číslo 4,777,244, Bucci F.., Razynska A., Urbaitis B., Fronticelli C.: Pseudosieťovanie ľudského hemoglobínu pomocou mono (3,5-dibromsa1icy1) fumarátu. J. Biol. Chem. 264: 6191-6195 (1989) a US patent číslo 4,001,200],
Zmesi sieťovaného hemoglobínu boli popísané v US patentoch 4,001,200, 4,011,401, 4,53,590 a 4,061736. Prácnejšie formy sieťovania hemoglobínu pre nasledujúce čistenie sú rovnako vysvetlené v US patente 4,857,636. Príprava a sieťovanie hovädzieho hemoglobínu boli popísané v Reola M., Gonzalez H., Canizaro P.C., Bingham D., Periman P.: Vývoj roztokov hovädzieho hemoglobínu zbaveného stromy ako náhrady krvi. Surg. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983) a medzinárodnej patentovej prihláške číslo PCT/US 87/02967, Int. publikácia číslo W0/88/03408 z 19. mája 1988.
Reakcia dimetyladipimidátu s normálnym ľudským hemoglobínom (HbA) a hemoglobínom kosáčikovitých krviniek (IlbS) boli popísané v Plese C.F., Amma F.L.: Cirkulárny dichroizmus ako test alosterickej R-T transformácie hemoglobínov a modifikovaných hemoglobínov (1977). US patent 3,925,344 (1975) popisuje sieťovanie hemoglobínu imidoestermi za účelom prípravy plazmového proteínu alebo doplnku plazmy, avšak tento materiál nie je vhodný ako kvapalina prenášajúca kyslík. Pennanthur-Das R., H e a t h R.H. , M e n t z e r W.C. , Lub i n B.H. : Modifikácia hemoglobínu s dimety ladipirnidátom, Príspevok jednotlivých zreagovatiých jednotiek k zmenám vlastností, Biochim. Biophys. Acta 704: 3 89-397 ( 1982) udávajú, že s i e ť ov a n i e pomocou i m i d o e s t e r o v (DMA) zvyšuje afinitu hemoglobínu ku kyslíku, čo ho robí nevhodným pre prenos kyslíka a jeho uvoľňovanie [Pennanthur-Das R . , V i c k e r y 1,. E . . N e n t z e r W . C . , i. u b i n B . H . : Modifikácia hemoglobínu A d i m e t y .1 ad i p i m i dá tom , Príspevok jednotlivých zreago4 vaných jednotiek k zmenám vlastností. Biochim. Biophys. Acta 580: 356-365 (1979)].
Je teda žiadúce, aby bola nájdená metóda sieťovania hemoglobínu, ktorá bv ho stabilizovala prevažne vo forme tetraméru alebo v násobkoch tetraméru, avšak s dostatočne nízkou afinitou ku kyslíku, vyjadrenou ako p50. Potom by účinne transportoval kyslík ' a následne ho uvoľňoval bunkám živého organizmu. Tiež je dôležité, aby molekulová hmotnosť bola prevažne aspoň 64000, čo sú tetramérne formy, s malým až žiadnym podielom pod 64000, čo sú dimérne a monomérne formy a s malým až žiadnym podielom nad 64000, kedy môžu byt molekuly dosť veľké, aby spôsobili ťažkosti v cicavčom organizme. Vývoj takej polymérnej metódy je preto veľmi potrebný pre úspešný vývoj prenášača ky s 1 í ka .
Podstata vynálezu
Jednou častou tohoto vynálezu je zmes sieťovaného hemoglobínu schopná prenášať a uvoľňovať kyslík v živých bunkách. Hemoglobín je v podstate bez nečistôt a je sieťovaný imidoesterom, takže je prítomný hlavne ako tetramér a väčšie oligoméry. Imidoestermi, ktorým sa pri sieťovaní hemoglobínu dáva prednosť, sú dimetyladipimidát alebo ditnetylsuberimidát. Hemoglobín prevažne v tetramérnej alebo vyššej forme je možné interpretovať tak, že aspoň 80 % sieťovaného hemoglobínu má molekulovú hmotnosť aspoň 64000 Daltonov, s výhodou tak, že aspoň 90 až 95 % sieťovaného hemoglobínu má molekulovú hmotnosť aspoň 64000 Daltonov. Naviac je hemoglobín sieťovaný imidoesterom, v porovnaní s hemoglobínom sieťovaným konvenčnými technikami, veľmi stály proti tvorbe methemoglobínu a má afinitu ku kyslíku p50 aspoň 1,733 kPa.
Zmes sieťovaného hemoglobínu môže tiež obsahovať farmaceutický prijateľný nosič na uľahčenie aplikácie transfúzie alebo injekcie do liečeného cicavca alebo na použitie ako kvapaliny prenášajúcej kyslík pre analytické, transplantačné alebo laboratórne účely. Typickým farmaceutický pni ja teľným nosičom m ô ž e by ť. č i s t e n á vo d a a lebo so ľ n é r o z t o k y .
Iným aspektom tohto vynálezu je metóda prípravy sieťovaného hemoglobínu zahŕňajúca a) odber cicavčej krvi. b) oddelenie červených krviniek z odobranej krvi a premytie červených krviniek, c) rozklad premytých červených krviniek, d) odstredenie rozložených červených krviniek, aby sa získal lyzát hemoglobínu, e) čistenie lvzátu anionaktívnou alebo kationaktívnou chromatografiou, f) u 11rafi 1trác i a alebo mikrofi 1trác i a eluovaného lvzátu z chromatografie, čím sa získa čistený hemoglobín a g) sieťovanie čisteného hemoglobínu imidoesterom, aby sa získal hemoglobín prevažne v ťetramérnej forme.
Rozklad červených krviniek je možné uskutočniť hypoosmotíckým šokom. U1traf i 1tráci a sa spravidla robí na membráne s dieliacou molekulovou hmotnosťou 300000 a mikrof .i 1 trác ia sa spravidla robí pomocou filtra 0,025 až 0,040 μm. Prípadne je možné uskutočniť krok (g), sieťovanie imidoestérom po získaní lyzátu červených krviniek, v kroku (d). Potom stupeň (e) začína čistením sieťovaného hemoglobínu. Spôsob môže zahŕňať dodatočný krok (h), v ktorom sa čistený sieťovaný hemoglobín delí podľa veľkosti, aby sa zbavil hemoglobínu s nízkou molekulovou hmotnosťou (menšou než 64000 Daltonov). Delenie podľa veľkosti sa spravidla vykonáva nízkotlakovou deliacou chromatografiou.
Tento vynález teda popisuje zmes hemoglobínu sieťovaného imidoestérom, podstatne zbavenú akýchkoľvek nečistôt, obsahujúcu hemoglobín prevažne v tetramérnej alebo vyššej forme, ktorá má zlepšenú stabilitu voči oxidácii hemoglobínu než tradičnejšie formy sieťovaného hemoglobínu, napríklad s glutaraldehydom. Zmes hemoglobínu tná dominujúcu molekulovú hmotnosť aspoň 64000 Daltonov a má zlepšenú stabilitu voči sieťovaniu. Hemoglobín je vhodný ako náhrada prenosu kyslíka krvou pre cicavce či všeobecne ako kvapalina prenášajúca kyslík.
Tento vynález popisuje metódu čistenia a sieťovania hemoglobínu určitými imi doesterini , ktoré neboli používané v sieťovaní hemoglobínu pre transfúznu terapiu. Tieto si. e ť u júce bifunkčné imidoes téry zahŕňajú medzi inými d ime ty 1 ad i pi midát a dimety1suberimidát. Použitie týchto s i e tujúci c h činidiel má proti p r e d c h á d z a j ú c i m s i e ť o v a d 1 á m h e m o g 1 o b í. n u výhod y . Boli o b j a v e n é zvláštni: reak č n é p o d m i e n k y , k t. o r é p o s k y t u j ú ú z 1< u d i s 6 sieťujúce bifunkčné špecificky a tribúciu molekulových hmotností a vhodné vlastnosti na prenos kyslíka.
Imidoestery ako dimetyladipimidát a dimetylsuberimidát sú činidlá, ktoré reagujú s proteínmi rýchlo v miernych podmienkach.
S epsilon-aminoskupinami lyzínových zvyškov a amínom amínového konca polypeptidového reťazca sa tvoria stále amidínové adukty reagenty.
Kichards pri štúdiu [(Wold F.: Bifunkčné (1972): Peters K., reagenty a problémy Rev. Biochem spravidla s hemoglobínu. reťazcami tetramérnu
Natl. Acad. Sci. beta-82 lyžínov
Metíiods in Enz. 25: 623-651 F.M.: Chemické sieťovanie, membránových štruktúr. Ann.
. 46: 523-551 (1977)]. Sieťujúce činidlá reagujú jednou až dvoma aminoskupinaini na jednotku K určiténu sieťovaniu dochádza medzi dvoma beta lyzínových zvyškov (beta-82), čo stabilizuje formu ľudského hemoglobínu. Dimetyladipimidát bol študovaný ako protikosáčikovité činidlo pre hemoglobín [Lubin
B.H., Pena V., Metzer W.C., Bymun E., Bradley T.B., Packer L.: Dimethyladipimidát: nové protikosáčikovité činidlo. Proc.
U.S.A. 72: 43-46 (1975)]. Modifikácia mení štruktúru deox idovane j formy IlbS a zabraňuje tak kryštalizácii alebo želatinácii. Kryštalizácia je molekulovou bázou kosáčikovitosti pozorovanej pri zasiahnutých červených krvinkách. Aj keď modifikácia beta-82 lvzínu sieťujúcim činidlom je potrebná na zabránenie kosáč ikovi tost i, skutočné spojenie vnútri tetraméru hemoglobínu nie dvoch beta-82 lyzínov vo je nutné. Tento vynález aplikuje dimetyladipimidát. na hovädzí hemoglobín vytvoriť tak medzijednotkových vysokomolekulárne zavedením stabilizované tetramérv väziet) medzi beta-82 lyzíny agregáty stabilizovaných med z imo1 eku 1 á rnych väzieb so zámerom zavedením ako aj tetramérov medzi eps i 1 on-am ino s kup i.nam i jednotlivých stabilizovaných tetramérov hemoglobín vi.
Výhody sieťovania hemoglobínu i m i d o e s t e r m i a zvlášť, d i. mety ] ad i p i in i dá tom sú dvojaké: po prvé, sieťovanie spomalí disociáciu tetramerného hemoglobínu s molekulovou 'hmotnosťou 64000 na dimérv s molekulovou hmotnosťou 32000. V nemodi f iko7 vanom hemoglobíne tetramérna a dimérna forma sú v dynamickej rovnováhe. Stabilizácia tetramérneho hemoglobínu sieťovaním imidoestermi podstatne zníži prechod hemoglobínu do obličkových kanálikov a zabráni filtrácii membránou g 1omeru1árneho puzdra
Po druhé, sieťovanie vedie k vzniku vysokomo1eku1 ových oligomérov tetramérneho hemoglobínu, ktoré budú extrémne odolné voči obličkovej filtrácii a stálejšie voči oxidácii pri fyziologickej teplote než nemodifikovaný hemoglobín či hemoglobín modifikovaný sieťujúcim činidlom g 1 utaraldehydom .
Dimetyladipimidát je relatívne lacné činidlo a je k dispozícii v dostatočnom množstve. Mieru sieťovania pomocou dimetyladipimidátu je možné dobre zväčšovať.
Schopnosť jednotlivých foriem hovädzieho hemoglobínu viazať kyslík sa merala a je uvedená v Tabuľke I. Hodnota p50 je parciálny tlak kyslíka, pri ktorom 50 % dosiahnuteľných centier viazalo kyslík. Hillov koeficient alebo n hodnota je vyjadrenie spolupôsobenia medzi centrami, ktoré viažu kyslík. Vysoká n hodnota znamená vysoké spolupôsobenie. Hodnoty p50 sa merali ako pri oxidácii, tak pri dezoxidácii roztokov hemoglobínu. Priemerné p50 hodnoty boli 1,80 kPa pre hemoglobín sieťovaný dimety 1 ad i pimidátom (DMA), 1,90 kPa pre hemoglobín sieťovaný glutara1dehvdom (GA) a 3,17 kPa pre nemodifikovaný hovädzí hemoglobín. Pokiaľ došlo k veľmi silnému sieťovaniu ako imidoestermi tak glutaraldehydom, p50 hodnoty týchto hemoglobínov boli silne znížené. Sieťovanie hemoglobínu ako iinidoestermi tak g 1utara 1 dehydom rovnako znižovalo spolupôsobenie. Väčšie zníženie sa pozorovalo pri vzorke spracovanej glutaraldehydoin .
Ϊ j
l ’<
Tabuľka I
| Vzorka hemoglobín | p 5 0 oxidácia kPa | p50 dezoxidácia kPa | n |
| Hovädzí Hb | 3,20 | 3,17 2, | 1-2,4 |
| Hb + GA | 2,00 | 1,80 | 1,2 |
| Prebytok GA | 0,93 | 0,87 | .1 , 1 |
| Hb+DMA | 1,87 | ί 1,90 | 1,6 |
| Prebytok DMA | 1,33 | 1 , 20 | 1,5 |
Porovnávala sa stabilita rôzne sieťovaných hemoglobínov a ukázalo sa, že hemoglobíny sieťované imidoestermi majú lepšiu stabilitu. Preto imidoester poskytol pri vhodných podmienkach sieťovania, popísaných nižšie, lepší hemoglobín na transport kyslíka, posudzované podľa stability a afinity ku kyslíku .
Počas inkubácie pri 36-37 °C vzorky hemoglobínu sieťovaného dimety 1adipimidátom, g 1utara1dehydom a nemodifikovaný hemoglobín obsahovali na začiatku inkubácie 2,5 %, 8 % a 3,5 % methemog1obínu. Po 5 hodinách pri 36-37 °C percentá methemoglobínu boli 8,9 %, 44,4 % a 0 % pre vzorky hemoglobínu sieťované dimetyladipimidátom, g 1utara1dehydom a nemodifikovaný hemoglobín. Po 24 hodinách koncentrácie methemog1obínu boli
24,1, 87,9 a 42 % pre vzorky hemoglobínu sieťované dimetvladipimidátom, g 1utara1dehydom a nemodi f i kovaný hemoglobín. Po 48 hodinách koncentrácie methemoglobínu vo vzorkách hemoglobínu sieťovaného d i m e t y 1 a d i p i m i d á t o m a pri n c m o d i f i k o v o n o m hemoglobíne boli 46,5 % a 6 8 %. Hemoglobín sieťovaný diinetvladipimidátom bol stabilnejší, než nemodifikovaný hemoglobín, proti tvorbe methemog1obínu. Literatúra udáva, že ľudský hemoglobín sieťovaný g 1utara ldehydom sa samovoľne oxiduje štyrikrát rýchlejšie než nemodi fikovaný ľudský hemoglobín. Preto sa nedalo očakávať, že hemoglobín sieťovaný d imety 1 ad i pi midátom bude stálejší než nemodi f i kovaný hemoglobín.
Stálosť n e m o d i f i k o v a n é h o h o vä dz i e 11 o h e m o g 1 o bí n u a hovädzieho hemoglobínu sieťovaného d ime ty J ad i. pimi dá tom č .i glutaraJdehýdom voči oxidácii sa tiež merala pri inkubácii počas 52 dní pri 4 °C v rovnakom fosfátovom tlmivom roztoku, ako je popísané hore. Po '2 8 dňoch sa v hovädzom hemoglobíne sieťovanom dimetyladipimidátom zvýšil obsah methemoglobínu z 2,5 % na
9,6 %. V tom istom období sa zvýšil obsah methemoglobínu v hemoglobíne sieťovanom glutaraldehydom z 8 % na 23,5 %. Pri meraní po 52 dňoch hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom obsahoval 14,3 % methemoglobínu, zatiaľ čo po 37 dňoch nemodifikovaný hovädzí hemoglobín obsahoval 16,3 X methemoglobínu. Rovnako ako pri inkubácii pri teplote 37 °C hemoglobín sieťovaný. dimetyladipimidátom bol významne stabilnejší než hemoglobín sieťovaný glutaraldehydom či nemoci i f i kovaný hovädzí hemoglobín .
Jeden aspekt tohto vynálezu sa týka zvýšenia stability cicavčích hemoglobínov vrátane hovädzieho hemoglobínu pre sieťovanie imidoestermi vrátane dimetyladipimidátu. Tu sa popisuje, ako sa stabilita cicavčích hemoglobínov môže zvýšiť reakciou s imidoestermi, špecificky s dimetyladipimidátom pri zvláštnych reakčných podmienkach. Okrem toho je popísaný spôsob výroby čisteného cicavčieho hemoglobínu. menovite hovädzieho hemoglobínu. Hemoglobín bude podstatne zbavený nečistôt, čo znamená, že nebude obsahovať žiadne látky, ktoré by mohli mať nepriaznivé účinky na liečeného cicavca. Hemoglobín bude dostatočne zbavený endotoxínov (napríklad menej než 0,5 EU/ml pri koncentrácii hemoglobínu aspoň 40 mg/ml), fosfolipidov, vírusov a iných nehemoglobínových proteínov pred sieťovaním. Je však rovnako možné najskôr sieťovať hemoglobín po zhromaždení lvzovaného hemoglobínu a potom čistiť sieťovaný hemoglobín. Tento postup môže byť účinnejší pri výrobe vo veľkom rozsahu. Čistený a sieťovaný hemoglobín bude vhodný ako náhrada krvi pre transfúzie u ľudí α zvierat.
Hemoglobín podľa tohto vynálezu sa spravidla pripraví odberom cicavčej krvi v aseptických podmienkach, premytím červených krviniek, ich rozkladom, odstredení m rozložených červených krviniek, u 1 traf j J trác i ou pomocou membrány s molekulovou hmôt no s t.o u aspoň 300000 alebo m i k r o f i 1 t. r á c i o u pomocou filtra 0,02 5 až 0,04 0 mikrometrov, čistením lyža f u au i onaktí vnou alebo kationaktívnou chromatografiou. aby sa získal čistený he10 moglobín a potom sieťovaním čisteného hemoglobínu imidoesterom, prípadne sa hemoglobín delí podľa veľkosti rozmerovou vylučovacou chromatografiou alebo u 1traf i 1tráciou, aby sa odstránil nízkomo1ekuίový hemoglobín.. Alternatívne sa môže hemoglobín sieťovať po odstredení a oddelení lvzátu. Čistenie sa potom môže robiť spolu s prípadným delením podľa veľkosti.
Takto’ pripravený hemoglobín bude podstatne zbavený nečistôt a bude tvorený prevažne stabilizovaným tetramérom. Iným spôsobom charakterizácie sieťovaného hemoglobínu je to, že má rozdelenie molekulovej hmotnosti prevažne aspoň 64000. Prevažne, tak ako sa tu používa znamená, že produkt obsahuje aspoň 80 % sieťovaného hemoglobínu, s výhodou 90 až 95 % sieťovaného hemoglobínu.
Aby sa pripravil hemoglobín špecializovaný na prenos kyslíka, sú špecifikované rôzne parametre sieťujúcej reakcie. Najprv koncentrácia chloridového iónu a/alebo chloridu sodného, ktorá má významný účinok na stupeň sieťovania (hovädzieho) hemoglobínu pomocou DMA v rozmedzí od 1 mmol Tris-HCl do 50 mmol Tris-HCl plus 2,0 Mol NaCl. V 1 a 10 mmol Tris-HCl po 10 pridaniach DMA zostalo nespo1ymerizované 90,3 X, respektíve
72,2 % hemoglobínu. Na rozdiel od tohoto výsledku v prítomnosti 50 mmol Tris-IICl s 0,1, 1,0 a 2,0 mmol NaCl zostalo nesieťované iba 25,0, 24,4 a 20,7 % hemoglobínu. Stály pokles nespolymerizovaného hemoglobínu a vzostup vysokej molekulovej hmotnosti (nad 400000 Daltonov) bol pozorovaný pri zvyšovaní koncentrácie soli. Najväčší podiel
64-400000 sa pozoroval pri sieťovaní hemoglobínu v rozsahu buď v 50 mmol Tris-HCl alebo v 50 mmol Tris-HCl + 100 mmol NaCl.
Po druhé sa ukázalo, že tlmivého roztoku. Napríklad na sieťovanie má silný vplyv typ reakcia sieťovania DMA prebiehala zle v roztokoch obsahujúcich glycín-HCl, etano1amín-HC1 a fosfát sodný + lyzín. Predpokladá sa, že v t ý c h t. o typoch 11 m i v ý c h roztokov primárny am í n i nh i boval sieťujúcu reakciu, o ktorej sa domnievame, že p r t; b i e b a p r i m á r n e n a a m i n o skúpi n á c h N-konca proteínu a na jeho lyží nových zvyškoch. Najväčší rozsah sieťovania bol pozorovaný v prítomnosti tlmivého roztoku s 2-amino-2-me ty 1 - 1-propano l oin , kedy zostalo len 23,4 X liemo11 sietovany len na 27,2 rom pre sieťovanie.
Po tretie hralo rom dôležitú úloh pH.
globínu nezosieťovaného. Tento tlmivý roztok má rovnako primárnu amínovú skupinu. Nasledujúcimi štyrmi tlmivými roztokmi, podľa účinnosti pri sieťovaní s DMA, boli tr i s (hydroxymety 1 )-atninome tán , uhličitan sodný. CHES [2-(N-cyk1ohexy1amino)-etánsu1 fónová kyselina] a CAPSO [3-(cyk1ohexy1 am i no)-2-hydroxy-1-propánsu 11ónová : kyselina].
Tri z nich majú primárnu aminovú skupinu. Naproti tomu C’APS [3-(cyklohexy1 amino)-1-propánsu1 fónová kyselina] nebol dobrým tlmivým roztokom pre reakciu sieťovania a výsledný produkt bol %. Fosfát sodný nebol tiež vhodným výbepri polymerizácii hemoglobínu imidoesteNapríklad pokusy sieťovať hemoglobín DMA pri pH hodnotách nižších než 8,0 boli spravidla neúspešné. Pri pH 8,0 po 10 pridaniach DMA a konečnom stechiometrickom pomere DMA k hemoglobínu rovnom 10 bol hemoglobín zosieťovaný len na
12,2 To. Zvýšenie účinnosti sieťovania sa pozorovalo pri pH 9,0, 10,0 a 10,5, kde zostalo nezosieťovaných len 58 Ί, ú 8 % a 50 % hemoglobínu na konci pridávania DMA. Z týchto výsledkov je zrejmé, že reakcia DMA s hemoglobínom vyžaduje k tomu, aby bola úspešná, pH 9,0 alebo vyššie.
Nakoniec bolo pozorované, že deoxidovaný hemoglobín sa ľahšie sieťuje ako hemoglobín oxidovaný.
Po zabezpečení hore uvedených po 1ymerizačných podmienok na optimálne sieťovanie ne z o s i eťovaný hemoglobín je možné odfiltrovať alebo chromatografovať na výťažok molekulovej hmotnosti 6ú000 alebo vyšší a potom ďalej odfiltrovať alebo chromatograf ova ť, aby sa získala molekulová hmotnosť prevažne 6A000. Optimalizácia sieťovania hemoglobínu teda značne uľahčuje ekonomickú a praktickú prípravu materiálu na prenos kyslíka podľa tohoto vynálezu, ktorý má prevažnú molekulovú hmotnosť 6A000 až 300000.
Po získaní zosieťovaného hemoglobínu sa tento spravidla zavedie do farmaceutický prijateľného nosiča pre infúzie alebo injekcie do liečeného cicavca. Typický farmaceutický prijateľný nosič môžu tvoriť fyziologicky prijateľné roztoky solí, vhodné pre infúzie alebo injekcie, ako s ú komerčné roztoky so1 2 lí. Farmaceutický prijateľným nosičom môže byt ktorákoľvek z rôznych kvapalín, ktoré by boli relatívne inertné voči zosietovanému hemoglobínu a nemali by škodlivý účinok na cicavca, ktorému by boli podávané. Vhodné kvapaliny môžu tiež zahŕňať iné krvné produkty, buď prirodzené alebo umelé, alebo kvapalné fluórouhlíky. Zosieťovaný hemoglobín podľa tohoto vynálezu sa spravidla zmieša s farmaceutický prijateľným nosičom, takže sa koncentrácia hemoglobínu môže upraviť na vhodné rozmedzie od 40 do 140 mg/ iní.
Predmet tohto vynálezu je popísaný v nasledujúcich príkladoch podrobnejšie podľa zhora uvedených jednotlivých krokov a molekulového zloženia. Popísané spôsoby sú použiteľné pre ľubovoľný cicavčí hemoglobín, i keď pre úlohy špecifických príkladov, ktoré popisujú čistenie, sieťovanie a modifikáciu, sa používa hovädzí hemoglobín. Hovädzí hemoglobín však má výhodu v tom, že má veľmi vysokú hodnotu p50, vhodnú pre transport kys 1íka.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Odber krvi a príprava hemolyzátu Červených krviniek mi nožnicami. Oholená plocha nasiaknutou jódovou tinktúrou
Krv sa odoberala za aseptických podmienok Holsteinským kastrátom na farme firmy The Upjohn Company Agricultural Division. Najprv sa oholili chlpy na krku každého býka elektrickýs a potom vytrela látkovou šatkou Nasledovalo umytie 95 X etanolom zo striekačky. Etanol sa nechal pred odberom krvi uschnúť na vzduchu. Odoberalo sa 0,5 až 1,0 litra krvi. do evakuovaných fliaš pre odber krvi, ktoré boli sterilné a zbavené pyrogénov. Pred odberom krvi sa pridalo do každej fľaše vhodné množstvo sterilného roztoku sodného liepa rinú. Ihneď po odbere sa fľaše n í. m sa d o p r a v o v a 1 i do i a b o r a t ó r i a
Pre p o uložili na ľad a čia točné skúšky sa odoberalo 2,5-5,0 litra krvi.
V laboratóriu sa všetko vykonávalo buď na ľade alebo pri °C, aby sa minimalizoval rast mikroorganizmov a s ním spoje13 val i v 1,6 % soľanke otáčkami/min pri 4 0 C ná tvorba pyrogénov. Okrem toho by sa čistiace kroky mali vykonával: v čistom prostredí s filtrovaným vzduchom, ktorý má nízky obsah častíc. Prvé kroky čistenia hemoglobínu zahŕňajú oddelenie červených krviniek od krvnej plazmy, s následným opakovaným premývaním červených krviniek roztokom soli a odstredením pre peletizáciu červených krviniek. Celá krv sa najprv preniesla do 0,51 odstredivkových fliaš zbavených pyrogénov a odstreľovala sa 30-40 minút 4000 otáčkami/min pri 4 °C. Červené krvinky s pri odstreďovaní pe1etizova1 i. Odstredená krvná plazma sa oddelila odsatím. Červené krvinky sa znovu suspendovali v ľadovo chladnom roztoku obsahujúcom 16 gramov chloridu sodného (NaCl) v lit.ri čistenej vody. Tento roztok sa označuje ako 1,6% soľanka. Červené krvinky sa suspendovali miešaním sterilnou sklenenou tyčinkou zbavenou pyrogénov alebo opakovaným miernym prevracaním odstredivkových fliaš. Po suspendovaní sa červené krvinky znovu odstreľovali 30-40 minút 10000 otáčkami/min pri 4 °C. Červené krvinky sa opät suspendoa znovu odstreľovali 30-40 minút 10000 Červené krvinky sa premývali v 1,6 % soľanke celkom trikrát pred ich prasknutím alebo lýzou.
Po premytí červených krviniek sa červené krvinky rozkladali hypoosmotickým šokom nasledujúcim spôsobom: K jednému objemu premytých pe1etizovaných červených krviniek sa pridali štyri objemy ľadovo chladného 2,5mrnol tlinivého roztoku fosforečnanu sodného s pH 7,4. Červené krvinky sa súspendovali v tomto zriedenom fosforečnánovom tlmivom roztoku miernym prevracaním odstredivkových fliaš. Po úplnom r o z p t ý 1 e n í krviniek sa suspenzie červených krviniek inkubovali pri 0-4 °C jednu hodinu s nasledujúcim odstreľovaním 30-40 minút 10000 otáčkami/min p r i 4 0 C. Po o d s t r e d e n í s a h e m o g i o h í n v su pernátante získal odsatím. V niektorých pokusoch sa postup upravil nasledujúcim spôsobom: po jednohodinovej inkubácii v 2,5mmol tlmivom roztoku ťosforčnanu sodného pri 4 C sa pridal 2,0 mol roztok chloridu sodného na konečnú koncentráciu 0,2 mol NaCl pred od s t r eil e n í m . Pridanie chloridu sodného k lvzátu červených krviniek viedlo k čistejšiemu supernatantu po odstredení.
Prípravu h e m o lvzátu je možné po odstredení vylepšil’. Oo
- 14 odstredeného lyzátu je možné zamiešať pomocný filtračný prostriedok, ktorým môže byť buď celulóza, alebo kremelina, či polymérny alebo kremičitý derivát. Tento prostriedok sa potom odstráni buď filtráciou alebo odstredenim. Do pomocného filtračného prostriedku sa zachytia ďalšie úlomky stromy, ako fosfolipidy, ktoré by sa snáď neodstránili odstredení m.
Alternatívou k hypoosmot ickému šoku pre rozklad červených / krviniek je mechanické rozdrvenie napr. pomocou Francúzskeho lisu alebo veľkokapacitným bunkovým homogen izátorom.
Obsah pyrogénov v štyroch spracovaných hemolvzátoch kolísal medzi 0,05 až 0,2 jednotiek endotoxínu (EU) na ml v teste na pyrogény s Limulus Amoebocyte Lvzátom (LAL). Ďalšie spracovanie pomocou ani ónakt í vrie j alebo katiónaktívne j chromatografie by odstránilo posledné stopy endotoxínu a fosfo 1ipidov.
Príklad 2
Zníženie obsahu vírusov
Pokiaľ je hovädzia krv zamorená vírusmi, určitá časť vírusovej záťaže sa odstráni premývaním červených krviniek pri ní zkootáčkovom odstreďovaní. Ďalší podiel sa odstráni pri vysokootáčkovom odstreďovaní hemolyzátu a zostane v tuhom zvyšku. Iná časť sa stratí pri zdokonalenom čistení.
Ďalšia redukcia vírusovej záťaže je možná mikrofiltráciou alebo u 1traf i 1tráciou. M ikrofi 1 trácia pomocou filtra 0,025 až 0,060 mikrometrov podstatne zníži obsah väčšiny vírusov. Mikrofiltračná náplň Ultipor N66 nylon 66 firmy Pall Corporation má porozitu 0,06 mikrometrov a je možné ju použiť na filtráciu hemolyzátu pred ďalším spracovaním. Naviac je v prípade potreby k dispozícii u 11rafilt ra č ná membrána s oddeľovacou molekulovou hmotnosťou 300000 od firmy Filtron Corporation, ktorá sa vkladá do u 1traf iltrač ne j produkčnej jednotky Pellicon firmy Amicon Corporation. Hemoglobín prejde voľne týmito ultraa mi kro f i 1 f račnýin i membránami, zalial' čo časť vírusov sa zachytí. Preto kombinácia týchto dvoch filtračných membrán podstatne zníži vírusovú záťaž. Obidva typy filtrov majú nízku z á d r ž pr o t e í n ov.
Vedľa filtrácie sa obsah vírusov vo filtrovanom hemolyzáte môže zmenšiť prídavkom vhodných detergentov, ety 1éndin itrotetraoctovej kyseliny, trinitrobuty 1 fosfátu, čo je činidlo schválené FDA, alebo kombináciou týchto látok.
Príklad 3
Iónová výmenná chromatografia hemoglobínu
Anionaktívna výmenná chromatografia sa používala široko na čistenie ľudských hemoglobínov [Williams R.C., Tsav K.: Anál. Biochem. 54:137-45 (1973)]. Pri vhodnom pH a iónovej sile sa hemoglobín môže zaviesť na menič aniónov (anex) tak, aby sa naň viazal. Proteínové a neproteínové nečistoty sa oddelia od hemoglobínu pri premývaní kolóny. Je možné tiež zvoliť podmienky, pri ktorých má hemoglobín malú alebo žiadnu afinitu k vybranému anexu. Pri týchto podmienkach nečistoty zostanú na v čerstvo pripravenom hemolyzáte zvyškové vírusy, ktoré sa neodstránili v predchádzajúcich výrobných krokoch, nízkomo1eku1ové bakteriálne endotoxíny a iné proteíny než hemoglobín. Fosfolipidy, endotoxíny a plazmové proteíny majú vyšší záporný náboj než hemoglobín a mali by mať vyššiu afinitu k meniču aniónov podmienkach. Vo vhodných zavádzacích a elučných aniónaktívna výmenná chromatografia by inala byť oddelenie hemoglobínu od týchto nečistôt.. Okrem toho by aniónaktívna výmenná chromatografia mala ďalej znížiť vírusovú záťaž.
Používali sa tri postupy aniónaktívnej tografie na čistenie hemoglobínu: viazanie a vymývanie pri znižujúcom sa pH gradiente, viazanie pri zvýšenom pH a vymývanie pri. s tupú o v i tom gradiente nižších pH a zavádzanie pri hodnotách pH, pri ktorých sa hemoglobín neviaže na menič aniónov, ale prechádza kolónou bez zadržania. Všetky pokusy prebiehali na kolónach, dá sa však predpokladať, že je možné nájsť podobné podmienky pre šaržové spracovania, ktoré bv dali temer zhodné výsledky. Anexom používaným pri týchto pokusoch bola Q-Sepharose Fast Flow firmy Pharmacia. Je kolóne. Hlavnými nečistotami sú fosfolipidy, potenciálne vo vybraných podmienkach užitočná pre výmennej chromapri zvýšenom pH možné však predpokladať, že tieto postupy budú použiteľné s radom komerčných anexov pre nízky až stredný tlak, ktoré boli vyvinuté na čistenie proteínov, vrátane tých, ktoré majú kvartérne aminové a diéty 1aminoetyLové skupiny.
Kat.iónaktí vna výmenná chromatograf i a sa tiež široko používala pri čistení cicavčích hemoglobínov [Bucci E.: Príprava izolovaných reťazcov ľudského hemoglobínu. Meth. in Enzymol.
/
76: 97-106 (1981)]. Pri vhodnom pH a iónovej sile hemoglobín je možné zaviesť na menič katiónov (katex) tak, aby sa naň viazal. Fosfolipidy, endotoxíny a plazmové proteíny by mali vykazovať nižšiu afinitu ku katexu v podmienkah, pri ktorých sa viaže hemoglobín. Pri vhodných zavádzacích a elučných podmienkach katiónaktívna výmenná chromatograf i a by mala byť užitočná pre oddelenie hemoglobínu od týchto nečistôt. Okrem toho by katiónaktívna výmenná chromatografia mala ďalej znížiť vírusovú záťaž .
Boli navrhnuté dva postupy katiónaktívnej výmennej chromatografie na čistenie hemoglobínu. Pri prvom sa hemoglobín zavádzal v podmienkach, kedy sa viaže na katex, a potom sa vymýva pri lineárnom pH gradiente. Pri druhom postupe sa hemoglobín zavádzal v podmienkach, kedy sa viaže na katex a potom sa vymýva pri stupňovitom pH gradiente. Pri obidvoch postupoch fosfolipidy a endotoxíny prechádzajú bez zadržania živicou, a tým sa tieto nečistoty oddelia od hemoglobínu. Je možné použiť rad komerčných katiónaktívnych živíc. S výhodou sa používal katex S-Sepharose Fast Flow firmy Pharmacia, pre svoje vynikajúce viazanie proteínov a prietokové charakteristiky. Je možné predpokladať, že podobnú funkciu splní mnoho ďalších nízko- až strednotlakových chromatografickýeh živíc so sulfopropvlovými a karboxvmety 1ovými skupinami. Zväčšenie meradla pri týchto živiciach je ekonomické.
Príklad 3 A
A n i ó na k t. í vna výmenná chromatograf ia s lineárnym pH grád í entom.
Tento pokus ukázal podmienky a n i. óna k t í vne j výmennej chromaiografie, pri ktorej sa hovädzí hemoglobín zavádzal na menič
- 17 aniónov a potom sa vymýval pri lineárnom pH gradiente. Kolóna 2,5x5,5 cm s Q-Sepharose Fast Flow sa pripravila a vyčistila pôsobením 0,5mol NaOH cez noc. Kolóna sa premyla lOOinmol Tris, pH 8,5, až odtok z kolóny mal pH 8,5. Potom sa kolóna vyvážila 50mmol Tris, pH 0,5. Päť ml vzorky čerstvo pripraveného hemolyzátu hovädzích červených krviniek, obsahujúcej približne 350 mg hemoglobínu, sa zriedilo na 10 ml so lOOmmol Tris, pH
8,5 a zaviedlo na kolónu Q-Sepharose Fast Flow rýchlosťou 2,5 ml za minútu. Po zavedení sa kolóna premývala SOmmol Tris, pH
8,5, až sa absorbancia odtoku z kolóny vrátila na základ. Kolóna sa potom vymývala lineárnym gradientom pozostávajúcim z východiskového tlmivého roztoku oproti ôOinmol Tris, pH 6,5, na desať objemov kolóny. Hemoglobín sa vymýval v podstate ako jediný hlavný pík s mnohými menšími píkmi vymývanými pred a za ním. Jediný hlavný pík obsahoval 95 X hemoglobínu, ktorý bol zavedený na kolónu. Všetky c hromatograf ické postupy sa vykonávali pri 5 ’C.
Príklad 3D
Aniónaktívna výmenná chromatografia so stupňovitým pH gradientom
Tento pokus ukázal podmienky aniónaktívnej výmennej chromatografie, pri ktorých sa hovädzí hemoglobín zavádzal na menič, a potom sa vymýval jedným krokom pH gradientu. Kolóna 2,5x5,5 cm s Q-Sepharose Fast Flow sa pripravila a vyčistila ako v Príklade 3Λ. Osem ml vzorky hemolyzátu hovädzích červeobsahujúcej približne 400 mg hemoglobínu, sa ml s 50mmol Tris, pH 0,5 a zaviedlo na kolónu ml za minútu. Po zavedení sa kolóna premývala
50mmol Tris, pH 8,5, až sa absorbancia odtoku z kolóny vrátila na základ. Kolóna sa potom vymývala 50mmol Tris, pH 7,4. Obsah hemoglobínu prítomného v bohatej frakcii Q-Sepharosy bol takmer zhodný s tým, ktorý bol zavedený na kolónu. To ukazovalo na takmer kvantitatívny výťažok tohto kroku.
ných krviniek zriedilo na 16 rýchlosťou 2,7
Príklad
3C
Aniónaktívna výmenná chromatografi a pri ktorej sa hemoglobín ne zachytáva
Tento pokus ukázal podmienky aniónaktívnej výmennej chromatografie, pri ktorých sa hovädzí hemoglobín neviazal na anex, ale prechádzal kolónou bez . zádrže. Kolóna 2.5x5,5 cm s Q-Sepharose Fast Flow sa pripravila a vyčistila pôsobením 0,5mol NaOH cez noc. Kolóna sa premyla lOOmmol Tris, pH 7,4 až odtok z kolóny mal pH 7,4. Desať ml vzorky čerstvo pripraveného hemolyzátu hovädzích červených krviniek, obsahujúcej 880 mg hemoglobínu, sa zriedilo na 40 mi s SOmmol Tris, pH 7,4 a 35 ml sa zaviedlo na kolónu rýchlosťou 2,5 ml za minútu. Po zavedení sa kolóna premývala 50mmol Tris, pH 7,4, až do skončenia vymývania hemoglobínu. Hemoglobín prechádzal kolónou bez zachytenia a výťažok bol 88 %.
Príklad 3D
Katiónaktívna výmenná chromatografia hemoglobínu
Tento pokus ukázal podmienky katiónaktívnej výmennej chromatografi e, pri ktorej sa hovädzí hemoglobín zavádzal na katex a potom sa vymýval pri lineárnom pH gradiente. Kolóna 2,5x5,5 cm s S-Sepharose Fast Flow sa pripravila a vyčistila pôsobením 0,5mol NaOH cez noc. Kolóna sa premyla lOOmmol Bis-Tris, pH 6,0 až odtok z kolóny mal pH 6,0. Potom sa kolóna vyvážila 50mmol Bis-Tris, pH 6,0. Päť ml vzorky čerstvo pripraveného hemolyzátu hovädzích červených krviniek sa zriedilo na 10 ml s SOmmol Bis-Tris, pH 6,0 a zaviedlo na kolónu
S-Sepharose rýchlosťou 2,5 ml za minútu. Po zavedení, sa kolóna premývala 50mmol Bis-Tris, pH 6,0, až sa absorbancia odtoku z kolóny vrátila na základ. Kolóna sa potom vymývala lineárnym grád i entom pozostávajúcim z ko Iónového tlinivého roztoku a SOmmol Bis-Tris, pH 8,0, na desať objemov kolóny. Všetky chromatografické postupy sa vykonávali pri 5 °C.
P r í k l a d 4
Sieťovanie hovädzieho hemoglobínu d i mety 1 ad i pi mi dátom
Vzorka obsahujúca 170 ing čisteného hovädzieho hemoglobínu sa spracovávala nasledujúcim spôsobom: Sieťujúce reakcie sa robili pri koncentrácii tetraméru - hemoglobínu 1,75 mmol alebo 112 mg/ml. Vysoké koncentrácie tetraméru hemoglobínu podporujú medzimo1eku1árne sieťovanie tetramcrov hemoglobínu. Hemoglobín sa modifikuje v prítomnosti tlmivého roztoku 50mmol Tris, pH 8,8, pri 4 “C, prídavkom ekvimo 1 eku1 ového množstva dimetyladipimidátu (napr. 1,75 mmol d i mety 1 ad i pimidátu na 1,75 mmol tetraméru hemoglobínu). Reakcia s dimetyladipiinidátom sa opakuje osemkrát, v 30 minútových intervaloch pri 4 °C. Pri každom kroku sa pridá 50 mg/ml roztok dime ty ladipimidátu v 0,025inol uhličitane sodnom, pH 9,25, až do konečnej koncentrácie 1,75 mmol. Roztok hemoglobínu sa mieša v priebehu pridávania sieťujúceho činidla a potom sa inkubuje na ľade počas 30 minút. Po každých 30 minútach sa odobrala 0,4ml vzorka a pridalo sa 4 ml 0,25mol fosforečnanu sodného, pH 7,0. Fosfátový tlmivý roztok zastavuje sieťovanie hydrolýzou imidoesteru. K zastaveniu dôjde počas dvoch hodín pri izbovej teplote. Zostávajúci roztok hemoglobínu sa nechá opäť reagovať s sieťujúceho činidla. Osem reakčných cyklov
3,5 hodiny. V tomto pokuse sa používal špecifický imidoester dimetyladipimidát. Iné imidoesterv sa môžu tiež použiť.
čerstvým roztokom sa urobila počas
P r í k 1 a d 5
Rozmerová vylučovacia HPI.C hemoglobínu sieťovaného dimetyladipimidátom
Koncentrácia hemoglobínu sa stanovovala spektrofotomet rieky podľa publikovaných R.E., Benesch R., Yund S extinkčných koeficientov [Benesch Rovnica pre s p e k t. r o f o t o m e t r i c k ú dukty analýzu zmesí, hemoglobínu. Anál. Biochem. 55: 245-48 ( 1973)]. Reakčné produkty sa sledovali po každom pridaní sieťujúceho činidla pomocou rozmerovej vylučovacej HPLC zastavenej reakcie sa zriedili na (SEC-HPLC). Pro1 mg t e t r a m é r u liemog 1 obínu/m 1 v 0,2mo! fosforečnane sodnom, pH 7,0. Zriedený produkt sa analyzoval rozmerovou vylučovacou HPLC dvoma spôsobmi. Pri prvom sa SEC kolóna Zorbax GF-250 (Dupont) vyrovnala 0,2mol fosforečnanom sodným, pil 7,0 a pr e vá d z k o va 1 a pri 1 ml/min. ( Pharma c ia ) , Obidve kolóny hmotnosťou.
Postupné
Druhý sa uskutočnil na kolóne Superose 12 FPLC vyrovnané 0,lmol fosforečnanom sodným, pH 7,0. sa kalibrovali proťeínmi so známou molekulovou kroky sieťovania dimetyladipimidátom viedli k postupnému zvyšovaniu množstva po 1ymerizovaného hemoglobínu so stabilizovaným tetramérom. Rozsah molekulovej hmotnosti na Superose 12 FPLC bolo možné definovať nasledovne: 1) % nad 400000 Daltonov, 2) % nad 64000 Daltonov a pod 400000 Daltonov a 3) X pod 64000 Daltonov. Po štyroch krokoch sieťovania relatívne percentá boli: 1) 0 %, 2 ) 40,64 %, 3) 59,36 %. Po siedmich krokoch boli % a 3) 45,5 %. Po percentuálne hodnoty: 1) 4,1 %, 2) 50,4 ôsmich krokoch boli percentuálne hodnoty:
1) 7,5 Ί,, 2) 50,6 % a 3) 41,9 X. Pík triedy 3) s hodnotou pod 64000 Daltonov pozostával z jediného symetrického piku s molekulovou hmotnosťou 30000 Daltonov. Táto frakcia sa vymývala spolu s nemodif i kovaným hovädzím hemoglobínom. Predpokladá sa, že sa skladá prevažne z diméru hemoglobínu. Obsah methemoglobínu v hemoglobíne po siedmich krokoch bol pod 2,5 X. Viditeľné spektrum sieťovaného hemoglobínu sa podobalo nemodi fikovanému hovädziemu hemoglebínu.
Príklad 6
E1 ek tro f or é za sieťovaného hemoglobínu na SDS po 1 yakry 1 anii do vo m géle
E1 ekt.ro f or é za na po 1yakry1ovom géle s dodecy 1 su 1 f átom sodným (SDS-PAGE) sa robila so vzorkami sieťovaného a nesledovaného hemoglobínu nasledovne: Vzorky hemoglobínu sa zriedili na 2 mg/ml v 0,005mol fosforečnane sodnom, pH 7,4, 0,15mol NaCl a zriedené vzorky sa zmiešali s 3 dielmi štandardného SDS-gélového tlmivého roztoku s nasledujúcou inkubáciou 3 hodiny pri 37 C. Vzorky sa spracovali na 10-20 % ISS minigéloch v neredukovanej forme. SDS-PAGĽ' sieťovaného hemoglobínu po 7 k r o k o c h s i e ť o vani a u k á z a 1 a , ž t: 8 0 X vzorky s a sieť o v a 1 o m e d z i jednotkami. Aspoň osem mu 1 f i múrov jednotkových molekulových hmotností bolo prítomných, všetky v približne rovnakých podie 1 och .
Príklad 7
Kyslíková rovnováha sieťovaného a ne s i eťovaného hovädzieho hemoglobinu
Meranie kyslíkovej rovnováhy sieťovaného a ne s ieťovaného hovädzieho hemoglobínu sa robilo pomocou prístroja Hemoxanalyzer firmy TCS Medical Industries. Po siedmich reakčných krokoch s d imety 1adipimidá tom vzorka sieťovaného hemoglobínu sa zriedila na 1,5 mg/ml soľankou s fosfátovým tlmivým roztokom, pH 7,4 a podrobila analýze. V rovnakých podmienkach sa tiež analyzovala vzorka nemodi f ikovaného hovädzieho hemoglobínu a vzorka hovädzieho hemoglobínu, ktorá bola sieťovaná v našom laboratóriu gl utaraldehydom s použitím metódy popísanej v Guillochon D. aj.: Účinok g 1utara1dehydu na hemoglobín. Diochem. Pharm. 35: 317-23 (1986). Hodnoty p50 (parciálny tlak kyslíka pri polovičnom nasýtení) v rôznych hemoglobínoch boli: 1,80 kPa pri hemoglobíne sieťovanom dimety1adipimidátom, 1,90 kPa pri hemoglobíne sieťovanom g 1utara1dehydom a 3,17 kPa pri nemodifikovanom hovädzom hemoglobíne.
Príklad 8
Skúšky stálosti n e m o d i f i k o v a n é h o a modifikovaného hovädzieho hemoglobínu
Hovädzí hemoglobín, ktorý prešiel siedmimi krokmi sieťovania dimety 1adipimidátom, nemodifikovaný hovädzí hemoglobín a hemoglobín sieťovaný g l u tara1dehydom sa inkuhovali pri 36-37 °C v O,125inol fosforečnanu sodného, pH 7,1. Koncentrácie hemoglobínu boli 40 mg/ml pri hemoglobíne sieťovanom d imety 1 ad i pi m i dá tom a pri nemodifikovanom hovädzom hemoglobíne a 28 mg/ml pri hemoglobíne sieťovanom g 1utara1 d e hydom . V určitých časových intervaloch sa z každého druhu hemoglobínu odobrali vzorky, zriedili sa 1/100 v O,25rnol fosfátovom tlinivoín roztoku, pH 7,3, a pozorovali sa medzi 680 až 420 nm na skanovacom spektro f otometri, UV-v i d i i e ľne, Model 160 firmy Shimadzu. Obsah inethemog I obi nu sa stanovil analýzou všetkých spektier podľa publikovaných rovníc [Denesch R.E., Benesch R., Yund S.: Rovnica pre spektrofotometrickú analýzu zmesí hemoglobínu. Anál. Biochem. 55: 245-40 (1973)]. Spektrá sa stanovovali pri 22 QC. Hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom a hemoglobín sieťovaný g 1 utara 1 dehydoin sa tiež inkubovali pri 4 °C po dlhšiu dobu. V rôznych časových intervaloch sa odoberali vzorky a obsah methemoglobínu sa stanovil zhora popísaným spôsobom. Hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom a hemoglobín sieťovaný g 1 utara 1 dehydom a nemoci i f i kovaný hemoglobín obsahovali 2,5 %, 8,0 % a 3,5 % methemog1 obinu pred inkubáciou pri 36-37 °C. Po 5 hodinách pri 36-37 °C sa obsah methemoglobínu zvýšil na 8,9 %, 44,4 % a β % v zodpovedajúcich vzorkách. Po 24 h koncentrácie methemog1 obinu boli 24,1, 87,9 a 42 % pre hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom, hemoglobín sieťovaný g 1utara1dehydom a nemodifikovaný hemoglobín. Po 48 h koncentrácie methemog1obínu boli v hemoglobíne sieťovanom dimetyladipimidátom a nemoci i f i kovanom hemoglobíne 46,5 % a 68 Ϊ. Hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom je stabilnejší voči vzniku methemog 1 obi nu ako nemoci i f i kovaný hemoglobín pri 36-37 °C. Podľa literárnych údajov sa ľudský hemoglobín sieťovaný glutaraldehydom samovoľne okysličuje štyrikrát rýchlejšie ako nemodi f i kováný ľudský hemoglobín fGuillochon D. aj.: Účinok g 1utara1dehydu na hemoglobín. Biochem. Pharm. 35: 317-23 (1986)7- Preto sa nedalo očakávať, že hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom bude stálejší voči samovoľnej oxidácii než nemodifikovaný hovädzí hemoglobín.
Stálosť hemoglobínu sieťovaného dimetyladipimidátom či glutaraldehydom voči samovoľnej oxidácii sa merala po inkubácii počas 28 dní pri 4 °C v rovnakom fosfátovom tlmivom roztoku, ako je popi satí é zhora. Po 2 8 dňoch sa pri hovädzom hemoglobíne sieťovanom dimetyladipimidátom zvýšil obsah methemoglobínu z 2,5 % na 9,6 %. V tom istom období sa zvýšil obsah me themog 1 o bi nu pri hemoglobíne: sieťovanom glutaraldehydom z 8,0 % na 23,5 %.
P r í k 1 a d 9
I’reparat í vna rozmerová vylučovacia chromá tograí i a hemoglobínu sieťovaného dimetyladipimidátom
Preparatívna rozmerová vylučovacia chromatografia sa používala na odstránenie nízkomo1eku1 ových podielov (to je pod 64000 Daltonov) z hovädzieho hemoglobínu sieťovaného dimetyladipimidátom. Hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom. 40 mg/ml,' sa naniesol na 2,5x90 cm kolónu Sephacryl S-200HR (Pharmacia) vyrovnanú 0,025mol fosforečnanom sodným, 0,1.5mol NaCl, pH 7,4. Objem násady bol 1 % objemu lóže kolóny a prietok bol 0,45 ml/min. Piky z chromátografi e sa spájali a spojené vzorky analyzovali SEC-HPLC na kolóne Superose 12 FPLC (ako je popísané zhora), aby sa stanovilo rozdelenie molekulových hmotností ich hemoglobínov. Vzorka pred delením sa tiež analyzovala na kolóne Superose.
Preparatívna rozmerová vylučovacia chromatografia rozdelila hemoglobín sieťovaný dimetyladipimidátom na dve hlavné frakcie. Frakcia 1 obsahovala podiely sieťovaného hemoglobínu s vyššou molekulovou hmotnosťou a predstavovala 51,3 % celkove získaného hemoglobínu. Frakcia 2 obsahovala sieťovaný hemoglobín s molekulovou hmotnosťou menšou než 64000. SEC-HPLC nedeleného sieťovaného hemoglobínu ukázala, že obsahuje 2,6 % frakcie nad 400000 Daltonov, 47,2 % had 64000 Daltonov a 50,2 % pod 64000 Daltonov. Podľa analýzy SEC-HPLC čistená fakcia 1 z preparatívnej rozmerovej vylučovacej chromatograf i e obsahovala 4,7 frakcie nad 400000 Daltonov, 92,7 % nad 64000 Daltonov a 2,6 % pod 64000 Daltonov. Táto metóda bola úspešná pri odstraňovaní nízkomo1ekulových typov hemoglobínu.
Claims (15)
- Zmes sieťovaného hemoglobínu na prenos kyslíka do živých buniek, v y z n a č u j ú c a sa tým, že hemoglobín v podstate bez nečistôt., sieťovaný imidoestermi, je prítomný prevažne vo forme tetraméru a má p50 aspoň 1,73 kPa.
- 2. Zmes sieťovaného hemoglobínu podľa nároku 1, v y z n a č uj ú c a s a t ý m , že imidoesterom je dimetyladipimidát alebo dimety 1 suberimidát..
- 3. Zmes sieťovaného hemoglobínu podľa nároku 1, v y z, n a č ujúca sa tým, že aspoň 80 % sieťovaného hemoglobínu má molekulovú hmotnosť aspoň 64000.
- 4. Zmes sieťovaného hemoglobínu podľa nároku 1, v y z n a č ujúca sa tým, že aspoň 95 % sieťovaného hemoglobínu má molekulovú hmotnosť aspoň 64000.
- 5. Zmes sieťovaného hemoglobínu podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľné nosné médium.
- 6. Zmes sieťovaného hemoglobínu podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že farmaceutický prijateľným nosným médiom je čistená voda alebo roztok soli.
- 7. Spôsob prípravy zmesi sieťovaného hemoglobínu na prenos kyslíka do živých buniek, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že sa čistený lyzáť hemoglobínu sieťuje imidoestermi pri pH aspoň 8,0 v po 1ymer i za čnom roztoku obsahujúcom tlmivý roztok Tris-HCl, až má sieťovaný hemoglobín molekulovú hmotnosť prevažne 6 4 000 a p50 aspoň 1 ,73 kí’a .
- 8. Spôsob prípravy podľa nároku 7, v y z n a č u j ú c i tým, že po 1ymer i za č ný roztok obsahuje NaCl.hl
- 9. Spôsob prípravy podľa nároku 7, tým, že pH je od 8,0 do 1.2,0 vyznačuj i sa
- 10.Spôsob prípravy podľa nároku 7, vyzná tým, že po 1ymerizačný roztok obsahuje a od asi 0,1 do asi 2,0 mol NaCl.čujúci sa 50 mmol Tris-HCl
- 11.Spôsob prípravy podľa nároku 7, vyznač u j ú c i sa t ý m , že čistený lyzát hemoglobínu sa deoxidu je.
- 12.Spôsob prípravy podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že. nízkomolekulový hemoglobín sa odstráni rozmerovou frakc i onác i ου.
- 13.Spôsob prípravy podľa nároku 12, vyznačujúc i sa tým, že rozmerová frakcionácia sa uskutočuje chromá togra f om .
- 14.Spôsob prípravy podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m, že imidoesterom je dimetyladipimidát alebo dimetylsuberimidát.
- 15.Spôsob prípravy podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že polymerizácia sa uskutočňuje opakovanou reakciou uvedeného čisteného hemoglobínu s ekvimo1eku1árnym množstvom imidoestéru.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61984090A | 1990-11-29 | 1990-11-29 | |
| PCT/US1991/007155 WO1992009630A1 (en) | 1990-11-29 | 1991-10-03 | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK54993A3 true SK54993A3 (en) | 1993-10-06 |
Family
ID=24483529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK54993A SK54993A3 (en) | 1990-11-29 | 1991-10-03 | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5362855A (sk) |
| EP (1) | EP0559655B1 (sk) |
| JP (1) | JPH06502848A (sk) |
| AT (1) | ATE119917T1 (sk) |
| AU (1) | AU650287B2 (sk) |
| CA (1) | CA2093650A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ281912B6 (sk) |
| DE (1) | DE69108258T2 (sk) |
| DK (1) | DK0559655T3 (sk) |
| ES (1) | ES2069908T3 (sk) |
| FI (1) | FI932461A (sk) |
| HU (2) | HUT64571A (sk) |
| IE (1) | IE914144A1 (sk) |
| IL (1) | IL99785A (sk) |
| MX (1) | MX9102239A (sk) |
| NO (1) | NO931956D0 (sk) |
| NZ (1) | NZ240377A (sk) |
| PL (1) | PL167340B1 (sk) |
| PT (1) | PT99666A (sk) |
| SK (1) | SK54993A3 (sk) |
| WO (1) | WO1992009630A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA918348B (sk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0646130B1 (en) * | 1993-03-16 | 1996-12-11 | Hemosol Inc. | Selective crosslinking of hemoglobins by oxidized, ring-opened saccharides |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| DE4418973A1 (de) * | 1994-05-31 | 1995-12-14 | Barnikol Wolfgang | Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| US6150507A (en) * | 1995-03-23 | 2000-11-21 | Biopure Corporation | Method for producing a purified hemoglobin product |
| US5981716A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Gruppo Lepettit, S.P.A. | Process for the purification of proteins |
| FR2736930B1 (fr) * | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
| US5872015A (en) * | 1996-05-10 | 1999-02-16 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Molecular diversity screening method |
| EP0941130B1 (en) * | 1996-11-05 | 2003-03-26 | Challenge Bioproducts Co., Ltd. | Chemical modification of biomedical materials with genipin |
| US7282220B1 (en) | 1996-11-05 | 2007-10-16 | Hsing-Wen Sung | Genipin-crosslinked gelatin microspheres as drug carrier |
| US6949384B2 (en) * | 2001-12-21 | 2005-09-27 | Spectromedical Inc. | Method for monitoring degradation of Hb-based blood substitutes |
| US7449339B2 (en) * | 1999-11-23 | 2008-11-11 | Nir Diagnostics Inc. | Spectroscopic method and apparatus for total hemoglobin measurement |
| CN100431602C (zh) * | 2003-01-29 | 2008-11-12 | 北原实验室有限公司 | 具有低量四聚体的聚合血红蛋白溶液及制备方法 |
| US7135554B1 (en) * | 2004-01-27 | 2006-11-14 | Biopure Corporation | Method of forming a polymerized hemoglobin solution from stabilized hemoglobin |
| DE102011105525B4 (de) * | 2011-06-24 | 2015-03-26 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Biopolymer-Aggregaten und Viren aus einem Fluid |
| WO2019018403A1 (en) | 2017-07-18 | 2019-01-24 | Virtech Bio, Llc | BLOOD SUBSTITUTES COMPRISING HEMOGLOBIN AND METHODS OF MAKING |
| CN111989568B (zh) * | 2018-04-18 | 2024-05-28 | 积水医疗株式会社 | 血红蛋白分析方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3925344A (en) * | 1973-04-11 | 1975-12-09 | Community Blood Council | Plasma protein substitute |
| US4001200A (en) * | 1975-02-27 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4001401A (en) * | 1975-02-02 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin |
| US4061736A (en) * | 1975-02-02 | 1977-12-06 | Alza Corporation | Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4053590A (en) * | 1975-02-27 | 1977-10-11 | Alza Corporation | Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin |
| DE3144705C2 (de) * | 1981-11-11 | 1983-12-08 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat |
| US4600531A (en) * | 1984-06-27 | 1986-07-15 | University Of Iowa Research Foundation | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield |
| US4711852A (en) * | 1984-11-05 | 1987-12-08 | Akzo N.V. | Control for blood gas analyzers and hemoglobin analysis |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| WO1988003408A1 (en) * | 1986-11-10 | 1988-05-19 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| GB8710598D0 (en) * | 1987-05-05 | 1987-06-10 | Star Medical Diagnostics Ltd | Hemoglobin based blood substitute |
| IL87708A (en) * | 1988-09-08 | 1994-04-12 | Technion Inst For Research And | Hemoglobin-based blood substitute possessing a colloid oncotic pressure substantially similar to human blood and method for the preparation thereof |
-
1991
- 1991-10-03 AT AT91917174T patent/ATE119917T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-03 JP JP3516187A patent/JPH06502848A/ja active Pending
- 1991-10-03 EP EP91917174A patent/EP0559655B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 WO PCT/US1991/007155 patent/WO1992009630A1/en active Search and Examination
- 1991-10-03 PL PL91299380A patent/PL167340B1/pl unknown
- 1991-10-03 ES ES91917174T patent/ES2069908T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 SK SK54993A patent/SK54993A3/sk unknown
- 1991-10-03 DE DE69108258T patent/DE69108258T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-03 AU AU85466/91A patent/AU650287B2/en not_active Ceased
- 1991-10-03 HU HU9301563A patent/HUT64571A/hu unknown
- 1991-10-03 CZ CZ93854A patent/CZ281912B6/cs unknown
- 1991-10-03 DK DK91917174.4T patent/DK0559655T3/da active
- 1991-10-03 CA CA002093650A patent/CA2093650A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-18 IL IL9978591A patent/IL99785A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-18 ZA ZA918348A patent/ZA918348B/xx unknown
- 1991-10-29 NZ NZ240377A patent/NZ240377A/xx unknown
- 1991-11-27 MX MX9102239A patent/MX9102239A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 IE IE414491A patent/IE914144A1/en unknown
- 1991-11-29 PT PT99666A patent/PT99666A/pt not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-05-20 US US08/065,170 patent/US5362855A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-28 NO NO931956A patent/NO931956D0/no unknown
- 1993-05-28 FI FI932461A patent/FI932461A/fi unknown
-
1994
- 1994-06-15 US US08/260,173 patent/US5521154A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00661P patent/HU211703A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1992009630A1 (en) | 1992-06-11 |
| IL99785A (en) | 1996-05-14 |
| ZA918348B (en) | 1993-04-19 |
| HUT64571A (en) | 1994-01-28 |
| US5362855A (en) | 1994-11-08 |
| AU650287B2 (en) | 1994-06-16 |
| PT99666A (pt) | 1992-10-30 |
| AU8546691A (en) | 1992-06-25 |
| MX9102239A (es) | 1992-07-08 |
| US5521154A (en) | 1996-05-28 |
| PL167340B1 (pl) | 1995-08-31 |
| EP0559655A1 (en) | 1993-09-15 |
| FI932461A0 (fi) | 1993-05-28 |
| IE914144A1 (en) | 1992-06-03 |
| ATE119917T1 (de) | 1995-04-15 |
| NZ240377A (en) | 1993-01-27 |
| DE69108258T2 (de) | 1995-08-10 |
| IL99785A0 (en) | 1992-08-18 |
| DK0559655T3 (da) | 1995-07-24 |
| HU211703A9 (en) | 1995-12-28 |
| ES2069908T3 (es) | 1995-05-16 |
| FI932461A (fi) | 1993-05-28 |
| HU9301563D0 (en) | 1993-09-28 |
| CA2093650A1 (en) | 1992-05-30 |
| CZ85493A3 (en) | 1994-02-16 |
| CZ281912B6 (cs) | 1997-03-12 |
| NO931956L (no) | 1993-05-28 |
| EP0559655B1 (en) | 1995-03-15 |
| JPH06502848A (ja) | 1994-03-31 |
| DE69108258D1 (de) | 1995-04-20 |
| NO931956D0 (no) | 1993-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK54993A3 (en) | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions | |
| US5264555A (en) | Process for hemoglobin extraction and purification | |
| US5650388A (en) | Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions | |
| US5312808A (en) | Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions | |
| US4598064A (en) | Alpha-alpha cross-linked hemoglobins | |
| JP2000513377A (ja) | プリオンのクロマトグラフィー除去方法 | |
| CA1058075A (en) | Process of improving the compatibility of gamma globulins | |
| CA2235767A1 (en) | Use of hydrophobic zeolites, syringe and method for removing of preservatives from a polypeptide solution | |
| FI104722B (fi) | Pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmenetelmä | |
| DE69026513T2 (de) | Polyhämoglobin durch purinderivate und glutathion stabilisiert | |
| US7038016B2 (en) | Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution | |
| US20040014641A1 (en) | Mammalion haemoglobin compatible with blood plasma, cross-linked and conjugated with polyalkylene oxides as artificial medical oxygen carriers, production and use thereof | |
| Simoni et al. | Biocompatibility of hemoglobin solutions. II. The inflammatory reaction of human monocytes and mouse peritoneal macrophages | |
| WO2004089404A1 (fr) | Conjugat d'hemoglobine, son procede de preparation et son utilisation | |
| FI106362B (fi) | Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi | |
| CN101002943B (zh) | 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法 | |
| Menu et al. | Haemoglobin Pyridoxalation in Phosphate Buffer: Comparison of Results with Those Obtained with Tris-Hcl Buffer |