FI106362B - Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

* 106362

Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää sellaisen uuden he- moglobiinikoostumuksen valmistamiseksi, joka on tehokas elämän ylläpitämisessä vakavan verenvuodon jälkeen eri lajisissä eläimissä, ihraiset mukaan luettuina, myrkytön ja vapaa veren mukana välittyvistä sairauksista. Tarkemmin 10 määriteltynä keksintö koskee menetelmää verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää olennaisesti pyrogeenitöntä, mikrobitonta, aktiivista hemoglobiinia, joka on saatettu reagoimaan o-ATP:n ja o-adenosiinin kanssa, niin että muodostuu sil-15 loitettu hemoglobiini, joka edelleen saatetaan reagoimaan pelkistetyn glutationin kanssa, jolloin o-ATP on perjodaa-tilla hapetettu ATP ja o-adenosiini on perjodaatilla hapetettu adenosiini, ja hemoglobiini silloitetaan molekyylin-sisäisesti o-ATP:11a ja molekyylienvälisesti o-adenosii-20 nilla, ja hemoglobiini, o-ATP, o-adenosiini ja glutationi saatetaan reagoimaan moolisuhteessa noin 1:3:10:20.

Taustan kuvaus

Verellä on monia tehtäviä, joista kaikki ovat elintärkeitä . Vakava verenvuoto tai veren menetys vaarantaa : 25 elämän kahdesta pääsyystä: 1) kierrossa olevan veritila vuuden lasku vähentää kudosperfuusiota ja aiheuttaa iske-mian; (2) hapenkuljetuksen väheneminen heikentää kudoksen happitilannetta ja aiheuttaa hypoksian. Verenkiertojärjestelmä reagoi näihin muutoksiin verisuonten supistumisella, 30 joka edelleen pahentaa iskemiaa ja hypoksiaa. Lopulta kehittyy solujen metaboliassa ja toiminnassa muutoksia, jot-ka johtavat sokkiin ja kuolemaan.

Tämän patenttijulkaisun yhteydessä, "verenkorvike" ei ole valmiste, joka voi korvata veren kaikkien sen toi-35 mintojen suhteen, vaan hätätilanteessa käytettävä elvytys- « 106362 neste, jolla on kyky toteuttaa seuraavat toiminnot: veritilavuuden palautus, hapen kuljetus ja verisuonten supistumisen vähentäminen. Tämän nesteen tulee kuitenkin olla vapaa toksisista sivuvaikutuksista samoin kuin sairauden-5 aiheuttajista, kuten bakteereista ja viruksista.

Yli 50 vuoden ajan pyrkimykset kehittää verenkorvi-ketta ovat keskittyneet hemoglobiiniin (Hb), koska se on ainoa aine, jolla on kyky ottaa vastaan kylliksi happea ilmasta toimiakseen fysiologisena hapenkantajana. Lisäksi 10 hemoglobiinilla on sama kolloidisosmoottinen paine kuin seerumin albumiinilla, ja se voi siksi toimia plasmatilavuuden suurentajana. Nämä yritykset eivät tähän mennessä ole kuitenkaan olleet menestyksellisiä jäljempänä kuvattavien monien ongelmien vuoksi, jotka on tunnistettu hitaas-15 ti ja ovat olleet vaikeita ratkaista.

(1) Myrkyllisyys, joka johtuu hemoglobiinin konta-minoitumisesta ympäristön bakteeriendotoksiineilla, perus-kudoksen fosfolipideillä ja ei-hemiproteiineilla ja -peptideillä; 20 (2) hemoglobiinin korkea happiaffiniteetti liuok sessa, joka häiritsee hapen vapautumista kudoksiin; (3) Hb-molekyylin epästabiilius ja taipumus poistua suonista ja erittyä nopeasti munuaisten kautta: (4) Hb:n taipumus itsehapettumiseen ja toimimatto- ; 25 man met-Hb:n ja myrkyllisten vapaiden happiradikaalien muodostamiseen; (5) vereen liittyvien sairauksien, kuten hepatiitin ja AIDSin välittyminen luonnon Hb:n kautta.

Ongelma, joka koskee myrkyllisyyttä, ts. Hb-liuos-30 ten kykyä aktivoida verisuonten sisäinen veren koaguloitu-minen ja aiheuttaa munuaisvaurio, tiedostettiin ensimmäi- « seksi. Rabiner teki 1960-luvulla tunnetuksi havainnon, että tällainen toksisuus johtuu punasolujen peruskudokses-ta (punasolujen kalvofragmenteista) eikä Hb:sta. Hän pai-35 notti peruskudoksettoman hemoglobiinin tarvetta. Tämä ehto « 106362 on kuitenkin vuosien varrella ollut ristiriidassa sen tosiasian kanssa, että kaikista peruskudoselementeistä todella vapaata hemoglobiinia ei ole tuotettu. Tämän keksinnön tekijä on työtovereineen tunnistanut punasolujen kal-5 von toksisiksi tekijöiksi aminofosfolipidit fosfatidyyli-etanoliamiinin (PE) ja fosfatidyyliseriinin (PS), jotka normaalisti sijaitsevat kalvon sytoplasmapuolella. Näillä yhdisteillä on erityinen affiniteetti Hb:n suhteen ja ne on vaikeampi poistaa Hb-liuoksesta kuin muut peruskudos-10 komponentit. Kun PE:n ja PS:n kontaminoimaa Hb:a infusoi-daan koe-eläimiin, kuten kaniineihin ja apinoihin, merkittäviä tilavuuksia, esimerkiksi vähintään 1/3 eläimen laskennallisesta veritilavuudesta, se aiheuttaa systeemisen tulehdusreaktion, jolle on tunnusmerkillistä suonensisäi-15 sen koagulaation ja komplementin aktivaatio, leukosyyttien ja verihiutaleiden aktivaatio ja iskeamia-tulehdusvaurioi-den kehittyminen elintärkeissä elimissä.

Vasta vähän aikaa sitten tunnistettu ongelma on Hb-liuosten helppo kontaminoituminen ympäristön bakteeriendo-20 toksiineilla. Ennen molukkirapuamebosyyttilysaattitestin kehittämistä US-farmakopea on ollut riippuvainen kaniinilla tehtävästä pyrogeenisyystestistä määrityksenä endotok-sdiinien havaitsemiseksi. On kuitenkin raportoitu, että Hb, jossa on endotoksiineja pitoisuuksina, jotka ovat sel-: 25 västi pyrogeenisyystason alapuolella, aiheuttaa samankal taista toksisuutta kuin aminofosfolipidien konaminoima Hb, sillä endotoksiinin myrkyllinen komponentti on itse asiassa lipidi (lipidi A) . Bakteeriendotoksiineja voidaan poistaa biologisista liuoksista käyttämällä affiniteettikroma-30 tagrafiakolonneja, kuten Detoxi-Gel-kolonneja (Pierce

Chemical Co.). Nämä kolonnit eivät kuitenkaan pysty pois- • » tamaan kaikkea läsnä olevaa endotoksiinia, jos lähtömateriaali sisältää yli 2 endotoksiiniyksikköä millilitraa kohden määritettynä käyttämällä "kvantitatiivista kromo-35 geenistä molukkiraputestiä (QCL-1000, Whittaker M.D. Bio- 4 106362 products), jonka mukaan 1 endotoksiiniyksikkö (EU) = 0,1 nanogrammaa bakteerilipopolysakkaridia.

Hemoglobiini täytyy puhdistaa ei-hemiproteiineista ja -peptideistä. Vaikka toksisuutta ei ole liitetty min-5 kään määrätyn proteiinin läsnäoloon, puhdistukseen antaa aiheen tarve vähentää luonnon Hb:a sisältävien liuosten immunogeenisyyttä. On myös esitetty ajatus, että jokin peptidi aiheuttaa Hb-liuosten vasokonstriktorivaikutuksen, joka havaitaan eristetyissä elimissä, kuten sydämessä ja 10 munuaisessa, ja eristetyissä valtimoissa. Alalla tunnetaan joukko erilaisia menetelmiä tällaisen puhdistuksen tekemiseksi, ja niihin kuuluvat seuraavat: (1) sentrifugointi ja suodatus (Coczi, US-patentti-julkaisu 3 991 181); 15 (2) tolueeniuutto (Bonsen, US-patenttijulkaisut 4 001 200 ja 4 001 401; (3) ultrasuodatus (Kothe et ai., US-patenttijulkaisu 4 526 715); (4) ultrasuodatus ynnä happosaostus (Bonhard et 20 ai., US-patenttijulkaisut 4 136 093 ja 4 336 248); (5) ioninvaihtokromatografia (Meiller, US-patentti-julkaisu 4 100 149; (6) sinkkisaostus (Tye, US-patenttijulkaisut 4 473 494 ja 4 529 719); : 25 (7) kiteytys [Devenuto et ai., Journal of Labor- » · atory and Clinical Medicine 89 (1977) 509 - 514].

Mikään näistä menetelmistä ei kuitenkaan ole täysin tyydyttävä. Edellä mainituissa menetelmissä (1) - (4) on luontaisia rajoituksia, jotka koskevat kykyä erottaa täy-30 dellisesti Hb muista proteiineista, kun taas menetelmät (5) - (7) eivät sovellu laajamittaiseen puhdistukseen.

Yksi 1970-luvulla tunnistettu ongelma on liuoksessa olevan Hb:n korkea happiaffiniteetti. Tämä on ominaisuus, joka säätelee hemoglobiinin kykyä ottaa vastaan happea 35 ilmasta keuhkoissa ja vapauttaa se kudoksiin. Yksi tämän • 5 106362 ominaisuuden ilmaisutapa on P50-arvo eli hapen osapaine, jossa Hb kyllästyy 50-%:isesti. Mitä alhaisempi P50 on, sitä suurempi on hemoglobiinin kyky sitoa happea ja sitä heikompi sen kyky vapauttaa happea kudoksiin. Ihmisveren 5 P50 on noin 2 8 mmHg, kun taas ihmisen Hb:n P50 on liuoksessa noin 13 mmHg. Ero johtuu siitä, että punasolussa Hb reagoi 2.3- difosfoglyseraatin (2,3-DPG:n) kanssa, mikä alentaa Hb:n affiniteettia hapen suhteen. Punasolun ulkopuolella tämä vuorovaikutus häviää, ja siten Hb sitoo 02:n niin tiu- 10 kasti, että lakkaa toimimasta 02:n kantajana. Tämän ongelman ratkaisemiseksi Benesch et ai. ovat kehittäneet Hb:n kovalenttisen reaktion pyridoksaali-5'-fosfaatin, erään 2.3- DPG-analogin kanssa. Aluksi toivottiin, että mainitunlainen reaktio sekä heikentäisi happiaffiniteettia että 15 stabiloisi Hb-molekyylin tetrameeriseen muotoon. Tämä ei kuitenkaan ole toteutunut. Tämän keksinnön tekijä työtovereineen on osoittanut, että naudan hemoglobiinilla on liuoksessa sama P50-arvo kuin ihmisen verellä ja sen affiniteettia 02:n suhteen säätelevät kloridit 2,3-DPG:n sijasta.

20 Kun otetaan huomioon tämä suotuisa ominaisuus ynnä naudan punasolujen saatavuus suurina määrinä ja puhtaan hemoglobiinin alhainen antigeenisuus nisäkkäiden kesken, on olemassa etuja, jotka puolustavat naudan hemoglobiinin käyttöä verenkorvikkeen pohjana.

; ; 25 Yksi toinen 1970-luvulla tunnistettu ongelma on hemoglobiinin nopea poistuminen verisuonista ja lyhyt vii-pymisaika suonissa. Tämä liitetään yleensä Hb-tetramee-rien, α2β2, taipumukseen hajota dimeereiksi, 2αβ, jotka läpäisevät helposti hiussuoniston. Nyt näyttää siltä, että 30 proteiinin pinnan sähkövarauksella on myös tärkeä merkitys; elektronegatiivisuus ja alhainen isoelektrinen piste suosivat viipymistä verisuonissa. Hemoglobiinin poistumisella verisuonista on seuraavat epätoivottavat vaikutukset : 106362 (1) plasmatilavuutta suurentava vaikutus on lyhytkestoinen; (2) Hb:n kulku munuaiskerästen läpi saa aikaan osmoottisen diureettisen vaikutuksen, joka pienentää plasma- 5 tilavuutta sen ylläpitämisen sijasta; (3) Hb:n takaisinabsorboituminen munuaistiehyeissä vahingoittaa tiehytsoluja; (4) Hb:n kulku välitilanesteisiin aiheuttaa turvotusta ja soluvaurioita.

10 Tekniikan tason mukaisesti on keskitytty yksinomaan

Hb:n dimeroitumisen ehkäisemiseen. Tähän tarkoitukseen on kehitetty seuraavia kolmea tyyppiä olevia tapoja muuntaa Hb: a: (a) molekyylienvälinen silloitus eli polymerointi ,· 15 (b) Hb:n kytkeminen muihin molekyyleihin; (c) molekyylinsisäinen a- ja β-ketjujen silloitus.

Laajimmin käytetty edellä mainituista menetelmistä on Hb:n molekyylienvälinen silloitus glutaarialdehydillä, jota kuvaavat Bonsen et ai., US-patenttijulkaisuissa 20 4 001 200, 4 001 401 ja 4 053 590, Morris et ai., US-pa- tenttijulkaisussa 4 061 736 ja Bonhard et ai., US-patent-tijulkaisussa 4 136 093, jotka kaikki mainitaan tässä viitteinä kokonaisuudessaan. Molekyylienvälisessä silloituksessa on sinänsä erilaisia epäkohtia, jotka luetellaan 25 seuraavassa: (1) Glutaarialdehydi on luonnostaan myrkyllistä, eikä sen metabolisten sivutuotteiden potentiaalista toksisuutta tunneta.

(2) Glutaarialdehydi on hyvin reaktiivinen ja sillä 30 on taipumus muodostaa useita siltoja Hb-molekyylin eri kohtien, kuten a- ja 6-aminoryhmien ja sulfhydryyliryhmien kanssa. Tämä johtaa erilaisten molekyylityyppien muodostumiseen, joiden lukumäärä ei ole ennustettavissa.

(3) Polymerointia on vaikea kontrolloida, ja se 35 näyttää jatkuvan varastoinnin aikana lämpötilassa 4 °C, 106362 mikä johtaa koko ajan kasvavien polymeerien muodostumiseen, joilla on suurentunut viskositeetti ja happiaffini-teetti.

(4) Silloituksen epäspesifinen luonne voi mahdol-5 listaa Hb-dimeerien läsnäolon edelleen liuoksessa.

Vaihtoehtoisesti Hb:a on kytketty suurikokoisiin molekyyleihin, kuten dekstraaniin ja hydroksietyylitärkke-lykseen (US-patenttijulkaisu 4 064 118), polyeteeni- tai polypropeeniglykoleihin (US-patenttijulkaisu 4 412 986) , 10 inuliiniin (US-patenttijulkaisu 4 377 512) ja polyalkeeni-oksidiin (US-patenttijulkaisu 4 670 417) . Näillä kytketyillä hemoglobiineilla on kuitenkin suurentunut happiaf-finiteetti ja taipumus omaksua epäsuotuisia, kytkentäai-neille tyypillisiä ominaisuuksia. Molekyylinsisäinen sil-15 loitus on saatu aikaan käyttämällä "diaspiriiniestereitä" (Tye, US-patenttijulkaisu 4 529 719; Walder, US-patenttijulkaisu 4 598 004) ja "perjodaatilla hapetettua adenosii-nitrifosfaattia" (o-ATP) [F. J. Scannon, Molecular modification of hemoglobin, Critical Care Medicine 10 (1982) 20 261 - 265; A. G. Greenburg ja P. W. Mafuid, Modification of hemoglobin - Ring opened diols, Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss, New York 1983, s. 9 - 17] . Diaspiriinihemoglobiineilla on kuitenkin edelleen lyhyt viipymisaika verisuonissa puoliintumisajan ollessa 25 3-4 tuntia, ja ATP-hemoglobiinit on havaittu epätyydyt täviksi suurten met-Hb-pitoisuuksien, korkean happiaffini-teetin ja lyhyen puoliintumisajan vuoksi.

Merkittävää edistystä on raportoitu saavutetun saattamalla ihmisen Hb reagoimaan pyridoksaali-5'-fosfaa-30 tin ja glutaarialdehydin kanssa, jolloin syntyy polymeroi-tua pyridoksaloitua Hb:a ("poly-PLP-hemoglobiinia"), ts. hemoglobiinia, jolla väitetään olevan sekä alhainen happi-affiniteetti että pitkittynyt viipyminen verisuonissa [Moss, G. S. et ai., Hemoglobin solution - From tetramer 35 to polymer, Biomaterials, Artificial Cells and Artificial • 106362

Organs 16{1 - 3) (1988) 57 - 69; Devenuto, F. ja Zegna, A. , Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymer-ized human hemoglobin, J. Surgical Research 34 (1983) 205 - 212] . On kuitenkin havaittu, että pyridoksalaatio 5 häiritsee polymeraatiota, niin että paljon pyridoksaloitua Hb:a jäisi polymeroitumatta, kun taas polymeroitunut Hb olisi pyridoksaloitumatonta. Tästä on seurauksena, että liuoksen infusoinnin jälkeen Hb, joka toimii hyvin 02:n kuljettajana, erittyisi nopeasti munuaisten kautta, kun 10 taas verenkiertoon jäävällä Hb:11a olisi korkea 02-affini-teetti.

Viimeisten muutaman vuoden aikana on noussut esiin kysymyksiä, jotka koskevat hemoglobiinin luontaista myrkyllisyyttä. On toisaalta kuvattu koehavaintoja Hb:n veri-15 suonia supistavasta vaikutuksesta. Toisaalta Hb :11a on taipumus itsehapettua met-Hb:ksi, ts. hemirauta hapettuu +2:n arvoisesta ferrotilasta +3:n arvoiseen ferritilaan, jolloin syntyy myrkyllisiä vapaita happiradikaaleja. Niinpä on esitetty ajatus, että Hb saattaa toimia hapettimen 20 esiasteena verenkiertoon infusoituna. Tämä aiheuttaisi solukalvojen lipoperoksidaation ja vaurioittaisi solurakenteita. Nämä molemmat ilmiöt, verisuonten supistuminen ja vapaiden happiradikaalien syntyminen, pahentaisivat lievittämisen sijasta verenvuodon aiheuttamia iskemia-hy-·' 25 poksiavaurioita. Tämän keksinnön tekijän ja työtovereiden aiemmat kokeelliset tutkimukset osoittavat, että sekä verisuonten supistumista että radikaalien muodostumista voidaan kontrolloida seuraavilla kolmella toimenpiteellä: (1) Hb:n täydellinen puhdistus,- 30 (2) sellaisen Hb:n valmistus ja stabilointi, jossa met-Hb:n muodostuminen on vähäistä; (3) happiradikaaleja sitovien aineiden lisääminen.

Luonnon Hb:a sisältävien liuosten anto tuo lisäksi mukanaan verituotteiden kautta välittyvien sairauksien 35 vaaran. Vaikka bakteerit ja parasiitit voidaan helposti 106362 poistaa suodatuksella tai ultrasuodatuksella, virukset ovat vakavampi ongelma. Alalla tunnetaan kaksi menetelmää virusten inaktivoimiseksi. Toinen on fysikaalinen menetelmä, jossa pastöroidaan deoksimuodossa olevaa hemoglobiinia 5 10 tuntia lämpötilassa 60 °C pH:n ollessa 7,5. Tämän mene telmän on havaittu inaktivoivan malliviruksia, kuten sind-bis-, polio- ja pseudorabiesviruksia, samoin kuin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV). Toinen on kemiallinen menetelmä, joka koostuu kloroformikäsittelystä. Molemmat menetel-10 mät saavat kuitenkin aikaan Hb:n merkittävän denaturoitu- misen, ellei ryhdytä erityistoimenpiteisiin.

Niinpä edelleen tarvitaan parannettua verenkorvi-ketta, joka on stabiili, happiaffiniteetiltaan alhainen, myrkytön ja veren kautta välittyviä taudinaiheuttajia si-15 sältämätön.

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee menetelmää verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi. Valmistettava tuote käsittää puhdistettua nisäkkään hemo-20 globiinia (Hb), edullisesti naudan Hb:a, joka on silloitettu molekyylinsisäisesti ATP:lla (o-ATP), esimerkiksi perjodaatilla hapetetulla ATP:lla, ja molekyylienvälisesti adenosiinilla (o-adenosiini), esimerkiksi perjodaatilla hapetetulla adenosiinilla, saatettu reagoimaan pelkistetyn ·< 25 glutationin (GSH) kanssa ja liuotettu mahdollisesti ei- elektrolyyttejä sisältävään vesiliuokseen ja rikastettu välittömästi ennen käyttöä esimerkiksi mannitolin, elektrolyyttien ja mahdollisesti muiden farmaseuttisesti hyväksyttävien lisäaineiden suhteen.

3 0 Keksinnön mukaiselle menetelmälle verenkorvikkeeksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi, on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Menetelmä käsittää « 10 106362

Hb:n erottamisen bakteeriendotoksiineista, perusku-doksen fosfolipideistä ja/tai ei-Hb-proteiineista ja -peptideistä; hemoglobiinin muuttamisen liuoksessa karboksihemo-5 globiiniksi; karboksihemoglobiinin saattamisen reagoimaan o-ATP: n kanssa hemoglobiinin pääasiassa molekyylinsisäisen silloittumisen aikaansaamiseksi; karboksihemoglobiinin saattamisen reagoimaan o-ade-10 nosiinin kanssa hemoglobiinin pääasiassa molekyylienväli- sen silloittumisen aikaansaamiseksi; glutationin, esimerkiksi pelkistetyn glutationin, lisäämisen liuokseen o-adenosiinisilloitusreaktion keskeyttämiseksi ja Hb:n isoelektrisen pisteen alentamiseksi; 15 silloitetun karboksihemoglobiinin muuttamisen sil loitetuksi oksihemoglobiiniksi; ja mahdollisesti silloitetun hemoglobiinin farmaseuttisesti hyväksyttävän liuoksen muodostamisen.

Valmistuksessa saatava tuote on stabiili, sen puo-20 liintumisaika verenkierrossa on noin 24 tuntia, sillä on alhainen happiaffiniteetti ja samanlainen P50-arvo kuin verellä, ja se on myrkytön ja veren mukana välittyviä sairauksia sisältämätön.

Tässä kuvataan myös menetelmä sirppisoluanemiaa 25 sairastavan, sirppisolukriisissä olevan ihmisen hoitamiseksi, jossa annetaan ihmiselle sellainen tilavuus keksinnön mukaisesti valmistettua verenkorviketta, joka vaikuttaa sirppisoluanemiaoireita lievittävästi.

Edelleen esitetään menetelmä veren korvaamisen tar-30 peessa olevan ihmisen hoitamiseksi, jossa annetaan ihmiselle laskimonsisäisesti sellainen tilavuus keksinnön mukaisesti valmistettua verenkorviketta, joka vaikuttaa veritilavuuden ja/tai veren toiminnan palauttavasti.

Keksintö ja monet siihen liittyvät edut käyvät täy-35 dellisemmin ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauk- 106362 sesta tarkasteltessa sitä yhdessä seuraavien piirustusten kanssa.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää HPLCrllä kokoeksluusiokolonnilla 5 saadun puhtaan naudan Hb:n spektrianalyysiä. Kromatogram-missa näkyy yksi piikki kohdassa 9,4 minuuttia, joka vastaa tetrameerisessä muodossa olevaa hemoglobiinia (64 000 daltöniä).

Kuvio 2 esittää HPLC:llä DEAE-kolonnilla saadun 10 puhtaan naudan hemoglobiinin spektrianalyysiä. Kromato-grammissa näkyy muutamia piikkejä alueella 20 - 36 minuuttia, jotka vastaavat eri Hb-komponenttien erilaisia iso-elektrisiä pisteitä.

Kuviot 3A ja 3B esittävät naudan puhtaan hemoglo-15 biinin spektrejä ennen pastörointipuhdistusta (3A) ja sen jälkeen (3B) (HPLC, DEAE-kolonni, spektrin aallonpituusalue 230 - 599 nm) . Kuviossa 3A näkyy ei-Hb-proteiineja retentioaikojen 17 ja 51 minuuttia kohdalla. Kuviossa 3B ei-Hb-proteiineja ei enää näy.

20 Kuvio 4 esittää molekyylienvälisesti o-ATP:llä ja molekyyliensisäisesti o-adenosiinilla silloitetun ja pelkistetyn glutationin kanssa yhdistetyn naudan Hb:n spektrianalyysiä HPLC-kokoeksluusiokromatografiän jälkeen, Kro-matogrammissa näkyy kuusi Hb-molekyyliaggregaattipiikkiä. 25 Kuvio 5 esittää kuvion 4 yhteydessä esitetyllä ta valla muunnetun naudan Hb:n spektrianalyysiä HPLC-DEAE-kolonnikromatografiän jälkeen. Kromatogrammissa näkyy yksi piikki retentioajan 51 minuuttia kohdalla, Hb:n isoelekt-rinen piste on siirtynyt verrattuna muuntamattomaan Hb:iin 30 pinnan elektronegatiivisten varausten lisääntymisen vuok-s i.

Kuvio 6 esitää isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF - Pharmacia) tehtyä tutkimusta.

Kuvio 7 esittää Sephadex-kolonnista vedellä eluoi-35 tujen, o-ATP- ja natriumperjodaattireaktioseoksesta saatu- 106362 jen peräkkäisten fraktioiden absorbanssia aallonpituudella 258 nm.

Kuvio 8 esittää anioninvaihtokolonnista eluentilla A eluoitujen, o-adenosiini- ja natriumperjodaattireaktio-5 seoksesta saatujen peräkkäisten fraktioiden absorbanssia aallonpituuksilla 258 ja 232 nm.

Tämän keksinnön muut päämäärät, edut ja piirteet käynevät ilmi ammattimiehille seuraavasta kuvauksesta.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus 10 Tämä keksintö syntyi keksinnön, tekijöiden halusta parantaa tekniikan tasoa vastaavia hoitoja, joissa tehdään ihmisveren korvaaminen. Keksinnön mukainen tekniikka tarjoaa turvallisen ja tehokkaan keinon veren korvaamiseksi akuuteissa verenmenetystapauksissa samoin kuin hoidettaes-15 sa potilaita, jotka potevat veritauteja, jotka vaativat veritilavuuden nopeaa ja tehokasta korvaamista ainakin osittain oireita aiheuttavien kriisien estämiseksi ja/tai lievittämiseksi. Yksi esimerkki mainitunlaisesta tilanteesta on sirppisoluanemiapotilaiden tilanne. Kun tällai-20 set potilaat joutuvat sirppisolukriisiin, heille voidaan antaa laskimonsisäisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistettua verenkorviketta, joka saa aikaan kriisin aiheuttamien oireiden odottamattoman hyvän lievittymisen.

Tämä keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa käyttöön ·· 25 koostumuksen, joka käsittää olennaisesti pyrogeenitöntä, mikrobitonta aktiivista hemoglobiinia, joka on saatettu reagoimaan o-ATP:n ja o-adenosiinin kanssa, niin että muodostuu silloitettu hemoglobiini.

Yhdessä keksinnön mukaisen menetelmän erityisen 30 edullisessa suoritusmuodossa käytetään naudan hemoglobiinia. Tässä yhteydessä voidaan kuitenkin käyttää muitakin hemoglobiinilähteitä.

Keksinnön mukaisesti silloitettu hemoglobiini saatetaan edelleen reagoimaan pelkistetyn glutationin kanssa 35 o-adenosiinin kanssa tapahtuvan silloittumisreaktion kes- 4 13 106362 keyttämiseksi, millä on myös Hb:n isoelektristä pistettä alentava vaikutus.

Keksinnön mukaisesti o-ATP on perjodaatilla hapetettu ATP, o-adenosiini on perjodaatilla hapetettu 5 adenosiini ja hemoglobiini silloitetaan molekyylien-sisäisesti perjodaatilla hapetetulla ATP:11a ja molekyyli-envälisesti perjodaatilla hapetetulla adenosiinilla, jolloin muodostuu polyhemoglobiini.

Koska o-ATP ja o-adenosiini ovat kaksi puriinin (P) 10 johdannaista, tuotteesta käytetään tässä merkintää Hb-PP-GSH.

Keksinnön mukaisesti valmistettava koostumus käsittää hemoglobiinia, o-ATP:a, o-adenosiinia ja glutationia suunnilleen moolisuhteessa 1:3:10:20. Silloitetun hemoglo-15 biinin moolimassa on edullisesti noin 130 - 390 kilodalto-nia, edullisemmin noin 190 - 260 kilodaltonia. Yksi vielä edullisempi valmistettavan koostumuksen muoto on sellainen, jossa hemoglobiini käsittää vähemmän kuin noin 5 % met-hemoglobiinia.

20 Yhdessä mitä edullisemmassa suoritusmuodossa kek sinnön mukaisesti valmistettava hemoglobiini on naudan hemoglobiini .

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavassa hemoglobiini (Hb-)valmisteessa yhdistyvät sen rakenneosien seu-· 25 raavat suotuisat ominaisuudet: (1) Tehokas hapenkantaja. Erityisesti naudan Hb :11a on luonnostaan alhainen happiaffiniteetti (P50-arvo 28 mmHg), johon eivät vaikuta erilaiset kemialliset reaktiot .

30 (2) Tehokas plasmatilavuuden kannalta. Hb silloite taan sekä molekyylinsisäisesti että molekyylienvälisesti, ja sillä on siten pitkittynyt viipymisaika verisuonissa (puoliintumisaika 24 tuntia).

14 106362 (3) Verisuonia laajentavat ominaisuudet. Molemmat puriinijohdannaiset Hb:iin yhdistettyinä vähentävät noradrenaliinin indusoimaa verisuonten supistumista.

(4) Sillä ei ole hapetinesiastevaikutusta pelkiste-5 tyn glutationin ja mannitolin läsnäolon ansiosta.

Naudan hemoglobiinin suotuisat ominaisuudet on todistettu [M. Feola et ai., , Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics 157 (1983) 399 - 408]. 10 Sen lisäksi että naudan Hb:a on saatavissa suuria määriä ja sen avulla vältetään ihmisverelle ominaiset välittyvät sairaudet, erityisesti AIDS, sen P50-arvo on yli kaksinkertainen ihmisen Hb:n vastaavaan arvoon nähden (28 ja 13 mmHg) eikä se tarvitse 2,3-DPG-modulaatiota.

15 Keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa käyttöön ve- renkorvikkeen, joka käsittää olennaisesti pyrogeenitöntä, mikrobitonta, aktiivista hemoglobiinia (Hb), joka on silloitettu o-ATP:11a ja o-adenosiinilla, ja farmaseuttisesti hyväksyttävää nestemäistä kantajaa. Yhdessä mitä edulli-20 simmassa suoritusmuodossa kantaja on farmaseuttisesti hyväksyttävä liuos ja edullisemmin vesiliuos. Mikä tahansa mainitunlainen liuos, joka ei häiritse Hb:n toiminnallisia ominaisuuksia, soveltuu käytettäväksi tässä yhteydessä. Vesiliuos voi lisäksi sisältää ei-elektrolyyttejä ja/tai ·· 25 elektrolyyttejä.

Keksinnön mukaisen menetelmän yksi suoritusmuoto tarjoaa käyttöön liuoksen, joka on elektrolyyttejä sisältämätön vesiliuos. Tämä suoritusmuoto esitetään esimerkissä 1. Esimerkkejä ei-elektrolyyteistä, joita voidaan lisä-30 tä keksinnön mukaisesti silloitetun hemoglobiinin vesiliuokseen, ovat ihmisen albumiini, erilaiset plasmafraktiot ja plasma. Mitä tahansa ei-elektrolyyttiä, joka on farmaseuttisesti hyväksyttävä eikä häiritse keksinnön mukaisesti silloitetun hemoglobiinin hapenkantotoimintaa, kuten « « 106362 dekstraania ja hydroksietyylitärkkelystä, voidaan kuitenkin myös käyttää.

Yhdessä toisessa suoritusmuodossa kantaja on farmaseuttisesti hyväksyttävä vesiliuos, joka sisältää elektro-5 lyyttejä. Tämä esitetään esimerkeissä 2-4. Elektrolyyttejä, joita voidaan käyttää valmistettaessa verenkorviket-ta, ovat tyypillisesti natrium-, kalium-, kalsium- ja mag-nesiumkationit ja kloridi-, bikarbonaatti-, glukonaatti-ja sulfaattianionit. Seuraavat ovat ainoastaan esimerkke-10 jä; muitakin voidaan käyttää: injektointikelpoinen (steriili, pyrogeenitön) vesi, pH säädetty suunnilleen arvoon 8,1 - 8,2 lisäämällä steriiliä pyrogeenitöntä puskuria, THAM-liuosta (Tromethamine Injectable; Abbott Laboratories, North Chicago, II) ; injektointikelpoinen 15 vesi - THAM-liuos ynnä lisättyjä elektrolyyttejä, kuten 113 mekv/1 natriumkloridia, 27 mekv/1 natriumbikarbonaattia, 4 mekv/1 kaliumkloridia, 5 mekv/1 kalsiumglukonaat-tia, 3,5 mekv/1 magnesiumsulfaattia; elektrolyyttien suhteen tasapainotettu fysiologinen suolaliuos (Normosöl R, 20 pH 7,4, sisältää 140 mekv/1 natriumia, 5 mekv/1 kaliumia, 3 mekv/1 magnesiumia, 98 mekv/1 kloridia, 27 mekv/1 ase-taattia ja 23 mekv/1 glukonaattia; Abbott Laboratories); Ringerin liuos, johon on lisätty laktaattia ja sisältää 130 mekv/1 natriumia, 4 mekv/1 kaliumia, 3 mekv/1 kal-·« 25 siumia, 109 mekv/1 kloridia ja 2 8 mekv/1 laktaattia t (Abbott Laboratories), ym.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän yhden suoritusmuodon mukaisesti naudan Hb:n happiaffiniteettia voidaan alentaa edelleen suurentamalla verenkorvikkeen kloridi-30 ionipitoisuutta. Tämä voidaan tehdä lisäämällä noin 10 - 25 mekv kloridia/1 verenkorviketta, edullisemmin noin 15 mekv kloridia/1 verenkorviketta.

Mahdollisten immunologisten ongelmien suhteen eri nisäkäslajien välisten Hb-siirtojen järkevyys on todistet-35 tu hyvin. Puhdasta naudan hemoglobiinia on annettu toistu- 106362 vasti, jopa 6 kertaa, kaniineille ja apinoille tilavuuksina, jotka vastaavat 1/3 - 1/2 laskennallisesta veritilavuudesta ilman reaktioiden ilmaantumista kliinisesti ja Ouchterlonyn testillä detektoitavissa olevien vasta-ainei-5 den muodostumista [M. Feola et ai., Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions, Transfusione del sanque (italiankielinen) 33 (1988) 121 - 128].

Bakteeriendotoksiineja sisältämättömän Hb-liuoksen valmistamiseksi tässä valmistusmenetelmässä käytettävä 10 strategia on kontaminoitumisen ehkäiseminen sen korjaami sen sijasta. Kun otetaan huomioon endotoksiinin affiniteetti hemoglobiinin suhteen, puhdistaminen on äärimmäisen vaikeata ellei mahdotonta, kun merkittävää kontaminoitumista on tapahtunut. Kontaminoitumisen olennainen estämi-15 nen vaatii seuraavaa: (1) Lähtömateriaali on hyvin vähäisessä määrin kontaminoitunutta .

(2) Valmistusvaiheet toteutetaan suljetussa järjestelmässä .

20 (3) Kaikki Hb:n kanssa kosketukseen joutuvat pinnat ovat steriilejä ja pyrogeenittömiä.

(4) Kaikki kemikaalit ovat puhtaita.

(5) Kaikki liuokset ovat steriilejä ja pyrogeenittömiä .

25 (6) Laatua tarkkaillaan kaikissa vaiheissa.

Herkin menetelmä endotoksiinin detektoimiseksi on "kvantitatiivinen kromogeeninen molukkiraputesti" (QCL-1000, Whittaker M.D. Bioproducts). Jos lähtömateriaalin tai hemoglobiinin havaitaan missä tahansa valmistusvai- 30 heessa sisältävän yli 2 endotoksiiniyksikköä/ml (EU/ml), se heitetään pois. Pitämällä yllä alhainen kontaminaatio- taso koko prosessin ajan voidaan täydellinen puhdistus saada aikaan johtamalla liuos lopuksi affiniteettikromato-grafiakolonnin, kuten Detoxi-Gel-kolonnin (Pierce Chemical 35 Company), läpi.

106362

Samaa periaatetta, voimakkaan kontaminaation välttämistä yhdistyneenä loppupuhdistukseen, sovelletaan pe-ruskudoksen fosfolipidien, erityisesti aminofosfolipidien, poistamiseen. Peruskudoskontaminaation välttämiseksi tässä 5 menetelmässä sovelletaan punasolujen dialysointi- ja ult-rasuodatusmenetelmää [DeLoach, J. R. et ai., Analytical Biochemistry 157 (1986) 191 - 198] . De Loachin menetelmän mukaisesti punasoluja dialysoidaan ensin hypotonista fos-faattiliuosta vastaan käyttämällä Travenol-keinomunuaista, 10 kunnes punasolususpension osmolaarisuus saavuttaa suunnilleen arvon 150 - 200 mosm/1, edullisemmin noin 160 mosm/1. Tässä vaiheessa punasolut saavat pallomaisen muodon ja solukalvon huokoset venyvät. Sitten soluille tehdään ultrasuodatus Amicon-suodattimen läpi, jonka huo-15 koskoko on noin 0,1 μ.πι, kolonnissa vallitsevan paineen ollessa noin 35 - 103 kPa (5 - 15 psi), edullisemmin noin 69 kPa (10 psi). Siten hemoglobiini "tulee puristetuksi ulos" soluista solukalvojen rikkoutumatta. Tämän keksinnön mukaisesti käytetään sekä punasolujen dialysointiin että 20 ultrasuodatukseen menettelyä, joka toteutetaan yhdessä suljetussa järjestelmässä. Se on steriili, pyrogeenitön ja kertakäyttöinen. Dialysointineste käsittää esimerkiksi steriiliä pyrogeenitöntä deionisoitua vettä, jonka pH on säädetty suunnilleen arvoon 8,0 - 8,4, edullisemmin noin 25 8,2, esimerkiksi Tham-liuoksella fosfaattiliuoksen sijas ta, mikä vähentää hemoglobiinin hapettumista. Tämän menettelyn tuloksena on Hb-liuos, joka sisältää noin 3 -5 mg/dl fosfolipidejä mitattuna "Phospholipid Test Set" -välineistöllä (Boehringer-Mannheim Diagnostics, 30 Indianapolis, IN) ja vain hyvin pieniä määriä aminofosfo-lipidejä PE ja PS ohutkerroskromatografiällä määritettynä. Jäännösfosfolipidi voidaan poistaa esimerkiksi kloroformi-uutolla. Läsnä olevien fosfolipidien alhaisen pitoisuuden vuoksi tämä vaihe voidaan toteuttaa käyttämällä alhaisia 35 kloroformipitoisuuksia lyhyissä sentrifugoinneissa. Siten « 106362 voidaan estää Hb:n denaturoituminen. Fosfolipidin poisto voidaan kuitenkin tehdä muillakin alalla tunnetuilla keinoilla, kunhan huolehditaan proteiinin denaturoitumisen välttämisestä tai minimoinnista.

5 Samat periaatteet pätevät Hb:n puhdistamiseen ei- hemiproteiineista ja -peptideistä. Tässä tapauksessa ensimmäinen vaihe käsittää kaikkien plasmaproteiinien poistamisen punasolujen "puhdistuksen" aikana. Hb:n eristäminen punasoluista voidaan tehdä tässä yhteydessä ilman pu-10 nasolujen kalvojen laajamittaista rikkomista, jolloin estetään myös peruskudosproteiinien aiheuttama kontaminaatio. Hb:n puhdistus voidaan sitten saada aikaan selektiivisellä lämpösaostuksella (Bioseparations, toim. Belter, P. A., Cussler, E. L. ja Hu, W. S., John Wiley & Sons, New 15 York 1988, s. 227 - 229). Tässä menetelmässä proteiinien denaturoituminen ja saostuminen saadaan aikaan kohottamalla lämpötila suunnilleen alueelle 56 - 72 °C, edullisemmin noin 60 - 70 °C. Tämä proteiinien käsittely noudattaa ensimmäisen kertaluvun kemiallista kinetiikkaa ja Arrheniuk-20 sen lämpötilariippuvuutta: Siten d>P> - = -k>P> dt 25 jossa P on liuenneen proteiinin pitoisuus. Nopeusvakio κ saadaan kaavasta, κ = K0eE/RT 30 jossa κ on tunnusmerkillinen vakio, E/R on denaturaation ^ aktivaatioenergia ja T on lämpötila. Denaturaatioenergia vaihtelee proteiinista toiseen. Koska E on yhtälössä eksponenttina, sillä on suuri vaikutus, kun lämpötila muuttuu 35 edes vähän. Tähän energiaan vaikuttavat myös pH-muutokset.

19 106362

Ollessaan hiilimonoksidin kyllästämä Hb (HbCO) on kestävä lämpötilan indusoimaa saostumista vastaan pH: n ollessa noin 7,6 - 7,8. Niinpä HbCO-liuoksen pastörointi voidaan tehdä pitämällä sitä 9 tuntia suunnilleen lämpötilassa 5 56-64 °C ja edullisemmin lämpötilassa 60 °C , minkä jäl keen seuraa noin 0,45 - 1,15 tuntia, edullisemmin noin 1 tunnin, kestävä pastörointi suunnilleen lämpötilassa 68 - 74 °C, edullisemmin noin 70 °C, pH:n ollessa noin 7,6 - 7,8 ja HbCO-pitoisuuden ollessa noin 8-12 g/dl, 10 edullisemmin noin 10 g/dl. Näissä olosuhteissa saostuvat kaikki ei-hemiproteiinit Hb: n denaturoitumisen ollessa vähäistä. Ei-hemoglobiiniproteiinien poissaolo keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetusta liuoksesta on todistettu käyttämällä isoelektristä fokusointia (IEF) ja ja 15 kokoeksluusio- ja anioninvaihtokorkeapainenestekromatogra-fialla (HPLC). Talteen otetun hemoglobiinin denaturoitu-mattomuuden osoitti IEF:ssä fokusoitujen vyöhykkeiden "tahrattomuus" ja hapenkuljetustoiminnan säilyminen (hap-pidissosiaatiokäyrät, P50, Bohrin ilmiö) .

20 Keksinnön mukaisen puhdistuksen yksi sivutuote on virusten inaktivoituminen. Kloroformiuuton on itse asiassa havaittu inaktivoivan joukon lipidivaipallisia viruksia, kuten hepatiitti B, non-A non-B hepatiitti, lehmärokko ja pox-virukset, sekä plasmassa että seerumissa [Feinston, S.

; 25 M. et ai., Inactivation of Hepatitis B virus, and non-A, non-B hepatitis by chloroform, Infection and Immunity 41 (1983) 816 - 821] . Jotkut lipidittömät virukset, kuten reovirukset, voivat myös inaktivoitua osittain kloroformin vaikutuksesta. Toisaalta pastörointi suunnilleen lämpöti-30 lassa 56 - 64 °C, edullisemmin noin 60 °C, noin 9-12 *. tunnin, edullisemmin noin 10 tunnin, ajan inaktivoi joukon viruksia, joilla ei ole lipidivaippaa, samoin kuin ihmisen imuunikatoviruksen (HIV) [Estep, T. N. et ai., Virus Inactivation in Hemoglobin Solutions by Heat, Biomaterials, 20 106362

Artificial Cells and Artificial Organs 16(1 - 3) (1988) 129 - 1343] .

Glutaarialdehydillä tehtävän polymeroinnin tunnettujen epätoivottavien vaikutusten vuoksi tässä menetelmäs-5 sä Hb-molekyyli stabiloidaan tetrameeriseen muotoon käyttämällä adenosiini-51-trifosfaatin (o-ATP) dialdehydijohdannaista. ATP-molekyylissä on kolme peruskomponenttia; puriiniemäs adeniini, sokeri D-riboosi ja trifosfaattiket-ju.

10 ATP:n hapetus perjodaatilla avaa riboosirenkaan 2’,3'-cis-kohdasta ja muuttaa 2', 3'-diolin vastaavaksi dialdehydiksi [Lowe, P. N. et ai., Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds, Biochem. Soc. Transact. 7 15 (1979) 1131 - 1133].

Kukin o-ATP-molekyylin aldehydiryhmä voi reagoida lysiinin €-aminoryhmän kanssa, jolloin muodostuu Schiff-emäsadditiotuote, jolla on seuraava kemiallinen kaava.

20 (HB)-NH2 + OCH-ATP - (HB)-N=CH-ATP

Hb:n 2,3-DPG-tasku on Hb-molekyylin sisällä oleva alue, joka sitoo 2,3-DPG:n. Koska tämä alue sisältää kaksi lysiiniä, on mahdollista käyttää o-ATP:a näiden ryhmien j : 25 silloittamiseen ja siten molekyylin stabilointiin tetra meeriseen muotoonsa. Trifosfaattiketjun läsnäolo parantaa tämän reaktion spesifisyyttä. Tämä spesifisyys on todistettu muiden polyfosfaattien, kuten pyridoksaali-5'-fosfaatin, kohdalla. ATP:n etuna muihin yhdisteisiin nähden 30 on adeniiniryhmittymä. ATP hydrolysoituu in vivo ADP:ksi, m ·. AMP:ksi ja lopulta adenosiiniksi. Tämän hydrolyysin on havaittu aiheuttavan suotuisia farmakologisia vaikutuksia, kuten verisuonten laajenemista sekä yleis- että keuhkoverenkierrossa. Muita suotuisia vaikutuksia on osoitettu 35 annettaessa ATP:a yhdessä magnesiumkloridin (MgCl2) kanssa 106362 verenvuotosokin hoidossa. Näihin suotuisiin vaikutuksiin kuuluvat mikroverenkierron paraneminen, solukalvotoiminnan paraneminen ja "pohjustava" vaikutus solunsisäisten ade-niininukleotidien palauttamisessa (Chaudry, I. H. ja Naue, 5 A. E., Overview of hemorrhagic shock, Pathophysiology of Shock, Anoxia and Ischemia, toim. Cowley, R. A. ja Trump, B. F., Williams and Wilkins, Baltimore, MD 1982, s.

203 - 219).

Kuten edellä mainittiin, aiemmat yritykset silloit-10 taa Hb o-ATP:lla eivät ole onnistuneet, koska kemiallinen reaktio tuottaa hyväksyttävää suurempia met-Hb-pitoisuuk-sia (jopa 30 %) ja o-ATP:lla muunnetulla Hb:11a on edelleen lyhyt viipymisaika verisuonissa.

o-ATP:n hapetusvaikutus johtuu kuitenkin yhdistees-15 sä läsnä olevista jodaattijäännöksistä (IO4 ja IOj) . Itse asiassa o-ATP:n täydellinen puhdistus (katso esimerkki 10) auttaa olennaisesti tähän ongelmaan. Lisäksi met-Hb:n muodostuminen voidaan minimoida saattamalla o-ATP reagoimaan karboksi-Hb:n kanssa eikä deoksi-Hb:n kanssa, kuten on 20 tehty aiemmin. o-ATP:n reaktio HbC0:n kanssa tapahtuu, jos liuoksen pH lasketaan suunnilleen alueelle 7,25 - 7,15, tarkemmin ottaen suunnilleen arvoon 7,20.

Jäljellä on kuitenkin ongelma, joka koskee lyhyttä viipymisaikaa verisuonissa. Tämän keksinnön tekijät ovat : 25 havainneet, että molekyylinsisäisesti silloitettu tetra- • meerinen Hb suodattuu edelleen munuaiskerästen läpi ja vahingoittaa munuaistiehyeitä. Siksi on välttämätöntä silloittaa hemoglobiini sekä molekyylienvälisesti että molekyylinsisäisesti, jos on määrä saavuttaa riittäviä suonen-30 sisäisiä viipymisaikoja ja välttää munuaisten vahingoittu- minen.

c Tässä keksinnössä hyödynnetään yhtä toista puriini-johdannaista, adenosiinin dialdehydijohdannaista eli per-jodaatilla hapetettua adenosiinia (o-adenosiini) toisena 35 silloitusaineena. Hb-molekyylin pinnalla on 44 lysiiniami- 106362 noryhmää. Siten on mahdollista käyttää o-adenosiinia muodostamaan siltoja kahden tai useamman tällaisen ryhmän välille kahden tai useamman Hb-tetrameerin sitomiseksi. Adenosiinilla on monia etuja muihin yhdisteisiin nähden.

5 Adeniinin läsnäolon ansiosta adenosiinilla on samankaltainen verisuonia laajentava vaikutus kuin ATP:lla [Su, C., Extracellular functions of nucleotides in heart and blood vessels, Annual Review of Physiology 47 (1985) 665 - 676] . Lisäksi adenosiini estää verihiutaleiden aggregoitumista 10 ja parantaa filtraatiota munuaiskeräsissä. Molemmat nämä vaikutukset ovat suotuisia verenvuodon ja reperfuusion jälkeen (Berne, R. M., Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, MA 1983) .

Hb:n reaktio o-adenosiinin kanssa oli tuntematon 15 ennen tätä keksintöä. On tärkeää, että reaktio tehdään hemoglobiinin ollessa karboksimuodossaan (HbCO), jotta vähennetään met-Hb:n muodostumista. Lopuksi mainittakoon, että reaktio etenee hitaammin alemmissa lämpötiloissa, esimerkiksi suunnilleen lämpötila-alueella 25 - 10 °C, ja 20 hyvin hitaasti suunnilleen lämpötilassa 4 °C. Nämä olosuhteet ovat toivottavat, koska ne mahdollistavat reaktion keskeyttämisen millä hetkellä tahansa halutun molekyyli-aggregaatin muodostuttua. Tämä mahdollistaa molekyylikool-taan erilaisten Hb-polymeerien valmistuksen suunnitelmal-:; 25 lisella ja toistettavissa olevalla tavalla, mitä ei voida saavuttaa käytettäessä muita silloitusaineita, kuten glu-taarialdehydiä. Hb:n silloittaminen o-adenosiinilla voidaan keskeyttää lisäämällä pelkistettyä glutationia (GSH), joka, samoin kuin lysiini, sisältää e-aminoryhmän. Tulles-30 saan mukaan tähän reaktioon GSH:sta tulee osa Hb-koostu- *. musta.

« GSH on edullinen keskeytysaine, sillä sitä on runsaasti punasolussa, jossa sen päätehtävä on toimia "hape-tinloukkuna", joka suojaa hemoglobiinia hapetinrasituksel-35 ta (Larson, A., Functions of Glutathione: Biochemical, 106362

Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York 1983). GSH suojaa hemoglobiinia liuoksessa samoin kuin erytrosyyttiympäristössä. Hb:n silloitus o-adenosiinilla, jota seuraa reaktio GSH:n kanssa, saa ai-5 kaan elektronegatiivisten varausten lisääntymisen Hb-mole-kyylin pinnalla, jolloin Hb:n isoelektrinen piste laskee suunnilleen arvosta 6,8 alueelle 6,1 - 6,2. Tämä edistää hemoglobiinin stabiloitumista ja pidentää sen viipymistä verisuonissa estämällä sitä suodattumasta munuaisten läpi. 10 o-ATP:a ja o-adenosiinia on saatavissa kaupallises ti (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), tai niitä voidaan valmistaa jäljempänä esimerkkeissä 10 ja 11 kuvattavilla menetelmillä. Pelkistettyä glutationia on saatavissa kaupallisesti .

15 Kun on tehty nämä reaktiot ja muutettu karboksihe- moglobiini takaisin oksihemoglobiiniksi, voidaan saadut yhdisteet (Hb-PP-GSH) liuottaa erilaisiin väliaineisiin säilytystarpeiden mukaan. Jos liuosta on määrä säilyttää muutamia kuukausia tai jopa vuosia, (Hb-PP-GSH) voidaan 20 jättää liuotetuksi "injektointikelpoiseen" steriiliin, pyrogeenittömään veteen, jonka pH on säädetty suunnilleen arvoon 8,1 - 8,2 lisäämällä THAM-liuosta (20 mmol/1). Tämän keksinnön tekijät ovat havainneet, että Hb liuotettuna veteen, jonka pH on emäksinen, 8,1 - 8,2, itsehapettuu j ; 25 vähemmän ja sitä voidaan säilyttää pidempiä aikoja kuin

Hb:a, joka on liuotettu elektrolyyttiliuokseen, jonka pH on noin 7,4. Tässä tapauksessa elektrolyyttejä voidaan lisätä liuokseen välittömästi ennen käyttöä (katso edellä esitetyt esimerkit). Jos liuos on sen sijaan määrä käyttää 30 tuntien tai päivien kuluessa, voidaan Hb-PP-GSH liuottaa ' *. suoraan elektrolyyttien suhteen tasapainotettuun fysiolo giseen suolaliuokseen, kuten Normal R:ään (katso edellä esitetyt esimerkit). Yhdiste voidaan vaihtoehtoisesti liuottaa Ringerin liuokseen, johon on lisätty laktaattia 35 (katso edellä esitetyt esimerkit) tai mm. hypotoniseen tai 24 106362 isotoniseen natriumkloridiliuokseen. Kun keksinnön mukaista verenkorviketta on määrä käyttää verenvuotosokin hoitoon, voidaan liuokseen lisätä magnesiumkloridia (MgCl2) , edullisesti juuri ennen käyttöä, suunnilleen koostumuksen 5 ATP-sisältöä vastaava moolimäärä. Tämän on havaittu täydentävän ATP:n suotuisia vaikutuksia mikroverenkiertoon ja tuovan ylimääräisiä kloridi-ioneja, jotka säätävät alaspäin Hb:n happiaffiniteettia ja antavat tulokseksi kudoksen paremman happitilanteen. Mannitolia voidaan lisätä 10 edullisesti juuri ennen käyttöä, sillä sen tiedetään toimivan OH-radikaalien (myrkyllisimpien happiperäisten vapaiden radikaalien) ja ehkä myös muiden radikaalien sito-jana [Freeman, B. A. ja Crapo, J. D., Free radicals and tissue injury, Laboratory Investigation 47 (1982) 15 412 - 426] . Mannitolia voidaan tyypillisesti lisätä noin 0,5 - 2,0 mg/ml, edullisesti noin 0,8 mg/ml liuosta.

Tämä keksintö tarjoaa siten käyttöön menetelmän ve-renkorvikkeena käyttökelpoisen koostumuksen valmistamiseksi, jolla on kyky 20 (a) palauttaa ja ylläpitää plasmatilavuus, (b) toimittaa elintärkeisiin elimiin happea ja (c) vähentää verisuonten supistumista verenvuodon jälkeen.

Keksinnön mukaisesti valmistettu koostumus tarjoaa :; 25 käyttöön verenkorvikkeen, joka on myrkytön annettuna ni säkkäille, ihmiset mukaan luettuina, ja vapaa veren mukana välittyvistä tautipartikkeleista.

Keksinnön muut päämäärät, piirteet ja edut käyvät ilmi seuraavasta tämän keksinnön mukaisten edullisten suo-30 ritusmuotoesimerkkien yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

*. Esimerkit

Yksi edullinen menetelmä kompleksituotteen valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti käsittää seuraavat viisi vaihetta: 35 (A) punasolujen puhdistus, 106362 (B) hemoglobiinin eristys, (C) hemoglobiinin puhdistus, (D) hemoglobiinin muuntaminen reaktiolla o-ATP:n, o-adenosiinin ja glutationin kanssa, 5 (E) lopputuotteen (Hb-PP-GSH)n valmistus.

Esimerkki 1

Punasolujen (RBC:den) puhdistus

Keksinnön mukaisesti valmistettavan koostumuksen yksi edullinen lähtömateriaali on naudan veri, kuten edel-10 lä käsiteltiin. Keksinnön mukaista menetelmää tämän koostumuksen valmistamiseksi voidaan kuitenkin soveltaa käyttämällä muiden nisäkkäiden, ihminen mukaan luettuna, verta lähtömateriaalina. Naudan verta voidaan ottaa useista terveistä luovuttajista tai yksittäisistä teurastamoon mene-15 vistä eläimistä. Ensin mainitussa tapauksessa sidotaan kiinni aikuinen nauta, ajellaan kaula ja käsitellään iho antiseptisellä saippualla. Verta otetaan aseptisissa olosuhteissa ulompaan kaulalaskimoon tehdyn piston kautta. Yhdestä eläimestä voidaan ottaa noin 1 500 ml verta, kerä-20 tä se tyhjäksi imettyyn, steriiliin, pyrogeenittömään 2 l:n pulloon, joka sisältää 200 ml ACD-antikoagulanttia (Virbac, Inc., Lenexa, Kansas). Toisessa tapauksessa, kun eläin on tainnutettu ennen teurastusta, toinen puoli kaulasta "preparoidaan" nopeasti ja sijoitetaan pistoputki . 25 ihonalaisesti yhteiseen päänvaltimoon. Yhestä aikuisesta lehmästä voidaan ottaa noin 10 1 verta. Eri eläimistä peräisin olevia verieriä ei sekoiteta. Pullot pidetään jäissä laboratorioon siirtämisen aikana.

Erityisesti käytettäessä lähtömateriaalina naudan 30 verta on tärkeää, että punasolut (erytrosyytit) erotetaan täydellisesti valkosoluista (leukosyyteistä), verihiuta- • t leista ja plasmasta. Tämä vaihe vähentää ei-hemiproteii-nien ja muiden aineiden aiheuttamaa kuormitusta, josta hemoglobiini on lopulta puhdistettava. Kaikkien leukosyyt-35 tien poistaminen poistaa myös näihin soluihin liittyvät • • > 106362 mahdolliset virukset, kuten sytomegaloviruksen, ihmisen immuunikatoviruksen jne.

Punasolut puhdistetaan "pyöritys-jäähdytys-suoda-tusmenetelmällä". "Pyöritysvaihe" koostuu useista sentri-5 fugoinneista, jotka tehdään suljetussa järjestelmässä käyttämällä veripankkisoluerotinta, kuten DIDECO-järjestelmää (Electromedics Inc., Englewood, Colorado), seuraavasti : sentrifugointi kierrostaajuudella 1 000 min"1 lämpö-10 tilassa 15 °C 20 minuuttia verihiutaleiden ja plasman poistamiseksi; sentrifugointi kierrostaajuudella 4 500 min"1 lämpötilassa 15 °C 10 minuuttia plasman poistamiseksi täydellisemmin; 15 pesu (4 kertaa) isotonisella suolaliuoksella (puna solujen ja suolaliuoksen suhde 1:4) sentrifugoimalla kierrostaajuudella 4100 min"1 lämpötilassa 4 °C 10 minuuttia; lopullinen pesu isotonisella Tham-liuoksella, pH 8,1 - 8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, 20 Illinois). Tämä mahdollistaa pestyjen punasolujen suspen-doinnin elektrolyytittömään, pH-arvoltaan korkeaan liuokseen, joka suojaa hemoglobiinia hapettumiselta.

Menettelyn "jäähdytysosan" yhteydessä punasoluja säilytetään "siirtopakkauksissa" (steriilejä, pyrogeenit-:. 25 tömiä muovisäiliöitä, valmistaja Fenwal Laboratories,

Deerfield, Illinois) lämpötilassa 4 °C yön yli eli 18 tuntia. Valkosoluilla on alhaisessa lämpötilassa taipumus aggregoitua pieniksi rykelmiksi. "Suodatusvaiheessa" solut johdetaan 20 μιη:η selluloosasuodattimen, kuten Fenwalin 30 valmistaman "suurikapasiteetisen transfuusiosuodattimen" *. läpi, jolloin leukosyyttiaggregaatit poistuvat.

Leukosyyttien ja verihiutaleiden poissaolon varmistamiseksi tehdään solulaskenta käyttämällä Coulter-solu-laskuria ja proteiinien poissaolo suspensiosta varmiste-35 taan tavanomaisin kemiallisin menetelmin. Bakteeriendotok- 106362 27 siinien läsnäolo määritetään käyttämällä "kvantitatiivista kromogeenista molukkiraputestiä" (QCL-1000, Whittaker Bio-products, Walkervsille, Maryland).

Esimerkki 2 5 Hemoglobiinin eristys

Hemoglobiinin eristäminen punasoluista tehdään kahdessa vaiheessa. Ensin dialysoidaan 1 1 suspensiota, joka sisältää punasoluja isotonisessa Tham-liuoksessa, pH 8,1 -8,2, pitoisuutena 20 % (hematokriitti 0,20), hypotonista 10 (230 mosm/1) Tham-liuosta (10 1) vastaan käyttämällä kei nomunuaista, jonka huokoskoko on 0,2 0 μτα, kuten tuotetta "Krosflo II Filtration Module with 10 Ft2 Surface Area" (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) . Dialyysiä jatketaan, kunnes dialysaatti muuttuu punertavaksi (hemoglobiinin 15 sävyttämäksi). Tässä vaiheessa punasolut turpoavat pallomaisiksi ja venyneet soolukalvot muuttuvat Hb:a läpäiseviksi. Toisena vaiheena keinomunuaiseen kohdistetaan 69 kPa:n (10 psi) paine, joka puristaa Hb:n ulos soluista rikkomatta solukalvoja. "Kalvohaamut" heitetään pois yh-20 den läpikulun jälkeen. Hemoglobiinin siirtyessä hypotonista liuosta sisältävään säiliöön punasolusäiliössä pidetään yllä tilavuus lisäämällä Tham-liuosta (230 mosm/1). Eristetty hemoglobiini suodatetaan käyttämällä 0,20 μιη:η suodatinta, kuten "Posidyne I.V. Filter" -suodatinta (PALL . 25 Biochemical Inc., Fajardo, Puerto Rico), hiukkasmaisten mikrobiepäpuhtausjäännösten poistamiseksi ja varastoidaan "siirtopakkauksissa" lämpötilassa 4 °C.

Tämän menettelyn tuloksena on Hb-liuos, joka sisältää 3-5 mg/dl fosfolipidejä (mitattuna käyttämällä "fos-30 folipiditestivälineistöä", Boehringer-Mannheim Diagnos-' ties, Indianapolis, Indiana) ja vain hyvin pieniä määriä

• I

aminofosfolipidejä PE ja PS (määritettynä ohutkerroskroma-tografialla).

28 106362

Hemoglobiinin puhdistus Tämä puhdistus tehtiin seuraavissa neljässä vaiheessa .

Esimerkki 3 5 Karboksimuodossa olevan hemoglobiinin (HbCO:n) pas törointi Tämä vaihe toteutetaan käyttämällä ennalta steriloitua, pyrogeenitöntä biologista reaktoria, kuten "paikallaan steriloitavissa olevaa 15 lm Microlift-bioreakto-10 ria, joka on varustettu NBS Model ML-4100 -ohjausjärjestelmällä" (New Brunswick Scientific Co., Edison, New Jersey). Se on suljettu säiliö, jossa on useita sisääntu-lokohtia kaasuja ja nesteitä varten, näytteenottoportit, sekoitin ja lämpötilansäätimet. Bioreaktori sijoitetaan 15 vetokaappiin. Hemoglobiini kyllästetään hiilimonoksidilla (puhtausaste 99,99 %, Criogenic Rare Cas Co., Hanahan, Etelä-Carolina) huuhtomalla useaan kertaan peräkkäin steriloidulla kaasulla paineella 101 kPa (760 mmHg) lämpötilassa 4 °C hitaasti sekoittaen. Täydellinen kyllästys var-20 mistetaan käyttämällä Cooximeter-laitetta (malli 282,

Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). Menettely kestää noin 15 minuuttia, Liuos jätetään CO:n alle, jonka paine on 101 kPa (760 mmHg). Sitten tehdään pastörointi nostamalla bioreaktorissa vallitseva lämpötila . 25 asteittain 4 °C:sta 60 °C:seen, antamalla sen olla tässä arvossa 9 tuntia ja nostamalla se sitten 70 °C:seen 1 tunnin ajaksi. Näiden jaksojen jälkeen lämpötila lasketaan asteittain takaisin 4 °C:seen.

Esimerkki 4 30 Sentrifugointi yhdessä kloroformin kanssa .. Tätä vaihetta varten bioreaktorista poistettu Hb- • t liuos suodatetaan 0,20 μτη:η suodattimen läpi steriileihin pyrogeenittömiin 250 ml m sentrifugipulloihin, jotka on suljettu sopivin tulpin ("polyallomeeripullot", jotka kes- 29 106362 tävät kloroformia, proteiineja ja alkoholia, toimittaja Sorvali Division, Du Pont Co., Wilmington, Delaware).

Toteutetaan kolmen sentrifugoinnin sarja käyttämällä Sorvall-sentrifugia (malli OTD75B, roottori TFA 20.250) 5 seuraavasti:

Sentrifugoidaan hemoglobiinia, joka on sekoitettu kloroformin kanssa suhteessa 15:1 (kussakin pullossa 232 ml Hb:a ja 18 ml kloroformia) kiihtyvyydellä 760 g lämpötilassa 4 °C 30 minuuttia. Supernatantti johdetaan 10 toiseen sarjaan pulloja käyttämällä steriiliä pyrogeeni- töntä letkua ja peristalttista pumppua laminaarivirtausve-tokaapissa.

Sentrifugoidaan Hb:a, joka on sekoitettu kloroformin kanssa suhteessa 16:1, kiihtyvyydellä 1600 g lämpöti-15 lassa 4 °C 15 minuuttia ja kiihtyvyydellä 3800 g 15 minuuttia. Supernatantti siirretään kolmanteen sarjaan pulloja.

Sentrifugoidaan ilman kloroformia kiihtyvyydellä 61 400 g 60 minuuttia.

20 Kolmannen sentrifugoinnin jälkeen Hb-liuos siirre tään steriileihin, pyrogeenittömiin, tyhjiksi imettyihin 1 000 ml:n pulloihin (Abbot Laboratories), joissa on se-koitussauva. Jäljellä oleva kloroformijäännökset poistetaan huuhtomalla steriloidulla CO-kaasulla 2 tuntia hi-. 25 taasti sekoittaen lämpötilassa 4 °C.

Tässä vaiheessa käytettävä kloroformi on HPLC-laatua, ja sen UV-allonpituusraja on 244 nm (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey). Pullot voidaan käyttää uudelleen, kun ne on käsitelty (a) E-TOXA-Clean-30 pesuaineella (Sigma Chemicals) ja (b) 95-%:isella (190 1 .. proof) etanolilla ja (c) steriloitu lämpötilassa 120 °C 80 * « minuuttia.

Tämä sentrifugointisarja ei pelkästään poista kaikkia fosfolipidejä vaan myös ei-hemiproteiinit, jotka on 35 denaturoitu ja saostettu aiemmassa pastörointivaiheessa.

•

• I

30 106362

Esimerkki 5

Suodatus endotoksiiniaffiniteettikromatografiako- lonnin läpi

Hb-liuos johdetaan affiniteettikromatografiakolon-5 nin, kuten Detoxi-Gel-kolonnin (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) läpi käyttämällä sisääntulossa ja ulosme-nossa "siirtopakkauksia" ja peristalttista pumppua, jolloin muodostuu suljettu järjestelmä. Menettely tehdään Class 100 -laminaarivirtausvetokaapissa.

10 Tällä vaiheella voidaan endotoksiinipitoisuus alen taa arvosta 2,0 - 2,5 EU/ml arvoon < 0,10 EU/ml.

Esimerkki 6

Dialysointi

Hb-liuos dialysoidaan steriiliä, pyrogeenitöntä, 15 deionisoitua vettä vastaan, jota käytetään suhteessa 1:10 ja jonka pH on säädetty arvoon 7,20 lisäämällä Tham-liuos-ta. Dialyysi tehdään käyttämällä keinomunuaista, jonka huokoskoko vastaa moolimassaa 6 000 daltöniä, kuten "90 SCA - Artificial Kidney" -laitetta (C-DAK Co., Miami 20 Lakes, FL) . Tämä vaihe eliminoi pienet molekyylit, konsentroi hemoglobiinin pitoisuuteen 10 g/dl ja alentaa Hb-liuoksen pH:n noin 8,2:sta noin 7,2:een.

Menettelyn tässä vaiheessa on valmistettu "puhdasta" hemoglobiinia, ts. hemoglobiinia, joka on täysin va-. 25 paata bakteeriendotoksiineista, peruskudoksen lipideistä ja fosfolipideistä ja ei-hemiproteiineista. 0,20 μτα:η suodattimen läpi prosessin eri vaiheissa tehtyjen toistuvien suodatusten odotetaan myös poistaneen kaikki mikrobiepä-puhtaudet, kun taas pastöroinnin ja kloroformikäsittelyn 30 odotetaan inaktivoineen sekä lipidivaipattomat että lipi-divaipalliset virukset. Lisäksi karboksimuodossa olevan • i hemoglobiinin käyttö mahdollistaa puhdistuksen hapettumisen ollessa vähäistä (met-hemoglobiinia muodostuu 1 -2,5 %).

35 106362

Esimerkki 7

Hemoglobiinin muuntaminen

Hemoglobiinin reaktio o-ATP:n, o-adenosiinin ja pelkistetyn gutationin kanssa toteutetaan biologisessa 5 reaktorissa seuraavasti. Liuos, joka sisältää 10 g/dl kar-boksitilassaolevaa hemoglobiinia vedessä, jonka pH on säädetty Thamilla arvoon 7,20, syötetään takaisin bioreakto-riin ja pidetään lämpötilassa 4 °C hitaasti sekoittaen hiilimonoksidipaineen 101 kPa {1 atm) alaisena.

10 o-ATP valmistetaan esimerkin 10. mukaisesti ja säi lytetään jauheen muodossa. Se liuotetaan nyt steriiliin, pyrogeenittömään veteen, jonka pH on säädetty arvoon 7,20, ja lisätään välittömästi Hb-liuokseen siten, että mooli-suhde Hb:o-ATP on 1:3. Reaktion annetaan edetä lämpötilas-15 sa 4 °C sekoittaen kierrostaajuudella 150 min"1 CO.-n alla 24 tuntia. Liuoksesta otetaan näytteitä 6 tunnin välein ja ne tutkitaan HPLC:llä käyttämällä kokoeksluusiokolonnia hemoglobiinin moolimassan kasvun tarkistamiseksi ja anio-ninvaihtokolonnia sähköisen varauksen muutoksen tarkista-20 miseksi. Käytetään Watersin HPLC-järjestelmää, joka käsittää Waters 712 -injektorin, Wayers 990 Photodiode Detector -yksikön ja NEC Power Mate 2 -tietokoneen. Kokoeksluusio-kolonnin (Protein Pak 300 SW) ja anioninvaihtokolonnin (DEAE-5 PW) toimittaja on myös Waters (Waters Chromato-25 graphy Division, Millipore Co., Milford, MA). Ideaalinen silloitustilanne saavutetaan noin 24 tunnin kuluttua, jolloin anioninvaihto-HPLC-tutkimus osoittaa, että 90 - 95 % o-ATP:sta on kulunut kemiallisessa reaktiossa. Tuloksena saadaan molekyyliaggregaatti, joka koostuu seuraavista 30 taulukossa esitettävistä komponenteista.

> • ; • l ♦ ♦ •.

106362

Taulukko

Hb:n komponentit

Muoto M (kO) Prosentuaalinen osuus 5 Hemoglobiinitetrameerit 64 70

Hemoglobiinioktameerit 130 21

Hemoglobiinidodekameerit 195 8 Näissä reaktio-olosuhteissa o-ATP saa toisin sanoen 10 aikaan etupäässä molekyylinsisäistä mutta myös jonkin verran molekyylienvälistä silloittumista. Tämä ei kuitenkaan häiritse seuraavaa reaktiota.

24 tunnin kuluttua o-adenosiini, joka on valmistettu esimerkin 11 mukaisesti ja säilytetty jauhemuodossa, 15 liuotetaan steriiliin veteen, jonka pH on säädetty arvoon 7,20 lisäämällä Thamia ja sisältää muutaman pisaran etanolia. Tätä yhdistettä lisätään Hb-liuokseen siten, että Hb:n ja o-adenosiinin moolisuhteeksi tulee 1:5, ja reaktion annetaan edetä samoissa olosuhteissa 24 tuntia. Tässä 20 vaiheessa lisätään toinen annos o-adenosiinia samassa moo-lisuhteessa 1:5 ja reaktion annetaan edetä vielä 24 tuntia. Näytteet tutkitaan HPLC:llä ja kemiallinen reaktio keskeytetään, kun Hb-tetrameerien osuus on laskenut 70 %:sta 30 %:iin. Jos reaktio etenee paljon tätä pitem-25 mälle, muodostuu liian suuria polymeerejä. Sitten Hb-liu- okseen lisätään GSH:ta liuotettuna Tham-pitoiseen veteen, pH 7,20, Hb:n ja GSH:n moolisuhteen ollessa 1:20 ja reaktion annetaan edetä 16 tuntia. Tässä vaiheessa hemoglobii-niaggregaatti sisältää alla olevassa taulukossa esitettä-30 viä muotoja.

33 106362

Taulukko Hb:n muodot

Hb:n muoto M (kD) Prosentuaalinen osuus 5 Tetrameerit 64 30 " x 2 130 20 " x 3 195 20 " x 4 - 6 256 - 390 30 10 Tällä aggregaatilla esiintyy yksi piikki DEAE- HPLCrssä kohdalla 50 - 51 minuuttia.

Näiden kemiallisten reaktioiden lopuksi hemoglobiini muutetaan karboksimuodosta takaisin oksimuotoon huuhtomalla useaan kertaan steriilillä hapella paineella 241 kPa 15 (35 psi) sekoittaen varovasti lämpötilassa 4 °C ja valot

tamalla lisäksi 20 sekuntia kestävillä voimakkailla valo-pulsseilla käyttämällä Quartzline Lamp DWY 120V 650W

-lamppua (General Electric Co., Cleveland, Ohio, joka on kytketty "Type 4051 Molequartz" -laitteeseen (Mole-20 Richardson Co., Hollywood, CA) . Hemoglobiinin takaisinha- pettuminen voidaan varmistaa käyttämällä IL Cooximeter -laitetta.

Esimerkki 8

Keksinnön mukaisen koostumuksen valmistus ja säily-25 tys

Viimeisessä vaiheessa Hb-liuosta dialysoidaan ensin Tham-liuosta (50 mmol/1, pH 8,1) vastaan käyttämällä keinomunuaista, jonka moolimassaraja on noin 65 - 85 kD ("Duo-Flux"; C-DAK, Miami Lakes, FL), kunnes Hb-tetramee-30 rien prosentuaalinen osuus on laskenut 30 %:sta noin ’ ^ 5 %:iin. Lopullisen Hb-aggregaatin molekyylikokojakautuma oli alla olevan taulukon mukainen.

« 106362 34

Taulukko

Hb-aggregaattien molekyylikokoj akautuma Muoto M (kD) Prosentuaalinen osuus 5 -------

Hb-tetrameeri 64 5

Hb-tetrameeri x 2 130 18

Hb-tetrameeri x 3 195 20

Hb-tetrameeri x 4 260 30 10 Hb-tetrameeri x 5 325 16

Hb-tetrameeri x 6 390 10

Niinpä suurimpana prosenttiosuutena esiintyvä mole-kyylityyppi koostuu neljästä Hb-tetrameerista, ja sen moo-15 limassa on 260 000 daltonia. Tämä aggregaatti esiintyy yhtenä piikkinä DEAE-HPLC-spektrissä kohdalla 50 - 51 minuuttia, mikä heijastaa isoelektrisen pisteen muutosta 6,8:sta 6,l:een.

Pois heitettyä hemoglobiinia sisältävä dialysaatti 20 voidaan konsentroida Hb-pitoisuuteen 10 g/dl dialysoimalla 6 000 daltonin keinomunuaisella (90 SCE Artificial Kidney, C-DAK Co.) ja käyttää uudelleen o-adenosiinilla tehtävään molekyylienväl-iseen silloitukseen.

Kun hemoglobiiniliuos on määrä käyttää tuntien tai 25 päivien kuluessa, Tham-liuosta (50 mmol/1) vastaan tehtyä ensimmäistä dialyysiä voi seurata dialyysi elektrolyyttien suhteen tasapainotettua fysiologista suolaliuosta vastaan (Normosol R, pH 7,4, sisältää 140 mekv/1 natriumia, 5 mekv/1 kaliumia, 3 mekv/1 magnesiumia, 98 mekv/1 klori-30 dia, 27 mekv/1 asetaattia ja 23 mekv/1 glukonaattia; .· Abbott Laboratories) .

Niinpä keksinnön mukaisesti muunnettu hemoglobiini (Hb-PP-GSH) voidaan lopullisessa muodossaan liuottaa suunnilleen pitoisuudeksi 10 g/dl joko vesi-THÄM-liuokseen, pH 35 noin 8,1 - 8,2, pitkäaikaista säilytystä varten tai tasa- 106362 painotettuun elektrolyyttiliuokseen, pH noin 7,4, käytettäväksi ilman pitkää viivettä.

Pitkäaikaista säilytystä varten vesi-THAM-liuokseen liuotettu Hb voidaan laittaa 600 ml:n Fenwal-muovipussei-5 hin (steriilejä, pyrogeenittömiä pusseja, Baxter Healthcare Co., Fenwal Division, Deerfield, IL) ja säilyttää jäädytettyinä suunnilleen lämpötilassa -90 °C. Näissä olosuhteissa ei havaittu tapahtuvan hemoglobiinin itsehapet-tumista korkeintaan noin vuoden mittaisen jakson aikana. 10 Tänä aikana Hb:n polymeroitumisprofiili, HPLCrllä ja iso-elektrisellä fokusoinnilla määritettynä, säilyi muuttumattomana. Kestoltaan keskinkertaisen, kuten 1-6 kuukautta kestävän, varastoinnin ollessa kyseessä vesi-THAM-liuokseen liuotettua hemoglobiinia voidaan säilyttää lasi-15 pulloissa (steriili, pyrogeenitön "Empty evacuated container"; Abbott Laboratories) nestemuodossa suunnilleen lämpötilassa 4 °C. Näissä olosuhteissa Hb:n itsehapet-tumisen havaittiin tapahtuvan suunnilleen nopeudella 1 % kuukaudessa. Polymeroitumisprofiilin havaittiin muuttuvan 20 hyvin vähän 6 kuukauden aikana; suuret polymeerit vähenivät noin 5 - 7 % oktameerien ja tetrameerien osuuden kasvaessa samalla.

Lyhytaikaisen, esimerkiksi alle 1 kuukauden kestävän, varastoinnin ollessa kyseessä Hb voidaan liuottaa 25 elektrolyyttien suhteen tasapainotettuun liuokseen ja säilyttää lasipulloissa ("Empty evacuated container"; Abbott Laboratories) nestemuodossa lämpötilassa 4 °C. Näissä olosuhteissa Hb:n itsehapettumisen havaittiin tapahtuvan suunnilleen nopeudella 3 - 5 % kuukaudessa.

3 0 Esimerkki 9 - Koostumuksen karakterisointi

Uuden tuotteen karakterisointiin käytettiin seuraa-via menettelyjä. Hemoglobiini-, met-Hb- ja karboksi-Hb-pitoisuudet mitattiin Cooximeter-laitteella (Model 282 35 Cooximeter, Instrumentation Laboratories, Lexington, 106362

Massachusetts). Liuoksen elektrolyyttipitoisuudet ja os-molaarisuus määritettiin ASTRA-laitteella (Beckman Co., Palo Aito, Kalifornia). Onkoottinen paine määritettiin käyttämällä Weil-onkometriä (Instrumentation Laborator-5 ies). Viskositeetti määritettiin lämpötilassa 37 °C leikkausnopeudella 100 s"1 käyttämällä Brookfield-viskosimetriä (Brookfield Engineering Laboratories, Stoughton, MA).

Hb:n puhtaus muista proteiineista, fosfolipideistä ja bakteeriendotoksiineista määritettiin edellä kuvatulla 10 tavalla. Hapensitomiskapasiteetti laskettiin Hb-pitoisuu-desta ja Cooximeter-laitteella mitatusta hapen tilavuus-osuudesta. Hb:n happijakautumakäyrät mitattiin Hem-O-Scan-laitteella (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland). P50-arvot saatiin näiltä käyriltä stan-15 dardiolosuhteissa lämpötilan (37 °C) , pH:n (7,40) japC02:n [5,3 kPa (40 torria)] suhteen.

Fosfaattipitoisuus analysoitiin Fisken ja

Subbarowin menetelmällä [Journal of Biological Chemistry 66 (1925) 375 - 380]. GSH-pitoisuus määritettiin Reedin et 20 ai. menetelmällä [Analytical Biochemistry 106 (1980) 55 - 62] .

Adenosiini määritettiin HPLC:llä mittaamalla absor-banssi aallonpituudella 258 nm ja laskemalla syötetty määrä ja hemoglobiiniin sisällytetyksi tullut määrä. ATP-mää-25 rä laskettiin fosfaattimäärityksen tuloksesta.

Tässä karakterisoitu tuote identifioitiin (Hb-PP-GSH)n:ksi, jossa Hb on puhdistettu naudan hemoglobiini, PP on puriinijohdannaiset o-ATP ja o-adenosiini ja GSH on pelkistetty glutationi. Perusmolekyyli on tetrameerisessa 30 muodossa oleva Hb, jota esittävät kuviot 1 ja 2. Sen puh-. distusta muista proteiineista valaistaan kuviossa 3. Yh- diste sisältää yhtä millimoolia (mmol) kohden hemoglobiinia noin 3 mmol ATP:a, noin 10 mmol adenosiinia ja noin 20 mmol GSH:ta. Tämä kemiallinen koostumus ynnä eri vai-35 heissä valmistuksen aikana tehdyt HPLC-analyysit osoitta- 37 106362 vat, että o-ATP osallistuu pääasiassa Hb:n molekyylinsi-säiseen silloitukseen, kun taas o-adenosiini saa aikaan molekyylienvälisen silloittumisen. Lisäksi o-adenosiini kytkee GSH-molekyylin Hb:iin. Yhdistettä valaistaan kuvi-5 oissa 4 ja 5. Kokoeksluusio-HPLC:llä tehty spektrianalyysi, jota esittää kuvio 4, osoittaa, että yhdiste koostuu alla olevassa taulukossa esitettävistä kuudesta molekyyli-tyypistä.

10 Taulukko

Hb-molekyylityypit

Muoto Prosentuaalinen osuus 1. Hb (tetrameeri) 5 15 2. (Hb)2 18 3. (Hb)3 20 4. (Hb)4 30 5. (Hb)5 16 6. (Hb)6 10 20 Käy ilmi, että vallitseva tyyppi näiden joukossa on (Hb)4, ts. neljän tetrameerin aggregaatti. DEAE-HPLC-koionnilla tehty analyysi (kuvio 5) antaa tulokseksi yhden piikin kohdalla 50 - 51 minuuttia, mikä osoittaa, että yhdis-25 teellä on yhtenäinen, redusoitunut (muuntamattomaan Hb:iin nähden) isoelektrinen piste. Isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF) tehty analyysi (kuvio 6) osoittaa nämä Hb:n muuntumiset toiselta kannalta katsottuna.

Kun yhdistettä (Hb-PP-GSH) säilytetään vesi-THAM-30 liuoksessa, voidaan ennen käyttöä lisätä seuraavia elekt- ' .. rolyyttejä.

* « 38 106362

Natriumkloridi, esimerkiksi 25 mekv/ml 113 mekv/1

Inj. USP NaCl (Abbott Lab.)

Natriumvetykarbonaatti, esimerkiksi 27 mekv/1 1,0 mekv/1, Inj. USP NaHC03 (Abbott Lab.) 5 Kaliumkloridi, esimerkiksi 20 mekv/ml 4 mekv/1

Inj. USP KC1 (Abbott Lab.)

Kalsiumglukonaatti, esimerkiksi 0,465 mekv/ml 5 mekv/1 Inj. USP (American Regent Lab.)

Magnesiumsulfaatti, esimerkiksi 0,8 mekv/ml 3,5 mekv/1 10 Inj . USP MgS04 (ANTRA Pharmaceutical)

Lisäksi voidaan lisätä mannitolia noin 0,8 mg/ml liuosta. Käytettäessä näitä liuoksia voi lopullisella he-moglobiiniliuoksella olla seuraavassa taulukossa esitettä-15 vä koostumus.

·· «« 106362 3 3

Taulukko

Hemoglobiiniliuoksen (lopputuotteen) ominaisuudet Liuoksen komponentti Määrä 5 Hemoglobiini (g/dl) 10,0

Met-Hb (% hemoglobiinista) 3,5 ± 0,05

Karboksi-Hb (% hemoglobiinista) 1,5 ± 0,05 pH (yksikköä) 7,4 ± 0,05 THAM-liuos (ml/dl) 6,66 10 Natrium (mekv/1) 140

Kalium (mekv/1) 4

Kalsium (mekv/1) 5

Magnesium (mekv/1) 3,5

Kloridi (mekv/1) 117 15 Vetykarbonaatti (mekv/1) 27

Glukonaatti (mekv/1) 5

Sulfaatti (mekv/1) 3,5

Mannitoli (mg/dl) 80

Kolloidisosmoottinen paine (mmHg) 22 ± 2 20 Viskositeetti (cP) 1,74 ± 0,04

Osmolaarisuus (mosm/1) 325 ± 10

Ei-Hb-proteiinit ei havaittavissa

Peruskudoksen fosfolipidit ei havaittavissa ja lipidit 25 Bakteeriendotoksiinit < 0,10 EU/ml

Steriiliys steriili

Stabiilius lämpötilassa -90 °C rajaton

Kun yhdiste (Hb-PP-GSH) säilytetään liuotettuna 30 Normosol R:ään, lisätään ennen käyttöä vain edellä esitet- ’ a·· ty määrä mannitolia. Tämän lopputuotteen ominaisuudet ovat * samanlaiset kuin edellä olevassa taulukossa esitetyt, paitsi että Normosol R ei sisällä kalsiumglukonaattia.

Hb-pitoisuuden ollessa 10 g/dl tämä Hb-liuos kul-35 jettaa oltuaan alttiina normaalipaineiselle ilmalle 13 • 40 106362 tilavuus-% happea, mikä osoittaa hapensitomiskapasiteetin olevan lähes 100 % (1,3 tilavuusosaa happea/1 g Hb:a).

Tämän liuoksen P50-arvo on korkea (noin 28 mmHg) huolimatta suuren kloridipitoisuuden aiheuttamasta polymeroitumises-5 ta. Osmolaarisuus on korkeampi kuin plasman mutta viskositeetti alhaisempi kuin kokoveren. Kolloidisosmoottinen paine on alempi kuin plasman huolimatta korkeasta hemoglobiinipitoisuudesta (albumiiniin verrattuna) sen vuoksi, että hemoglobiini on polymeroitunut, niin että "Hb-hiuk-10 kasten" lukumäärä on alentunut.

Esimerkki 10 o-ATP:n laajamittainen valmistus

Perusmenetelmä o-ATP:n valmistamiseksi on alalla tunnettu [katso S. B. Easterbrook-Smith efc ai., Pyruvate 15 Carboxylase: Affinity labeling of the magnesium adenosine triphosphate binding site, European Journal of Biochemistry 62 (1976) 125 - 130].

Muutoksia tehtiin suurten ainemäärien valmistamiseksi ja tyydyttävän kemiallisen reaktion takaamiseksi 20 hemoglobiinin kanssa.

Adenosiini-5'-trifosfaattidinatriumsuolahydraatin (ATP), F.W. 551.15, ja natriumperjodaatin (NaI04) , puhtaus-aste 99 %, F.W. 213.89, toimitti Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Kymmenen 120 ml:n Sephadex G-10 -ko-25 lonnia toimitti Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. Kutakin kolonnia kohden liuotettiin lämpötilassa 0 °C 550 mg ATP:a 15 ml:aan steriiliä pyrogeenitöntä vettä (injektiovesi, Abbot Laboratories), jonka pH oli säädetty Tham-liuoksella arvoon 7,0. Lisättiin natriumperjodaattia 30 moolisuhteessa (ATP:NaI04) 1:1,1 ja liuoksen annettiin ·. seistä lämpötilassa 4 °C pimeässä 1 tunti. Reaktio keskey tettiin käsittelemällä 15 minuuttia eteeniglykolilla moolisuhteessa (ATP:eteeniglykoli) 2:1. Reaktioseos laitettiin Sephadex G-10 -kolonnin, joka oli ennalta tasapaino-35 tettu "injektiovedellä", lämpötilassa 4 °C. Kolonnia elu- • 106362 oitiin 200 ml :11a vettä. Ensimmäinen puolisko nukleotidi-piikistä, fraktiot 20 - 30, jotka esitetään kuviossa 7, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin välittömästi Labconco Freeze-Dry System -laitteella, joka oli varustettu 5 Stoppering Tray Dryer -yksiköllä (Labconco Co., Kansas City, MO) alennetussa paineessa < 1,3 Pa (<10 μmilg) lämpötilassa -40 °C. Jauhe säilytettin tummissa pulloissa lämpötilassa -90 °C käyttöön asti.

o-ATP-pitoisuus määritetään mittaamalla absorbanssi 10 aallonpituudella 258 nm, kun taas perjodaatin läsnäolo määritetään mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 232 nm. Kolonneja pestään 30 tuntia injektiovedellä lämpötilassa 4 °C, kunnes eluaatin absorbanssi on alle 0,043 aallonpituudella 232 nm, ts. kunnes perjodaatti on koko-15 naan huuhtoutunut pois, ennen uudelleenkäyttöä.

Tämän keksinnön kannalta ovat tärkeitä kaksi toimenpidettä: (1) talteen otetaan vain o-ATP:a sisältävät fraktiot, joissa ei ole pieniäkään perjodaattijäännöksiä; (2) nämä fraktiot kylmäkuivataan välittömästi ja pakaste-20 taan lämpötilassa -90 °C. Nämä toimenpiteet estävät hemoglobiinin hapettumisen kemiallisen reaktion aikana.

Esimerkki 11 o-adenosiinin laajamittainen valmistus

Perusmenetelmä o-adenosiinin valmistamiseksi on 25 alalla tunnettu [Khym, J. X. ja Cohn, W. E., Characterizations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides, Journal of American Chemical Society 82 (1960) 6380 - 6386]. Siihen tehtiin muunnoksia suurten ainemäärien valmistamiseksi ja tyydyttävän kemiallisen 30 reaktion takaamiseksi hemoglobiinin kanssa.

.. Adenosiinin, jonka puhtausaste oli 98 %, toimitti

Sigma Chemical Co., kun taas natriumperjodaatin toimitti • Aldrich Chemical Co. Adenosiini (6 g) liuotettiin 200 ml:aan liuosta, joka sisälsi 150 mmol/1 NaI04:a vedes-35 sä, huoneenlämpötilassa 30 min:n aikana. Liuos johdettiin • 106362 300 ml:n kolonnin läpi, joka sisälsi asetaattimuodossa olevaa anioninvaihtohartsia AG l-X-8, 100 - 200 meshiä (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ja joka oli ennalta tasapainotettu etikkahappoliuoksella (20 mmol/1; eluentti 5 A) (Fisher Scientific Co.). Kolonni eluoitiin 2 litralla eluenttia A virtausnopeudella 15 ml/min lämpötilassa 4 °C keräten 150 ml:n fraktioita. Otettiin talteen vain fraktiot 2-15 (kuvio 8), jotka kylmäkuivattiin välittömästi ja pakastettiin o-ATP:n yhteydessä kuvatulla tavalla.

10 Ennen uudelleenkäyttöä kolonniin syötettiin 6 1 ammoniumkloridiliuosta (100 mmol/1; eluentti B) kaiken perjodaatin vapauttamiseksi. Perjodaattipitoisuus fraktioissa määritettiin mittaamalla absorbanssi aalonpituudella 232 nm. Tämän jälkeen kolonni pestiin 6 1:11a "injektio-15 vettä" ja tasapainotettiin uudelleen etikkahappoliuoksella (20 mmol/1).

Tämän keksinnön kannalta ovat tärkeitä kaksi toimenpidettä: talteen otetaan vain o-adenosiinia sisältävät fraktiot, joissa ei ole pieniäkään perjodaattijäännöksiä 20 ja nämä fraktiot kylmäkuivataan välittömästi ja pakastetaan lämpötilassa -90 °C. Nämä toimenpiteet estävät hemoglobiinin hapettumisen kemiallisen reaktion aikana.

Keksinnön sovellusten kuvaus

Esimerkki 12 25 Toksisuus kaniineissa Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun koostumuksen (Hb-PP-GSH) toksisuus testattiin kaniineissa tieteellisessä kirjallisuudessa aiemmin kuvatulla menetelmällä [Feola, M. et ai., Toxicity of Polymerized Hemoglobin Solutions, 30 Surgery, Gynecology and Obstetrics 166 (1988) 211 - 222].

Kaniineille (New Zealand, 12 eläintä, paino 4,0 kg) sijoitettiin lidokaiinilla (1 %) tehdyssä paikallispuudutuksessa steriilit kanyylit toisen korvan keskusvaltimoon ja toisen korvan reunalaskimoon. Virtsarakkoon sijoitet-35 tiin steriili katetri. Raajoihin sijoitettiin paikallis- • · 106362 puudutuksessa termistorianturi ja EKG-neulaelektrodit. Elektrokardiogrammia (EKG), verenpainetta, ruumiin lämpötilaa ja virtsantuotantoa seurattiin jatkuvasti kolmen tunnin ajan, minkä jälkeen katetrit ja elektrodit poistet-' 5 tiin ja eläimet palautettiin häkkeihinsä. 30 minuuttia kestäneen stationaaritilan (perustaso) jälkeen otettiin valtimolinjasta 5 minuutin aikana 80 ml verta, joka määrä vastaa 1/3:aa veritilavuudesta [kaniinin laskennallinen veritilavuus = 6 % painosta (kg)]. Infusoitiin yhtä suuri 10 tilavuus Hb-PP-GSH:ta laskimolinjan kautta 30 minuutin aikana. Tämä vastaa suunnilleen 2 g:aa hemoglobiinia. Veren otto aiheutti verenpaineen laskun ja pulssin nopeutumisen. Nämä muutokset korjautuivat nopeasti. Lisäksi puls-sipaine (systolisen ja diastolisen paineen erotus), joka 15 laski alhaiseksi verenoton jälkeen, palautui ensin normaaliksi ja kohosi sitten perustason yläpuolelle, mikä osoittaa Hb-liuoksen verisuonia laajentavan vaikutuksen. Tämä vaikutus kesti koko kolme tuntia kestäneen tarkkailun ajan. EKG:ssä ei näkynyt sydämen rytmihäiriöitä. Virtsan-20 tuotanto säilyi normaalina, eikä hemoglobiinia poistunut virtsaan.

Verinäytteet, joita otettiin 30 minuutin ja 1, 3 ja 24 tunnin kuluttua verenkorvikkeen annosta, osoittivat seuraavaa: 25 (1) Valkosolujen ja verihiutaleiden määrä ei vähen tynyt enempää kuin veren laimenenemista vastaavassa määrin.

(2) Suonen sisäinen koagulaatio ja fibrinolyysi eivät aktivoituneet määritettynä mittaamalla seerumin fib-30 rinogeeni, protrombiiniaika ja fibriinin hajoamistuotteet.

- (3) Kreatiinifosfokinaasiaivoisoentsyymin (CPK-BB) tai -sydänlihasisoentsyymin (CPK-MB) lisääntymistä, joka > viittaisi aivo- tai sydänlihasvaurioon, ei tapahtunut.

• « 44 106362 (4) Maksavaurioon viittaavaa seerumin glutamiini-palorypälehappotransaminaasin (SGPT) lisääntymistä ei tapahtunut .

(5) Valtimoveren kaasutilanne oli normaali, mikä 5 osoittaa normaalin keuhkotoiminnan.

(6) Seerumin kreatiniini oli normaali, mikä viittaa munuaisten normaaliin toimintaan.

3 ja 24 tunnin kuluttua otetut yhdistetyt veri- ja virtsanäytteet osoittivat normaalin kreatiniinin poistumi-10 sen, mikä myös osoittaa munuaisten normaalin toiminnan. Kokoveren happidissosiaatiokäyrissä ei näkynyt P50-arvon muutosta, ts. hemoglobiinin aiheuttamaa happiaffiniteetin kasvua. Plasman Hb-pitoisuus oli 24 tunnin kuluttua noin 50 % alkutasosta, mikä viittaa siihen, että hemoglobiinin 15 puoliintumisaika on 24 tuntia.

Eläimet näyttivät normaaleilta ja käyttäytyivät normaalisti kyseisten 24 tunnin aikana. Tässä vaiheessa ne lopetettiin ja elintärkeät elimet tutkittiin histologises-ti. Mitään tieteellisessä kirjallisuudessa aiemmin kuvat-20 tuja patologisia muutoksia ei havaittu (a) sydämessä, (b) keuhkoissa, (c) maksassa eikä (d) munuaisissa. Nämä havainnot ovat selvästi vastakkaisia kuin aiemmin epäpuhtaan glutaarialdehydillä silloitetun hemoglobiinin käytön jälkeen kuvatut (katso edellä esitetty viite).

>: 25 Esimerkki 13

Teho kaniineissa

Tuotteen teho verenkorvikkeena testattiin kaniineissa. Kun oli sijoitettu edellisessä esimerkissä kuvattujen kaltaiset laitteet, vertailuryhmältä (10 New Zealand 30 -kaniinia, paino 4,0 kg) poistettiin 1/3 laskennallisesta ·♦ veritilavuudesta [veritilavuus = 6 % painosta (kg)], minkä jälkeen poistettiin toinen 1/3 15 minuutin kuluttua. Kaikki nämä eläimet kuolivat ilman hoitoa tunnin kuluessa. 10 kaniinista koostuvalle koeryhmälle toteutettiin sama me-35 nettely, mutta eläimet saivat infuusiona kokonaisverihävi- • 4 106362 ötä vastaavan tilavuuden Hb-PP-GSH:ta liuotettuna elektro-lyyttiliuokseen. Kaikki nämä eläimet pysyivät elossa, ja niiden hematokriittiarvot (punasolupitoisuudet) palautuivat perustasolle 7 päivän kuluessa.

5 Esimerkki 14

Verisuonten laajeneminen veren korvaamisen jälkeen rotissa 12 Sprague-Dawley-rottaa, joiden paino oli 350 -450 g, nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti 10 45 mg/kg natriumpentobarbitaalia ja ne laitettiin leik kauspöydälle selälleen. Oikea reisivaltimo, yhteinen pään-valtimo ja ulompi kaulalaskimo paljastettiin kirurgisesti ja niihin sijoitettiin polyeteenikanyylit (malli PE 50; Intramedic, New York). Ulommassa kaulalaskimossa oleva 15 katetri työnnettiin oikeaan eteiseen ja termistorianturi (malli IF, Columbus Instruments, Columbus, Ohio) päänval-timon kautta nousevaan aorttaan. Kukin katetri täytettiin fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 5 ky/ml naudan hepariinia. Reisivaltimo- ja kaulalaskimolinjat kyt-20 kettiin paineantureihin. Raajoihin sijoitettiin ihon alle neulaelektrodit, joita käytettiin elektrokardiogrammin (EKG) seuraamiseen. Lämpölamput säädettiin pitämään ruumiinlämpö vakiona.

Pulssia seurattiin EKG-käyrältä ja sydämen lyönti- 25 tilavuutta mitattiin lämpölaimennusmenetelmällä, injektoi malla 200 μΐ huoneenlämpötilassa (20 - 22 °C) pidettyä fysiologista suolaliuosta oikeaan eteiseen ja rekisteröimällä aorttatermistorin välittämä lämpölaimenemiskäyrä. Systeeminen verisuoni vastus laskettiin vähentämällä vaiti-30 mopaineen keskiarvosta oikean eteisen paine ja jakamalla sydämen lyöntitilavuudella.

Kun perustason hemodynaamiset tulokset oli rekisteröity, poistettiin valtimolinjasta 5 minuutin kuluessa 1/3 laskennallisesta veritilavuudesta [rotan veritilavuus = 35 7 % painosta (kg)]. 15 minuutin kuluttua infusoitiin sama 46 106362 tilavuus Hb-PP-GSH:ta elektrolyyttiliuokseen liuotettuna laskimolinjan kautta. Mitattiin pulssi, keskimääräinen valtimopaine ja sydämen lyöntitilavuus ja laskettiin systeeminen verisuonivastus perustasolla (T^, 15 minuutin 5 kuluttua verenotosta (T2) ja 15 minuutin kuluttua hemoglobiinin infusoinnista (T3). Tulokset analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Studentin t-testiä tulospareille.

Tulokset, joista esitetään jäljempänä yhteenveto, osoittavat systeemisen verisuonivastuksen nousua verenoton 10 jälkeen, minkä jälkeen seuraa lasku normaalitasolle ja verisuonten laajeneminen jopa perustasoon nähden verenkor-vikkeen annon jälkeen.

Taulukko 15 Hemodynaamiset käyrät veren Hb-PP-GSH:11a korvaamisen jälkeen

Perustaso Verenvuoto Hemoglobiini

Pulssi (lyöntiä/min) 320 ±5 390 ± 101 300 ± 101 20 Keskimääräinen valtimopaine (mmHg) 105 ± 5 90 ± 31 105 i 51

Sydämen lyöntitilavuus [ml/(kg·min)] 425 ± 20 275 t 151 455 r 281

Systeeminen verisuonivastus 0,23 ± 0,02 0,33 ± 0,031 0,21 t 0,021 [mmHg/(ml-kg-min)] 25 Luvut: Keskiarvo ± standardipoikkeama »Tilastollisesti merkitsevä ero (P < 0,05) aiempaan jaksoon nähden ·

Esimerkki 15

Vapaiden happiradikaalien muodostuminen kaniineissa 30 12 kaniinia (New Zealand, paino 4,0 kg) rauhoitet tiin klooripromatsiinilla (5 mg/kg, lihaksensisäisesti) ja varustettiin rajoitetulla laitteistolla. Steriilit muovi-‘ kanyylit sijoitettiin toisen korvan keskusvaltimoon ja reunalaskimoon ja termistorianturi ja neulaelektrodit 35 ihonalaisesti raajoihin. Poistettiin kolmasosa laskennal lisesta veritilavuudesta [2 % painosta (kg)] valtimolinjan kautta 5 minuutin aikana ja infusoitiin sama tilavuus Hb- 47 106362 liuosta laskimon kautta 30 minuutin aikana. Kuudesta kaniinista koostuva vertailuryhmä sai muuntamatonta Hb:a, kun taas koeryhmä (kuusi kaniinia) sai Hb-PP-GSH:ta elekt-rolyyttiliuokseen liuotettuna. Vaikutuksia tutkittiin 5 plasman veytperoksidipitoisuuksien (H202) ja lipidiperoksi-dien suhteen, jotka määritettiin perustasolla ja 15 minuutin ja 1, 3 ja 24 tunnin kuluttua Hb-infuusiosta. Myös plasman Hb ja met-Hb mitattiin samoin aikavälein.

H202-pitoisuus oli kasvanut muuntamatonta Hb: a 10 saaneessa ryhmässä arvosta 2 ± 2 pmol/ml arvoon 70 ± 5 pmol/ml tunnin kuluttua ja laskenut sitten arvoon 50 ± 5 pmol/ml kolmen tunnin kuluttua ja 10 ± 5 pmol/ml 24 tunnin kuluttua. Koeryhmässä H202-pitoisuus oli kasvanut arvosta 2 ± 2 pmol/ml vain arvoon 10 ± 2 pmol/ml tunnin 15 kuluttua ja laskenut sitten takaisin perustasolle kolmen tunnin kuluttua. Vastaavasti lipidiperoksidipitoisuudet olivat nousseet vertailuryhmässä perustasolta 1,5 ± 0,9 nmol/ml arvoon 4,0 ± 1,0 nmol/ml tunnin kuluttua. Koeryhmässä ei tapahtunut merkitsevää nousua. Plasman met-Hb 20 nousi 0 %:sta 15 %:iin tunnin aikana ryhmässä, joka sai muuntamatonta Hb:a. Se kasvoi 0 %:sta 5 %:iin Hb-PP-GSH:ta saaneessa ryhmässä. Näiden muuttujien ero kyseisten kahden ryhmän välillä havaittiin merkitseväksi tilastollisella analyysillä, Studentin t-testillä parittomille näytteille 25 ja näytepareille ynnä ANOVA:11a.

Vaikka keksintöä on kuvattu edellä esitetyn eri-tyissuoritusmuodon avulla, monet vaihtoehdot, variaatiot ja muunnokset lienevät ilmeisiä ammattimiehille. Mainitut vaihtoehdot, variaatiot ja muunnokset on tarkoitettu liit-30 teenä olevien patenttivaatimusten hengen mukaisiksi ja kuuluviksi niiden suoja-alan piiriin.

• . .

48 106362

Esimerkki 16

Hb-PP-GSH:n formulointi elektrolyyttien poissa ollessa

Hb-PP-GSH valmistettiin esimerkeissä 1-9 esite-5 tyllä tavalla. Muunnettua hemoglobiinia dialysoitiin ainoastaan Tham-liuosta vastaan (50 mmol/1, Tromethamine, Injectable, Abbot Laboratories, N. Chicago, IL, pH 8,1). Hb-PP-GSH-valmiste jätettiin lopullisessa muodossaan veteen ynnä Tham-liuokseen, pH 8,1, pitoisuudeksi 40 g/dl. 10 Formulasta puuttuivat elektrolyytit, mutta se sisälsi man-nitolia, jota lisättiin kuten edellä, 0,8 mg/ml liuosta. Liuos sisälsi tyypillisesti 6,66 ml Thamia 100 ml:aa kohden vettä.

Esimerkki 17 15 Elektrolyytittömän Hb-PP-GSH-valmisteen ominaisuu det

In vitro tehty tarkkailu osoitti, että Hb-PP-GSH:ta voidaan säilyttää jääkaapissa, lämpötilassa 4 eC, pidempiä aikoja liuotettuna elektrolyytittömään liuokseen, kuten 20 Tham-liuokseen, kuin fysiologiseen suolaliuokseen liuotet tuna.

Havaittiin, että 3 kuukauden aikana hemoglobiinin itsehapettuminen met-Hb:ksi tapahtui nopeudella 3 - 5 % kuukaudessa elektrolyyttejä sisältävän formulan ollessa 25 kyseessä, kun taas elektrolyyttejä sisältämättömällä for mulalla se tapahtui nopeudella 1 % kuukaudessa. Tämä voidaan selittää sillä, että kloridi-ionit, joita on läsnä fysiologisessa suolaliuoksessa, alentavat hemoglobiinin happiaffiniteettia ja helpottavat siten hapen vapautumista 30 ja itsehapettumista.

’ Esimerkki 18

Elektrolyytittömän Hb-PP-GSH:n vaikutus in vivo Hb-PP-GSH jätettiin liuotetuksi Tham-liuokseen pitoisuutena 10 %. Lisättiin 0,8 mg/ml mannitolia, mutta 35 elektrolyyttejä ei lisätty. Tilavuus, joka vastaa 1/3:aa 49 106362 laskennallisesta veritilavuudesta, injektoitiin laskimonsisäisesti 9 rotasta koostuvan ryhmän jäseniin (paino 350 - 400 g). Eläimet saivat normaalisti ravintoa ja vettä ennen koetta, ja ne nukutettiin injektoimalla intraperito-5 neaalisesti 45 mg/kg natriumpentobarbitaalia ja käsiteltiin edellä esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.

Ruumiinlämpöä, hengitystä, elektrokardiogrammia, valtimopainetta ja sydämen lyöntitilavuutta seurattiin 2 tunnin ajan. Virtsantuotanto rekisteröitiin tunnin ajan 10 ennen hemoglobiiniliuoksen antoa ja 2 tuntia sen jälkeen ja virtsasta tarkistettiin hemoglobinuria. Verinäytteitä otettiin ennen Hb-PP-GSH:n antoa ja 2 tunnin ajan 15 minuutin välein annon jälkeen ionisoituneen kalsiumin ja kokonaiskalsiumin pitoisuuksien mittaamiseksi seerumista. 15 Yhdessäkään eläimistä ei kehittynyt minkäänlaisia merkkejä akuutista toksisuudesta. Pulssin ohimenevä hidastuminen tapahtui, mutta ilman rytmihäiriöitä tai muutoksia elektrokardiogrammin muodossa. Hengitystaajuus, verenpaine ja sydämen lyöntitilavuus pysyivät merkittävän vakioina. 20 Eläinten virtsantuotanto kasvoi suunnilleen arvosta 0,6 ± 0,3 ml/h suunnilleen arvoon 1,6 ± 0,3 ml/h (P alle 0,05), eikä hemoglobinuriaa esiintynyt. Seerumin kokonais-kalsiumtaso pysyi suurin piirtein vakiona, kun taas ionisoituneen kalsiumin taso laski suunnilleen arvosta 25 0,85 ± 0,05 mmol/1 suunnilleen arvoon 0,62 ± 0,03 mmol/1.

Tämä muutos ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä ja kesti vain muutamia minuutteja. Ionisoituneen kalsiumin tason muutos palautui annettaessa laskimonsisäisesti kal-siumglukonaattia (10 % Calcium Gluconate for Injection, W. 30 A. Butler, Cincinnati, OH), joka infusoitiin annoksena 2 mg/100 g (eläimen paino) 2 minuutin aikana.

Tämä esimerkki osoittaa, että Hb-PP-GSH:ta voidaan antaa jopa ilman elektrolyyttilisäystä, esimerkiksi infu-soitavan tilavuuden ollessa pienempi kuin kolmasosa las-35 kemiallisesta veritilavuudesta.

106362

Esimerkki. 19

Hb-PP-GSH:n kliininen testaus

Hb-PP-GSH:a testattiin ihmisillä Kinshasassa, Zairen tasavallassa Afrikassa maan hallituksen kasvatus-5 ja tiedeministeriöltä (Department of Education ja Scientific Research) saadun hyväksymisen jälkeen. Ajanjaksona 15. elokuuta - 15. syyskuuta 1990 hoidettiin 9 potilaan ryhmää Kinshasan sirppisoluanemiakeskuksessa (Center for Sickle Cell Anemia). Ryhmässä oli 5 miespuolista ja 4 10 naispuolista potilasta, joiden ikä oli 4 - 13 vuotta. Viidellä lapsista oli vakava anemia ja veren hemoglobiinita-sot olivat korkeintaan 5 g/dl. Neljällä lapsista oli lievempi anemia ja hemoglobiinitasot olivat noin 8 g/dl, mutta he kärsivät "sirppisolukriisistä", ts. akuutista mikro-15 verisuonten tukkeutumisesta käsissä ja jaloissa (2 potilasta) , vasemmassa keuhkossa (1 potilas) ja pernassa (1 potilas). Potilailla esiintyi kipua, kuumetta ja yleistä huonovointisuutta ja heikkoutta.

Vakavaa anemiaa poteva potilasryhmä arvioitiin lää-20 ketieteellisesti oleva verensiirron tarpeessa, kun taas toista ryhmää oli määrä hoitaa laskimonsisäisillä nesteillä, vasodilataattoreilla ja analgeettisilla anti-in-flammatorisilla aineilla. Hemoglobiinia (Hb-PP-GSH:sta) pidettiin aiheellisena kummankin ryhmän hoidossa. Hemoglo-... 25 biinin odotettiin korvaavan punasoluja ja parantavan ve renkiertoa ja kudosten happitilannetta seuraavilla kahdella mekanismilla: kierrossa olevan veritilavuuden kasvu; lisääntynyt hapenvälitys.

30 Koska hemoglobiini on silloitettu ATP:n, joka on vasodilataattori, ja adenosiinin, joka myös on vasodila-taattori ja anti-inflammatorinen aine, johdannaisilla, liuoksen odotettiin lisäksi lievittävän "sirppisolukrii-sissä" olevia potilaita mahdollisesti vaivaavaa mikroveri-35 suonten tukkeutumista.

106362

Keksinnön mukaisesti valmistetulla Hb-PP-GSH-liuoksella tehdyn hoidon lisäetuna verensiirtoon nähden on, että siihen ei liity vaaraa veren välityksellä tarttuvien sairauksista, kuten malariasta, bakteerisairauksista ja ' 5 AIDSista.

Tässä valmistettu Hb-PP-GSH säilytettiin Fenwal-pusseissa, joista kukin sisälsi 250 ml seosta, jossa oli 10 % hemoglobiinia vesi-THAM-liuoksessa. Pussit pidettiin jäädytettyinä (pakattuina geelijäähän) käyttöön asti. Fen-10 wal-pussit siirrettiin huoneenlämpötilaan kaksi tuntia ennen antoa ja hemoglobiiniliuos sulatettiin. Elektrolyyttejä ja mannitolia lisättiin edellä kuvatulla tavalla. Kunkin pussin koko tilavuus annettiin laskimonsisäisesti suunnilleen nopeudella 30 pisaraa/min. Tämä tilavuus vas-15 taa noin 12 - 23 %:a veritilavuudesta, jonka lasketaan olevan kullakin potilaalla 7 % painosta (kg).

Yksi potilas, jolla oli vakava anemia, hemoglobiini 4,5 g/dl, sai kaksi infuusiota kahtena peräkkäisenä päivänä .

20 Ratkaisevat tunnusarvot, lämpötila, pulssi, hengi tys ja verenpaine rekisteröitiin 15 minuutin väliajoin hemoglobiinin annon aikana ja 2 tunnin ajan sen jälkeen. Tänä aikana kiinnitettiin myös huomiota allergisten reaktioiden, kuten urtikarian, ihottumien, keuhkoputken sal-... 25 pautumisen ja pahoinvoinnin - oksentelun mahdolliseen ke hittymiseen. Virtsantuotantoa mitattiin kahden tunnin ajan ennen Hb-PP-GSH:n antoa ja kaksi tuntia sen jälkeen. Virtsasta testattin hemoglobiinin läsnäolo ja sedimentti tutkittiin mikroskooppisesti. Verinäytteet otettiin ennen Hb-30 PP-GSH:n antoa, heti annon jälkeen, kahden tunnin kuluttua ' * annosta ja päivittäin 5 päivän ajan. Potilaan verestä tes tattiin plasman hemoglobiini (infusoitu hemoglobiini), kokonaishemoglobiini (infusoitu ynnä punasolujen sisältämä hemoglobiini) ja retikulosyytit (nuoret punasolut).

• _ 106362

Yhdelläkään potilaista ei kehittynyt allergista reaktiota, ja kaikki tunsivat olonsa yleisesti paremmaksi. "Sirppisolukriisissä" olevat ilmoittivat kivun vähentyneen ilman analgeetteja. Kuume laski, pulssi hidastui, veren-5 paine pysyi stabiilina pulssipaineen kasvaessa jonkin verran, mikä on merkki verisuonten laajentumisesta, ja hengitys pysyi muuttumattomana. Virtsantuotanto kasvoi koko ryhmässä ennen Hb-PP-GSH:n antoa mitatusta keskimääräisestä arvosta noin 50 ± 7 ml/2 tuntia suunnilleen arvoon 10 130 ± 15 ml/2 tuntia Hb-PP-GSH:n annon jälkeen. Virtsassa ei esiintynyt hemoglobinuriaa, eikä sedimentissä havaittu lieriöitä. Vaikuttavin havainto oli kokonaishemoglobiinin progressiivinen paraneminen 5 päivän aikana koko ryhmän keskiarvosta noin 6,39 ± 2,12 suunnilleen arvoon 10,5 ± 15 1,13 g/dl ja retikulosyyttien merkitsevä lisääntyminen suunnilleen arvosta 11,2 ±7,6 suunnilleen arvoon 62,2 ± 12/1000.

Tämä viittaa siihen, että hemoglobiiniliuos ei pelkästään ollut välitön punasolujen korvaaja vaan stimuloi 20 potilaiden luuydintä tuottamaan uusia omia punasoluja. Tämä stimulaatio on dokumentoitu vain 5 päivän ajalta, mutta kesti todennäköisesti pidempään.

Yhteenvetona voidaan todeta, että merkittävien Hb-PP-GSH-tilavuuksien antaminen 9 sirppisoluanemiaa poteval-.. 25 le lapselle ei aiheuttanyt myrkytys- eikä allergisia reak tioita, paransi heidän yleistilaansa ja vaikutti pitkitetystä suotuisasti luuytimeen, jossa se sai aikaan uusien punasolujen tuotannon.

Kun keksintöä on nyt kuvattu kokonaisuudessaan, am-30 mattimiehelle lienee ilmeistä, että siihen voidaan tehdä monia muutoksia ja muunnoksia poikkeamatta tässä esitetyn keksinnön hengestä tai sen suoja-alan piiristä.

4 • l

Claims (11)

106362 Pa ten fctivaatimukset:

1. Menetelmä verenkorvikkeena käytettäväksi soveltuvan koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää olennai- 5 sesti pyrogeenitöntä, mikrobitonta, aktiivista hemoglobiinia, joka on saatettu reagoimaan o-ATP:n ja o-adenosiinin kanssa, niin että muodostuu silloitettu hemoglobiini, joka edelleen saatetaan reagoimaan pelkistetyn glutationin kanssa, jolloin o-ATP on perjodaatilla hapetettu ATP ja 10 o-adenosiini on perjodaatilla hapetettu adenosiini, ja he moglobiini silloitetaan molekyylinsisäisesti o-ATP:11a ja molekyylienvälisesti o-adenosiinilla, ja hemoglobiini, o-ATP, o-adenosiini ja glutationi saatetaan reagoimaan moolisuhteessa noin 1:3:10:20, tunnettu siitä, 15 että liuoksessa oleva hemoglobiini muutetaan karboksihe-moglobiiniksi; karboksihemoglobiiniliuos konsentroidaan; konsentroidussa liuoksessa oleva karboksihemoglo-20 biini silloitetaan pääasiassa molekyylinsisäisesti O-ATP:11a; liuoksessa oleva karboksihemoglobiini silloitetaan pääasiassa molekyylienvälisesti o-adenosiinilla; glutationia lisätään karboksihemoglobiini/o-adeno-... 25 siiniliuokseen o-adenosiinisilloitusreaktion keskeyttämi seksi ; silloitettu karboksihemoglobiini muutetaan silloitetuksi oksihemoglobiiniksi; ja silloitetun oksihemoglobiinin farmaseuttisesti hy-30 väksyttävä vesiliuos muodostetaan elektrolyyttien poissa ollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos käsittää lisäksi ei-elektrolyyttej ä. « . . 106362

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että silloitetun hemoglobiinin moolimassa on noin 130 - 390 kilodaltonia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että vähemmän kuin noin 5 % hemoglobiinista on met-hemoglobiinia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini on naudan hemoglobiini .

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiiniliuos valmistetaan jakamalla kokoveri leukosyytti-erytrosyyttiseoksek-si, verihiutaleiksi ja plasmaksi; 15 suspendoimalla siten saatu leukosyytti-erytrosyyt- tiseos vesiliuokseen; jäähdyttämällä leukosyytti-erytrosyyttiliuos leukosyyttien aggregoimiseksi ja leukosyyttiaggregaatin poistamiseksi ; 20 dialysoimalla oleellisesti leukosyytitön punaso- lususpensio hypotonista liuosta vastaan hemoglobiinin eristämiseksi erytrosyyteistä ja hemoglobiiniliuoksen saamiseksi; ja erottamalla erytrosyytit hemoglobiiniliuoksesta ... 25 korotetun hydrostaattisen paineen alaisena tehtävällä ult- rasuodatuksella.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi liuoksessa oleva eristetty hemoglobiini muutetaan 30 karboksihemoglobiiniksi; hemoglobiiniliuos pastöroidaan ei-hemiproteiinien denaturoimiseksi ja saostamiseksi; fosfolipidit ja saostuneet ei-hemiproteiinit poistetaan liuoksesta; 55 106362 endotoksiinit poistetaan hemoglobiiniliuoksesta affiniteettikromatografiällä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuokseen lisätään Iisak- 5 si elektrolyyttejä ja/tai mannitolia.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa koostumukseen lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää vesiliuosta.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos on elektrolyyttejä sisältämätön vesiliuos.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että silloitettu hemoglobiini 15 liuotetaan vesiliuokseen. • _ . 56 106362