JP4581110B2 - ヘモグロビンの精製方法 - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願
本願は、１９９５年３月２３日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／４０９，３３７号の一部継続出願である１９９５年６月２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／４５８，９１６号の一部継続出願である１９９５年６月７日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／４７３，４９７号の一部継続出願である１９９８年７月１０日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０９／１１３，９５３号の継続出願であって、それらの教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
血液損失（例えば急性出血からまたは外科手術の間に）から、貧血（例えば悪性貧血または鎌状赤血球貧血から）から、あるいはショック（例えば循環血液量減少性ショック、アナフィラキシーショック、敗血症ショックまたはアレルギー性ショック）から生じる低酸素症を治療または予防するために代用血液が求められている。これらの代用血液としての能力を有する血液および血液分画の使用には不利な点が伴う。例えば、全血の使用は、しばしば、患者の回復を悪化させたり、患者を死に至らしめることもある肝炎誘発ウイルスやＡＩＤＳ誘発ウイルスの伝播の危険性を伴う。さらに全血の使用は、免疫血液学的問題およびドナー間の不適合性を回避するための血液型検査と交差適合試験を必要とする。
【０００３】
代用血液としてのヒトヘモグロビンは、浸透作用ならびに酸素を輸送および移入するための能力を有するが、腎経路によっておよび血管壁を通して循環から速やかに除去されるという欠点を持ち、非常に短い、従って一般的には満足できない半減期をもたらす。さらに、ヒトヘモグロビンは、しばしば有毒なレベルのエンドトキシン、細菌および／またはウイルスで汚染されている。
【０００４】
非ヒトヘモグロビンもヒトヘモグロビンと同じ欠点を有する。さらに、非ヒト供給源からのヘモグロビンもまた、一般的には抗体などのタンパク質で汚染されており、受容者において免疫系応答を引き起こしうる。
【０００５】
これまで、ペルフルオロ化学物質、合成ヘモグロビン類似体、リポソーム被包ヘモグロビンおよび化学修飾ヘモグロビンを含む、少なくとも４種類の他の代用血液が使用されてきた。しかしながら、これらの代用血液の多くが一般的には血管内貯留時間が短く、異物として循環系によって排除されるか若しくは肝臓や脾臓および他の組織に停留してきた。また、これらの代用血液の多くは生体系とは生物学的に不適合であった。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、精製ヘモグロビン産物の製造方法に関する。
【０００７】
一態様では、前記方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにヘモグロビン溶液を負荷する工程を含む。カラムのｐＨよりも低いｐＨを有する少なくとも１種のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンアセトン緩衝液をカラムにインジェクトし、それにより、精製ヘモグロビン産物をカラムから溶出する。
【０００８】
他の態様では、ヘモグロビン溶液を、最初にカラムを約８．７を超えるｐＨに平衡させた陰イオン交換カラムに負荷する。次に約８．６未満のｐＨを有する少なくとも１種の緩衝液をカラムにインジェクトし、それにより、精製ヘモグロビン産物をカラムから溶出する。
【０００９】
さらに他の態様は、ヘモグロビン溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷する工程を含む。次に、約８．２〜約８．６の範囲のｐＨを有する、少なくとも１１カラムボイドボリュームの平衡化用緩衝液をカラムにインジェクトする。その後、平衡化用緩衝液のｐＨ未満のｐＨを有する緩衝液をカラムにインジェクトし、それにより、カラムから精製ヘモグロビン産物が溶出する。
【００１０】
さらに他の態様では、最初に約８．７を超えるｐＨに平衡させた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにヘモグロビン溶液を負荷する。次に、約８．２〜約８．６までの範囲のｐＨを有する少なくとも１１カラムボイドボリュームのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸の平衡化用緩衝液をカラムにインジェクトする。その後約８．２未満のｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸の緩衝液をカラムにインジェクトし、それにより、カラムから精製ヘモグロビン産物が溶出する。
【００１１】
本発明の方法は、カルボニックアンヒドラーゼのような強固な抵抗性のタンパク質さえも実質的に含まないヘモグロビン産物を有利に実現する。前記方法はまた、多くの夾雑物を含む溶液からヘモグロビンを比較的高い収率で得ることができる。それゆえ、１つの種由来のヘモグロビンを、受容種が重要な副作用を被ることなく、異なる種において代用血液として成功裡に使用することができる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の工程の特徴およびその他詳細について、添付の図面を参照しながらより詳しく記載し、請求項において指し示す。本発明の特定の態様は、例示として示すものであり、本発明を制限するものとしてでないことが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な態様で使用することができる。
【００１３】
本発明は、クロマトグラフィーカラムを使用して、他の血液タンパク質成分を実質的に含まない精製ヘモグロビン産物の製造方法に関する。前記方法は、ヘモグロビン成分を溶出するためにｐＨグラジエントを使用することを特徴とする。
【００１４】
赤血球の破壊、分画および／または限外濾過から得られた濃縮Ｈｂ溶液を１以上の平行（ｐａｌｌａｒｅｌ）クロマトグラフィーカラムに負荷し、高速液体クロマトグラフィーによって、抗体、エンドトキシン、リン脂質、酵素（カルボニックアンヒドラーゼなど）、ウイルスおよび伝染性海綿状脳症病原因子などのその他の夾雑物から、ヘモグロビンをさらに分離する。クロマトグラフィーカラムとしては、非ヘモグロビンタンパク質からＨｂを分離するのに適した陰イオン交換担体が挙げられる。適当な陰イオン交換担体としては、例えば、シリカ、アルミナ、チタニアゲル、架橋デキストラン、アガロース、あるいはジエチルアミノエチルまたは第四アミノエチル基のような陽イオン性化学官能基によって誘導体化された、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレートまたはスチレンジビニルベンゼンのような誘導体化された部分（ｍｏｉｅｔｙ）が挙げられる。溶解ＲＢＣ相に生じやすい他のタンパク質および夾雑物に比してＨｂの選択的吸着と脱着のために適当な陰イオン交換担体および対応する溶出物は、通常の当業者によって容易に決定できる。
【００１５】
より好ましい態様では、熱水処理して孔サイズを増大させ、γ−グリシドキシプロピルシランに曝露して活性エポキシド基を形成し、ついでＣ₃ Ｈ₇ （ＣＨ₃ ）₂ ＮＣｌに曝露させて第四アンモニウム陰イオン交換担体を形成する、シリカゲルから陰イオン交換担体を形成するために方法を使用する。この方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１２０：３２１〜３３３（１９７６）に記載されており、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。ひとつの態様では、１または複数のクロマトグラフィーカラムを最初に約８．７を超えるｐＨに平衡化する。好ましくは、クロマトグラフィーカラムを約８．７〜約１０．０の範囲のｐＨに平衡化する。特に好ましい態様では、平衡化のｐＨは、約８．７〜約９．３の範囲であり、最も好ましくは約８．９〜約９．１の範囲である。好ましくは、最初にカラムを平衡化するために用いられる緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸（トリス−酢酸）であり、約２０ミリモル／リットル（ｍＭ／ｌ）の濃度を有する。
【００１６】
好ましくは、精製水（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）に対して透析したヘモグロビン溶液、さらに好ましくは約２８０μＳ／ｃｍの伝導率とｐＨ約６．７５〜約７．７５を有するヘモグロビン溶液をカラム中の担体にインジェクトして、それにより、カラムをヘモグロビンで負荷する。カラムに負荷するヘモグロビン溶液の濃度は、一般的には約９０〜約２００グラム／リットルの範囲の濃度である。好ましくは、ヘモグロビン溶液の濃度は、約９０〜約１１０グラム／リットルの範囲である。好ましくは、濃縮Ｈｂ溶液のインジェクト後、クロマトグラフィーカラムをトリス−酢酸で約１０分間洗浄し（４カラムボイドボリューム）、担体に結合していない非ヘモグロビン成分を溶出して、担体へのヘモグロビンの強力な結合を促進する。
【００１７】
酵素カルボニックアンヒドラーゼ、リン脂質、抗体およびエンドトキシンのようなタンパク質夾雑物をＨｂから分離するために、クロマトグラフィーカラムにおいてｐＨグラジエントを使用する。ｐＨグラジエントは、連続グラジエントであってもよく、段階的グラジエントであってもよい。異なるｐＨ値を有する緩衝液を逐次的にカラムにインジェクトして、経時的に溶出液のｐＨグラジエントをつくる。インジェクション前に緩衝液を適当な１０，０００ダルトンの脱発熱原性化（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）膜などで濾過することが好ましい。Ｈｂおよび非ヘモグロビン夾雑物の溶出が一般にｐＨに依存し、イオン強度には有意に依存しないように、当該緩衝液は低いイオン強度を有する１価緩衝液でなければならない。一般的には、約５０ｍＭ以下のイオン濃度の緩衝液は、適切な低イオン強度を有する。
【００１８】
好ましくは、段階的グラジエントにおいてカラムから溶出することにより、ヘモグロビン溶液の夾雑物とヘモグロビンとを分離し、それにより、ヘモグロビンをカラムに負荷するｐＨとヘモグロビンとをカラムから溶出する最終ｐＨとの間のｐＨを有する緩衝液を使用する。１つの態様では、段階的グラジエントは、適当な緩衝液をカラムに注入する工程を含む。緩衝液は、最初にカラムをヘモグロビンで負荷する時点でのカラムのｐＨより低いｐＨを有する。カラムを緩衝液で平衡化する。好ましくは、少なくともカラム容積の約６倍の緩衝液をカラムにインジェクトする。本明細書において規定される「カラム容積」とは、いかなる充填物質をも含まないカラムの容積である。一般的には、本発明で使用するための適当なカラム充填物、すなわち交換担体は、カラムの総容積の約０．５２５のボイド率をカラムに生じさせる。従ってカラム容積の６倍が約１１．７倍の「カラムボイドボリューム」に等しい。一般には、少なくとも１１カラムボイドボリュームの緩衝液をカラムにインジェクトする。
【００１９】
好ましくは、緩衝液のｐＨは、約８．６より低い。より好ましくは、緩衝液のｐＨは約８．２〜約８．４の範囲である。特に好ましい態様では、緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸（トリス−酢酸）である。このようにしてカラムを平衡化することにより、ヘモグロビン溶液の夾雑物をカラムから溶出する。
【００２０】
その後、緩衝液をカラムにインジェクトしてヘモグロビンを溶出する。好ましくは、緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸（トリス−酢酸）である。より好ましくは、トリス−酢酸溶液は約６．５〜約７．５の範囲のｐＨを有する。前記ヘモグロビン溶出液が精製ヘモグロビン産物である。
【００２１】
好ましい態様では、Ｈｂ溶出物の純度を保証するためにＨｂ溶出物の最初の３％〜４％およびＨｂ溶出物の最後の３％〜４％を廃棄する。Ｈｂ溶出物を滅菌フィルターに通すことが好ましい。適当な滅菌フィルターとしては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｂｒａｎ Ｃａｔ ＃５２３２５０７ Ｇ１ＰＨフィルターなどの０．２２μｍフィルターが挙げられる。
【００２２】
クロマトグラフィーカラムを再使用する場合には、カラムに残存する夾雑非ヘモグロビンタンパク質とエンドトキシンとを第四の緩衝液によって溶出する。適当な緩衝液の例はＮａＣｌ／トリス−酢酸溶液（約１．０Ｍ ＮａＣｌと約２０ｍＭトリス−酢酸の濃度；約８．４〜約９．４、好ましくは約８．９〜９．１のｐＨ）である。最も好ましい態様では、緩衝液のすべてが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸である。一般的には、使用する緩衝液は、約０℃〜約５０℃の範囲の温度である。好ましくは、緩衝液の温度は、使用中約１２．４±１．０℃である。さらに、緩衝液は、一般的には約９℃〜約１１℃の範囲の温度で保存する。
【００２３】
本明細書に規定する代用血液は、少なくとも生体器官および組織に酸素を輸送して移入することができ、十分な血管内膨張圧を維持することができる、ヒト、哺乳動物および他の脊椎動物において使用するためのヘモグロビンベースの酸素運搬組成物である。脊椎動物は古典的に定義されている通りであり、ヒトまたは組織に酸素を運ぶために循環系の血液を使用する他のあらゆる脊椎動物を含む。さらに、循環系の定義は、古典的に定義されている通りであり、心臓、動脈、静脈および毛細血管のようなより小さな脈管構造を含む微小循環（ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）からなる。
【００２４】
本発明の方法によって形成される代用血液は、好ましくは本発明の１つの態様に従って作製され、顕著な免疫応答をもたらさず、受容者にとって非毒性であるレベルのエンドトキシン、リン脂質、異種タンパク質および他の夾雑物が挙げられるべきであろう。好ましくは、代用血液は、ウルトラピュア（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ）である。本文中で定義する「ウルトラピュア」とは、０．５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシン、３．３ｎｍｏｌ／ｍｌ未満のリン脂質およびほとんどまたは全く検出できないレベルの血清アルブミンまたは抗体などの非ヘモグロビンタンパク質を含むことを意味する。
【００２５】
「エンドトキシン」の語は、多くの条件下で毒性である、グラム陰性菌細胞壁の外層の一部として産生される細胞結合リポ多糖類をさす。動物に注入したとき、エンドトキシンは発熱、下痢、出血性ショック、および他の組織損傷を引き起こしうる。エンドトキシン単位（ＥＵ）は、１９８３年の米国薬局方協約、３０１４ページにより、米国標準品ロットＥＣ−５の０．１ナノグラムに含まれる活性として定義された。ＥＣ−５の１バイアルは、１０，０００ＥＵを含む。代用血液中のエンドトキシン濃度を測定するための適当な手段の例としては、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって開発された方法「動態／濁度測定リムルスアメーバ様細胞溶解産物〔Ｋｉｎｅｔｉｃ／Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｌｉｍｕｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｉｃ Ｌｙｓｔａｔｅ（ＬＡＬ）’５０００法」が挙げられる。
【００２６】
本明細書で規定する「安定重合ヘモグロビン」は、２年以上にわたる適当な保存温度での保存期間中、好ましくは低酸素環境で保存したとき２年以上にわたって、分子量分布および／またはメトヘモグロビン含有量を実質的に上昇または低下させない、ヘモグロビンベースの酸素運搬組成物である。１年以上にわたる保存のための適当な保存温度は：約０℃〜約４０℃である。好ましい保存温度範囲は、約０℃〜約２５℃である。
【００２７】
適当な低酸素環境、あるいは実質的に酸素不含である環境とは、少なくとも約２ヵ月間、好ましくは少なくとも約１年間、あるいはより好ましくは少なくとも約２年間の保存期間にわたって、代用血液中約１５重量％未満のメトヘモグロビン濃度をもたらせる、代用血液と接触する酸素の累積量と定義される。酸素の累積量は、代用血液包装内への酸素の侵入および代用血液と包装の最初の酸素含有量を含む。
【００２８】
赤血球（ＲＢＣ）の採集からヘモグロビン重合まで、本方法全体を通して、血液溶液、ＲＢＣおよびヘモグロビンは、温度を約２０℃未満、０℃を超える温度に保持することなど、細菌増殖あるいは生物負荷量（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を最小限に抑えるのに十分な条件下に保持する。好ましくは温度を約１５℃以下に保持する。より好ましくは、温度を１０±２℃に保持する。
【００２９】
本方法においては、安定重合ヘモグロビン代用血液を調製する工程のためのコンパートメントの一部は、無菌産物を製造するに十分に衛生的にする。無菌は、当該分野において定義されている通りであり、特に、溶液がＵＳＰ ＸＸＩＩ、第７１章、１４８３−１４８８頁に規定されている無菌性についての米国薬局方の必要条件に合致することである。さらに、工程の流れにさらされるコンパートメントの部分は、通常、工程の流れと反応しないまたは工程の流れを汚染しない物質で製造されるかまたはおおわれる。かかる物質としては、ステンレス鋼およびインコネルなどの他の鋼合金が挙げられうる。
【００３０】
適当なＲＢＣ供給源は、ヒト血液、ウシ血液、ヒツジ血液、ブタ血液、他の脊椎動物由来の血液、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２：５５−５９（１９９４）に述べられているトランスジェニックＨｂなどの遺伝子導入によって産生されるヘモグロビンなどが挙げられる。
【００３１】
血液は、生存ドナーまたは新鮮屠殺したドナーから採集することができる。ウシ全血を採集するための１つの方法が、Ｒａｕｓｃｈらに許諾された米国特許第５，０８４，５５８号明細書および同第５，２９６，４６５号明細書に述べられている。血液は衛生的に採集することが好ましい。
【００３２】
採集時または採集直後に、血液の顕著な凝固を防ぐために血液を少なくとも１つの抗凝固薬と混合する。血液のための適当な抗凝固薬は当該技術において古典的に知られている通りであり、例えば、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリンなどが挙げられる。血液と混合する場合、抗凝固薬は、粉末などの固形形態または水溶液でありうる。
【００３３】
血液溶液供給源は、新鮮採集されたサンプル由来または血液銀行の使用期間終了後のヒト血液のような古いサンプル由来でありうることが理解される。さらに、血液溶液は、それまで凍結状態および／または液体状態で保持されていたものであってもよい。血液溶液は、本方法において使用する前に凍結されていないことが好ましい。
【００３４】
他の態様では、血液溶液に抗凝固薬を導入する前に、ペニシリンなどの血液溶液中の抗生物質のレベルを測定する。血液サンプルのドナーが抗生物質で治療されていなかったことを確認することにより、抗生物質レベルを測定して、血液サンプルが病原菌を含まないというある程度の保証を与える。抗生物質に関する適当なアッセイとしては、例えば、「乳中のペニシリンの迅速検出」と題する方法を用いるペニシリンアッセイキット（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などが挙げられる。血液溶液は、約０．００８単位／ｍｌまたはそれ以下のペニシリンレベルを含むことが好ましい。一方、ウシにおいて疾患がないことあるいは抗生物質治療が行われていないことをモニターするための牛群管理プログラムを使用してもよい。
【００３５】
好ましくは、大きな凝集物や粒子を取り除くために、抗凝固ステップの前またはその間に、例えば、濾過器を通すことによって血液溶液を濾す。６００メッシュスクリーンは適当なストレーナーの例である。
【００３６】
次に血液溶液中のＲＢＣを透析濾過（ダイアフィルトレーション）または等張液などの少なくとも１種の溶液による個別の希釈と濃縮段階の組合せなどの適当な手段によって洗浄し、血清アルブミンまたは抗体（例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ））などの細胞外血漿タンパク質からＲＢＣを分離する。ＲＢＣをバッチでまたは連続的供給モードで洗浄できることが理解できる。
【００３７】
許容されうる等張液は、当該分野において知られている通りであり、ＲＢＣの細胞膜を破壊せず、かつ全血の血漿部分を置換するｐＨと浸透圧モル濃度を有する、クエン酸塩／塩類液などの溶液が挙げられる。好ましい等張液は、中性ｐＨと約２８５−３１５ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度とを有する。好ましい態様では、等張液はクエン酸ナトリウム二水和物（６．０ｇ／ｌ）と塩化ナトリウム（８．０ｇ／ｌ）との水溶液で構成される。
【００３８】
本発明の方法において使用されうる水は、蒸留水、脱イオン水、注射用蒸留水（ＷＦＩ）および／または低発熱原性水（ＬＰＷ）などが挙げられる。好ましいＷＦＩは、注射用蒸留水に関する米国薬局方規格に適合する脱イオン化された蒸留水である。ＷＦＩはさらにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１，１５−２３（１９９１）の中に記述されている。好ましいＬＰＷは、０．０２ＥＵ／ｍｌ未満を含む脱イオン水である。
【００３９】
等張液は、血液溶液に加える前に濾過することが好ましい。適当なフィルターとしては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１フィルターなどのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ １０，０００ダルトン限外濾過膜あるいはＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中空糸、１０，０００ダルトン（Ｃａｔ ＃ＵＦＰ−１０−Ｃ−８５）などが挙げられる。
【００４０】
好ましい態様では、血液溶液中のＲＢＣを透析濾過によって洗浄する。適当なダイアフィルターとしては、０．１μｍ〜０．５μｍのフィルター（例えば０．２μｍ中空糸フィルター、Ｍｉｃｒｏｇｏｎ Ｋｒｏｓｆｌｏ ＩＩ−マイクロフィルトレーションカートリッジ）などの実質的により小さな血液溶液成分からＲＢＣを分離する孔サイズを備えた微小孔膜などが挙げられる。同時に、ダイアフィルターを通して失われる濾液の割合（または容量）に等しい割合で相殺として濾過した等張液を継続的に（またはバッチで）加える。ＲＢＣ洗浄の際に、直径がＲＢＣよりも有意に小さい直径であるか、あるいは血漿のように液体である血液溶液の成分はダイアフィルターの壁を通過して濾液中に入る。ＲＢＣ、血小板および白血球などの希釈血液溶液のより大きな物質が保持され、これらを等張液と混合して、継続的にまたはバッチごとに加えて透析された血液溶液を形成する。
【００４１】
より好ましい態様では、最初に一定容量の濾過した等張液を透析濾過タンクに加えて、透析濾過タンク中の血液溶液の容量を希釈する。好ましくは、加える等張液の容量は血液溶液の最初の容量にほぼ等しい。
【００４２】
別の態様では、一連の連続的（または逆連続的）希釈と濃縮ステップを通してＲＢＣを洗浄し、ここで、少なくとも１種の等張液を添加することにより血液溶液を希釈し、フィルターを通して濃縮し、それにより、透析された血液溶液を形成する。
【００４３】
ＲＢＣを汚染する血漿タンパク質のレベルが実質的に低下したとき（一般的には少なくとも約９０％）、ＲＢＣ洗浄を終了する。一般的には、ダイアフィルター３４から排出される濾液の容量が、血液溶液を濾過等張液で希釈する前に透析濾過タンク中に入っていた血液溶液の容量の約３００％以上になったとき、ＲＢＣ洗浄を終了する。追加的ＲＢＣ洗浄によってＲＢＣから細胞外血漿タンパク質をさらに分離してもよい。例えば、６容量の等張液による透析濾過は少なくとも約９９％のＩｇＧを血液溶液から除去することができる。
【００４４】
次に透析した血液溶液を、遠心分離などによる透析血液溶液中のＲＢＣを白血球および血小板から分離するための手段に供する。
【００４５】
ＲＢＣを他の血液成分から分離するために、当該分野において一般的に知られる他の方法が使用できることは明白である。例えば沈殿が使用でき、かかる分離方法は、他の血液成分からＲＢＣを分離する前に、ＲＢＣの有意の量の細胞膜を破壊しない、例えば約ＲＢＣの約３０％未満しか破壊しない。
【００４６】
ＲＢＣの分離後、ＲＢＣを溶解するための手段によってＲＢＣを溶解し、ＲＢＣからヘモグロビンを放出させてヘモグロビン含有溶液を形成する。溶解手段は、機械的溶解、化学的溶解、低張性溶解、あるいは酸素を運搬して放出するＨｂの能力を有意に損傷することなくヘモグロビンを放出させる他の既知の溶解方法のように、種々の溶解方法が使用できる。
【００４７】
さらに他の態様では、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：２５８−２６０（１９９２）に述べられている組換えによって生成されたヘモグロビンのような、組換えによって生成されるヘモグロビンをＲＢＣの代わりに本発明の方法において処理することができる。ヘモグロビンを含む細菌細胞を上記に述べられているように洗浄して、夾雑物から分離することができる。次にこれらの細菌細胞をボールミルのような当該技術において既知の手段によって機械的に破壊し、細胞からヘモグロビンを放出させて溶解細胞相を形成する。その後この溶解細胞相を溶解ＲＢＣ相と同様に処理する。
【００４８】
溶解後、溶解ＲＢＣ相を限外濾過して、分子量約１００，０００ダルトンを超えるタンパク質のようなより大きな細胞デブリを除去する。一般に細胞デブリは、Ｈｂ、より小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素および有機代謝中間体を除く、すべての完全なおよび断片化された細胞成分を含む。許容される限外濾過器としては、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｈ１）およびＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ．；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＵＦＰ１００Ｅ５５）によって製造されている１００，０００ダルトンのフィルターなどが挙げられる。
【００４９】
溶解ＲＢＣ相中のＨｂの濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで限外濾過を継続し、重合に使用できるヘモグロビンの収率を最大にする。溶解ＲＢＣからＨｂを分離するためには、沈殿、遠心分離あるいはマイクロフィルトレーションを含めた他の方法が使用できる。
【００５０】
次にＨｂ限外濾液を限外濾過して、電解質、補酵素、代謝中間体および分子量約３０，０００ダルトン未満のタンパク質のようなより小さな細胞デブリとＨｂ限外濾液からの水を除去することができる。好適な限外濾過器には、３０，０００ダルトンの限外濾過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｔ１および／またはＡｒｍｉｃｏｎ，＃５４０ ４３０）が含まれる。
【００５１】
その後、上記に詳述したように濃縮Ｈｂ溶液を１またはそれ以上の平行クロマトグラフィーカラムに充填することができる。
【００５２】
次に、好ましくはクロマトグラフィー工程で得たＨｂ溶出物を、変性あるいは酸化ヘモグロビン（メトヘモグロビン）の形成から生じるであろうような、Ｈｂ溶出物中のＨｂが酸素を運搬し、放出する能力を有意に低下させることなくＨｂを実質的に脱酸素化する手段によって、重合の前に脱酸素化して脱酸素化されたＨｂ溶液（以下、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂという）を形成することが好ましい。
【００５３】
１つの態様では、相の膜を越えて不活性ガスを移動させることによってＨｂ溶出物を脱酸素化する。そのような不活性ガスには、例えば窒素、アルゴンおよびヘリウムが含まれる。当該技術において既知の、ヘモグロビンの溶液を脱酸素化するための他の手段を使用してＨｂ溶出物を脱酸素化できることがわかっている。そのような他の手段は、例えばＨｂ溶出物の窒素スパージング、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システイン、亜ジチオン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸ナトリウムのような還元剤による化学的除去、あるいは光による光分解を含みうる。
【００５４】
クロマトグラフィーカラムからの溶出後、好ましくはＨｂ溶出物を濃縮して工程の効率を高める。Ｈｂ溶出物を限外濾過器を通して再循環させてＨｂ溶出物を濃縮し、濃縮Ｈｂ溶液を形成する。好適な限外濾過器には、例えば３０，０００ダルトンまたはそれより小さい限外濾過器（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１またはＡｍｉｃｏｎ Ｃａｔ ＃５４０４３０）が含まれる。典型的には、Ｈｂの濃度が約１００〜約１２０ｇ／ｌになったとき、Ｈｂ溶出物の濃縮を終了する。Ｈｂ溶出物を濃縮する間、好ましくはＨｂ溶出物の温度を約８〜１２℃に保持する。
【００５５】
次に、好ましくは濃縮されたＨｂ溶液に緩衝液を加えてＨｂ溶液のイオン強度を調整し、Ｈｂの脱酸素化を強化する。イオン強度を約１５０ｍｅｑ／ｌ〜約２００ｍｅｑ／ｌに調整して、Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を低下させることが好ましい。適当な緩衝液は、Ｈｂタンパク質の有意の変性を生じさせないが、Ｈｂの脱酸素化を促進するうえで十分に高いイオン強度を有するｐＨの緩衝液を含む。適当な緩衝液としては、例えば、約６．５〜約８．９のｐＨ範囲を有する生理食塩水が挙げられる。好ましい緩衝液は、ｐＨ約８．９の１．０Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−酢酸水溶液である。
【００５６】
好ましくは、得られた緩衝Ｈｂ溶液を次いで限外濾過器を通して再循環させ、再びＨｂ溶液を濃縮して工程の効率を高める。好ましい態様では、Ｈｂの濃度が約１００ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｌになったとき、濃縮を終了する。
【００５７】
脱酸素化の間、適当な相間移動膜を通してＨｂ溶液を循環させる。適切な相間移動膜には、例えば０．０５μｍポリプロピレン中空ファイバーマイクロフィルター（例えばＨｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃａｔ ＃ ５ＰＣＭ−１０７）が含まれる。同時に、相間移動膜を越えて不活性ガスの向流を通過させる。適当な不活性ガスとしては、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウムなどが挙げられる。相間移動膜を越えたガス交換によりＨｂ溶液から酸素を取り除く。
【００５８】
Ｈｂ溶液中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビンまたはＨｂＯ₂ ）含有量が約２０％またはそれより小さいレベルにＨｂ溶液のｐＯ₂ が低下するまで、脱酸素化を続ける。好ましい態様では、Ｈｂ溶液中のＨｂＯ₂ 含有量は約１０％またはそれより小さい。
【００５９】
脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を、典型的にはメトヘモグロビン形成の速度に対して脱酸素化の速度を釣り合わせるレベルに保持する。メトヘモグロビン含有量を２０％未満に制限するように温度を保持する。さらにＨｂ溶液の脱酸素化しながら、至適温度によって約５％未満のメトヘモグロビン含有量、好ましくは約２．５％未満のメトヘモグロビン含有量を生じさせる。典型的には、脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃に保持する。
【００６０】
脱酸素化の間、そしてその後本発明の方法の残りの段階を通して、Ｈｂを低酸素環境に保持してＨｂによる酸素吸収を最小限に抑え、約２０％未満、好ましくは約１０％未満のＨｂＯ₂ 含有量を保持する。
【００６１】
次に脱酸素化されたＨｂを、好ましくは、スルフヒドリル化合物を含む低酸素含有量保存緩衝液で平衡させ、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを形成する。適当なスルフヒドリル化合物には、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、Ｄ，Ｌ−システイン、γ−グルタミル−システイン、グルタチオン、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、１，４−ブタンジチオール、チオグリコレート、および他の生体適合性スルフヒドリル化合物のような非毒性還元剤が含まれる。低酸素含有量保存緩衝液の酸素含有量は、緩衝液中のスルフヒドリル化合物の濃度を有意に低下させず、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のオキシヘモグロビン含有量を約２０％またはそれより低い、好ましくは約１０％未満に制限するのに十分な低さでなければならない。典型的には、保存緩衝液は約５０トル未満のｐＯ₂ を有する。
【００６２】
好ましい態様では、保存緩衝液は、Ｈｂ重合とメトヘモグロビン形成を相殺するために適当なｐＨ、典型的には約７．６〜約７．９のｐＨを有していなければならない。
【００６３】
ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合するスルフヒドリル化合物の量は、重合の際にＨｂの分子内架橋を高めるのに十分多く、且つ高いイオン強度によってＨｂ分子の分子間架橋を有意に低下させることがない十分少ない量である。典型的には、約０．２５モル〜約５モルのｄｅｏｘｙ−Ｈｂを酸化に対して安定化するために約１モルのスルフヒドリル官能基（−ＳＨ）が必要である。
【００６４】
好ましい態様では、保存緩衝液は約２５〜３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７〜７．８）を含み、さらに酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度が約０．００３重量％〜約０．３重量％であるような量のＮＡＣを含む。より好ましくは、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度は約０．０５重量％〜約０．２重量％である。
【００６５】
好ましくは、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合する前に、１０，０００ダルトンの限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１またはＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｘｃｅｌｌ Ｃａｔ ＃ＵＦＰ−１０−Ｃ−７５）などを通して、保存緩衝液を濾過する。
【００６６】
１つの態様では、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを次いで任意のフィルターに通過させる。適当なフィルターには、０．２μｍポリプロピレンプレフィルターおよび０．５μｍ滅菌マイクロフィルター（Ｐａｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＩＩ，Ｃａｔ ＃ＡＢＩＹ００５Ｚ７またはＧｅｌｍａｎ Ｓｕｐｏｒ）が含まれる。ｄｅｏｘｙ−Ｈｂを実質的に酸素不含の大気下に保持する。これは、例えば工程の装置を酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの充填前および充填後に窒素のような不活性ガスで清掃し、おおうことによって実現できる。
【００６７】
任意に、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合に移す前に、適切な量の水を重合反応器に加える。１つの態様では、水の適切な量は、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に加えるとき約１０〜約１００ｇ／ｌ Ｈｂの濃度の溶液を生じる量である。好ましくは水は酸素除去されている。
【００６８】
重合工程で水のｐＯ₂ を、ＨｂＯ₂ 含有量を約２０％に制限するのに十分なレベル、典型的には約５０トル未満に低下したあと、重合反応器を窒素のような不活性ガスでおおう。その後、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に移し、同時にそれを適切な流量の不活性ガスでおおう。
【００６９】
重合反応器中の酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ溶液の温度を、架橋剤と接触したとき酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの重合を至適にする温度まで上昇させる。典型的には、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの温度は重合の間を通じて約２５℃〜約４５℃、好ましくは約４１℃〜約４３℃である。重合反応器を加熱するための許容される熱伝達手段の例は、ジャケットを通して高温のエチレングリコールを適用することによって加熱する、ジャケット式加熱系である。
【００７０】
次に酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを、約２時間〜約６時間にわたって酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合させるのに十分な温度で適当な架橋剤に曝し、重合ヘモグロビン（ポリ（Ｈｂ））の溶液を形成する。
【００７１】
好適な架橋剤としては、例えば、特に、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、活性形態のポリオキシエチレンおよびデキストランのようなＨｂタンパク質を架橋結合する多官能性薬剤、グリコールアルデヒドのようなα−ヒドロキシアルデヒド、Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイル−（２' −ニトロ，４' −スルホン酸）−フェニルエステル、ｍ−マレイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホスクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ，Ｎ' −フェニレンジマレイミド、ならびにビス−イミデート類、アシルジアジド類またはアリール二ハロゲン化物類に属する化合物などが挙げられる。
【００７２】
架橋剤の好適な量は、分子内架橋がＨｂを安定化し、また分子間架橋がＨｂのポリマーを形成して、それによって血管内貯留を高めることができる量である。典型的には、架橋剤の好適な量は、架橋剤対Ｈｂのモル比が約２：１を超える量である。好ましくは架橋剤対Ｈｂのモル比は約２０：１〜４０：１である。
【００７３】
好ましくは、重合は、約３５ミリモル未満またはそれと等しい塩化物濃度を有し、ｐＨが約７．６〜約７．９である緩衝液中で実施する。
【００７４】
好ましい態様では、適当な量の架橋剤を酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂに加え、それを次いで低い剪断で混合するための手段によって混合する。好適な低剪断混合手段にはスタティックミキサーが含まれる。好適なスタティックミキサーは、例えばＣｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．から入手される「Ｋｅｎｉｃｓ」スタティックミキサーである。
【００７５】
１つの態様では、スタティックミキサーを通して酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂと架橋剤を再循環させると、架橋剤と酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合を伴う乱流状態を生じ、それにより高濃度の架橋剤を含むｄｅｏｘｙ−Ｈｂのポケットを形成する潜在的可能性を低下させる。架橋剤とｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合は、高分子量のＨｂポリマー、すなわち５００，０００ダルトンより大きい重量のポリマーの形成を低減し、同時に重合の際に架橋剤とｄｅｏｘｙ−Ｈｂのより速やかな混合を可能にする。さらに、スルフヒドリル化合物、好ましくはＮＡＣの存在により、Ｈｂ重合の間に有意のＨｂ分子内架橋が生じる。スルフヒドリル化合物とグルタルアルデヒドおよび／またはＨｂの相互作用の正確な機序は不明であるが、スルフヒドリル化合物は、高分子量Ｈｂポリマーの形成を少なくとも部分的に阻害し、安定化された四量体Ｈｂを選択的に形成するようにＨｂ／架橋剤の化学結合に影響を及ぼすと考えられる。
【００７６】
ポリ（Ｈｂ）は、ポリ（Ｈｂ）においてＨｂ分子の実質的な部分（例えば少なくとも約５０％）が化学結合しており、約１５％未満のような小量だけが高分子量の重合ヘモグロビン鎖内に含まれる場合、有意の分子内架橋を有すると定義される。高分子量のポリ（Ｈｂ）分子は、例えば約５００，０００ダルトンを超える分子量を有する分子である。
【００７７】
好ましい態様では、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する。典型的には、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ１キログラムにつき約１０〜約７０グラムのグルタルアルデヒドを使用する。より好ましくは、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂ１キログラムにつき約２９〜３１グラムのグルタルアルデヒドが添加されるまで、５時間かけてグルタルアルデヒドを加える。
【００７８】
重合後、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を典型的には約１５℃〜約２５℃に低下させる。
【００７９】
使用する架橋剤がアルデヒドでない場合には、形成されるポリ（Ｈｂ）は一般に安定なポリ（Ｈｂ）である。使用する架橋剤がアルデヒドである場合には、形成されるポリ（Ｈｂ）は、適当な還元剤と混合してポリ（Ｈｂ）中のあまり安定でない結合を低減し、より安定な結合を形成するまでは一般に安定でない。適当な還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、亜ジチオン酸ナトリウム、トリメチルアミン、ｔ−ブチルアミン、モルホリンボラン、ピリジンボランなどが挙げられる。還元剤を加える前に、任意にポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が約７５〜約８５ｇ／ｌに上昇するまで、限外濾過によってポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮する。好適な限外濾過器の例は、３０，０００ダルトンフィルター（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０ＬＴおよびＡｍｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃５４０４３０）である。
【００８０】
次に、還元剤を保存するため、およびその後の還元の際にＨｂを変性させることがある水素ガスの発生を防ぐために、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨをアルカリｐＨの範囲に調整する。
【００８１】
１つの態様では、ｐＨを１０より大きく調整する。重合の間または重合後にポリ（Ｈｂ）溶液に緩衝液を加えることによってｐＨを調整することができる。ポリ（Ｈｂ）内は、典型的には精製して非重合ヘモグロビンを除去する。これは、透析濾過（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって実施できる（例えば、１９９７年１１月２５日発行の同時係属の米国特許第５，６９１，４５３号明細書参照、その教示は参照してここに組み込まれる）。
【００８２】
ｐＨの調整後、典型的には脱酸素化ループを通して少なくとも１つの還元剤、好ましくは水素化ホウ素ナトリウム溶液を重合工程に加える。典型的には、ポリ（Ｈｂ）のＨｂ四量体１モルにつき（６４，０００ダルトンのＨｂにつき）約５〜約１８モルの還元剤を加える。好ましい態様では、重合サブシステム９８においてポリ（Ｈｂ）溶液９リットルごとに０．２５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１リットルを０．１〜０．１２ｌｐｍの速度で加える。
【００８３】
その後、安定なポリ（Ｈｂ）を適当なｐＨと生理的電解質レベルを有する透析濾過液で透析濾過することにより、安定なポリ（Ｈｂ）のｐＨと電解質を生理的レベルに回復させて、安定な重合ヘモグロビン代用血液を形成することができる。好ましくは、透析濾過液は緩衝液である。
【００８４】
ポリ（Ｈｂ）を還元剤で還元した場合、透析濾過液は酸性ｐＨ、好ましくは約４〜約６のｐＨを有する。
【００８５】
また、最終的な重合ヘモグロビン代用血液の安定性を高めるための酸素捕捉剤として非毒性スルフヒドリル化合物を安定なポリ（Ｈｂ）溶液に加えることができる。スルフヒドリル化合物は、透析濾過液の一部としておよび／または別途に加えることができる。保存期間中、酸素を捕捉してメトヘモグロビン含有量を約１５％未満に保持するスルフヒドリル濃度を確立する量のスルフヒドリル化合物を加える。好ましくは、スルフヒドリル化合物はＮＡＣである。典型的には、加えるスルフヒドリル化合物の量は、約０．０５重量％〜約０．２重量％のスルフヒドリル濃度を確立するのに十分な量である。
【００８６】
好ましい態様では、重合反応器および残りの輸送装置において不活性な実質的に酸素不含の大気で圧を保持しながら、無菌取扱い条件下で代用血液を包装する。
【００８７】
本発明の方法によって形成される適当な安定な重合ヘモグロビン代用血液に関する規格を表Ｉに提供する。
【００８８】
【表１】

【００８９】
その後安定な代用血液を、上記で詳述したような低酸素環境を有する、短期保存容器または滅菌保存容器中で保存する。保存容器はまた、保存期間中の蒸発による代用血液の有意の濃縮を防ぐために、水蒸気通過に対して十分に不透過性でなければならない。代用血液の有意の濃縮とは、代用血液の１またはそれ以上のパラメータが規格から逸脱して高くなる濃縮である。
【００９０】
本発明の方法に従って形成される安定な重合ヘモグロビン代用血液の合成は、さらに米国特許第５，２９６，４６５号明細書に述べられている。
【００９１】
本発明の方法によって形成される代用血液を受容することができる脊椎動物としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ラット、ウマまたはヒツジなどの哺乳動物が挙げられる。さらに、当該代用血液を受容することができる脊椎動物としては、胎児（出生前脊椎動物）、出生後脊椎動物、出生時の脊椎動物などが挙げられる。
【００９２】
本発明の代用血液は、１以上の注入法により、代用血液を直接および／または間接的に脊椎動物の循環系に注入することによって循環系に投与することができる。直接注入法としては、例えば、静脈内および動脈内注射のような血管内注射、ならびに心臓内注射などが挙げられる。間接注入法としては、例えば、腹腔内注射、代用血液がリンパ系によって循環系に輸送される皮下注射、トロカールまたはカテーテルによる骨髄への注射などが挙げられる。好ましくは、代用血液を静脈内投与する。
【００９３】
治療する脊椎動物は、代用血液の注入の前、注入中、および／または注入後に正常血液量、血液量過多あるいは血液量減少でありうる。代用血液は、トップローディングのような方法および交換法によって循環系に投与することができる。
【００９４】
代用血液は、循環系の一部または全体を通じてのＲＢＣ流の低下、貧血およびショックを含めた多くの異なる原因から生じる脊椎動物内の酸素欠乏組織を処置するために治療的に投与することができる。さらに代用血液は、脊椎動物の組織への、あるいは脊椎動物の循環系全体でのＲＢＣ流の起こりうるまたは予想される低下から生じうる、脊椎動物内の組織の酸素枯渇を防ぐために予防的に投与することができる。さらに、１９９５年３月２３日出願の同時係属の米国特許出願番号第０８／４０９，３３７号明細書は、特に部分的動脈閉塞由来または微小循環における部分的遮断由来の低酸素症を処置するために治療的または予防的にヘモグロビンを投与すること、ならびにその場合に使用する用量を記述しており、これはその全体が参照してここに組み込まれる。
【００９５】
典型的には、代用血液の好適な用量または用量の組合せは、血漿中に入ったとき、脊椎動物の血液中で約０．１〜約１０グラムＨｂ／ｄｌ、あるいは大量の血液喪失を補うために必要であればそれ以上の総ヘモグロビン濃度を生じる量である。
【００９６】
下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００９７】
実施例１
安定な重合Ｈｂ代用血液の合成
米国特許第５，２９６，４６５号明細書に述べられているように、ウシ全血のサンプルを採集し、クエン酸ナトリウム抗凝固薬と混合して血液溶液を形成し、その後エンドトキシンレベルに関して分析した。
【００９８】
各々の血液溶液サンプルは採集後約２℃の温度に保持し、６００メッシュスクリーンで漉して大きな凝集物と粒子を除去した。
【００９９】
プールする前に、血液溶液中のペニシリンレベルが≦０．００８単位／ｍｌであることを確認するため、「乳中のペニシリンの迅速検出（”Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎ Ｍｉｌｋ”）」と題する方法を用いる、ミシガン州デトロイトのＤｉｆｃｏ社から購入したアッセイキットで各血液溶液サンプル中のペニシリンレベルを測定した。
【０１００】
その後血液溶液サンプルをプールし、脱発熱原性化した（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）クエン酸ナトリウム水溶液と混合して、ウシ全血中０．２重量％クエン酸ナトリウム溶液（以下「０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液」）を形成した。
【０１０１】
次に０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液を連続的に８００μｍと５０μｍのポリプロピレンフィルターに通して、直径約５０μｍまたはそれより大きい血液溶液デブリを除去した。
【０１０２】
次いでＲＢＣを洗浄して、ＢＳＡあるいはＩｇＧのような細胞外血漿タンパク質をＲＢＣから分離した。血液溶液に含まれるＲＢＣを洗浄するために、最初に透析濾過タンク中の血液溶液の容量を、等容量の濾過等張液を透析濾過タンクに加えることによって希釈した。等張液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１）１０，０００ダルトン限外濾過膜で濾過した。等張液は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）中６．０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム二水和物および８．０ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含有した。
【０１０３】
その後、希釈した血液溶液を、０．２μｍ中空ファイバー（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ Ｋｒｏｓｆｌｏ ＩＩマイクロフィルトレーションカートリッジ）ダイアフィルターを通して透析濾過することにより、もとの容量まで濃縮した。同時に、０．２μｍダイアフィルターによる濾液損失の割合に等しい割合で、相殺として濾過等張液を継続的に加えた。透析濾過の間に、直径がＲＢＣより有意に小さかった、または血漿のような液体である希釈血液溶液の成分は、濾液と共に０．２μｍダイアフィルターの壁を通過した。ＲＢＣ、血小板、および白血球のような希釈血液溶液のより大きな物質は、継続的に添加する等張液と共に保持され、透析された血液溶液を形成した。
【０１０４】
ＲＢＣ洗浄の間、希釈血液溶液を約１０〜２５℃の温度に保持し、ダイアフィルターの入口での流体圧を約２５ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉにして工程の効率を高めた。
【０１０５】
ダイアフィルターから排出される濾液の容量が濾過等張液で希釈する前の血液溶液の容量の約６００％に等しくなったとき、ＲＢＣ洗浄を終了した。
【０１０６】
次に透析した血液溶液を、＃２８リングダムを取り付けたＳｈａｒｐｌｅｓ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、＃ＡＳ−１６型に約４ｌｐｍの速度で継続的にポンプで送り込んだ。同時に透析血液溶液を供給しながら遠心分離操作を実施し、白血球および血小板からＲＢＣを分離した。操作中、ＲＢＣを重いＲＢＣ相に分離し、同時に白血球（ＷＢＣ）と血小板の大部分を軽いＷＢＣ相に分離するのに十分な速度、特に約１５，０００ｒｐｍで遠心分離機を回転させた。操作の間、ＲＢＣ相とＷＢＣ相の分画を別々に且つ継続的に遠心分離機から排出した。
【０１０７】
ＲＢＣの分離後、ＲＢＣを溶解してヘモグロビン含有溶液を形成した。ＲＢＣを遠心分離機から排出しながら、ＲＢＣの実質的な部分を機械的に溶解した。ＲＢＣの細胞膜を、遠心分離機からのＲＢＣ相の流出に対し角度を為してＲＢＣ相排出ラインの壁に衝突させて破壊し、それによりＲＢＣからのヘモグロビン（Ｈｂ）をＲＢＣ相に放出した。
【０１０８】
次に溶解したＲＢＣ相をＲＢＣ相排出ラインを通してスタティックミキサー（６エレメントのＫｅｎｉｃｓ １／２インチ、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．）に流入した。ＲＢＣ相のスタティックミキサーへの移動と同時に、等量のＷＦＩもスタティックミキサーに注入して、ＷＦＩをＲＢＣ相と混合した。ＲＢＣ相とＷＦＩのスタティックミキサーへの流速は、それぞれ約０．２５ｌｐｍである。
【０１０９】
スタティックミキサーにおいてＲＢＣ相とＷＦＩを混合すると、溶解ＲＢＣコロイドが生じた。溶解ＲＢＣコロイドをスタティックミキサーから、Ｈｂを非ヘモグロビンＲＢＣ成分から分離するのに適したＳｈａｒｐｌｅｓ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（＃ＡＳ−１６型、Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）に移した。溶解ＲＢＣコロイドを軽いＨｂ相と重相に分離するのに十分な速度で遠心分離機を回転させた。軽相はＨｂを含み、またＨｂの密度にほぼ等しいかまたはそれより小さい密度を有する非ヘモグロビン成分も含んだ。
【０１１０】
０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ，Ｃａｔ ＃ＨＶＬＰ ０００ Ｃ５マイクロフィルターを通して、Ｈｂ相を遠心分離機からＨｂ精製に備えて保持タンクに連続的に排出した。次いで、細胞支質を濃縮水でマイクロフィルターから保持タンクに戻した。マイクロフィルトレーションの間、保持タンク内の温度を１０℃またはそれ以下に保持した。効率を高めるため、マイクロフィルター入口の流体圧が約１０ｐｓｉの初期圧から約２５ｐｓｉに上昇したとき、マイクロフィルトレーションを終了した。その後Ｈｂマイクロフィルトレートをマイクロフィルターからマイクロフィルトレートタンクに移した。
【０１１１】
その後、Ｈｂマイクロフィルトレートをポンプで１００，０００Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｈ１限外濾過器に通した。Ｈｂマイクロフィルトレートに含まれるＨｂと水の実質的な部分が１００，０００ダルトンの限外濾過器を透過してＨｂ限外濾液を形成し、一方分子量約１００，０００ダルトン以上のタンパク質のような大きな細胞デブリは保持され、マイクロフィルトレートタンク内に再循環された。同時に、限外濾液中に失われた水を補うためにＷＦＩを継続的にマイクロフィルトレートタンクに加えた。一般に細胞デブリは、Ｈｂ、より小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素および有機代謝中間体を除く、すべての完全なおよび断片化した細胞成分を含む。マイクロフィルトレートタンク中のＨｂ濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで限外濾過を継続した。Ｈｂを限外濾過する間、マイクロフィルトレートタンクの内部温度を約１０℃に保持した。
【０１１２】
Ｈｂ限外濾液を限外濾液タンクに移し、次いで３０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｔ１限外濾過器を通してＨｂ限外濾液を再循環させて、電解質、補酵素、代謝中間体および分子量約３０，０００ダルトン未満のタンパク質と、Ｈｂ限外濾液からの水を除去し、それによって約１００ｇ Ｈｂ／ｌを含む濃縮Ｈｂ溶液を生成した。
【０１１３】
次に濃縮Ｈｂ溶液を限外濾液タンクから、平行するクロマトグラフィーカラム（長さ２フィート、内径８インチ）に含まれる担体に移して、高性能液体クロマトグラフィーによってＨｂを分離した。クロマトグラフィーカラムは、非ヘモグロビンタンパク質からＨｂを分離するのに適した陰イオン交換担体を含んだ。陰イオン交換担体はシリカゲルから形成された。シリカゲルをγ−グリシドキシプロピルシランに接触させて活性エポキシド基を形成し、さらにＣ₃ Ｈ₇ （ＣＨ₃ ）₂ ＮＣｌに接触させて第四アンモニウム陰イオン交換担体を形成した。シリカゲルを処理するこの方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１２０：３２１−３３３（１９７６）に述べられている。
【０１１４】
Ｈｂ結合を促進する第一緩衝液（トリス−酢酸）でクロマトグラフィーカラムを洗い流して、各々のカラムを前処理した。緩衝液のｐＨは約９．０±０．１であった。次に濃縮Ｈｂ溶液４．５２リットルを各クロマトグラフィーカラムに注入した。濃縮Ｈｂ溶液の注入後、クロマトグラフィーカラムに緩衝液を通過させてクロマトグラフィーカラムを洗浄し、カラムからの溶出物の段階的ｐＨグラジェントを作製した。使用時の各緩衝液の温度は約１２．４℃であった。クロマトグラフィーカラムに注入する前に、緩衝液を１０，０００ダルトン限外濾過膜に通して前濾過した。
【０１１５】
特に、第一緩衝液である２０ｍＭトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン酢酸（トリス−酢酸）（ｐＨ約８．４から約９．４）は、精製水（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）中の濃縮Ｈｂ溶液をクロマトグラフィーカラムの担体中に運搬し、Ｈｂを結合させた。約８．３のｐＨを有する第二緩衝液でクロマトグラフィーカラム内のｐＨを調整し、Ｈｂを保持しながら、夾雑する非ヘモグロビン成分をクロマトグラフィーカラムから溶出した。カラム当り約３．５６ｌｐｍ、または約６．１カラム容積（１１．７ボイドボリューム）の流速で約３０分間、第二緩衝液との平衡を継続した。第二緩衝液からの溶出物は廃棄した。第三緩衝液の５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ約６．５から約７．５）は、クロマトグラフィーカラムからＨｂを精製ヘモグロビン産物として溶出した。
【０１１６】
次に滅菌０．２２μ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｃａｔ ＃５２３２５０７ Ｇ１ＰＨフィルターを通してＨｂ溶出物をタンクに導入し、そこでＨｂ溶出物を採集した。Ｈｂ溶出物の最初の３〜４％とＨｂ溶出物の最後の３〜４％は廃棄した。
【０１１７】
溶出物が０．０５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを含み、３．３ｎｍｏｌ／ｍｌ未満のリン脂質を含む場合には、Ｈｂ溶出物をさらに使用した。１００ｇ Ｈｂ／ｌの濃度を有するウルトラピュア溶出物６０リットルに、１．０Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．９）緩衝液９ｌを加えて１６０ｍＭのイオン強度を有するＨｂ溶液を形成し、Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を低下させた。その後限外濾過器、特に１０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１フィルターを通して再循環させることにより、Ｈｂ濃度が１１０ｇ／ｌになるまでＨｂ溶液を１０℃で濃縮した。
【０１１８】
次に、０．０５μｍ Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｔ ＃Ｇ−２４０／４０）のポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜を通して１２ｌｐｍでＨｂ溶液を再循環させることにより、ＨｂＯ₂ 含有量が約１０％になるレベルまでＨｂ溶液のｐＯ₂ を低下させてＨｂ溶液を脱酸素化し、脱酸素化Ｈｂ溶液（以下「ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ」）を生成した。同時に相転移膜の反対側を通して６０ｌｐｍ流量の窒素ガスを適用した。脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃に保持した。
【０１１９】
同時に脱酸素化の間およびその後の工程全体を通して、Ｈｂを低酸素環境に保持してＨｂによる酸素吸収を最小限に抑え、ｄｅｏｘｙ−Ｈｂ中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビンまたはＨｂＯ₂ ）含有量を約１０％未満に保った。
【０１２０】
次に、０．２重量％のＮ−アセチルシステイン、５０ｔｏｒｒ未満のｐＯ₂ を有する３３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含む保存緩衝液１８０ｌにより、限外濾過器を通してｄｅｏｘｙ−Ｈｂ ６０ｌを透析濾過し、酸化に対して安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを生成した。ｄｅｏｘｙ−Ｈｂと混合する前に、保存緩衝液を１０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１脱発熱原性フィルターで脱発熱原性化した。
【０１２１】
限外濾過器を通しての液体損失にほぼ等しい割合で保存緩衝液を継続的に加えた。限外濾過器での透析濾過を通して失われた液体の容量がｄｅｏｘｙ−Ｈｂの初期容量の約３倍になるまで透析濾過を継続した。この時点で物質を保存してもよい。
【０１２２】
酸化安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合装置に移す前に、酸素除去ＷＦＩを重合反応器に加えて、酸化安定化ｄｅｏｘｙ−Ｈｂの酸化を防ぐために重合装置から酸素を一掃した。重合装置に加えたＷＦＩの量は、酸化安定化ｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に加えたとき、約４０ｇ Ｈｂ／ｌの濃度を有するＨｂ溶液を生じる量であった。その後重合装置全体を通してＷＦＩを再循環させ、０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｔ ＃５ＰＣＭ−１０８，８０平方フィート）を通して加圧窒素の向流に対して流すことによりＷＦＩを脱酸素化した。相転移膜を通るＷＦＩと窒素ガスの流速は、それぞれ約１８〜２０ｌｐｍと４０〜６０ｌｐｍであった。
【０１２３】
重合装置中のＷＦＩのｐＯ₂ を約２ｔｏｒｒ ｐＯ₂ 未満に低下させたあと、約２０ｌｐｍの窒素を重合装置の上方空隙に流入して重合反応器を窒素でおおった。その後酸化安定化したｄｅｏｘｙ−Ｈｂを重合反応器に移した。
【０１２４】
Ｈｂ溶液をＷＦＩと混合して作製した、約３５ｍｍｏｌまたはそれ以下の塩化物濃度を有するｐＨ７．８の１２ｍＭリン酸緩衝液において重合を実施した。
【０１２５】
その後、Ｈｂ溶液を４２℃に加熱し、６エレメントのＫｅｎｉｃｓ １−１／２インチスタティックミキサー（Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．）を通して再循環させながら、酸化安定化ｄｅｏｘｙ−ＨｂとＮ−アセチルシステインを架橋剤であるグルタルアルデヒドと５時間にわたってゆっくり混合し、明細にはＨｂ１キログラムにつきグルタルアルデヒド２９．４グラムと混合して、重合Ｈｂ（ポリ（Ｈｂ））溶液を生成した。
【０１２６】
酸化安定化ｄｅｏｘｙ−Ｈｂとグルタルアルデヒドをスタティックミキサーを通して再循環させることにより、酸化安定化ｄｅｏｘｙ−Ｈｂとグルタルアルデヒドの概して均一な混合を伴う乱流条件を生じさせ、それによって高濃度のグルタルアルデヒドを含むｄｅｏｘｙ−Ｈｂのポケットを形成する潜在的可能性を低下させた。グルタルアルデヒドとｄｅｏｘｙ−Ｈｂの概して均一な混合は、高分子量のポリ（Ｈｂ）（５００，０００ダルトン以上の分子量を有する）の形成を低減し、同時に重合の際にグルタルアルデヒドとｄｅｏｘｙ−Ｈｂのより速やかな混合を可能にした。
【０１２７】
さらに、Ｈｂの重合の際にＮ−アセチルシステインが存在することの結果として、Ｈｂ重合の間に有意のＨｂ分子内架橋が生じた。
【０１２８】
重合後、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を約１５℃から約２５℃の温度に低下した。
【０１２９】
次に、ポリ（Ｈｂ）の濃度が約８５ｇ／ｌに上昇するまで限外濾過器を通してポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させることにより、ポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮した。適切な限外濾過器は、３０，０００ダルトンフィルター（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ ＃ＣＤＵＦ０５０ＬＴ）である。
【０１３０】
その後、ポリ（Ｈｂ）溶液を水素化ホウ素ナトリウム６６．７５ｇと混合して再びスタティックミキサーで再循環させた。明細には、ポリ（Ｈｂ）溶液９リットルごとに、０．２５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１リットルを０．１から０．１２ｌｐｍの速度で加えた。
【０１３１】
ポリ（Ｈｂ）溶液に水素化ホウ素ナトリウムを加える前に、水素化ホウ素ナトリウムを保存し、水素ガスの発生を防ぐために、ｐＨを約ｐＨ１０に調整することによってポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨを塩基性にした。ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨは、約１０．４から約１０．６のｐＨを有する、脱発熱原性化し、脱酸素化した１２ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液約２１５ｌでポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過することによって調整した。ポリ（Ｈｂ）溶液を３０ｋＤ限外濾過器を通して重合反応器から再循環させることにより、ポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過した。透析濾過による限外濾過器を通しての液体損失の割合にほぼ等しい割合で、ホウ酸ナトリウム緩衝液をポリ（Ｈｂ）溶液に加えた。透析濾過により限外濾過器を通して失われた液体の容量が重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の初期容量の約３倍になるまで透析濾過を継続した。
【０１３２】
ｐＨ調整後、水素化ホウ素ナトリウム溶液を重合反応器に加え、ポリ（Ｈｂ）溶液中のイミン結合をケチミン結合に還元して、（Ｈｂ）溶液中に安定なポリを生成した。水素化ホウ素ナトリウムを添加する間、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液をスタティックミキサーと０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルター相転移膜を通して継続的に再循環させ、溶解した酸素および水素を除去した。スタティックミキサーを通して流すことはまた、水素化ホウ素ナトリウムとポリ（Ｈｂ）溶液を速やかに且つ有効に混合する水素化ホウ素ナトリウム乱流条件を提供した。０．０５μｍ相転移膜を通るポリ（Ｈｂ）溶液と窒素ガスの流速は、それぞれ約２．０〜４．０ｌｐｍと約１２〜１８ｌｐｍであった。ホウ酸ナトリウムの添加が完了したあと、重合反応器において、その中に含まれる撹拌器を約７５回転／分で回転させながら、還元を継続した。
【０１３３】
水素化ホウ素ナトリウムの添加から約１時間後に、安定なポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が１１０ｇ／ｌになるまで、３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して重合反応器から安定ポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させた。濃縮後、ＷＦＩ中２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ ＮＡＣ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌおよび１．３６ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む、濾過して脱酸素化した低ｐＨ緩衝液（ｐＨ５．０）で、３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して安定ポリ（Ｈｂ）溶液を透析濾過することにより、安定ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨと電解質を生理的レベルに回復させて、安定な重合Ｈｂ代用血液を生成した。限外濾過器での透析濾過を通して失われた液体の容量が、濃縮Ｈｂ産物の透析濾過前の容量の約６倍になるまで透析濾過を継続した。
【０１３４】
ｐＨと電解質を生理的レベルに回復させたあと、濾過して脱酸素化した低ｐＨ緩衝液を重合反応器に加えて、安定な重合Ｈｂ代用血液を５．０ｇ／ｄｌの濃度に希釈した。希釈した代用血液を、ＷＦＩ中２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ ＮＡＣ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌおよび１．３６ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む、濾過して脱酸素化した緩衝液（ｐＨ７．８）に対してスタティックミキサーと１００，０００ダルトンの精製フィルターを通して重合反応器から再循環させることによって透析濾過した。代用血液が、解離条件下で実施したＧＰＣにより約１０％またはそれ以下の改変四量体および非改変四量体種を含むまで、透析濾過を継続した。
【０１３５】
精製フィルターは、制限透過ラインを有する低い膜内外圧の条件下で操作した。実質的な量の改変四量体Ｈｂと非改変四量体Ｈｂを除去したあと、代用血液の濃度が約１３０ｇ／ｌになるまで３０，０００ダルトンの限外濾過器を通して代用血液の再循環を継続した。
【０１３６】
その後、低い酸素環境で且つ酸素侵入の少ない適切な容器中で安定な代用血液を保存した。
【０１３７】
実施例２
重合ヘモグロビンの分析
ヘモグロビン産物中のエンドトキシン濃度を、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｊ．Ｌｅｖｉｎら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７５：９０３−９１１（１９７０）によって開発された「動態／濁度測定ＬＡＬ５０００法」という方法によって測定する。極微量の支質を調べるために様々な方法、例えば沈殿アッセイ、免疫ブロッティング、および当業者に既知の特異的細胞膜タンパク質あるいは糖脂質に関する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。
【０１３８】
「注入液中の微粒子物：単回用量輸注のための大容量注入液」、米国薬局方、２２：１５９６、１９９０の方法によって微粒子数を測定した。
【０１３９】
グルタルアルデヒド濃度を調べるため、ヘモグロビン産物の一般的サンプル４００μｌをジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化し、その後誘導体溶液の１００μｌアリコートを、グラジエントに沿って１ｍｌ／分の速度で、２７℃でＹＭＣ ＡＱ−３０３ ＯＤＳカラムに注入した。グラジエントは２つの移動相、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡから成った。グラジエントの流れは、一定な６０％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡを６分間、８５％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡまでのリニアグラジェントを１２分間以上、１００％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡまでのリニアグラジェントを４分間以上から成り、１００％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡで２分間保持し、４５％の水中０．１％ＴＦＡで再平衡させた。３６０ｎｍで紫外線検出を測定した。
【０１４０】
ＮＡＣ濃度を調べるため、ヘモグロビン産物のアリコートを脱気したリン酸ナトリウム水溶液で１：１００に希釈し、５０μｌを、グラジエントを含むＹＭＣ ＡＱ−３０３ＯＤＳカラムに注入した。グラジエント緩衝液は、リン酸ナトリウム水溶液および水中８０％アセトニトリルと０．０５％ＴＦＡの混合物から成った。グラジエントの流れは、１００％の水中リン酸ナトリウムを１５分間、次に１００％の８０％アセトニトリルと０．０５％ＴＦＡ混合物までのリニアグラジエントを５分間以上から成り、５分間保持した。その後系を１００％リン酸ナトリウムで２０分間再平衡させた。
【０１４１】
次の２つの論文に述べられている手順に基づく方法によってリン脂質分析を実施した：Ｋｏｌａｒｏｖｉｃら、「生物学的供給源からリン脂質を分離するための抽出法の比較」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６：２４４−２５０，１９８６およびＤｕｃｋ−Ｃｈｏｎｇ，Ｃ．Ｇ．、「硝酸マグネシウムによる消化を含む、リン脂質のリンを測定するための速やかで感受性の高い方法」Ｌｉｐｉｄｓ，１４：４９２−４９７，１９７９。
【０１４２】
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｒｙｏｍａｔｉｃ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ，＃３Ｃ２型、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓでの分析により、浸透圧モル濃度を測定した。
【０１４３】
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓからのＣｏ−Ｏｘｉｍｅｔｅｒ ＃４８２型で、総ヘモグロビン、メトヘモグロビンおよびオキシヘモグロビン濃度を測定した。
【０１４４】
Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 、Ｃｌ^- 、Ｃａ^{+ +} 、ｐＯ₂ 濃度は、Ｎｏｖａｓｔａｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ ４，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって測定した。
【０１４５】
酸素結合定数Ｐ₅₀は、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＴＣＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈｈａｍｐｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって測定した。
【０１４６】
温度とｐＨは、当業者に既知の標準的方法によって測定した。
【０１４７】
解離条件下でヘモグロビン産物に関するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を実施することにより分子量（Ｍ．Ｗ．）を決定した。ヘモグロビン産物の一般的サンプルを分子量分布に関して分析した。５０ｍＭ ビス−トリス（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および０．１ｍＭ ＥＤＴＡの移動相内でヘモグロビン産物を４ｍｇ／ｍｌに希釈した。この緩衝液は、ポリ（Ｈｂ）からＨｂ四量体を、分子内あるいは分子間架橋を通して他のＨｂ ２量体に架橋結合していない２量体に解離するのに役立つ。希釈したサンプルをＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ３０００ＳＷカラムに注入した。流速は０．５ｍｌ／分で、２８０ｎｍで紫外線検出を記録した。
【０１４８】
本発明の方法に従って作製した動物用（ＯＸＹＧＬＯＢＩＮ^TM）および人体用（ＨＥＭＯＰＵＲＥ^TM２）Ｈｂ代用血液に関する上記の試験の結果をそれぞれ表IIとIIIに要約する。
【０１４９】
【表２】

【０１５０】
【表３】

【０１５１】
実施例３
イヌにおけるインビボでの膨張作用の測定
この試験の目的は、脾摘出したビーグル犬において動物用（ＯＸＹＧＬＯＢＩＮ^TM）Ｈｂ代用血液のインビボでの膨張作用、特に投与したヘモグロビン１グラムについて血管内空隙に流入する水の容量を、トップローディング投与後の血漿容量の膨張を測定して調べることであった。さらに、Ｐｈａｒｍａｃｉａによって製造されている、１０％デキストラン４０と０．９％生理食塩水の（ＲＨＥＯＭＡＣＲＯＤＥＸ^TM−生理食塩水）の同等用量も測定した。
【０１５２】
２匹のイヌを、常套的な健康スクリーニングと少なくとも４週間の順化期間後に本試験に登録した。処置の少なくとも３日前にイヌを脾摘出した。アトロピンとメペリジンＨＣｌの組合せでイヌを前麻酔し、イソフルオラン（ｉｎｆｌｕｏｒａｎｅ）の吸入によって麻酔した。手術処置の間、乳酸加リンガー液を１０〜２０ｍｌ／ｋｇ／時で注入した。
【０１５３】
使い捨て頭部カテーテルを通してＨｂ代用血液（４０ｍｌ／ｋｇ）を２０ｍｌ／ｋｇ／時でイヌに投与した。投与前および投与から１／４、１／２、１、２、３、４時間後またはそれ以上にわたってヘマトクリットの最低点が確立されるまで、ヘマトクリットを測定した。
【０１５４】
投与後の血漿容量の変化が正確に測定できるように、一定な血漿容量とＲＢＣ質量を確保するためイヌを脾摘出した。
【０１５５】
血漿容量の変化の計算は、次の式を用いて行った：
【０１５６】
【数１】

【０１５７】
式中、ＰＶは血漿容量であり、Ｈｃｔ₁ は最初のヘマトクリット、Ｈｃｔ₂ は最後のヘマトクリットである。この計算は、循環血液量中のＲＢＣの数と平均血球量が一定なままであると仮定して、ヘマトクリットの変化に基づいた。
【０１５８】
表IVに示すように、ヘマトクリットの最低点は両方のイヌにおいて投与後２時間目に生じた。平均血球量（ＭＣＶ）は試験全体を通じて安定なままであった。
【０１５９】
【表４】

【０１６０】
投与後血管内に流入する液体の容量は、イヌ３５０３Ｃおよび１４雄性に関してそれぞれ６ｍｌ／ｇヘモグロビンと９ｍｌ／ｇヘモグロビンであった。合成コロイド溶液（Ｒｈｅｏｍａｃｒｏｄｅｘ（登録商標）−生理食塩水）の用量は、同様の膨張作用を生じさせる用量に基づいて計算した。Ｒｈｅｏｍａｃｒｏｄｅｘは、静脈内投与した１グラムにつき空隙から約２２ｍｌの液体を流入させる。
【０１６１】
計算したＲｈｅｏｍａｃｒｏｄｅｘの同等用量は、３０ｍｌ／ｋｇおよび１５ｍｌ／ｋｇのＨｂ代用血液についてそれぞれ１４ｍｌ／ｋｇおよび７ｍｌ／ｋｇであった。
【０１６２】
（Ｏｘｙｇｌｏｂｉｎ^TM）Ｈｂ代用血液によって血管内に流入する液体の量は、８ｍｌ Ｈ２Ｏ／ｇヘモグロビンであった。投与量の容量は３０ｍｌ／ｋｇで、投与量中のヘモグロビン濃度は１３ｇ／ｄｌであったので、１回投与量当りのヘモグロビンの総量は３．９ｇ／ｋｇであり、Ｈｂ代用血液による１回の投与について血管内空隙に流入した液体の総容量は３１．２ｍｌであった。
【０１６３】
合成コロイド溶液はデキストラン１ｇ当たり約２２ｍｌの水の割合で流入する。同等用量のＨｂ代用血液当たりのコロイド溶液中のデキストランの総量は１．４ｇである。従って、同等用量のコロイド溶液当たりの血管内空隙に流入する液体の総容量は１４ｍｌである。
【０１６４】
実施例４
イヌの用量応答試験
本試験は、急性正常血液量性血液希釈した後６０分および２４時間における脾摘出ビーグル犬におけるイヌ赤血球ヘモグロビンに対する動脈酸素含有量および酸素供給に関して、１０％デキストラン４０と０．９％食塩水との（ＲＨＥＯＭＡＣＲＯＤＥＸ^TM−生理食塩水，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）合成コロイド溶液と比較して、本発明の獣医学用（ＯＸＹＧＬＯＢＩＮ^TM）Ｈｂ代用血液の薬剤効果と用量応答とを調べるために実施した。
【０１６５】
急性正常血液量性血液希釈は、手術による血液損失による貧血の臨床状態を模倣する実験モデルである。この方法によって、重度の貧血（Ｈｃｔ＝９％、Ｈｂ＝３ｇ／ｄｌ）を引き起こし、酸素運搬サポートの絶対的必要性を生じさせた。大量の出血に伴って酸素供給送達と酸素含有量とは急激に低下した。
【０１６６】
正常血液量性血液希釈モデルを開発する際に、対照のイヌに関して実施したような容積膨張だけによって酸素供給送達を回復させるための処置、あるいはヘモグロビン溶液で処置したイヌの場合のように動脈酸素含有量の増加に関連した容積膨張によって酸素供給送達を回復させるための処置は、死に至る血圧および心拍出量の不可逆的な低下を避けるためにヘマトクリットが９％に達する約１０分以内に実施しなければならないことが見出された。
【０１６７】
標的ヘマトクリットに達して５分以内にデキストラン４０溶液で血管容積を膨張させたにもかかわらず、この試験において１２匹の対照イヌのうち２匹が、投与中または投与後に死亡した。これらのイヌの死亡は、実験モデルの重症度の反映であり、また重篤な急性血液損失の臨床状態を表わすものである。
【０１６８】
３０匹のイヌを常套的な健康スクリーニングと少なくとも４週間の順化期間後、本試験に登録した。処置は、各々のレプリケートが１匹のイヌ／性別／群を含む３匹のイヌのレプリケート（Ａ、ＢおよびＣ）を使用して交互に実施した。処置の第１日目の３２日前に、イヌを５群に無作為に割り付けた（雄性３匹と雌性３匹の１群あたり６匹のイヌ）。群間の等しい分布を保証する方法を用いて、体重に基づくブロックランダム化によってイヌをそれぞれの群に割り当てた。雄性と雌性は別々に無作為化した。臨床徴候の異常あるいは臨床病理学的データの異常のような許容されない治療前データを示したイヌは、同じ環境条件下に保持した予備のイヌに取り替えた。
【０１６９】
被験／対照物質は、単回静脈内注入によって投与した。注入ポンプによって注入の速度を調節した。１時間あたりに注入された実際の容量は、各々のイヌの最も新しい体重に依存した。
【０１７０】
ヘモグロビン溶液の最高用量は、正常血液量のイヌでの容積膨張による急性心臓血管作用の安全上限に基づいた。中用量は、用量応答曲線の形を定義するために選択した。最低用量は、イヌにおいて容積および血行力学的効果によって定義されるような臨床上適切な用量の下限に基づいた。
【０１７１】
実験モデルに対する脾収縮による循環ＲＢＣ増加の影響を避けるため、処置の少なくとも７日前に各々のイヌを脾摘出した。ヘモグロビン溶液による処置の当日、イソフルランの吸入によって各々のイヌを麻酔し、２０−２５ｍｌ／ｋｇの一回換気量で室内の空気を使用して機械的に換気した。手技の間、動脈ｐＣＯ₂ を約４０ｍｍＨｇに保持するように換気の割合を調節した。イソフルランの呼気終期濃度を測定し、各イヌごとに麻酔相の有効な比較を提供するように調節した。血行力学的機能と酸素輸送パラメータをモニターするためにイヌに器具を装着した。圧の分析と圧の追跡によって肺動脈内へのフローディレクティド（ｆｌｏｗ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）カテーテルの設置を確認した。熱希釈心拍出量能力を備えた二管腔カテーテルを大腿動脈に設置し、血圧モニタリングと採血のための動脈系を提供した。容積置換と被験／対照物質の投与のため、橈側皮静脈あるいは必要に応じて他の静脈にカテーテルを設置した。
【０１７２】
手術の前日、手術当日および脾摘出後３日間、各々のイヌに予防的に１日１回抗生物質（プロカインペニシリンＧ）の筋肉内注射を実施した。必要に応じて、局所抗生物質、Ｖ−Ｓｐｏｒｉｎ（ポリミキシンＢ、バシトラシン、ネオマイシン）を１日１回手術部位に適用した。
【０１７３】
器具装着後、ｐＣＯ₂ が約４０ｍｍＨｇに達するよう血行力学的安定化を実施し、ベースライン測定を行なった。その後、イヌを出血させ、同時に等血液量状態を維持するために回収した容積の約１．６から２．３倍を乳酸加（ｌａｃｔａｔｅｄ）リンガー液で置換して、急性正常血液量性血液希釈のモデルを作製した。肺動脈楔入圧をほぼベースライン値に保持することによって等血液量状態を実現した。血液の回収／容積置換は、ヘモグロビン濃度が約３０ｇ／ｌ（３．０ｇ／ｄｌ）になるまで約４５から９０分を要した。重力静脈内注入セットと注入バッグの周囲の圧カフを使用して乳酸加リンガー液を速やかに注入した。急性貧血の誘発後および投与開始前に５分間以上にわたって動脈収縮期血圧が≦５０ｍｍＨｇであった場合にはそのイヌを除外し、同じ環境条件下に保持した予備のイヌに取り替えた。
【０１７４】
コロイド対照とヘモグロビン溶液との用量を表Ｖに示すように投与した。出血前、投与前、投与直後、および投与後６０分と２４時間目に血行力学的測定を行った。６０分の測定後、イヌを麻酔から回復させ、投与後２４時間目に実施する血行力学的測定のために再び器具を装着した。
【０１７５】
【表５】

【０１７６】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）あるいは出血前または投与前の数値を共変量とする共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）のいずれかによって、すべての血行力学的パラメータを統計的に解析した。投与した溶液の容積効果、Ｈｂ代用血液の作用（薬剤効果）、およびＨｂ代用血液の用量応答（用量効果）を調べるために比リニア対比を構築した。これらの試験は、実験群間の差が０．０５レベルで統計学的に有意であるパラメータに関してのみ実施した。選択した時点での特定変数の比較を、各群における対応あるｔ検定によって実施した。
【０１７７】
動脈酸素含有量は、本試験における効果の１つの判定基準であった。動脈酸素含有量は、細胞および血漿ヘモグロビンの酸素運搬能力と血漿中の溶解酸素の測定値である。血漿ヘモグロビンが存在しない場合は、飽和細胞ヘモグロビンによって運搬される酸素の量と吸気酸素の分圧とから動脈酸素含有量を計算する。血漿ヘモグロビンは、本試験における酸素含有量に有意に寄与すると予想されたので、ＬｅｘＯ２Ｃｏｎ−Ｋ装置（Ｃｈｅｓｔｎｕｔ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）を使用して直接酸素含有量を測定した。実験の間酸素強化空気は投与しなかった。これは、その必要がなく、吸気酸素濃度の上昇が動脈酸素含有量の測定に及ぼしうる紛らわしい影響を避けるためであった。
【０１７８】
貧血の誘発後、平均動脈および静脈酸素含有量はすべての群においてそれぞれ約４倍と８倍に低下した。すべてのＨｂ代用血液処置群において、投与前の数値に比して投与後６０分で動脈酸素含有量が有意に上昇し、中用量と高用量群では投与後２４時間においても有意に上昇したままであった。いずれの対照群でも、投与後に動脈酸素含有量あるいは静脈酸素含有量は変化しなかった。
【０１７９】
図２に示すように、投与後６０分と２４時間において、対照群と比較してＨｂ代用血液処置群では動脈酸素含有量が有意に上昇した。投与後６０分と２４時間では線形用量応答が認められた。投与後６０分に、動脈酸素含有量に関して有意の容積効果が検出された。
【０１８０】
投与後６０分と２４時間において、対照群と比較してＨｂ代用血液処置群では静脈酸素含有量も有意に上昇した。上昇は投与後６０分には線形用量応答を示したが、２４時間目には線形用量応答を示さなかった。
【０１８１】
投与後６０分にＨｂ代用血液で処置した群に関して認められた動脈−静脈（Ａ−Ｖ）酸素含有量の差における用量効果は、薬剤効果が存在しないことに基づく有意の容積効果と、投与後６０分の対照群における容積効果の同様の所見に帰せられた。Ｈｂ代用血液処置群は、コロイド対照に比して２４時間後にも有意の線形用量応答を伴ってＡ−Ｖ酸素差の有意の上昇を示した。Ａ−Ｖ差は心拍出量の観点から解釈しなければならない。投与後２４時間目に、対照群におけるＡ−Ｖ差はＨｂ代用血液処置群よりも有意に低かった。この相違についての１つの可能な説明は、対照群のイヌが末梢組織の酸素消費要求を満たすためにより高い心拍出量に依存しなければならなかったということである。Ｈｂ代用血液処置群は、心拍出量の上昇を必要とせずに、投与後２４時間目に末梢組織の要求を満たすのに十分なＡ−Ｖ差を維持していた。
【０１８２】
この試験では動脈酸素含有量に加えて、イヌのＲＢＣヘモグロビンの寄与率に関して規準化した総動脈酸素含有量（ＣａＯ₂ ／ｇ ＲＢＣ Ｈｂ）も検討した。ＲＢＣヘモグロビンはすべての群で一定であるので、投与群間での動脈酸素含有量の差を明らかにすることによってこの比較を行った。血漿または総ヘモグロビン濃度と動脈酸素含有量の潜在的な相関は、効果についての有用な臨床測定を提供する。図３に示すように、投与後６０分と２４時間目に、すべてのＨｂ代用血液処置群（２４時間での低用量群を除く）が投与前の数値に比べてＣａＯ₂ ／ｇＲＢＣヘモグロビンの有意の上昇を示した。コロイド対照では、ＲＢＣヘモグロビンの寄与率に対する動脈酸素含有量は、投与前と投与後６０分または２４時間との間で有意差がなかった。
【０１８３】
赤血球ヘモグロビンの寄与率に対する総動脈酸素含有量は、投与後６０分にコロイド対照と比較してＨｂ代用血液処置群では有意に上昇し、有意の線形用量応答を示した。投与後２４時間目にも有意の線形用量応答を伴って有意の用量効果が生じたが、薬剤効果はそれほど有意ではなかった（Ｐ＜０．０６）。
【０１８４】
酸素供給送達は効果のもうひとつの判定基準である。酸素供給送達は動脈酸素含有量と心拍出量に基づいて計算される。それ故酸素供給送達は、心拍出量に作用するすべての生理的因子によって影響される。この試験のために選択した対照は合成コロイド（ＲＨＥＯＭＡＣＲＯＤＥＸ^TM−生理食塩水，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であり、これは静脈内容積を膨張させ、酸素を運搬しないことが知られている。かかる対照は、Ｈｂ代用血液中のヘモグロビンのコロイド特性との等容積膨張の比較を提供した。
【０１８５】
Ｈｂ代用血液の各々の用量は、異なる容積効果を示すと予想されたので、２つの用量のデキストラン溶液を容積効果についての対照として使用し、従ってデータは異なる用量の薬剤効果だけを反映することになる。この比較は低用量と中用量に関して行った。コロイド対照の用量は、実施例２の結果から決定した、低および中用量被験物質のｉｎ ｖｉｖｏでの膨張作用の等しい比較を提供するデキストラン４０の用量に基づいて選択した。
【０１８６】
容積効果は、コロイド中用量（１４ｍｌ／ｋｇ）とコロイド低用量（７ｍｌ／ｋｇ）間の平均値の差を用いて統計的に定義した。薬剤効果は、各々のＨｂ代用血液処置群とその対応するコロイド対照を比較することによって決定した。低用量と高用量のＨｂ代用血液処置群間で統計的な有意差が認められたとき、線形用量応答を確認した。
【０１８７】
次の式に従って酸素供給送達を計算した：ＤＯ₂ ＝ＣＯ×ＣａＯ₂ ×１０／ｋｇ。式中、ＣＯは心拍出量、ＣａＯ₂ は動脈酸素含有量である。予想されたように、すべての処置群における貧血の誘発後、ＤＯ₂ の２倍から３倍の平均値低下が全群で起こった。酸素含有量は、心拍出量の増加と酸素抽出の増加によってベースライン酸素消費量を維持しなければならないほどに低下し、その結果、より低い静脈酸素含有量を生じた。図４に示すように、酸素供給送達は、投与前の数値に比して投与後６０分に低用量Ｈｂ代用血液処置群では約３０％上昇し、中および高Ｈｂ代用血液処置群では１００％以上上昇した。その差は３つの投与群すべてについて有意であった（ｐ＜０．０５）。対照群はこの時点で有意差を示さなかった。投与後６０分には、ＤＯ₂ はすべての群間で有意に異なり、有意の薬剤効果と線形用量応答を伴う用量効果を示した。２４時間目には、群間で酸素供給送達に差を認めなかった。すべてのＨｂ代用血液処置群に関する投与後６０分での酸素供給送達の改善は、それらの対応するコロイド対照と比較して、心拍出量の中等度の増加に加えて、主として動脈酸素含有量の用量関連性の上昇によるものであった。
【０１８８】
酸素消費量は次の式に従って計算した：ＶＯ₂ ＝ＣＯ×ＣａＯ₂ ×１０ｋｇ。貧血の誘発後すべての群において２から３倍のＤＯ₂ の平均低下が起こった。Ｈｂ代用血液処置群または対照群間で、あるいは投与前と投与後の数値を比較したとき群内で、統計的な有意差を認めなかった。
【０１８９】
すべての群について酸素抽出率（ＶＯ₂ ／ＤＯ₂ ）は貧血の誘発後約３倍の上昇を示した。投与後６０分に、対照群に比してすべてのＨｂ代用血液処置群において酸素抽出率が用量依存的に有意に低下した。投与後２４時間目にはＨｂ代用血液処置群と対照群間で有意差を認めなかった。
【０１９０】
貧血の誘発後すべての群で平均心拍出量が１０％から３９％上昇した。コロイド対照群では出血前の数値に比べて投与後２４時間目に心拍出量が有意に上昇したが、Ｈｂ代用血液処置群では心拍出量は有意に上昇しなかった。投与後６０分には、コロイド低用量群と中用量群との間での心拍出量の有意差に寄与する有意の容積効果が明白であった。心拍出量の上昇は、投与後の血管内容積の膨張による一回拍出量の増加あるいは重篤な貧血のストレスによる交感神経緊張の上昇に関連すると考えられた。Ｈｂ代用血液低用量群から高用量群までの有意の用量応答が投与後６０分には明白であったが、２４時間後には明らかではなかった。投与後６０分あるいは２４時間目に、Ｈｂ代用血液処置群とコロイド対照群との間で心拍出量に差を認めなかった。
【０１９１】
肺動脈楔入圧（ｗｅｄｇｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＰＡＷＰ）は貧血誘発の間有意に変化しなかった。ＰＡＷＰは、投与前の数値に比して投与後６０分に低用量コロイド群で有意に低下し、中用量コロイド群では不変のままであった。中用量と高用量Ｈｂ代用血液処置群におけるＰＡＷＰは、投与後６０分に投与前の数値に比べて、線形用量応答として有意に上昇した。ＰＡＷＰの上昇は投与後６０分の血管内容積の用量依存的上昇を反映した。投与後６０分あるいは２４時間目にＨｂ代用血液処置群と対照群との間で有意の薬物効果は検出されなかった。投与後６０分にコロイド対照群において有意の容積効果が検出された。
【０１９２】
収縮期、拡張期および平均動脈血圧は、貧血の誘発後全群において有意に低下し、投与直後に有意に上昇した。貧血誘発後の収縮期動脈血圧の低下は、おそらく貧血の結果として、血液粘性の低下による末梢血管抵抗の低下に関連すると考えられた。投与後６０分には、両方のコロイド対照群の収縮期、拡張期および平均動脈血圧は投与前の数値と有意差がなかった。低用量コロイド対照の収縮期、拡張期および平均血圧は、投与後２４時間目に投与前の数値と比較して有意に上昇した。これに対し、すべてのＨｂ代用血液処置群において、投与前の数値と比較して投与後６０分および２４時間目の収縮期、拡張期および平均血圧の上昇は統計的に有意であった。Ｈｂ代用血液処置群の収縮期、拡張期および平均血圧は、投与後６０分には対応するコロイド対照群よりも有意に高かったが、２４時間目には有意差がなかった。
【０１９３】
投与前の数値と比較して投与後６０分に中および高用量Ｈｂ代用血液処置群において収縮期、拡張期および平均肺動脈圧の有意の上昇を認めた。中用量Ｈｂ代用血液処置群では肺拡張期動脈圧に関して投与後２４時間目にも上昇が持続した。さらに低用量コロイド群は、平均肺動脈圧に関して投与前の数値に比べて投与後２４時間目に統計的に有意の上昇を示した。この上昇は臨床的に重要であると考えられた。投与前の数値と比較して、Ｈｂ代用血液の投与後６０分の全身動脈収縮期および拡張期血圧の上昇は、Ｈｂ代用血液の直接の薬剤効果であった。コロイド対照群では拡張期血圧は不変のままであり、これはおそらく末梢血管抵抗の低下の結果であった。
【０１９４】
投与後６０分あるいは２４時間目にも、肺収縮期動脈圧に関してはＨｂ代用血液処置群と対照群との間で有意差を認めなかった。これに対し、肺拡張期および平均動脈圧は投与後６０分に容積、薬剤および用量効果に関して有意に異なったが、投与後２４時間目には有意差がなかった。
【０１９５】
総ヘモグロビンは出血によって約４倍以上低下した。Ｈｂ代用血液処置群は、投与後６０分および２４時間目に対応するコロイド対照群に比して総ヘモグロビンの用量依存的上昇を示した。
【０１９６】
血漿ヘモグロビン濃度は、投与後６０分と２４時間目に対応するコロイド対照群に比してＨｂ代用血液処置群では用量依存的に有意に上昇した。対応するコロイド対照と比べて、すべてのＨｂ代用血液処置群での投与後の血漿および総ヘモグロビン濃度の上昇は、Ｈｂ代用血液のヘモグロビン含有量をもたらした。用量依存的な有意の上昇は、動脈酸素含有量の持続的な上昇に相関して２４時間持続した。
【０１９７】
要するに、Ｈｂ代用血液による処置への反応はリニアであった。すなわち対応するコロイド対照と比較して、投与後６０分でのＨｂ代用血液の用量が高いほど酸素供給送達および血行力学の改善が大きかった。室内の空気を呼吸しながら、動脈酸素含有量と正常な臨床徴候が持続したことは、３０ｍｌ／ｋｇおよび４５ｍｌ／ｋｇ用量のＨｂ代用血液処置群での２４時間持続するＨｂ代用血液の有益な生物学的作用を裏付ける。Ｈｂ代用血液のクリアランスが、投与後２４時間目に酸素供給送達と血行力学的作用に関して認められた変化を説明すると考えられる。結論として、この試験からの結果は、３０から４５ｍｌ／ｋｇの範囲の用量選択を裏付けている。これらの投与群のいずれもが、対応するコロイド対照群と統計的な有意差を示し、効果と用量応答パラメーターはリニアであった。
【０１９８】
この用量範囲の臨床的根拠は、重度の貧血イヌ（例えば著明な臨床徴候を伴ってヘマトクリット＜１５％）が、動脈酸素含有量および酸素供給送達の改善の線形用量応答によって明らかにされたように、より高用量から恩恵を受けるという事実に基づく。しかし、血管内容積過負荷の素因があると考えられるイヌについては、より保存的な用量が指示されるであろう。Ｈｂ代用血液処置群において投与後６０分に肺動脈楔入圧と肺動脈圧の用量依存的な一過性の上昇が見られたことから、この個体群のイヌではより高用量の使用が制限されるであろう。それ故、貧血の程度と血管内容積状態が明らかにされている広範囲のイヌの個体群において、３０〜４５ｍｌ／ｋｇの用量範囲が有効であろう。
【０１９９】
実施例５
ヒト用量応答試験
この試験は、ヒトにおける血行力学、神経内分泌および血液学的パラメーターに関して、Ｈｂ代用血液（以下ＨＢＯＬ）の漸増速度での静脈内投与の安全性と耐容性を評価するために実施した。被験者は、年齢１８〜４５歳の健常成人男性（７０〜９０ｋｇ）であった。試験中、被験者には、１日当り炭水化物５５％、脂肪３０％（ポリ不飽和脂肪対飽和脂肪比 ２：１）、タンパク質１５％およびナトリウム１５０ｍＥｑの管理された等カロリー食を実施した。水分摂取量は、カフェイン含有飲料を避けて少なくとも３０００ｍｌ／日とした。また薬剤の併用も禁止した。さらに試験期間中、被験者は、アルコールまたはタバコも摂取しなかった。
【０２００】
検討した１２名の被験者を３つの試験群に分けた。各試験群では、３名の被験者にＨＢＯＬを投与し、１名には対照として乳酸加リンガー液を投与した。各試験群は、ＨＢＯＬ注入の速度が異なった。試験は３０日間の間隔で一重盲検速度上昇試験として実施した。
【０２０１】
入院期間である試験の１日目に、各被験者の利き腕でない方の橈骨動脈に小さなゲージの動脈カテーテルを挿入した。挿入部位を防腐液（アルコールおよび／またはヨウ素）で清浄し、橈骨動脈の部位より上に少量の１％〜２％リドカイン麻酔液を皮下注射した。血圧を監視し、血液ガスの評価を容易にするために動脈カテーテルを挿入した。１から２時間後、すべての被験者に対し、片方の上腕の静脈内に１つの大口径静脈内カテーテル（肘前窩に１６ゲージの針）を設置した。各被験者に瀉血を実施して、１５分以内で７５０ｍｌ（１．５単位）の全血を採取し、その後２時間にわたって乳酸加リンガー液２２５０ｍｌを持続注入して等血液量血液希釈を行なった。
【０２０２】
その後、滅菌手法を使用して、標準的な８０マイクロメートル血液フィルター、５マイクロメートルフィルター、および上腕静脈内の大口径静脈内カテーテルを通して連続的に、試験群１、２および３においてそれぞれ０．５ｇ／分、０．７５ｇ／分および１．０ｇ／分の速度で４５ｇ（３４６ｍｌ）のＨＢＯＬを各被験者に静脈内注入した。
【０２０３】
同時に、ＨＢＯＬの注入開始後最初の２８時間にわたって、橈骨動脈カテーテルによる侵襲性モニター、連続的肺機能試験、心機能評価ならびに常套的で頻繁に実施される多数の血液学、化学および尿実験（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）検査を各被験者に実施した。
【０２０４】
その後外来期間には（２日目〜２９日目）、退院後最初の４日間は毎日、その後１ヵ月間は週に１回のベースで、実験（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）検査、生命徴候、ＥＣＧおよび医学的事象を調べた。
【０２０５】
血行動態は顕著で、１日目にＨＢＯＬ処置群において（注入後）対照群よりも収縮期、拡張期および平均動脈圧の数値が一般的に高かった。患者の活動（例えば食事中あるいは入浴時）および日周期に対応して血圧データには著しい変動があったが、１日目だけはＨＢＯＬ処置被験者は概して対照群よりも収縮期血圧（約５〜１５ｍｍＨｇ）、拡張期血圧（約５〜１０ｍｍＨｇ）および平均動脈圧（約１０ｍｍＨｇ）の数値が高かった。数値は８〜１２時間でピーク効果に達する傾向にあり、睡眠中および動脈カテーテルを除去したときにはベースライン値に戻った。脈拍は、１日目には対照群と比べてすべてのＨＢＯＬ処置群で一般に約１０拍動低かった。脈拍低下の最低点は注入の最初の１５分以内に認められた。２４時間後にはすべての試験群で同等の数値であった。
【０２０６】
心係数は、注入の最初の１時間に約１〜２ｌ／分／ｍ² 低下し、４時間目まで対照よりも１ｌ／分／ｍ² 低いままであり、その後４時間目までにベースライン値に回復した。心係数も患者の活動時間（上記のような）には上昇した。
【０２０７】
総末梢抵抗は血圧の変化と平行したが、数値は２時間以内にベースライン値に戻った。総末梢抵抗の上昇と心係数の低下に伴う全身性血圧の一過性の上昇は予想外のものではない。投与速度およびこれらの血行力学的反応の大きさに差がなかったこと、そして介入処置が全く指示されなかった点に注目することが重要である。
【０２０８】
肺機能試験（肺活量および肺用量の多回測定を含む）および動脈血液ガスの測定には特に留意すべき点がなかった。注目すべきであったのは、ＨＢＯＬ処置群で認められた拡散能の増強であった。２４時間までの拡散能の１０〜１５％の上昇は、対照群での１０％低下と比べて統計的に有意であった。これらの所見は、すべての群で実施した瀉血と血液希釈の度合を考えると特に重要である。
【０２０９】
血液学的試験では、予想された瀉血と血液希釈処置によるヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数および血清タンパク質の一過性の低下以外には、血液学的および血清化学的検体検査に注目すべき点はなかった。例外は血清鉄とフェリチンで、これらはＨＢＯＬの投与後それぞれ６時間目と４８時間目までにピーク値を示した。
【０２１０】
血清化学測定は、血清トランスアミナーゼとリパーゼの一過性の上昇を示した１名の被験者（＃１０）を除いて、留意すべきものではなかった。この被験者が、これらの酵素上昇の時点に対応する臨床的に重要な併発医学事象（例えば嚥下困難あるいは腹痛）を生じなかったことは重要である。これらの検査値異常の正確な原因は明らかではないが、これまでの試験は、オッディ括約筋あるいは肝胆管および膵管系の他の部分の一過性の無症状痙縮が関わっていると考えられることを示唆している。これらの変化が一過性であり（そして腹部不快を伴わない）、明らかな続発症がなかった点に注目することが重要である。被験者＃１０における投与後の胆嚢超音波では有意の変化を認めなかった。
【０２１１】
尿検査は試験期間を通じて著明な点がなかった。試験期間中被験者において尿ヘモグロビンは検出されなかった。さらに、血液希釈の間、予想されたようにクレアチニンクリアランスがわずかに高く、尿アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質、電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物）、鉄、ミクロアルブミン、ＮＡＧ（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ）および尿の尿素窒素は異常を認めなかった。
【０２１２】
投与速度の関数として大部分の薬物動態学的パラメータには明らかな変化を認めなかった。総ヘモグロビンおよびヘモグロビンの見かけ分子量分画のサイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、ＨＢＯＬ注入の開始前と開始後に連続的な血液生検と累積尿生検を採集した。わずかに散在性の血漿２量体分画濃度が認められ、薬物動態分析から除外した。４量体の分布容積（速度上昇に伴い低下）、達成された４量体の最大濃度（速度上昇に伴い上昇）および４量体最大濃度の発生時間（速度上昇に伴い低下）においてのみ統計的な有意差（ｐ＜０．０５）を認めた。
【０２１３】
認められた医学的事象は、瀉血（例えば血管迷走神経エピソード）、多回のマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）肺機能試験（空気嚥下、おくびまたは腹部「ガス」）、動脈ライン挿入（例えば部位の痛みまたは刺痛）、あるいは腹部不快（例えば鉄補助剤の摂取に結びつくもの）に関連する予想された所見と一致した。非特異的な一過性の腹部「ガス」の背景が存在すると思われたが、明白な腹痛あるいは嚥下困難の症例はなかった。さらに、これらの症状と血清トランスアミナーゼあるいはリパーゼの変化に相関はなかった。
【０２１４】
要約すると、ＨＢＯＬは良好に耐容された。注入の最初の２時間の心係数低下に対応する血圧および総末梢抵抗の小さな一過性の上昇が認められたが、血行力学は正常であった。最初の２４時間において、ＨＢＯＬ処置群では対照群よりも拡散能の上昇が有意に高かった。
【０２１５】
実施例６
段階的自転車運動試験におけるヒトへのＨＢＯＬの作用
この試験は、ＨＢＯＬの自家輸血を実施した被験者の運動能を評価するために実施した。特定エンドポイントには肺機能（例えば拡散能、乳酸レベルおよびｐＯ₂ ）、血行力学（例えば心拍数、心係数および血圧）ならびに運動耐性（例えば期間、作業負荷および無酸素閾値）が含まれた。被験者は１８〜４５歳の健常男性であった。１名の被験者は、１５分以内に瀉血容量が得られなかったため、試験中に交替した。試験は無作為化、一重盲検、二元（ｔｗｏ−ｗａｙ）交差試験として実施した。
【０２１６】
すべての被験者に７５０ｍｌの瀉血を実施し、それに続いて乳酸加リンガー液［３：１］および自家輸血（ＡＴＸ）またはＨＢＯＬを４５ｇ注入した。ＡＴＸあるいはＨＢＯＬは９０分間にわたって０．５ｇ／分で投与した。瀉血の前日およびＡＴＸまたはＨＢＯＬの注入後約４５分に自転車運動ストレス試験を実施した。１週間後に同じ手順を繰り返して、被験者を反対の処置に切り替えた。
【０２１７】
投与の当日（１日目と８日目）、すべての被験者に対し、一方の橈骨動脈に動脈ラインを挿入し、心電図遠隔測定およびインピーダンスカルジオグラフィーを装着して、その後７５０ｍｌの全血の瀉血（ＰＢＸ）（＜１５分間）を実施した。このあと２時間かけて乳酸加リンガー液（ＲＬ）２２５０ｍｌを注入した（等容血液希釈期）。次に被験者にＨＢＯＬ（９０分間０．５ｇ／分の速度で４５ｇ［約３４６−３６０ｍｌ］）あるいはＡＴＸ（ＨＢＯＬと同じ速度と期間でヘモグロビン１１０−１２０ｇ［約７５０ｍｌ］）を注入した。各々の注入終了後約４５分にＢＥＳＴを実施した。１日目と８日目に２４時間にわたって動脈血液ガス、血液学、化学および尿検査の連続的測定を集中的に行った。投与からすべての投与終了後１ヵ月目まで外来患者ベースで連続的な追跡調査を実施した。
【０２１８】
被験者は、ＨＢＯＬとＡＴＸの期間中同様のレベルで運動することができた。無酸素閾値での酸素摂取（ＶＯ₂ ）と炭酸ガス放出（ＶＣＯ₂ ）はほぼ同じであった。ＭＥＴＳでの実際の作業負荷、ワット、脈拍（最大脈拍の％として）、無酸素閾値までの時間、一回換気量（ＶＴ）および１分換気量（ＶＥ）も同様であった。ＨＢＯＬとＡＴＸの期間中、動脈血液ガス値は同様であった。乳酸の上昇を伴ったｐＨと重炭酸イオンの小さな低下は無酸素閾値での予想された所見と一致する。これらの自転車試験の結果は、運動能（無酸素閾値に達するまでの時間と作業負荷として定義される）がベースラインと自家輸血あるいはＨＢＯＬの注入後で同様であることを示した。具体的には、血行力学が、収縮期、拡張期および平均動脈圧に関してＨＢＯＬ期間中わずかに高い数値（約５ｍｍＨｇ）であったことが注目された。血圧の上昇は、一般に最初の４時間以内の総末梢抵抗の上昇に対応した。心係数はＨＢＯＬ期間中に低下した（約０．５ｌ／分／Ｍ² ）。脈拍は、ＨＢＯＬ期間中にはＡＴＸ期間よりも約５〜１０拍低かった。これらの所見がＨＢＯＬ試験において認められ、臨床的な関係はほとんどなかった。
【０２１９】
肺機能試験は、ＡＴＸとＨＢＯＬの注入後に拡散能がベースラインより１４％上昇したことを除いて、注目すべき点はなかった。被験者は、ＨＢＯＬとＡＴＸの期間中同様の運動能を達成することができた。ピーク運動（無酸素閾値）の際の動脈血液ガス測定は両方の期間で同様であったが、動脈ｐＯ₂ は、ＨＢＯＬ期間の方が高い傾向にあった。血漿乳酸レベルは、ＡＴＸ期間よりもＨＢＯＬ期間中の方が低かった。安静代謝項目（ａｒｔ）測定は、酸素消費、炭酸ガス産生および代謝エネルギー消費がＨＢＯＬ期間中ＡＴＸ期間よりも大きいことを示した。上述したような比較はざっとＨＢＯＬ、１ｇ対ＡＴＸ、３ｇである。ＶＯ₂ とＶＣＯ₂ についての観察と拡散能を合わせると、ＡＴＸよりもＨＢＯＬ、１グラムについてより多くの酸素が組織レベルに供給送達されていることが示唆されている。一般に拡散能は直接ヘモグロビンレベルによって変動すると考えられているが、血漿へモグロビン１グラムはＲＢＣヘモグロビン３グラムと同じだけ拡散能を上昇させうるとの示唆がある。
【０２２０】
実験検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ）では、ＨＢＯＬ期間中のＡＬＴ、ＡＳＴ、５' −ヌクレオチダーゼ、リパーゼおよびクレアチンキナーゼの小さいが一過性の上昇が注目された。尿所見の異常は認めなかった。
【０２２１】
血液学的試験は実施例５におけるものと一致した。
【０２２２】
認められた医学的事象は、瀉血（例えば血管迷走神経エピソード）、多回の肺機能試験（おくびまたは腹部「ガス」）、動脈ライン挿入（例えば、挿入部位の痛みまたは刺痛）、あるいは１ヵ月の経過中に正常な被験者で認められることがある数多くの日常的な愁訴（例えば頭痛、上気道感染あるいは感冒）に関連する、予想された所見と一致した。腹部「ガス」と中上腹部（ｍｉｄ−ｅｐｉｇａｓｔｒｉｕｍ）に圧迫があったが、嚥下困難を伴わない、１名の被験者（被験者＃１０５）は、これまでのＨＢＯＬ試験で認められている他の消化器系愁訴を示唆している。ヘモグロビンは内因性酸化窒素機能（酸化窒素は特に食道と腸における胃腸平滑筋の弛緩に必須である）に妨げうるという概念に基づいて、Ｌ−アルギニンを治療手段として使用した。Ｌ−アルギニンは、酸化窒素シンターゼが酸化窒素を産生する基質である。理論的には、ヘモグロビンによって酸化窒素が低下している人の場合（おそらく酸化窒素へのヘムの結合）、Ｌ−アルギニンの投与は有益であると考えられる。明らかに被験者は、約２時間Ｌ−アルギニンにより症状の一過性の軽減を示した。Ｌ−アルギニンの血漿半減期は約１時間であるので、これは予想外の所見ではない。残念ながら、いくつかの副作用（吐気と嘔吐）が生じ、注入を中止した。我々はこの被験者に抗コリン作動性鎮痙薬、ヒヨスチアミンを２回投与することを選択した。これは明らかに腹部「ガス」と圧迫の症状を軽減し続けた。被験者はさらなる愁訴あるいは続発症を生じなかった。
【０２２３】
要約すると、ＨＢＯＬは運動中および安静時の酸素の供給送達と利用の改善に関連した。ＨＢＯＬは、これまでに認められたのと同様の血行力学の範囲（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、安全性検体検査結果、薬物動態および医学的事象を生じた。Ｌ−アルギニンによる介入は消化器症状の逆転をもたらしうるが、吐気と嘔吐によりその使用は制限された。しかし、抗コリン作用療法の使用は、現れた消化器症状の治療において有用であると考えられる。
【０２２４】
均等物
当業者は、単なる常套的な実験を使用して、ここで述べた本発明の特定態様の多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。これらやその他すべてのそのような均等物は、下記の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (34)

1. ａ）ヘモグロビン溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷する工程；および
   ｂ）該カラムのｐＨよりも低いｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種を該カラムにインジェクトし、それにより該カラムから精製ヘモグロビン産物を溶出する工程
   を含む、精製ヘモグロビン産物の製造方法。
2. それぞれ異なるｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも２種を逐次的にカラムにインジェクトし、それにより該カラムを段階的ｐＨグラジエントに供する、請求項１記載の方法。
3. ヘモグロビン産物の溶出前に、該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種を用いてカラムを平衡化する、請求項２記載の方法。
4. ８．２〜８．６の範囲のｐＨにカラムを平衡化する、請求項３記載の方法。
5. 該緩衝液をインジェクトする前に、８．７を超えるｐＨに最初にカラムを平衡化する、請求項４記載の方法。
6. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液を用いて最初に該カラムを平衡化する、請求項５記載の方法。
7. 最初の平衡化のｐＨが、８．７〜１０．０の範囲である、請求項６記載の方法。
8. 該カラム平衡化の間、少なくとも１１カラムボイドボリュームの緩衝液をカラムにインジェクトする、請求項４記載の方法。
9. 該平衡化が、８．２〜８．４の範囲のｐＨにおけるものである、請求項８記載の方法。
10. ６．５〜７．５の範囲のｐＨの緩衝液を用いてヘモグロビン産物を溶出する、請求項９記載の方法。
11. ａ）ヘモグロビン溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷し、該負荷カラムを最初に８．７よりも高いｐＨに平衡化する工程；および
    ｂ）８．２よりも低いｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種を該カラムにインジェクトし、それにより該カラムから精製ヘモグロビン産物を溶出する工程
    を含む、精製ヘモグロビン産物の製造方法。
12. 該最初の平衡化が、８．７〜１０．０の範囲のｐＨにおけるものである、請求項１１記載の方法。
13. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸を用いて最初に該カラムを平衡化する、請求項１２記載の方法。
14. ヘモグロビン溶液を該カラムに負荷するｐＨと該カラムから精製ヘモグロビンが溶出する最終ｐＨとの間のｐＨを有し、８．６未満のｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種を該カラムにインジェクトし、それにより該カラムを段階的ｐＨグラジエントに供する工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
15. ヘモグロビン産物の溶出前に、該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種を用いて該カラムを平衡化する、請求項１４記載の方法。
16. 該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液を用いて８．２〜８．６の範囲のｐＨにカラムを平衡化する、請求項１５記載の方法。
17. 該カラム平衡化の間、少なくとも１１カラムボイドボリュームの該緩衝液をカラムにインジェクトする、請求項１６記載の方法。
18. 該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸を用いる該平衡化が、８．２〜８．４の範囲のｐＨにおけるものである、請求項１７記載の方法。
19. ６．５〜７．５の範囲のｐＨでヘモグロビン産物を溶出する、請求項１８記載の方法。
20. ａ）ヘモグロビン溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷する工程；
    ｂ）８．２〜８．６の範囲のｐＨを有する少なくとも１１カラムボイドボリュームの平衡化用緩衝液をカラムにインジェクトする工程；および
    ｃ）平衡化用緩衝液のｐＨよりも低いｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液をカラムにインジェクトし、それにより該カラムから精製ヘモグロビン産物が溶出する工程
    を含む、精製ヘモグロビン産物の製造方法。
21. 平衡化用緩衝液が、８．３のｐＨを有する、請求項２０記載の方法。
22. それぞれ異なるｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも２種を逐次的にカラムにインジェクトし、それにより該カラムを段階的ｐＨグラジエントに供する、請求項２０記載の方法。
23. 該緩衝液をインジェクトする前に、８．７を超えるｐＨに最初にカラムを平衡化する、請求項２２記載の方法。
24. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液を用いて最初に該カラムを平衡化する、請求項２３記載の方法。
25. 最初の平衡化のｐＨが、８．７〜１０．０の範囲である、請求項２４記載の方法。
26. ６．５〜７．５の範囲のｐＨでヘモグロビン産物を溶出する、請求項２５記載の方法。
27. ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにヘモグロビン溶液を負荷し、該負荷カラムを最初に８．７よりも高いｐＨに平衡化する工程；
    ｂ）８．２〜８．６の範囲のｐＨを有する少なくとも１１カラムボイドボリュームのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸の平衡化用緩衝液を該カラムにインジェクトする工程；および
    ｃ）８．２よりも低いｐＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液の少なくとも１種をカラムにインジェクトし、それにより該カラムから精製ヘモグロビン産物が溶出する工程
    を含む、精製ヘモグロビン産物の製造方法。
28. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸緩衝液を用いて最初に該カラムを平衡化する、請求項２７記載の方法。
29. 最初の平衡化のｐＨが、８．７〜１０．０の範囲である、請求項２８記載の方法。
30. 該平衡化用緩衝液が、８．２〜８．４の範囲のｐＨを有する、請求項２９記載の方法。
31. ６．５〜７．５の範囲のｐＨの緩衝液を用いてヘモグロビン産物を溶出する、請求項３０記載の方法。
32. クロマトグラフィーカラムが、陰イオン交換担体で充填されたものである、請求項２７記載の方法。
33. 陰イオン交換担体が、アミンまたはアンモニウム含有シリカゲル、アルミナゲル、チタニアゲル、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレートおよびスチレンジビニルベンゼンからなる群より選ばれたものである、請求項３２記載の方法。
34. 陰イオン交換担体が、アミンまたはアンモニウム含有シリカゲルである、請求項３３記載の方法。