JPH10501823A - クモ膜下出血の治療における架橋ヘモグロビンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 クモ膜下出血の後の架橋ヘモグロビン輸注が、低灌流の組織領域を劇的に減少させそして低灌流の該領域における神経細胞損傷の程度を減少させる。治療上有効な量は体重ｋｇ当たり約1000〜5500ｍｇ／ｋｇの範囲でありそして出血発生後72時間までに投与されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 クモ膜下出血の治療における架橋ヘモグロビンの使用 本発明の背景 クモ膜下スペース中への血液の放出は、例えば脳への動脈血供給における動脈 瘤の破裂におけるように、血管の裂けに続いて起こる。クモ膜下スペース中の血 液の貯留は、脳硬膜を血液との接触に曝す。２〜３日の間に多数の出来事が起こ ると考えられる。即ち、赤血球（ＲＢＣ）が溶血し始め、遊離ヘモグロビンを含 むＲＢＣ成分を周囲のクモ膜下スペース中へ放出し、そして続いて進行する、ス ーパーオキシドアニオンラジカルの生成を伴い得るオキシヘモグロビンのメトヘ モグロビンへの変換である。かなりの証拠が、これらＲＢＣ成分が、相当の罹患 率及び死亡率に関係づけられる状態である大脳の血管痙攣の病因を媒介している ことを示唆している。 より最近では、ＲＢＣ成分中に含まれるスパスモーゲンを同定及び単離する多 くの試みがなされている。多くの研究者がヘモグロビンを血管作用性の因子とし て同定している。総論に関しては、Macdonald & Weir，Stroke，22:971（1991） を参照のこと。Miyaokaら，Neurol ．Med．Chir.，16:103（1976）、Sonobeら，A cta Neurochir., 44:97（1978）、及びOkamoto，Nippon Geka Hokan，51:93(198 2)を含む多数の研究者が、この研究に有意な貢献をしてきた。加えて、大脳の動 脈の血管収縮を起こす際のヘモグロビンの作用については充分な証拠がある（例 えば、Cookら，Proc ．West Pharmacol．Soc.，22:429（1979）を参照）。 作用のメカニズムは不完全にしか理解されていないものの、該技術分野におけ る一般的な典型は、ヘモグロビンが、血管痙攣の開始において生化学的犯人であ るというものである。一般的には、New Trends in Management of Cerebro-Vasc ular Malformations，Proceedings of the International Conference，Verona ，Italy，eds．Pasqualinら，Springer-Verlag，New York(1994)を参照。一つの 理論は、ヘモグロビンが強力な血管収縮因子のエンドセリンの放出を引き起こす ことによって作用し、それが今度は血管痙攣を仲介するというものである（Cost entinoら、Stroke，25:904(1994)）。別の一理論は、ヘモグロビンが酸化窒素を 除去する際に血管収縮が起こるというものである。 クモ膜下出血においては、動脈が破裂し（典型的には動脈瘤）、そして脳の全 体を多かれ少なかれ均一にコートするようにクモ膜下スペースに溢血する。およ そ３、４日の期間中に、血液成分の存在は血管痙攣又は重度の血管収縮の領域を 生じ、神経細胞が虚血になり神経細胞の損傷及び死亡をもたらし得る。作用は十 分に重症であり、そして脳全体のうち重大な神経学的欠陥又は死亡をもたらすの に十分な大きさの部分に及ぶ。 従って、クモ膜下出血において起きる虚血を防止又は最小化する治療は大いに 有益である。これまで、幾つかの薬剤処方が血管痙攣に対処するために提案され てきた。例えば、ニカルジピン又はニモジピン(nimodipine)の静脈内投与が用い られて幾らか成功している。利用しうる治療的アプローチの議論は、E.C．Haley ，”Principles of Pharmaceutical Therapy for Vasospasm Following Subarac hnoid Hemorrhage”，New Trends in Management of Cerebro-Vascu lar Malformations，上記，p.85.に含まれている。 本発明の要約 研究者及び医師は、クモ膜下出血の管理において脳組織の永久的な損傷を防止 し又は損傷の程度を抑えるために頭蓋内の血流を改善するため、一般的に薬物又 は血管作用性の薬物の組み合わせを投与する方法よりなる療法を求めてきた。従 って、本発明の一目的は、出血後の血管痙攣から起こる神経細胞の損傷を抑える ための方法を提供することである。 本方法では、架橋されたヘモグロビンの溶液が、クモ膜下出血の開始後又は開 始が疑われた後、治療上有効な量（通常、1000〜5500ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内） で患者又は他の哺乳類中へと輸注される。クモ膜下スペース中の遊離ヘモグロビ ンのこれまで観察されている一見有害な作用とは逆に、輸注された架橋ヘモグロ ビンは低灌流の領域及び虚血の危険に曝される組織の領域を減らし、出血後の血 管痙攣を防止し、そして神経細胞の損傷を減らすことが見出される。 従って、本発明によれば、低灌流及び虚血の領域を減らし、血管痙攣を予防又 は制限し、そしてクモ膜下出血を起こし又は起こしていることが疑われる患者及 び他の哺乳類における神経細胞損傷を減少する方法は、治療上有効な量の架橋ヘ モグロビンを輸注又はその他によって投与することを含む。投与量範囲は通常10 00〜5500mg／ｋｇ体重であり、及び出血の開始後72時間以内に投与される。出血 後の最初の72時間まで及びその間のヘモグロビンの投与は、単一のボーラスで、 又は1000〜5500ｍｇ／ｋｇの範囲内の個々の投与より なる一連の輸注であることができる。 本発明のヘモグロビンは、それらの個々の蛋白質サブユニットの解離を防止す るために、及び無傷のＲＢＣにおけるヘモグロビンの生理学的酸素放出特性を維 持するために、分子内又は分子間で架橋される。 図面の簡潔な記述 図１は、実験モデルにおける血液のクモ膜下輸注のためのカテーテル位置に対 する、脳の主要構造の解剖学的関係を示している、ラット大脳の長手断面の概要 図である。 図２ａ〜ｅは、実験的クモ膜下出血を起こしている典型的な試験動物に由来す る、組織学的分析のために得られた組織薄片を断面で描いている。 好ましい具体例の詳細な記述 溶血したＲＢＣから放出された遊離ヘモグロビンは、赤血球中のその天然のも のよりも、酸素に対して有意に高い結合親和性を有することが長らく知られてい る。この高い親和性の結合は、組織中における乏しい放出特性のために、酸素搬 送分子としてのヘモグロビンの有用性を低める。その後、分子的架橋がヘモグロ ビン四量体を、酸素の結合親和性が無傷の赤血球のものとほぼ同じであるコンフ ォメーションへにすることが発見された。本発明の架橋ヘモグロビンの許容しう るＰ₅₀値は、２０乃至４０である。架橋は、さもなければ二量体へと解離しがち な四量体のヘモグロビンを安定にもする。 やはり本発明の範囲内にあるのは、120,000 〜600,000 の分子量の範囲にある 高分子をつくりだすために更に重合された、又は劣化 を遅らせ及びヘモグロビンの半減期を増加する分子鎖によって修飾された、架橋 ヘモグロビンの治療的使用である。修飾している分子鎖は、ポリアルキレンオキ シド、コンドロイチン、又はポリアミドのポリマーでよい。 架橋は該技術分野において知られた方法のいずれの一つ又は組み合わせによっ て実行してもよい。例えば、米国特許番号4,001,401及び4,053,590は、ハロゲン 化されたシクロアルカン、ジエポキシド、及びジアゾベンジジン等のような芳香 族化合物を用いた、ヘモグロビン四量体のα及びβサブユニット間の分子内架橋 を開示している。米国特許番号5,248,766は、120,000ダルトンを上回る分子量を 有するポリグロビンを形成するようにオキシランによって四量体単位を共有結合 により分子間結合する架橋重合戦略を開示している。幾つかのこれらの化合物は 35〜40の範囲のＰ₅₀を有している。米国特許番号4,777,244は、脂肪族ジアルデ ヒドによる架橋するための方法を開示している。 本治療的具体例において、好ましい四量体ヘモグロビンは、米国特許番号4,59 8,064、4,600,531、及び再発行特許番号34,271中に記述されているように、二つ のαサブユニット間にジアスピリン架橋を形成するようにビス（3,5-ジブロモサ リチル）フマレートによって架橋される。一般的に、20〜40の作用範囲のＰ₅₀を 有する遊離四量体を得る架橋の方法の全てが、本治療において効果を有するであ ろう。不当な実験を伴わずに、各々のそのように架橋された四量体又はそれから 誘導されたポリマーに関して条件を調節することができる。治療用ヘモグロビン の他の要件（即ち、約0.25EU/ml未満の内毒素レベル、ウイルス不含であること 、未架橋ヘモグロビン残 部を0.2％未満しか有しないこと）は当業者に全て周知である。本発明において 有用なヘモグロビンの一つの特定の好ましい形に関するヘモグロビン規格の完全 なリストが実施例の表１に示されている。 動脈へのカニューレ挿入又は他の薬剤放出方法も効果的であるかも知れないが 、架橋ヘモグロビンの投与は静脈内輸注によるのが好ましい。組織の虚血、低灌 流、及びこれに関連した血管痙攣の驚くべき減少は、傷害された組織ベッドに対 する作用から生じ、それゆえ病変部位又はクモ膜下スペース中への直接の、治療 用ヘモグロビンの導入は利益を示すとは予想されず、及び血管痙攣例を促進する 可能性があるようである。従って、好ましくは全身輸注による、脳組織ベッドの 潅流による投与方法が重要である。 ヘモグロビン投与の量及びタイミングは個々の場合の環境によって変化し得る 。有効量の範囲は1000〜5500mｇ／ｋｇ体重であり、好ましい投与量の2000〜400 0ｍｇ／ｋｇを有する。1500〜3000ｍｇ／ｋｇの初期投与量と、同様の量のその 後の維持投与量とを投与することは有利かもしれない。血管痙攣が出血後３〜４ 日の期間に起きる可能性があることから、そして未重合の架橋ヘモグロビンは比 較的速い浄化率を有するため、複数回投与療法が、長期間にわたって有効レベル のヘモグロビン濃度を維持するために必要とされるかもしれない。 遊離循環ヘモグロビンのレベルは慣用の仕方でモニターでき、及び治療レベル は当業者に知られたパラメーターに関して調節されることができる。虚血性発作 が出血又は塞栓に由来していることが疑われる状況において、そして確定的な診 断が得られる前において、 架橋ヘモグロビンの等価な投与量を投与することも有利である。本発明の更なる 利点は続く実施例から明らかになろう。 実施例 以下の施例において、ラットにおける実験的に誘導されたクモ膜下出血の後の 、脳血流量及び脳の損傷に対する好ましい架橋ヘモグロビン、α−αジアスピリ ン架橋ヘモグロビン（ＤＣＬＨｂ）の作用が評価された。ＤＣＬＨｂ溶液（Baxt er Healthcare Corporation（Deerfield，IL）から得られた）がChateerjeeら， J．Biol．Chem．261:9929(1986)に従って調製された。 期限を過ぎたヒト赤血球が高張緩衝液への暴露によって崩壊された。溶血血液 はストロマ脂質を分離し除去するために遠心分離された。限外濾過の後、分子ヘ モグロビンが、ジアスピリン化合物、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレ ートとの反応によってα鎖において架橋された。ウイルス汚染の除去及び蛋白質 精製が熱低温殺菌によって達成された。Estepら，「Virus inactivation in hem oglobin solutions by heat」，Blood Substitutes，Edited by Change TMS，Ge yer RP，New York，Marcel Dekker，pp．129〜134(1989)。最終のＤＣＬＨｂ溶 液は10.2g/dl^-1の濃度を有していた（表１を見よ）。ＤＣＬＨｂ溶液は、この試 験に必要となるまで−70℃で貯蔵され、試験時に５℃で解凍され、そして試験日 に室温まで受動的に温められた。ＤＣＬＨｂの酸素輸送は、酸素解離曲線におい て若干右のシフトを伴うが全血と同様である。ビス（３，５−ジブロモサリチル ）フマレートによるα−α架橋は血管内半減期を約24時間に延長する。ＤＣＬＨ ｂの粘度（1.3 ｃＳｔ）は、 血清アルブミンと同等で及び全血（＞４．０ｃＳｔ）よりも相当小さい。 クモ膜下カテーテルが、３ｃｍの長さのポリエチレンチューブ（ＰＥ−１０） の一端で小さな結び目を結ぶことによって用意された。カテーテルは、結び目と カテーテルの根元端との間を５ｍｍとするように切って整えられた。少量のシア ノアクリレート接着剤が結び目につけられた。カテーテルは液体の自由な流通を 保証にするために食塩水で洗い流されそして先端においてHematoSealによってシ ールされた。 オスの自発性高血圧ラット（体重，３５０〜４００ｇ；年齢，１６〜２０週） が、Coleら，Lab Anim ．Sci.，40:506（1990）に記述されているように、フェイ スマスクを介して1.2 MAC イソフルラン(1.44% 呼吸終期)によって麻酔された 。動物は定位頭固定器にうつ伏せに配置された。温度は37℃にサーボ制御された 。実験的クモ膜下出血のモデルは、Solomon ら,「Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage：a new animal mo del」，Stroke，16:58〜64によって以前に記述されている。ベタジン（betadine ）で準備の後、後頭陵が位置決めされ及び小さな正中線切開が行われた。後頭骨 を筋組織から剥がし、及び環椎後頭骨膜を同定し、そして付着している結合組織 を除去した。必要に応じゲルフォームによって止血を行った。注意深い切開によ って環椎後頭骨膜に穴があくのを防止した。これは大槽の直上にあり、穿孔する と脳脊髄液（ＣＳＦ）の漏れを引起し得るからである。カテーテルは該膜の上に 配置され及び22−ｇ針が該膜を通して深さ１ｍｍまで進められた。少量のＣＳＦ 排出が起こって位置の正さが確認され、そしてカテーテルは大槽中に注意深く配 置された（図１を参照）。カニューレは、前記結び目が該膜に当接するまで後頭 骨の内側テーブルに沿って進められた（表面に配置するよう注意した）。カテー テルの配置後、少量の歯科用アクリル接着剤が結び目をその位置に固定するため にそれを覆うように塗られた。深い筋肉層が閉じられそしてカテーテルはその位 置に縫合された。表層の筋肉層及び皮膚が閉じられ、そして皮膚を0.375 ％ブピ バカインで浸潤した。ラットはインキュベーターへ戻されそして12時間の 明暗サイクルで72時間回復された。いかなる神経的後遺症を示しているラットは もの後の研究から除かれた（稀）。 動物準備：72時間の回復期の後、動物は上記のようにして麻酔され、経口気管 チューブを入れられそしてHarvard Rodent Respirator(Boston，MA)によって通 気された。大腿の血管に連続的血圧モニタリング(Micro-Med Analyzer，Louisvi lle，KY)、血液サンプリング、及び液体投与のためにカニューレが入れられた。 温度は発熱毛布によって37℃にサーボ制御された。動脈血（１２５μｌ）が３０ 分毎に採血されそしてｐＨ，ＰａＣＯ₂，ＰａＯ₂，グルコース，及びヘマトクリ ットに関して分析された(IL-1306 pH Blood Gas Analyzer，Instrumentation La boratory，Lexington，MA；YSI Model 23-A Glucose Analyzer，Yellow Springs Instruments，Yellow Springs，OH；IEC MB Centrifuge Microhematocrit，DAM ON/IEC Division，Needham Heights，MA)。クモ膜下血液の投与の前に、各ラッ トは、基底槽中への血液の流入を保証にするためにうつ伏せの、２０°頭を下げ た位置に配置された。シールされたカテーテルは先端で切られそして２０〜５０ μｌのＣＳＦが吸引された。新鮮な自家血液（０．３ｍｌ）が、大槽中へと１０ 分間かけて輸注され、１０分間、平均動脈圧２０〜３０ｍｍＨｇの平均的増加が これに伴った。ラットは全部で２０分間、頭を下げた位置に維持された。 パートＡ： 各ラットは次の血液量過多−血液希釈グループの一つへと無作為 割りつけされた。： 対照（ｎ＝１０）： ７．５ｍｌの新鮮な供与動物血液が与えられた（ヘマト クリット操作せず〔４５％〕）。 ３０／ＤＣＬＨｂ（ｎ＝１０）： 血液体積及びヘマトクリット（３０％）が １０％ＤＣＬＨｂ(Baxter Healthcare Corporation,Deerfield，IL，Lot 94D01A D11)による３．０ｍｌ交換輸血と、それに続くＤＣＬＨｂの付加的な７．５ｍｌ 輸注によって操作された。 ３０／アルブミン（ｎ＝１０）： 3.0 ｍｌ交換輸血により血液体積及びヘマ トクリット（３０％）が操作され、そして、膠質浸透圧を適合させた（７．５％ ）ヒトアルブミン溶液(Baxter Hyland，Glendale，CA，U.S.A.)７．５ｍｌ輸注 が行われた。 各交換輸血は、１．０ｍｌ／分の速度で適当な溶液を同時に抜取りそして輸注 することによって達成され、及び各７．５ｍｌ血液過多輸注は１５分間かけて投 与された。ボーラスとして与えられたとき、ヘモグロビン代用物は血圧を増加す る。Rabinoviciら，「Characterization of hemodynamic，hematologic，and bi ochemical responses to administration of liposome-encapsulated hemoglobi n in the conscious，freely moving rat」，Circ ．Shock，29:115〜132(1989) 。しかしながらこの種において、もしDCLHbが交換輸血として最初に与えられた ら、正常血圧が維持される。Coleら，「Focal cerebral ischemia in rats：eff ect of hypervolemic hemodilution with diaspirin cross-linked hemoglobin versus albumin on brain injury and edema」，Anesthesiology，78:335〜342( 1993)。 大脳の血流を測定するための手順は、Sakuradaら，「Measurement of local c erebral blood flow with iodo-C-14-antipyrine」,Am ．J．Physiol.，234:H59 〜H66(1978)及びColeら，「Focal cere bral ischemia in rats：effect of hemodilution with α−α cross-linked h emoglobin on CBF」,J ．Cereb．Blood Flow Metab.，12:971〜976(1992)中に与 えられている。ＣＢＦ測定の直前に、生理学的パラメーターが上記のように評価 された。１００ｍＣｉｋｇ^-1の¹⁴Ｃ−ヨードアンチピリン（New England Nuclea r，Boston，MA）が４６秒の間一定して増加する速度で与えられた。２１の動脈 血サンプルが、クエンチ較正して¹⁴Ｃ活性の測定のために採血された（Bechman 8000 Liquid Scintillation Spectrometer[Beckman，Brea，CA，U.S.A.]）。¹⁴ Ｃが輸注された後、脳は６０秒未満で除去されそして２−メチルブタン中（−３ ５℃）に配置された。脳は２０μｍ毎に区分され、そして解剖学的に予め決定さ れた５つの冠状平面の各々を取り囲む１０個の切片が２１日間Ｘ線フィルム(Kod ak OM-1，Rochester，NY)上に置かれた。５つの解剖学的平面は２．０ｍｍの連 続的増分とした。第１切片は、脳梁の前方正中線域にあり、そして第５切片は、 脳梁の後方正中線域よりも１．０ｍｍ後方にある。 フィルム処理（２１日間）の後、ＣＢＦの評価がSakuradaら，「Measurement of local cerebral blood flow with iodo-C-14-antipyrine」，Am ．J．Physiol .，234:H59〜H66(1978)の式に基づいたコンピュータープログラムによって行わ れた。０．８０の組織−血液分配係数が用いられ、そして各オートラジオグラフ は９個の¹⁴Ｃ標準（Amersham，Arlington Heights，IL）で較正された。Drexel/ DUMAS Image Analysis System(Drexel University，Philadelphia，PA)の使用に よって、各解剖学的切片は、40ｍｌ未満−100g^-1−分^-1のＣＢＦを有する領域を 画定するように分析された。全ての画 像分析は、研究プロトコールを知らない独立の観察者によって実施された。デー タは複数の比較に関してScheffe の検定による分散分析によって評価され、及び 平均値はｔ−検定によって適切に比較された。結果は表２に示されている。 ＤＣＬＨｂグループにおける低灌流の面積は対照に比して小さく、及び他の２ グループに比してＡｌｂグループにおいて小さかった。 パートＢ： 異なったラットがパートＡと同様に用意された（各グループにつ いてｎ＝６）。クモ膜下出血の後それらは９６時間の回復期間を与えられ、その 後それらは麻酔され、開胸が施され、そして標準のヘマトキシリン及びエオシン の染色のため、Sheehanら，「Theory and Practice of Histotechnology」，Col umbus ，Battelle Press(1980)に記述されているようにして、脳がホルマリ ンによって灌流された。６個の冠状切片（７μｍ）（前は頭頂皮質から後ろは小 脳まで）が、死んだ神経細胞の存在について顕微鏡（×４００）で評価され、そ れは個々に計数されそして各動物について総数として報告された（図２を見よ） 。死んだ神経細胞は、ピクノーゼ、核崩壊、核溶解、細胞質好酸性又はヘマトキ シリン親和性の喪失を示すものと、又は暗い、スカラップ形になったそして腫脹 した神経細胞と定義した。Garciaら，「Neuronal necrosis aftermiddle cerebr al artery occlusion in Wistar rats progresses at different time interval s in the caudoputamen and the cortex」，Stroke，26:636〜643(1995)に記述 された診断基準に従った。 全ての顕微鏡観察は、研究プロトコールを知らされていない独立の観察者によ って実施された。データは複数の比較に関してScheffe の検定による分散分析に よって評価され、及び平均値がｔ−検定によって適切に比較された。ｐ＜０．０ ５を有意を見なした。結果は表３に示されている。 死んだ神経細胞の数は、対照グループに比してＡｌｂグループにおける方が少 なかった。重要なことに、ＤＣＬＨｂグループにおいては、他の２グループに比 して、死んだ神経細胞のカウント数が少なかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． クモ膜下出血における神経細胞の損傷を減らす方法であって、 クモ膜下出血の発生の後、治療上有効な量の架橋ヘモグロビンの溶液を 哺乳類へと輸注すること、 を含む方法。 ２． クモ膜下出血における神経細胞の損傷を減らす方法であって、 分子内又は分子間架橋ヘモグロビンの溶液を、クモ膜下出血を起こして いる哺乳類へと治療上有効な量で輸注すること、 を含む方法。 ３． クモ膜下出血の発生の後の低灌流の領域を減少させる方法であって、 クモ膜下出血の発生の後、分子内又は分子間架橋ヘモグロビンの溶液を 哺乳類へと治療上有効な量で輸注すること、 を含む方法。 ４． 架橋ヘモグロビンの該治療上有効な量が1000ｍｇ／ｋｇ乃至5500ｍｇ／ ｋｇ体重の範囲にある、請求項１、２、又は３のいずれかに記載の方法。 ５． クモ膜下出血の発生の後の該投与の時間が72時間までである、請求項１ 、２、又は３のいずれかに記載の方法。 ６． クモ膜下出血の発生の後に、出血後の誘発される血管痙攣を防止する方 法であって、 出血の該発生後の最初の72時間のうちに治療上有効な量の 架橋ヘモグロビンを投与すること、 を含む方法。 ７． 該治療上有効な量が、出血の発生後の最初の72時間のうちに１回のボー ラスとして又は一連の輸注として投与される、請求項１、２、３又は５のいずれ かに記載の方法。 ８． 確定的な診断に先立って虚血性発作を治療する方法であって、 治療上有効な量の架橋ヘモグロビンを投与しそれによって該虚血性領域 及び神経細胞損傷を減らすこと を含む方法。