JP6786917B2 - ヘモグロビン調製液及びヘモグロビン類測定液体クロマトグラフィー法 - Google Patents

Description

本発明は、血液試料中のヘモグロビンを分析するための調製液及びこの調製液を用いた、ヘモグロビン類を測定するための液体クロマトグラフィー法に関する。

ヘモグロビンは、２個のα鎖および２個のβ鎖からなるα２β２の構造を持ち、成人では全ヘモグロビンの約９７％を占めるヘモグロビンＡ、２個のα鎖およびγ鎖からなるα２γ２構造を持ち、全ヘモグロビンの１％弱を占めるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、そして２個のα鎖およびδ鎖からなるα２δ２構造を持ち、全体のヘモグロビンの約２〜３％を占めるヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）から構成される。

さらにヘモグロビンＡは非糖化ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）と糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１）に大別され、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１）はβ鎖に結合した糖種と結合状態によりヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、不安定型糖化ヘモグロビン（Ｌ−Ａ１ｃ）、安定型糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）に分けることができる。

血中のグルコースと非酵素的に結合（糖化）を経て形成された安定型糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、食事などによる一時的な血糖値の上昇に影響されず、過去２から３ヶ月間の血糖値の変化を反映して濃度が変化するため、糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の指標として広く用いられている。

ＨｂＡ１ｃの測定には陽イオン交換液体クロマトグラフィー法（以下「ＨＰＬＣ法」と略記する）が精度、再現性に優れていることから広く使用されている。ＨＰＬＣ法では陽イオン交換体が充填された陽イオン交換カラムに、塩濃度もしくはｐＨの異なる溶離液を通液し、種々のヘモグロビンと充填剤との相互作用の相違を利用して分離する。一般的なＨＰＬＣ法では充填剤との相互作用の弱いＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−Ａ１ｃ、ＨｂＡ１ｃそしてＨｂＡ０の順に溶出し、各成分のピーク面積もしくは高さなどを計測することで、ＨｂＡ１ｃをはじめとする各ヘモグロビン種の存在率を測定する。

通常のＨｂＡ１ｃの測定は、キャリブレータによって校正されている装置の測定性能をコントロールで評価した後に、血液検体を測定する手順が一般的である。このキャリブレータによる装置の校正は、カラム交換時やメンテナンス時など必要に応じて行われることが知られている（特許文献１）。

凍結乾燥ヘモグロビンは長期的保存安定性に優れているため、キャリブレータとコントロールはヒト由来の赤血球成分を凍結乾燥したヘモグロビンであることが多い。凍結乾燥ヘモグロビンは調製液を用いて、手動希釈によって溶解かつ希釈され、液体クロマトグラフィーのヘモグロビン試料となる。

また、ＨｂＡ１ｃ一次標準物質として、検査医学標準物質機構（ＲｅＣＣＭ）のＨｂＡ１一次標準物質（ＪＣＣＲＭ ４１１）や、ＭＣＡ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒなどがあり、これらヘモグロビン凍結品も調製液を用いて、手動希釈によって希釈され、液体クロマトグラフィーのヘモグロビン試料となる。

血液検体はＥＤＴＡやフッ化ナトリウムなどの抗凝固剤入りの採血管に採血されたものである。多くは採血管の状態のまま液体クロマトグラフィー装置に搭載され、装置の自動希釈機能によって調製液で希釈されたのち、ただちに測定される。

貧血患者などヘモグロビン濃度が低い血液検体や、凍結保存されていた血液検体を測定する場合は、調製液を用いて、手動希釈によって溶血かつ希釈され、液体クロマトグラフィーのヘモグロビン試料となる。

液体クロマトグラフィー法では、測定結果の信頼性の点から、装置校正および精度管理は実測定と同じ条件で行うことが理想である。つまりキャリブレータやコントロール、血液検体など全てのヘモグロビン試料は、同一の希釈液で調製されることが望ましいことが知られている。また、全自動で希釈後すぐに測定される患者の血液検体とは異なり、キャリブレータ、コントロールで使用されるヘモグロビンを含む試料を手希釈で希釈し、希釈されたそのヘモグロビンを含む試料のＨｂＡ１ｃ濃度を測定までの時間内に一定にすることが困難であることが知られている。

しかし、測定するヘモグロビン試料は凍結乾燥ヘモグロビン、凍結ヘモグロビン液、血液検体など多様である。凍結乾燥ヘモグロビン、凍結ヘモグロビン液などには血漿成分を除去するなどの成分調整を施されているもの、安定性を確保するために糖類や防腐剤が添加されているものもある。

また、現在使用されている調製液は血液検体には使用可能だが、凍結乾燥品ではＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０間に新たな成分（ピーク）が出現し正しく測定できない、調製後の安定性が悪くＨｂＡ１ｃ濃度が変化してしまうなどの問題により使用できない場合がある。さらに凍結乾燥品には使用できるが、血液検体では溶血作用が不十分などの理由で使用できない場合もあり、同一の調製液でキャリブレータやコントロール、血液検体など全てのヘモグロビン試料を調製する方法は知られていなかった。

そのうえ、ＨＰＬＣ法を用いた装置では試料に含まれている脂質などの疎水性成分が装置やカラムなどに吸着することを防ぐために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のような洗浄力の高い界面活性剤を調製液に添加する必要がある。洗浄力の高い界面活性剤を含んだ調製液で凍結乾燥品を調製すると、溶出時間が大きく変動して正しく測定できず、かつ調製後の安定性が悪いためにＨｂＡ１ｃ濃度が変化するという問題が顕著であった。そのためキャリブレータやコントロールなどの凍結乾燥品の調製には使用することができなかった。

特許第４０６１３６５号

液体クロマトグラフィー法によるヘモグロビン測定の分野において、ヘモグロビンを含む試料から安定した精度の高いＨｂＡ１ｃ濃度の測定が可能であるヘモグロビン調製液が求められている。しかしながら、現在使用されているヘモグロビン調製液およびその測定方法は、ヘモグロビンを含む試料の状態によってはＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０間に新たな成分（ピーク）が出現し、正しく測定できないという課題があった。

また、ヘモグロビン調製液を用いて試料を調製した後、調製後の試料の安定性が原因でＨｂＡ１ｃ濃度が変化してしまうなどの観点から、キャリブレータやコントロール、血液検体など全てのヘモグロビンを含む試料を同一の希釈液で調製することが困難であるという課題があった。

さらに、凍結乾燥ヘモグロビン等の調製に時間がかる検体を使用した場合、ヘモグロビン調製液を加えた後、ただちに装置に搭載して装置の校正を開始することが困難であるという課題があった。

そこで本発明の目的は、ヘモグロビンを含む試料の状態を選ぶことなく、さらにキャリブレータやコントロール、血液検体などヘモグロビンを含む全ての試料を同一の調製液で調製可能なヘモグロビン調製液およびその測定方法を提供することである。

本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヘモグロビンを含む試料を調製液によって調製した後のＨｂＡ１ｃ値が安定しない原因は、調製液中に含まれるエーテル型非イオン性界面活性剤が、ＨｂＡ０分画に含まれるヘモグロビン類に作用することを見出した。さらにエステルエーテル型非イオン性界面活性剤は、当該ヘモグロビン類に作用しないことも見出した。つまり、本発明のヘモグロビン調製液がエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を含むが、エーテル型非イオン性界面活性剤を含まないことによって、ヘモグロビンを含む試料を前記調製液による調製の際に、ヘモグロビンを含む試料の種類、試料に添加されている添加物を選ぶことなく安定した精度の高いＨｂＡ１ｃ濃度の測定が可能となり、本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細を示す。
［１］ヘモグロビンを含む試料から、ヘモグロビン類を測定するための調製液であって、調製液に少なくとも１種類以上のエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を含み、エーテル型非イオン性界面活性剤を含まないことを特徴とする、ヘモグロビン調製液。
［２］エステルエーテル型非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートの中から、少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする、［１］に記載のヘモグロビン調製液。
［３］保存剤が、少なくとも１種類以上含まれることを特徴とする、［１］または［２］に記載のヘモグロビン調製液。
［４］保存剤が、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸のカリウム塩、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸のナトリウム塩またはアジ化ナトリウムの中から、少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする、［３］に記載のヘモグロビン調製液。
［５］［１］から［４］のいずれか一項に記載のヘモグロビン調製液によって調製されたキャリブレータ、コントロール又は血液検体を使用してヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン類を測定することを特徴とする、ヘモグロビンの測定方法。
［６］ヘモグロビンを含む試料から、ヘモグロビン類を測定するための測定方法であって、凍結乾燥ヘモグロビンを［１］から［４］のいずれか一項に記載の調製液で溶解かつ希釈後に、直ちにカラムへ導入することを特徴とするヘモグロビンの測定方法。

本発明に係るヘモグロビンを含む試料とは、凍結乾燥ヘモグロビン、凍結ヘモグロビン液、血液検体などが例示されるが、ヘモグロビンが含まれていれば特に制限はない。また、凍結乾燥ヘモグロビン、凍結ヘモグロビン液等の加工されている試料の場合、血漿成分を除去するなどの成分調整を施されている試料、安定性を確保するために糖類や防腐剤が添加されている試料も含まれていても特に制限はない。

本発明に係るヘモグロビン類を測定するための調製液とは、少なくとも１種類以上のエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を含み、エーテル型非イオン性界面活性剤を含まないことを特徴とする調製液である。

本発明に係る調製とは、ヘモグロビンを含む試料を任意の濃度とすることである。具体的には、ヘモグロビンを含む試料を調製液によってキャリブレータ―、コントロール、血液検体をカラムに導入するためのサンプルとして任意の濃度にすることである。

本発明に係るエステルエーテル型非イオン性界面活性剤とは、脂肪酸エステルにエチレンオキシドを付加した化合物を示す。例えば多価アルコールの脂肪酸エステルにエチレンオキシドを付加したポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノステアレ―ト、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エチレンオキシド平均付加モル数（ｎ）に特に制限はないが、ｎ＝２０であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレン（２０）モノステアレ―ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０）が特に好ましい。 本発明に係るエーテル型非イオン性界面活性剤とは、アルキルフェノールにエチレンオキシドを付加重合したポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルや、高級アルコールにエチレンオキシドが付加重合したポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールにエチレンオキシドを付加重合したポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール分類される。例えば、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルやポリエチレン（２３）ラウリルエーテルなどが挙げられるが、特に制限はない。

また、エステルエーテル型非イオン性界面活性剤の濃度としては０．０１〜０．４重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．２重量％である。０．０１重量％より薄い場合、ヘモグロビン試料に含まれる疎水性成分が装置やカラムなどに吸着することを防ぐことができない。また、カラムに導入されるヘモグロビン試料の体積にもよるが、４１５ｎｍの波長の光を吸収するエステルエーテル型非イオン活性剤が０．５重量％を超えて含まれている場合、ヘモグロビンの検出に一般的な４１５ｎｍ検出において、ＨｂＡ１ａよりも速い時間に界面活性剤由来のピークを検出することがあるため、好ましくない。

さらに、本発明に係るヘモグロビン類を測定するための調製液は、自体の保存性を高めるために保存剤が１種類以上含まれていても良い。保存剤は抗菌効果や防腐効果のある化合物であれば特に限定されないが、揮発により濃度変化しやすいアルコール系化合物ではなく、エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ）類などのキレート系保存剤やアジ化ナトリウムが好ましい。キレート系保存剤として、ＥＤＴＡ、グリコールエーテルジアミン四酢酸（以下、ＧＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡ類のナトリウム塩、ＥＤＴＡ類のカリウム塩、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸のナトリウム塩などが挙げられるが特に制限はない。なお、保存剤の濃度は０．０５〜６重量％、さらに好ましくは０．１〜３重量％である。

本発明に係るヘモグロビン類を測定するための調製液によって、ヘモグロビンを含む試料を調製する方法とは、凍結乾燥ヘモグロビンに調製液を加えて溶解かつ希釈する方法、少量の精製水を加えて一次希釈したヘモグロビン溶液を、調製液でさらに二次希釈する方法、調製液に凍結ヘモグロビンの解凍液や血液検体を少量加えて希釈する方法等が例示できるが、液体クロマトグラフィー法で分析できるようにヘモグロビンを含む試料が調製できれば特に制限はない。

このヘモグロビン類を測定するための調製液を陽イオン交換体液体クロマトグラフィー法で測定するヘモグロビン試料の調製に用いる場合、ヘモグロビン調製液のカチオン濃度が測定に影響を及ぼす。ヘモグロビン調製液中の水素イオンを除くカチオン濃度が５〜４０ｍＭの範囲であり、かつｐＨが５．０〜９．５であることが好ましい。

ｐＨが５．０より低い、またはｐＨ９．５よりも高い場合、ヘモグロビン試料中の各ヘモグロビンピーク形状が変化し、安定してＨｂＡ１ｃ％を測定することができない。保存剤やｐＨ調製剤由来の、水素イオンを除くカチオン濃度が５ｍＭ以下の調製液では、長期使用によりサンプルループなど装置の配管内に付着した生体由来物質の影響で、安定してＨｂＡ１ｃ％を測定することができない。一方４０ｍＭ以上になると、ＨｂＡ１ｃよりも充填剤との相互作用の弱いＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＦなどのＨｂ成分の分離が悪化してしまい、安定してＨｂＡ１ｃ％を測定することができない。

また水素イオンを除く総カチオン濃度が５〜４０ｍＭとなる範囲内であれば、ｐＨの安定を目的にリン酸やＭＥＳなどの緩衝剤を添加しても良い。

本発明に係るヘモグロビン類を測定するための調製液はエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を含むがエーテル型非イオン性界面活性剤を含まないことにより、ヘモグロビン成分の保持時間の変動や面積変化がない、安定したヘモグロビン測定が可能である。

従って、本発明に係るヘモグロビン調製液は液体クロマトグラフィー法で測定しうるすべてのヘモグロビン試料を調製できるため、正確な装置校正と精度管理、血液検体測定を行うことができる。さらに装置校正、精度管理、血液検体測定に使用するヘモグロビン調製液を、本発明に係るヘモグロビン調製液に統一することで、さらに測定結果の信頼性を高めることができる。

また、本発明に係るヘモグロビン調製液は、凍結乾燥ヘモグロビン等の調製に時間がかる検体であったとしても、ヘモグロビンを含む試料の状態に関わらず、本発明に係るヘモグロビン調製液を加えた後、ただちに装置に搭載して装置の校正を開始することが可能となる。従って、凍結乾燥ヘモグロビンが含有された容器を搭載された装置が、自動で本発明に係るヘモグロビン調製液を容器に添加後吸引し、ただちにカラムに導入して装置を校正することが可能となり、測定装置の自動化、測定結果の測定者間差の縮小、測定結果の信頼性をさらに高めることができると期待できる。

実施例１における凍結乾燥ヘモグロビン−Ａで得られたクロマトグラムを示す。 比較例１における凍結乾燥ヘモグロビン−Ａで得られたクロマトグラムを示す。 実施例３、比較例３、および比較例４における凍結乾燥ヘモグロビン−Ｂのクロマトグラムを示す。 実施例９、比較例７、比較例８、比較例１２における凍結乾燥ヘモグロビン−Ｍで得られたクロマトグラムを示す。

以下に実施例と比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、希釈後のクロマトグラム変化を観察した。結果を表１に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
界面活性剤として０．１重量％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０）、保存剤として０．１重量％アジ化ナトリウム、０．０５重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０５重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有する、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。

（２）ヘモグロビン試料の準備
〔Ｉ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ａに精製水５００μＬを加え３０分室温に放置し、４０ｇ／Ｌの高濃度ヘモグロビン溶液得た。この高濃度ヘモグロビン溶液２０μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料とした。

（３）測定
ヘモグロビン調製液による希釈直後、つまり５分以内に陽イオン交換カラムを接続した液体クロマトグラフィー装置にヘモグロビン試料を注入した。ｐＨ５．４のコハク酸緩衝液を用いてヘモグロビン成分を分離し、４１５ｎｍで検出した。このヘモグロビン試料を２５℃環境下に３０分放置した後、再度測定を実施した。

（実施例２）
界面活性剤が実施例１のＴｗｅｅｎ２０の替りにポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（以下、Ｔｗｅｅｎ８０）であることを除き、実施例１と同様に行った。

（比較例１）
界面活性剤が実施例１のＴｗｅｅｎ２０の替りにポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（以下、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）であることを除き、実施例１と同様に行った。

（比較例２）
界面活性剤が実施例１のＴｗｅｅｎ２０の替りにポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル（以下、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）であることを除き、実施例１と同様に行った。

実施例１で得られたクロマトグラムを図１に、比較例１で得られたクロマトグラムを図２に示した。

エーテル型非イオン性界面活性剤を含む比較例１と比較例２では、希釈直後の測定においてＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の間にピークＰｘが検出された。このＰｘは希釈後３０分経過すると検出されなくなった。これはＨｂＡ０の一部成分の溶出時間が、エーテル型非イオン性界面活性剤の作用を受けて変化したことによる。表１に示すようにエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を含む実施例１と実施例２ではＰｘは検出されず、クロマトグラムの経時変化は観察されなかった。

（実施例３）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、液体クロマトグラフィー法でＨｂＡ１ｃ％を測定した。結果を表２に示した。

（１）ヘモグロビン調製液の作製
界面活性剤として０．１重量％Ｔｗｅｅｎ２０、保存剤として０．０５重量％アジ化ナトリウム、０．０５重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０５重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有する、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。

（２）ヘモグロビン試料の準備
〔Ｉ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｂ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｂにヘモグロビン調製液１０００μＬを加えて溶解し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＩ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｃ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｃに精製水５００μＬを加え３０分室温に放置し、４０ｇ／Ｌの高濃度ヘモグロビン溶液得た。この高濃度ヘモグロビン溶液２０μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料とした。
〔ＩＩＩ〕血液検体凍結品−Ｉ
−８０℃に２ヶ月以上保管していた血液検体−Ｉを室温に２０分置き、解凍した。この血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＶ〕ヘモグロビン凍結品−Ｊ
−８０℃に保管していたヘモグロビン凍結品−Ｊを室温に１０分置き、解凍した。この解凍液６μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。

（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定
ヘモグロビン調製液による溶解または希釈直後、つまり５分以内に、陽イオン交換カラムを接続した液体クロマトグラフィー装置にヘモグロビン試料を注入した。ｐＨ５．４のコハク酸緩衝液とｐＨ６．３のコハク酸−リン酸緩衝液によるｐＨグラジエント法でヘモグロビン成分を分離し、４１５ｎｍで検出した。ＨｂＡ１ｃ％は下記の計算式Ａより算出した。

計算式Ａ：ＨｂＡ１ｃ％＝ＨｂＡ１ｃ面積／（ＨｂＡ１ａ＋ＨｂＡ１ｂ＋Ｌ−Ａ１ｃ＋ＨｂＡ１ｃ＋ＨｂＡ０）×１００
（比較例３）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、液体クロマトグラフィー法でＨｂＡ１ｃ％を測定した。結果を表２に示した。

（１）ヘモグロビン調製液の作製
０．０５重量％アジ化ナトリウム、０．０５重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０５重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有し、界面活性剤を含まないｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。

（２）ヘモグロビン試料の準備と（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例３と同様に行った。

（比較例４）
界面活性剤がポリエチレン（２３）ラウリルエーテル（以下、Ｂｒｉｊ３５）であることを除き、実施例３と同様に行った。

図３に、凍結乾燥ヘモグロビン−Ｂのクロマトグラムを示す。図３のクロマトグラムのように、ｐＨグラジエント法による凍結乾燥ヘモグロビンの分離では、ＨｂＡ０分画中にＰｙとＰｚが観察される。比較例４のクロマトグラムとＨｂＡ１ｃ％は、実施例３や比較例３とは大きく異なる。例えばＨｂＡ１ｃ％は０．３％も高く、Ｐｙのピーク面積はあきらかに小さい。これはＴｗｅｅｎ２０とは異なり、Ｂｒｉｊ３５がヘモグロビン成分の分離に影響することを示している。

一方、凍結血液検体Ｉとヘモグロビン凍結品−ＪはＢｒｉｊ３５の影響を受けなかった。

（実施例４）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％の経時変化を調査した。結果を表３に示した。

（１）ヘモグロビン調製液の作製
実施例１と同じヘモグロビン調製液を作製した。

（２）ヘモグロビン試料の準備
〔Ｉ〕血液検体−Ｄ
採血後２４時間以内であり、一度も凍結していない新鮮な血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＩ〕血液検体凍結品−Ｅ
２ヶ月以上−８０℃に保管していた血液検体を室温に２０分置き、解凍した。この血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。

（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定
ヘモグロビン調製液による希釈直後、つまり５分以内に、陽イオン交換カラムを接続した液体クロマトグラフィー装置にヘモグロビン試料を注入した。ｐＨ５．４のコハク酸緩衝液を用いてヘモグロビン成分を分離し、４１５ｎｍで検出した。またこのヘモグロビン試料を２５℃環境下に希釈後６０分放置したのち、再度測定した。
ＨｂＡ１ｃ％は以下の計算式Ａより算出した。

計算式Ａ：ＨｂＡ１ｃ％＝ＨｂＡ１ｃ面積／（ＨｂＡ１ａ＋ＨｂＡ１ｂ＋Ｌ−Ａ１ｃ＋ＨｂＡ１ｃ＋ＨｂＡ０）×１００
（実施例５）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％の経時変化を調査した。結果を表３に示した。

（１）ヘモグロビン調製液
界面活性剤として０．１重量％Ｔｗｅｅｎ２０、保存剤として０．４重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有するヘモグロビン調製液を作製した。このヘモグロビン調製液は水酸化ナトリウムによってｐＨ６．０に調製されている。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例４と同様に行った。

（実施例６）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備しＨｂＡ１ｃ％の経時変化を調査した。結果を表３に示した。

（１）ヘモグロビン調製液
界面活性剤として０．１重量％Ｔｗｅｅｎ２０、保存剤として０．０５重量％アジ化ナトリウム、０．１２重量％ＧＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡを溶解させるための０．０４重量％水酸化ナトリウムが溶解している、ｐＨ９．３のヘモグロビン調製液を作製した。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例４と同様に行った。

（比較例５）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％の経時変化を調査した。結果を表３に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
比較例３と同じヘモグロビン調製液を作製した。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例４と同様に行った。

（比較例６）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％の経時変化を調査した。結果を表３に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
比較例１と同じヘモグロビン調製液を作製した。
（２）ヘモグロビン試料の準備
実施例４と同様に行った。（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、ＨｂＡ１ｃ％の計算式を除き、実施例４と同様に行った。ＨｂＡ１ｃ％の計算は、Ｐｘが検出されなかったときは実施例４と同様に計算式Ａで、Ｐｘが検出された場合は下記の計算式Ｂにて行った。
計算式Ｂ：ＨｂＡ１ｃ％＝ＨｂＡ１ｃ面積／（ＨｂＡ１ａ＋ＨｂＡ１ｂ＋Ｌ−Ａ１ｃ＋ＨｂＡ１ｃ＋Ｐｘ＋ＨｂＡ０）×１００
実施例４から実施例６に示すとおり、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含むヘモグロビン調製液によって希釈された血液検体は、その血液検体の状態に依存せず、希釈直後から６０分後までクロマトグラムは変化せず、安定してＨｂＡ１ｃ％を測定可能であった。これらのＨｂＡ１ｃ％は、界面活性剤を含まない比較例５のＨｂＡ１ｃ％と比較して−０．１〜０．１％以内であることから、Ｔｗｅｅｎ２０はヘモグロビン成分に作用していないことがわかる。

比較例６では、新鮮な血液検体−Ｄとは異なり、血液検体凍結品−Ｅはクロマトグラム、ＨｂＡ１ｃ％ともに経時変化した。血液検体凍結品−Ｅは希釈した直後はＰｘが検出され、計算式Ｂによって算出されたＨｂＡ１ｃ％は比較例５よりも約−０．５％も小さかった。希釈６０分後にはＰｘがＨｂＡ１ｃ分画と融合し、そのＨｂＡ１ｃ％は計算式Ａから４．７％となり、比較例５より０．３％大きかった。これは血液を凍結融解することで劣化したＨｂＡ０成分が、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の作用を受けやすいことを表している。

（実施例７）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。

（１）ヘモグロビン調製液の作製
界面活性剤として０．４重量％Ｔｗｅｅｎ２０、保存剤として０．０８重量％アジ化ナトリウム、０．０８重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０８重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有する、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。

（２）ヘモグロビン試料の準備
〔Ｉ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｍ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｍに精製水５００μＬを加え３０分室温に放置し、４０ｇ／Ｌの高濃度ヘモグロビン溶液得た。この高濃度ヘモグロビン溶液２０μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料とした。
〔ＩＩ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｎ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｎに精製水５００μＬを加え３０分室温に放置し、４０ｇ／Ｌの高濃度ヘモグロビン溶液得た。この高濃度ヘモグロビン溶液２０μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料とした。
〔ＩＩＩ〕血液検体凍結品−Ｋ
２ヶ月以上−８０℃に保管していた血液検体を室温に２０分置き、解凍した。この血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＶ〕血液検体凍結品−Ｌ
２ヶ月以上−８０℃に保管していた血液検体を室温に２０分置き、解凍した。この血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定
ヘモグロビン調製液による希釈直後、つまり５分以内に、陽イオン交換カラムを接続した液体クロマトグラフィー装置にヘモグロビン試料を注入した。ｐＨ５．４のコハク酸緩衝液を用いてヘモグロビン成分を分離し、４１５ｎｍで検出した。ＨｂＡ１ｃ％は計算式Ａより算出した。

（実施例８）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．２重量％であることを除き、実施例７と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。

（実施例９）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０５重量％であることを除き、実施例７と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。

（比較例７）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．５重量％であることを除き、実施例７と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。

（比較例８）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表５に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
保存剤として０．０８重量％アジ化ナトリウム、０．０８重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０８重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有する、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。

（比較例９）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
界面活性剤として０．５重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、保存剤として０．０８重量％アジ化ナトリウム、０．０８重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０８重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有する、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液を作製した。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。ただし、Ｐｘが検出された凍結乾燥ヘモグロビン−ＭのＨｂＡ１ｃ％の計算は、計算式Ｂより算出した。

（比較例１０）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が０．４重量％であることを除き、比較例９と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、比較例９と同様に行った。

（比較例１１）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が０．２重量％であることを除き、比較例９と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、比較例９と同様に行った。

（比較例１２）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。結果を表４に示した。
（１）ヘモグロビン調製液の作製
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が０．０５重量％であることを除き、比較例９と同様に行った。
（２）ヘモグロビン試料の準備及び（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定は、実施例７と同様に行った。

比較例７に示すように、４１５ｎｍの波長の光を吸収するエステルエーテル型非イオン性界面活性剤濃度が０．５重量％を超える場合、ＨｂＡ１ｃ％の値への影響は小さいがＨｂＡ１ａよりも速い時間に界面活性剤由来のピークが検出されるため、好ましくない。また、比較例９〜比較例１２からわかるように、エーテル型界面活性剤は低濃度でもＨｂＡ１ｃ％に影響する。

（実施例１０）
下記の方法でヘモグロビン試料を準備し、希釈後のＨｂＡ１ｃ％の時間変化を観察した。結果を表５に示した。
（１）ヘモグロビン調製液
界面活性剤として０．１重量％Ｔｗｅｅｎ２０、保存剤として０．０７５重量％アジ化ナトリウム、０．０７５重量％ＥＤＴＡ４ナトリウム４水和物、０．０７５重量％ＥＤＴＡ２カリウム２水和物を含有するヘモグロビン調製液を作製した。このヘモグロビン調製液のｐＨは７．６であった。

（２）ヘモグロビン試料の準備
〔Ｉ〕血液検体−Ｄ
採血後２４時間以内の血液検体−Ｄをヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＩ〕血液検体凍結品−Ｅ
−８０℃に２ヶ月以上保管していた血液検体−Ｅを室温に２０分置き、解凍した。この血液検体をヘモグロビン調製液で希釈し、約１ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＩＩ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｆ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｆにヘモグロビン調製液１０００μＬを加え、マイクロピペットで３回吸引と吐出を繰り返し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。
〔ＩＶ〕凍結乾燥ヘモグロビン−Ｇ
凍結乾燥ヘモグロビン−Ｇに精製水５００μＬを加えて３０分室温に放置し、４０ｇ／Ｌの高濃度ヘモグロビン溶液を得た。この高濃度ヘモグロビン溶液２０μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料とした。この凍結乾燥ヘモグロビン−Ｇは、実施例７で使用した凍結乾燥ヘモグロビン−Ｍと同じ製造元から入手した。
〔Ｖ〕ヘモグロビン凍結品−Ｈ
−８０℃に保管していたヘモグロビン凍結品−Ｈを室温に１０分置き、解凍した。このヘモグロビン凍結品−Ｈは、実施例３で使用したヘモグロビン溶液凍結品−Ｊと同じ製造元から入手した。この解凍液６μＬをヘモグロビン調製液１０００μＬで希釈し、約０．８ｇ／Ｌのヘモグロビン試料を得た。

（３）ＨｂＡ１ｃ％の測定
ヘモグロビン調製液による溶解または希釈直後、つまり５分以内に、陽イオン交換カラムを接続した液体クロマトグラフィー装置にヘモグロビン試料を注入した。ｐＨ５．４のコハク酸緩衝液を用いてヘモグロビン成分を分離し、４１５ｎｍで検出した。得られたクロマトグラムにはＰｘが観察されなかったため、ＨｂＡ１ｃ％は実施例４と同様に計算式Ａより算出した。

一般的に市販されているキャリブレータの使用方法は、凍結乾燥ヘモグロビンを溶解かつ希釈させるためのヘモグロビン調製液を加えた後、一定時間、多くは３０分間放置した後測定する。しかしながら実施例１０では、凍結乾燥ヘモグロビンＦ−にヘモグロビン調製液を加えた時点から５分以内に、ヘモグロビンを含む試料がカラムへ導入することが可能であることが確認された。つまり、測定者が凍結乾燥ヘモグロビンに本発明に係るヘモグロビン調製液を加えた後、ただちに装置に搭載して装置の校正を開始することができることが確認された。すなわち、凍結乾燥ヘモグロビンが含有された容器が搭載されたヘモグロビン測定装置は、人の操作を介することなく自動で本発明に係るヘモグロビン調製液をヘモグロビンを含む試料が入った容器に添加して懸濁・吸引し、ただちにカラムに導入して装置を校正できることが示された。

Claims (6)

1. ヘモグロビンを含む試料から、ヘモグロビン類を測定するための調製液であって、調製液に少なくとも１種類以上のエステルエーテル型非イオン性界面活性剤を０．０５〜０．４重量％含み、エーテル型非イオン性界面活性剤を含まないことを特徴とする、ヘモグロビン調製液。
2. エステルエーテル型非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートの中から、少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする、請求項１に記載のヘモグロビン調製液。
3. 保存剤が、少なくとも１種類以上含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載のヘモグロビン調製液。
4. 保存剤が、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸のカリウム塩、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸のナトリウム塩またはアジ化ナトリウムの中から、少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする、請求項３に記載のヘモグロビン調製液。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載のヘモグロビン調製液によって調製されたキャリブレータ、コントロール又は血液検体を使用してヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン類を測定することを特徴とする、ヘモグロビンの測定方法。
6. ヘモグロビンを含む試料から、ヘモグロビン類を測定するための測定方法であって、凍結乾燥ヘモグロビンを請求項１から４のいずれか一項に記載の調製液で溶解かつ希釈後に、直ちにカラムへ導入することを特徴とするヘモグロビンの測定方法。

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