JPH11508236A

JPH11508236A - ヒドロキシアパタイトを用いる非重合化ヘモグロビンからの重合化ヘモグロビンの分離

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Publication number: JPH11508236A
Application number: JP9501473A
Authority: JP
Inventors: イー．ウェルツ，カーティス; エス．ゴーリル，マリア
Original assignee: バイオピュアコーポレーション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-07-21
Also published as: DE69607963T2; AU6048496A; CA2222755C; WO1996040782A1; EP0832130B1; EP0832130A1; CA2222755A1; ATE192165T1; DE69607963D1; US5691453A; ES2145456T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、血液から安定重合化ヘモグロビン代用血液を製造する方法に関する。本発明の方法は、重合化ヘモグロビン溶液をヒドロキシアパタイトＨＰＬＣカラムと接触させ、実質的に純粋な重合化ヘモグロビンを回収する工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＰＬＣを用いるヒドロキシアパタイトでのヘモグロビンの分離発明の背景血液の損失（例えば、急性出血からの又は外科手術の間）から生じる、貧血（例えば、悪性貧血又は鎌状赤血球貧血）により生じる、若しくはショック（例えば、容量欠乏ショック、アナフィラキシーショック、敗血症性ショック又はアレルギー性ショック）により生じる低酸素症を治療し、又は防止するために、代用血液が必要とされている。これらの役割のための血液及び血液画分の代用血液としての使用は、不利な点を伴っている。例えば、全血の使用は、しばしば、肝炎生産ウイルス及びＡＩＤＳ生産ウイルスの伝達のリスクをともない、それは患者を完全に回復させることができるが又患者を死亡させることもできる。さらに、全血の使用は、免疫血液学的な問題及びドナー間の不適合性を避けるために血液型及び交差試験を必要とする。代用血液としてのヒトヘモグロビンは、浸透活性並びに酸素輸送及び酸素転移の能力を有しているが、腎臓経路により及び血管壁を通して循環系から急速に排出されるという欠点を有しており、非常に短命であり、従って典型的に不十分な半減期に終わっている。さらに、また、ヒトヘモグロビンは毒性レベルのエンドトキシン、細菌及び／又はウイスルでしばしば汚染される。非ヒトヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンと同じ欠点を欠点として持っている。さらに、また、非ヒト材料由来のヘモグロビンは、典型的に抗体等の蛋白質で汚染され、そのことは受容者における免疫系応答の原因となりえる。以前、水素をフッ素で置換した化合物、合成ヘモグロビン類似体、リポソーム被包化ヘモグロビン、及び化学的修飾化ヘモグロビンに挙げられる少なくとも４つの他の型の代用血液が利用されてきた。しかしながら、これら代用血液の多くは、典型的に短い血管内維持時間を持っており、循環系により外来物質として排除され、又は肝臓、脾臓、及び他の組織内に留められる。また、それら代用血液の多くは、生物学的に生命系と両立しないものであった。そのため、ヘモグロビンに基づく代用血液の調製における最近の進展にもかかわらず、一般的に代用血液の注入により生じる免疫系応答及び毒素効果を発揮させない程度に十分低い、エンドトキシン、細菌、ウイルス、リン脂質及び非ヘモグロビン蛋白質等の汚染物質のレベルを有する代用血液についての必要性が存在し続けている。さらに、また、代用血液は、周囲の状況下において十分な量の酸素を組織に輸送する又は転移する能力も持ち、良好な血管内維持時間持っていなければならない。さらに、代用血液は、１）一般的に全血と等しい腫脹活性を有し、２）交差試験又は感受性試験なしにほとんどの受血者に輸血することができ、３）長時間、最小量の冷凍で保存できることが好ましい。発明の概要本発明は、全血から安定重合化ヘモグロビン代用血液を製造する方法に関する。具体的に述べると、本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラム（ＨＰＬＣなど）を用いる、重合化ヘモグロビンと非重合化ヘモグロビンの不均一な混合物からの、重合化ヘモグロビンの分離に関する。一態様として、本方法では、１若しくはそれ以上の精製又は反応段階によって、全血からヘモグロビン溶出液を分離し、任意に脱酸素化し、次いで、その溶出液をスルフヒドリル化合物と接触させることにより、酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を形成させ、次に、それを架橋剤(cross-linking agent)と混合して、重合反応混合物を形成させる。次に、その重合反応混合物をヒドロキシアパタイトを詰めたクロマトグラフィーカラムで分離し、二量体又は四量体ヘモグロビン分画をより高分子量のヘモグロビンポリマーから精製する。次に、そのようにして得た重合化ヘモグロビン溶液を、代用血液として使用するために、生理学的に許容できるものにする。本発明の利点は数多くある。１つの利点は、本発明の方法によって生産される重合化ヘモグロビンが、ダイアフィルトレーションやサイズ排除法より処理時間の短い一精製段階で高い純度を持つということである。また、本発明の方法を使用すると、重合化ヘモグロビン溶液からの重合化ヘモグロビン代用血液の収率が、ダイアフィルトレーションやイオン交換よりも高くなる。もう１つの利点は、本発明の方法によって生産されるヘモグロビンが、従来の方法よりも高い純度を持つということである。したがって、ある種に由来するヘモグロビンを、異なる種で、その受容種に有意な副作用を与えることなく、代用血液として使用することができる。発明の詳細な説明以下、本発明の方法の特徴とその他の詳細を、添付の図面を参照して詳述すると共に、請求の範囲に示す。例示のために本発明の特定の態様を示すが、それらが本発明の限定を意図しないことは理解されるだろう。本発明の原理は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な態様で使用することができる。前記のように、本発明は、ＨＰＬＣなどのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムを用いる、重合化ヘモグロビンと非重合化ヘモグロビンの不均一な混合物からの、重合化ヘモグロビン（ポリ（Ｈｂ））の分離に関する。好適なヒドロキシアパタイト材料には、懸濁液又はゲルとして例えばSigma Chemical Co. などから結晶型で入手できる水酸化リン酸カルシウムがある。好ましい態様として、ヒドロキシアパタイトを、BioRad Laboratories 製又はAmerican Internati onal Chemical Inc.製の球状巨孔性セラミック粒子として入手する。ヒドロキシアパタイトを含有するクロマトグラフィーカラムを、まず、ポリ（Ｈｂ）の結合を促進する低イオン強度緩衝液（例えば約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ）で調製する。具体的に述べると、好ましい低イオン強度緩衝液は、低濃度のリン酸塩又は塩化物を含有する。濃ポリ（Ｈｂ）溶液をそのカラムに注入し、結合させる。緩衝剤の濃度が増大する緩衝液を用いた連続的な溶出により、まず、非重合化ヘモグロビン（例えば二量体３２ｋＤａ蛋白質）と四量体（６４ｋＤａ蛋白質）を溶出させた後、所望の重合化ヘモグロビンを溶出させる。高緩衝剤濃度の例としては、約１００ｍＭから約１Ｍまでの間が挙げられる。好適な緩衝液の例には、リン酸緩衝液（リン酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸アンモニウムなど）と塩化物緩衝液（塩化ナトリウム及び塩化カリウムなど）がある。好適なクロマトグラフィーカラムとしては、総体積約６ｃｃのヒドロキシアパタイトをベッド高７．５ｃｍ、直径１ｃｍで乾燥充填したWaters AP-1 カラムを挙げることができる。好ましい態様として、ヒドロキシアパタイトカラムを、まず、低濃度リン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶出することによって調製する。ポリ（Ｈｂ）を濃縮した形態でそのカラムに注入し、結合させる。非ポリマーと安定な６４ｋＤポリマーの分離溶出は、もう１つの高濃度リン酸カリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．０）の一部を第１緩衝液に混合して、カラムを溶出することにより達成される。この非ポリマー及び６４ｋＤポリマー溶出混合緩衝液のリン酸濃度は６１ｍＭであり、Ｈｂのカラムからの溶出が低レベルで安定するまで溶出を続ける。次に、そのカラムを前記高リン酸カリウム濃度緩衝液で溶出することにより、分離したポリマー（Ｈｂ）を溶出させ、それを集めてさらに処理する。この例では、３３．２％の非ポリマー（すなわち３２ｋＤ二量体と６４ｋＤ四量体）と６６．８％の６４ｋＤａより大きいポリマーの組み合わせからなるポリマーとを含有するヘモグロビンポリマーの不均一な混合物を、１回の３０分間のクロマトグラフィー段階で、非ポリマーの含有率が約２．６％未満の混合物に精製することができる。混合非ポリマーを、８．９％の重合化ヘモグロビンを含む９１．１％の濃度で溶出する。本明細書で定義するところの代用血液とは、酸素を少なくとも生命維持に絶対必要な器官と組識に輸送及び転移させることができ、かつ、十分な血管内膨張圧を維持することができる、ヒト、哺乳動物その他の脊椎動物で使用するためのヘモグロビン系酸素運搬組成物である。脊椎動物とは古典的な定義通りで、循環系中の血液を使って組識に酸素を転移させているヒトその他の脊椎動物を含む。また、循環系の定義も古典的な定義通りであって、心臓、動脈、静脈、及び毛細血管のような小さい脈管構造を含む微小循環系からなる。本発明の方法によって製造される代用血液に含まれるエンドトキシン、リン脂質、外来蛋白質及びその他の汚染物質のレベルは、有意な免疫系応答をもたらさず、受容者にとって非毒性なレベルである。代用血液は超高純度であることが好ましい。本明細書で定義するところの超高純度とは、エンドトキシンの含有量が約０．５ＥＵ／ｍＬ未満、リン脂質の含有量が約３．３ナノモル／ｍＬ未満で、血清アルブミンや抗体等の非ヘモグロビン蛋白質の含有量が検出不能なレベルであるくらいに低いことを意味する。「エンドトキシン」という用語は、グラム陰性細菌細胞壁の外層の一部として生産される細胞結合型リポ多糖を意味し、これは多くの状況で毒性を持つ。エンドトキシンを動物に注射すると、発熱、下痢、出血性ショックその他の組識損傷を引き起こしうる。エンドトキシン単位（ＥＵ）は、１９８３年の米国薬局方会議（United States Pharmacopeial Convention）の3014頁に、０．１ナノグラムの米国参照標品（U.S．reference standard）ロットＥＣ−５中に含まれる活性と定義されている。１バイアルのＥＣ−５は、１０，０００ＥＵを含む。代用血液中のエンドトキシン濃度を測定するのに適した手段の例には、Associates of Cape Cod（マサチューセッツ州ウッズホール）によって開発された「速度／濁度測定リムウス遊走細胞ライステート（Kinetic/Turbidimetric Limuus Amebocyti c Lystate；LAL）5000法」という方法がある。本明細書で定義するところの安定重合化ヘモグロビンとは、低酸素環境下に保存すると、適切な貯蔵温度で２ヶ月以上の期間、好ましくは２年以上の期間、分子量分布及び／又はメトヘモグロビン含量が実質上増減しないヘモグロビン系酸素運搬組成物をいう。好適な貯蔵温度は、例えば約０℃〜約４０℃である。好ましい貯蔵温度範囲は約０℃〜約２５℃である。好適な低酸素環境とは、少なくとも１年の貯蔵期間中にその代用血液と接触する酸素の累積量が、その代用血液中に約１５重量％未満のメトヘモグロビン濃度をもたらす量であることをいう。酸素の累積量には、代用血液パッケージ内に漏れる酸素と、その代用血液とパッケージの当初の酸素含量が含まれる。重合化ヘモグロビンは、血液を抗凝固剤と混合して血液溶液を形成させた後、その血液溶液中の赤血球を洗浄して赤血球から小さな血漿蛋白質を分離する方法によって調製されることが好ましい。この方法には、洗浄した赤血球を白血球から分離した後、その赤血球を破壊してヘモグロビンを放出させ、ヘモグロビン溶液を得るという段階も含まれる。次に、ヘモグロビン溶液中の非ヘモグロビン成分を、公称分子量カットオフが１００ｋＤと３０ｋＤの限外濾過器と高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分子量分画し、ヘモグロビン溶液中の非ヘモグロビン成分をヘモグロビン溶液から分離して、ヘモグロビン溶出液を得る。次に、そのヘモグロビン溶出液を脱酸素化した後、スルフヒドリル化合物と接触させることにより、酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を作り、次いでそれを架橋剤と混合して、重合反応混合物を得る。このような方法は、例えば米国特許第５，２９６，４６５号や米国特許第５，０８４，５５８号に記述されている。次に、その重合反応混合物を安定化し、ヒドロキシアパタイト精製にかける。この方法では、赤血球（ＲＢＣ）収集からヘモグロビン重合反応に至るまで常に、微生物成長又は生体負担(bioburden)を最小限に抑えることのできる条件下に、血液溶液、ＲＢＣ及びヘモグロビンを維持する（例えば温度を約０℃以上約２０℃未満に維持する）。好ましくは、温度を約１５℃又はそれ以下に維持する。より好ましくは温度を１０±２℃に維持する。安定重合化ヘモグロビン代用血液の製造工程用の部品の一部は、滅菌製品を製造できる程度に消毒される。滅菌とは、当該技術分野で定義される通りであり、具体的には、その溶液が、USP XXII，セクション７１,1483-1488頁に規定される滅菌性に関する米国薬局方の基準に合致することをいう。さらに、処理流（proc ess stream）にさらされる部品の一部は、その処理流と反応しない又はその処理流を汚染しない材質で加工又は被覆されるのが通例である。そのような材質としては、ステンレス鋼その他のスチール合金（インコネルなど）を挙げることができる。好適なＲＢＣ源には、ヒト血液、ウシ血液、ヒツジ血液、ブタ血液、その他の脊椎動物由来の血液及び遺伝子導入法で生産されたヘモグロビン（例えばBIO/TE CHNOLOGY，12：55-59（1994）に記載のトランスジェニックＨｂなど）がある。血液は、生きた又は屠殺したばかりのドナーから集めることができる。牛全血を集める一方法は、Rauschらに付与された米国特許第５，０８４，５５８号と同５，２９６，４６５号に記述されている。血液は衛生的に集められることが好ましい。血液の有意な凝固を防止するために、収集時又は収集直後に、血液を少なくとも１種類の抗凝固剤と混合する。好適な抗凝血剤は従来から当該技術分野で知られているものであり、例えばクエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸及びヘパリンなどが挙げられる。血液と混合する時、抗凝固剤は粉末等の固形であってもよいし、水溶液であってもよい。血液溶液の供給源は、集めたばかりの試料からであってもよいし、血液バンクから得られる失効したヒト血液等の古い試料からであってもよいと理解される。また、血液溶液は以前に凍結及び／又は液体状態で保存されていたものであってもよい。この方法で使用する前に血液溶液を凍結しないことが好ましい。もう１つの態様として、血液溶液を抗凝固剤に導入する前に、その血液溶液中のペニシリン等の抗生物質レベルを検定する。抗生物質レベルは、その血液試料のドナーが抗生物質で処置されていなかったということを立証することによって、その血液試料が感染性生物を含んでいないことをある程度保証するために測定される。抗生物質に関する好適な検定法の例には、「乳中ペニシリンの迅速検出」と題する方法を使用するペニシリン検定キット（Difco,ミシガン州デトロイト）がある。血液溶液が含有するペニシリンレベルは約０．００８単位／ｍＬ以下であることが好ましい。別法として、家畜に疾病が無いこと、又は家畜が抗生物質処置されていないことを監視する獣群管理プログラムを使用することもできる。好ましくは、抗凝固段階に先立って、又は抗凝固段階中に、血液溶液を濾過して、大きな凝集体と粒子を除去する。６００メッシュのふるいが好適な濾過器の例である。次に、血液溶液中のＲＢＣを適当な手段（例えばダイアフィルトレーション、又は少なくとも１種類の等張溶液等の溶液を用いる不連続の希釈及び濃縮段階の併用など）で洗浄することにより、ＲＢＣを血清アルブミンや抗体（例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ））のような細胞外血漿蛋白質から分離する。ＲＢＣは、バッチ法でも、連続供給法でも洗浄できると理解される。許容できる等張溶液は当該技術分野で知られている通りであり、ＲＢＣの細胞膜を破裂させずに全血の血漿部分と置き換わるｐＨと浸透性を持つ、クエン酸／生理的食塩溶液のような溶液が挙げられる。好ましい等張溶液は中性ｐＨと約２８５〜３１５ｍＯｓｍの浸透性を持つ。好ましい態様として、この等張溶液は、クエン酸ナトリウムニ水和物（６．０ｇ／Ｌ）と塩化ナトリウム（８．０ｇ／Ｌ）の水溶液からなる。本発明の方法で使用することができる水には、蒸留水、脱イオン水、注射用蒸留水（ＷＦＩ）及び／又は低発熱物質水（ＬＰＷ）がある。ＷＦＩは、注射用蒸留水に関する米国薬局方(U.S．Pharmacological Specifications)を満たす脱イオン蒸留水であることが好ましい。ＷＦＩについてはPharmaceutical Engineeri ng，11，15-23（1991）に詳述されている。ＬＰＷは、０．００２ＥＵ／ｍＬ未満を含有する脱イオン水であることが好ましい。前記等張溶液は、血液溶液に添加する前に濾過しておくことが好ましい。好ましいフィルターの例には、Millipore １０，０００ダルトン限外濾過膜（Millip ore カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｇ１フィルターなど）や、A/G Technology 中空糸１０，０００ダルトン（カタログ番号ＵＦＰ−１０−Ｃ−８５）がある。好ましい態様として、血液溶液中のＲＢＣをダイアフィルトレーションによって洗浄する。好適なダイアフィルターには、０．１μｍ〜０．５μｍフィルター（例えば０．２μｍ中空糸フィルター、Microgon Krosflo II マイクロフィルトレーションカートリッジ）のように、ＲＢＣより十分に小さい血液溶液成分からＲＢＣを分離する孔径を持つ微孔性膜がある。同時に、濾過した等張溶液を、ダイアフィルターを横切って失われる濾液の速度（又は体積）に等しい速度で、連続的に（又は一括して）補充する。ＲＢＣ洗浄の間に、直径がＲＢＣよりかなり小さい血液溶液の成分、又は血漿のような液体成分は、ダイアフィルターの壁を通り抜けて濾液に入る。希釈された血液溶液中のＲＢＣ、血小板及びさらに大きい物体（白血球等）は保持され、連続的に又は一括して加えられる等張液と混合されて、透析血液溶液を形成する。より好ましい態様として、ある体積の濾過等張溶液をダイアフィルトレーションタンクに加えることにより、最初に、ダイアフィルトレーションタンク中の血液溶液の体積を希釈する。添加される等張溶液の体積は、血液溶液の当初の体積とほぼ等しいことが好ましい。もう１つの態様として、ＲＢＣを一連の連続（又は逆連続）希釈及び濃縮段階によって洗浄する。この場合、血液溶液は少なくとも１種類の等張溶液を加えることによって希釈され、フィルターを横切って流れることによって濃縮されて、透析血液溶液を形成する。ＲＢＣ洗浄は、ＲＢＣを汚染している血漿蛋白質のレベルが有意に減少（通常は少なくとも約９０％減少）した時に完了する。通例、ＲＢＣ洗浄は、ダイアフィルター３４から排出された濾液の体積が、血液溶液を濾過等張溶液で希釈する前にダイアフィルトレーションタンクに含まれていた血液溶液の体積の約３００％又はそれ以上に等しくなったときに完了する。さらにＲＢＣを洗浄することにより、ＲＢＣから細胞外血漿蛋白質をさらに分離することもできる。例えば、６体積の等張溶液でダイアフィルトレーションをすれば、ＩｇＧの少なくとも約９９％を血液溶液から除去することができる。次に、透析血液溶液中のＲＢＣを遠心分離などによって白血球及び血小板から分離するための手段に透析血液溶液をかける。ＲＢＣを他の血液成分から分離するための当該技術分野で広く知られている他の方法、例えば沈降分離（この分離法では、ＲＢＣが他の血液成分から分離される前に有意な量のＲＢＣの細胞膜が破壊されるということがない（例えばＲＢＣの約３０％未満））なども使用できると理解される。ＲＢＣの分離後、そのＲＢＣをＲＢＣ溶解手段によって溶解して、ＲＢＣからヘモグロビンを放出させ、ヘモグロビン含有溶液を得る。溶解手段には、例えば機械的溶解法、化学的溶解法、低浸透圧溶解法、又は酸素を輸送し放出するというＨｂの能力を有意に損なうことなくヘモグロビンを放出させるその他の既知溶解法など、様々な溶解法がある。さらなる態様として、組換え生産ヘモグロビン（例えばNature，356:258-260 （1992）に記載の組換え生産ヘモグロビンなど）を、ＲＢＣの代わりに本発明の方法で処理することもできる。ヘモグロビンを含有する細菌細胞を洗浄し、前記のように汚染物質から分離する。次に、これらの細菌細胞を当該技術分野で知られる手段（例えばボールミル）で機械的に破壊して、その細胞からヘモグロビンを放出させ、溶解細胞相を得る。次に、その溶解細胞相を溶解ＲＢＣ相と同様に処理する。溶解後、溶解ＲＢＣ相を限外濾過することによって、分子量が約１００，０００ダルトンを超える蛋白質のような大きな細胞残渣を除去する。一般に細胞残渣は、Ｈｂ、さらに小さい細胞蛋白質、電解質、補酵素及び有機代謝中間体以外の、完全な細胞成分と断片化された細胞成分の全てを含む。使用できる限外濾過器には、例えばMillipore製の１００，０００ダルトンフィルター（カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｈ１）やA/G Technology（マサチューセッツ州ニーダム）製の１００，０００ダルトンフィルター（モデル番号ＵＦＰ１００Ｅ５５）などがある。重合に利用できるヘモグロビンの収率を最大化するために、溶解ＲＢＣ相中のＨｂ濃度が８グラム／リットル（ｇ／Ｌ）未満になるまで限外濾過を続けることが好ましい。沈降分離、遠心分離又は精密濾過など、Ｈｂを溶解ＲＢＣから分離するための他の方法も使用できる。次に、そのＨｂ限外濾過液を限外濾過することによって、分子量が約３０，０００ダルトンより小さい蛋白質、代謝中間体、補酵素及び電解質などの小さな細胞残渣と水をＨｂ限外濾過液から除去することができる。好適な限外濾過器には、３０，０００ダルトン限外濾過器（Millipore カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｔ１及び/ 又はArmicon,＃５４０４３０）がある。次に、その濃縮Ｈｂ溶液を１又はそれ以上の並列クロマトグラフィーカラムに導いて、高性能液体クロマトグラフィーにより、抗体、エンドトキシン、リン脂質、酵素及びウイルスなどといった他の汚染物質からヘモグロビンをさらに分離する。好適な媒体の例には、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、疎水相互作用媒体及びアフィニティー媒体がある。好ましい態様として、クロマトグラフィーカラムは、非ヘモグロビン蛋白質からＨｂを分離するのに適した陰イオン交換媒体を含有する。好適な陰イオン交換媒体としては、例えば、ジエチルアミノエチルや４級アミノエチル基などの陽イオン性化学官能基で誘導体化されているシリカ、アルミナ、チタニアゲル、架橋デキストラン、アガロース、又はポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチル−メタクリル酸もしくはスチレンジビニルベンゼンなどの誘導体化成分がある。溶解ＲＢＣ相中に存在しそうな他の蛋白質及び汚染物質と比較してＨｂを選択的に吸着及び脱着するのに適した陰イオン交換媒体とそれに対応する溶離剤は、当該技術分野の適当な技術の一つによって容易に決定できる。より好ましい態様として、シリカゲルから陰イオン交換媒体を作るために、熱水処理によってポアサイズを拡大し、γ−グリシドキシプロピルシランにさらして活性エポキシド基を形成させ、次いでＣ₃Ｈ₇（ＣＨ₃）ＮＣ１にさらして４級アンモニウム陰イオン交換媒体を形成させるという方法を使用する。この方法は Journal of Chromatography，120：321-333（1976）に記述されており、この報文はそのまま参考文献として本明細書に組み込まれている。まず、Ｈｂ結合を促進する第１溶離剤を流し込むこと（flushing）によって、クロマトグラフィーカラムを前処理する。次に、濃Ｈｂ溶液をカラム中の媒体に注入する。濃Ｈｂ溶液を注入した後、クロマトグラフィーカラムを種々の溶離液で順次洗浄することにより、分離された精製Ｈｂ溶出液を得る。好ましい態様として、炭酸脱水酵素などの蛋白質汚染物質、リン脂質、抗体及びエンドトキシンをＨｂから分離するために、クロマトグラフィーカラム中にｐＨ勾配を使用する。異なるｐＨ値を持つ一連の緩衝液のそれぞれを順次注入することにより、クロマトグラフィーカラム中の媒体内にｐＨ勾配を作製する。それらの緩衝液は１０，０００ダルトン脱発熱原膜などによって濾過しておくことが好ましい。Ｈｂを分離するために使用する緩衝液は、Ｈｂと非ヘモグロビン汚染物質の溶出が概してｐＨに依存し、イオン強度には有意に依存しないよう、低いイオン強度を持つべきである。通例、イオン濃度が約５０ｍＭ又はそれ以下である緩衝液が、好適な低イオン強度を持つ。第１緩衝液は、濃Ｈｂ溶液をクロマトグラフィーカラム中の媒体へ輸送し、その媒体に対するＨｂの結合を促進する。次に、第２緩衝液がカラム内のｐＨを調節して、Ｈｂを媒体に結合させたまま、混入している非ヘモグロビン成分を溶出させる。次に、第３緩衝液がＨｂを溶出させる。次にそのＨｂ溶出液を集める。Ｈｂ溶出液は滅菌フィルターに通されることが好ましい。好適な滅菌フィルターには、Sartorius Sartobran ｐＨカタログ番号５２３２５０７Ｇ１ＰＨフィルターのような０．２２μｍフィルターがある。好ましい態様として、Ｈｂ溶出液の純度を保証するために、Ｈｂ溶出液の最初の３％〜４％とＨｂ溶出液の最後の３％〜４％を廃棄する。クロマトグラフィーカラムを再使用すべき場合は、次に、カラム中に残存する非ヘモグロビン蛋白質とエンドトキシンを第４緩衝液で溶出させる。好ましい態様では、第１緩衝液がトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）溶液（濃度約２０ｍＭ；ｐＨ約８．４〜約９．４）である。第２緩衝液は、第１緩衝液と第３緩衝液の混合液であり、第２緩衝液は約８．２〜約８．６のｐＨを持つ。第３緩衝液はトリス溶液（濃度約５０ｍＭ；ｐＨ約６．５〜約７．５）である。第４緩衝液はＮａＣｌ／トリス溶液（濃度約１．０ＭＮａＣｌ及び約２０ｍＭトリス；ｐＨ約８．４〜約９．４、好ましくは約８．９〜９．１）である。第２緩衝液のｐＨは約８．２と約８．４の間であることが特に好ましい。通例、使用する緩衝液の温度は約０℃〜約５０℃である。好ましくは、緩衝液の温度を使用中は約１２．４±１．０℃とする。さらに、緩衝液は通例、約９℃ 〜約１１℃の温度で保存される。次に、重合に先立って、酸素を輸送し放出するというＨｂ溶出液中のＨｂの能力を有意に減じることなく（このような減少は変性や酸化ヘモグロビン（met Ｈｂ）の生成などによって起こるだろう）Ｈｂを十分に脱酸素化する手段によって、Ｈｂ溶出液を脱酸素化し、脱酸素化Ｈｂ溶液（以下、脱酸素化−Ｈｂという）を得る。一態様として、相間膜（phasemembrane）を横切る不活性ガスのガス移動によって、Ｈｂ溶出液を脱酸素化する。そのような不活性ガスには、例えば窒素、アルゴン及びヘリウムなどがある。ヘモグロビン溶液を脱酸素化するための当該技術分野で知られる他の手段も、Ｈｂ溶出液の脱酸素化に使用できると理解される。そのような他の手段としては、例えばＨｂ溶出液の窒素散布、Ｎ−アセチル− Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システイン、亜ジチオン酸ナトリウム又はアスコルビン酸などの還元剤による化学的除去、若しくは光による光分解などを挙げることができる。この工程の効率を向上させるには、クロマトグラフィーカラムからの溶出後に、Ｈｂ溶出液を濃縮することが好ましい。Ｈｂ溶出液を限外濾過器に通して再循環させることにより、Ｈｂ溶出液は濃縮されて濃Ｈｂ溶液になる。好適な限外濾過器には、例えば３０，０００ダルトン又はそれ以下の限外濾過器（例えば、Mi llipore Helicon カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｇ１、又はAmiconカタログ番号５４０４３０）がある。通例、Ｈｂ溶出液の濃縮は、Ｈｂ濃度が約１００〜約１２０ｇ／Ｌになった時に完了する。Ｈｂ溶出液を濃縮する間は、Ｈｂ溶出液の温度を約８〜１２℃に維持することが好ましい。次に、緩衝液をＨｂ溶液（これは濃縮されていることが好ましい）に注いでＨｂ溶液のイオン強度を調節することにより、Ｈｂの脱酸素化を増進する。Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を減じるために、イオン強度を約１５０ｍｅｑ／Ｌ〜約２００ｍｅｑ／Ｌに調節することが好ましい。好適な緩衝液としては、Ｈｂ蛋白質をほとんど変性させないｐＨを持ち、かつ、Ｈｂ脱酸素化を促進しうる程度に高いイオン強度を持つ緩衝液が挙げられる。好適な緩衝液の例には、ｐＨ範囲約６．５〜約８．９の生理的食塩溶液がある。好ましい緩衝液はｐＨ約８．９の１．０ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス水溶液である。好ましくは、製造効率を向上させるために、得られた緩衝化Ｈｂ溶液を限外濾過器を通して再循環することにより、Ｈｂ溶液を再び濃縮する。好ましい態様として、Ｈｂ濃度が約１００ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌになったときに濃縮を完了する。脱酸素化中は、Ｈｂ溶液を、適当なフェイズトランスファーメンブレンを通して循環させる。適当なフェイズトランスファーメンブレンには、例えば０．０５ μｍポリプロピレン中空糸精密濾過器（例えばHoechst-Celaneseカタログ番号５ＰＣＭ−１０７）などがある。同時に、不活性ガスの向流をフェイズトランスファーメンブレンに通す。好適な不活性ガスには、例えば窒素、アルゴン及びヘリウムなどがある。これにより、フェイズトランスファーメンブレンを横切るガス交換がＨｂ溶液から酸素を取り除くことになる。脱酸素化は、Ｈｂ溶液中の酸素化Ｈｂ（オキシヘモグロビン又はＨｂＯ₂）含量が約２０％又はそれ以下になるレベルにＨｂ溶液のｐＯ₂が減少するまで続ける。好ましい態様では、Ｈｂ溶液中のＨｂＯ₂含量が、約１０％又はそれ以下である。脱酸素化中、Ｈｂ溶液の温度は、通例、脱酸素化速度をメトヘモグロビン生成速度と釣り合わせるレベルに維持される。温度は、メトヘモグロビン含量を２０％未満に制限するように維持される。最適な温度は、Ｈｂ溶液を脱酸素化しながらも、メトヘモグロビン含量を約５％未満（好ましくは約２．５％未満）にするだろう。通例、脱酸素化中は、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃に維持する。脱酸素化中と、その後の、本発明の方法の残りの段階の間は常に、Ｈｂを低酸素環境に維持することにより、Ｈｂによる酸素吸着を最小限に抑え、ＨｂＯ₂含量を約２０％未満（好ましくは約１０％未満）に維持する。次に、好ましくは、その脱酸素化Ｈｂをスルフヒドリル化合物を含有する低酸素含量貯蔵緩衝液と平衡化させることにより、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを得る。好適なスルフヒドリル化合物には、非毒性還元剤、例えばＮ−アセチル−Ｌ− システイン（ＮＡＣ）、Ｄ，Ｌ−システイン、γ−グルタミル−システイン、グルタチオン、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、１，４−ブタンジチオール、チオグリコール酸及びその他の生物適合性スルフヒドリル化合物がある。低酸素含量貯蔵緩衝液の酸素含量は、その緩衝液中のスルフヒドリル化合物の濃度を有意に減少させないほどに低く、かつ、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂ中のオキシヘモグロビン含量を約２０％又はそれ以下（好ましくは約１０％未満）に制限しうるほどに低くなければならない。通例、貯蔵緩衝液は約５０ｔｏｒｒ未満のｐＯ₂を持つ。好ましい態様として、貯蔵緩衝液はＨｂ重合とメトヘモグロビン生成を釣り合わせるのに適したｐＨ（通例、約７．６〜約７．９）を持つべきである。脱酸素化−Ｈｂと混合するスルフヒドリル化合物の量は、重合中のＨｂの分子内架橋を増大させるほどに高く、かつ、高イオン強度ゆえにＨｂ分子の分子間架橋を有意に減少させないほどに低い量である。約０．２５モル〜約５モルの脱酸素化−Ｈｂを酸化安定化するには、通例、約１モルのスルフヒドリル官能基（− ＳＨ）が必要である。好ましい態様として、貯蔵緩衝液は約２５〜３５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７〜７．８）を含有し、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度が約０．００３重量％〜約０．３重量％になるような量のＮＡＣを含有する。より好ましくは、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度を約０．０５重量％〜約０．２重量％にする。好ましくは、脱酸素化−Ｈｂとの混合に先立って、貯蔵緩衝液を、例えば１０，０００ダルトン限外濾過膜（Millipore Helicon カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｇ１又はA/G Technology Maxcellカタログ番号ＵＦＰ−１０−Ｃ−７５）などで濾過しておく。次に、一態様として、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを、任意のフィルターを通して流す。好適なフィルターには、０．２μｍポリプロピレンプレフィルター（Pa ll Proflle II カタログ番号ＡＢＩＹ００５Ｚ７）や０．２μｍ滅菌マイクロフィルター（Gelman Supor）がある。脱酸素化−Ｈｂは、実質上無酸素雰囲気下に維持される。これは、例えば、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂの充填前及び充填後に、窒素などの不活性ガスで処理装置をパージする(purging)か、覆うことによって達成できる。任意に、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを重合反応に移す前に、適当量の水を重合化リアクターに加えてもよい。一態様として、その水の適当量を、重合化リアクターに酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを加えた時に、約１０〜約１００ｇ／ＬＨｂの濃度を持つ溶液が得られるような量とする。その水は酸素欠乏状態であることが好ましい。重合段階の水のｐＯ₂が、ＨｂＯ₂含量を約２０％に制限することのできるレベル（通例、約５０ｔｏｒｒ未満）まで減少した後、重合化リアクターを窒素などの不活性ガスで覆う。次に、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを重合化リアクターに移送し、同時に不活性ガスの適当な気流で重合化リアクターを覆う。重合化リアクター中の酸化安定化脱酸素化−Ｈｂ溶液の温度を、架橋剤と接触させたときに酸化安定化脱酸素化−Ｈｂの重合が最適化されるような温度まで上げる。重合中の酸化安定化脱酸素化−Ｈｂの温度は、通例、約２５℃〜約４５℃ の温度（好ましくは約４１℃〜約４３℃）である。重合化リアクターを加熱するために使用できる熱伝導手段の例は、熱いエチレングリコールをジャケット内に注入することによって加熱するジャケット式加熱システムである。次に、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂを、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂが重合して重合化ヘモグロビン（ポリ（Ｈｂ））の溶液を形成しうるような温度で、約２時間〜約６時間、適当な架橋剤にさらす。好適な架橋剤の例には、Ｈｂ蛋白質を架橋する多官能試薬、例えばグルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、活性型のポリオキシエチレン及びデキストラン、α−ヒドロキシアルデヒド（グリコールアルデヒドなど）、Ｎ−マレイミド −６−アミノカプロイル−（２’−ニトロ，４’−スルホン酸）−フェニルエステル、ｍ−マレイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’−フェニレンジマレイミド、及びビスイミデート種、アシルジアジド種又はアリールジハライド種に属する化合物などがある。架橋剤の好適量は、分子内架橋によるＨｂの安定化と、分子間架橋によるＨｂポリマーの形成とを可能にし、それによって血管内保持時間を増大させることのできる量である。通例、架橋剤の好適量は、Ｈｂに対する架橋剤のモル比が約２：１を超える量である。Ｈｂに対する架橋剤のモル比は約２０：１〜４０：１であることが好ましい。好ましくは、約７．６〜約７．９のｐＨを持ち、約３５ｍＭかそれ以下の塩化物濃度を持つ緩衝液中で重合を行なう。好ましい態様として、適当量の架橋剤を酸化安定化脱酸素化−Ｈｂに加え、それを低剪断力の混合手段で混合する。好適な低剪断力混合手段には、静置混合機（static mixer）がある。好適な静置混合機は、例えばChemineer，Inc.製の「K enics」静置混合機である。一態様として、酸化安定化脱酸素化−Ｈｂと架橋剤を静置混合機経由で再循環させることによって、架橋剤と酸化安定化脱酸素化−Ｈｂのほぼ均一な混合を伴う乱流状態が起こり、それによって高濃度の架橋剤を含有する脱酸素化−Ｈｂのポケットが形成する可能性が減少する。架橋剤と脱酸素化−Ｈｂのほぼ均一な混合は、高分子量Ｈｂポリマー（すなわち５００，０００ダルトンを超えるポリマー）の形成を減少させると共に、重合中の架橋剤と脱酸素化−Ｈｂのより迅速な混合を可能にする。また、スルフヒドリル化合物（好ましくはＮＡＣ）の存在ゆえに、Ｈｂ重合中にかなりのＨｂ分子内架橋が起こるだろう。スルフヒドリル化合物のグルタルアルデヒド及び／又はＨｂとの相互作用に関する正確な機構はわからないが、スルフヒドリル化合物はＨｂ／架橋剤化学結合に、高分子量Ｈｂポリマーの生成を少なくとも部分的に阻害し、安定化された四量体型Ｈｂを優先的に生成させるような影響を与えると思われる。ポリ（Ｈｂ）は、Ｈｂ分子のかなりの部分（例えば少なくとも約５０％）がそのポリ（Ｈｂ）中で化学結合しており、高分子量重合化ヘモグロビン鎖内には少量（例えば１５％未満）しか含まれない場合に、有意な分子内架橋を持つと定義される。高分子量ポリ（Ｈｂ）分子とは、例えば約５００，０００ダルトンを超える分子量を持つような分子である。好ましい態様として、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する。通例、１キログラムの酸化安定化脱酸素化−Ｈｂにつき約１０〜約７０グラムのグルタルアルデヒドを使用する。より好ましくは、１キログラムの酸化安定化脱酸素化− Ｈｂにつき約２９〜３１グラムのグルタルアルデヒドを、５時間かけて加える。重合後、一般的には、重合化リアクター中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を、約１５℃〜約２５℃まで下げる。使用する架橋剤がアルデヒドでない場合、生成したポリ（Ｈｂ）は一般に安定なポリ（Ｈｂ）である。使用する架橋剤がアルデヒドである場合、生成したポリ（Ｈｂ）は、一般に、適当な還元剤と混合してそのポリ（Ｈｂ）中の不安定な結合を還元してより安定な結合にするまでは、安定でない。好適な還元剤の例には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、トリメチルアミン、ｔ−ブチルアミン、モルホリンボラン及びピリジンボランがある。還元剤の添加に先立って、ポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が約７５〜約８５ｇ／Ｌに増大するまで、限外濾過によってポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮してもよい。好適な限外濾過器の例は、３０，０００ダルトンフィルター（例えばMillip ore Helicon カタログ番号ＣＤＵＦ０５０ＬＴ及びAmiconカタログ番号５４０４３０）である。還元剤が水素化ホウ素である場合は、その還元剤を保護し、次の還元中にＨｂを変性させうる水素ガスの発生を防止するために、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨをアルカリ性ｐＨに調節する。一態様として、そのｐＨを１０以上に調節する。ｐＨは、ポリ（Ｈｂ）溶液に緩衝剤溶液を添加することによって調節することができる。ｐＨ調節後、少なくとも１種類の還元剤（好ましくは水素化ホウ素ナトリウム溶液）を、一般的には脱酸素化ループを通して重合化リアクターに加える。通例、ポリ（Ｈｂ）内のＨｂ四量体１モルにつき（Ｈｂ６４，０００ダルトンにつき）約５〜約１８モルの還元剤を加える。好ましい態様として、重合サブシステム９８中のポリ（Ｈｂ）溶液各９リットルにつき、１リットルの０．２５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液を毎分０．１〜０．１２リットルの速度で加える。このようにして得たポリ（Ｈｂ）溶液は、前記のように、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけることができる。次に、安定ポリ（Ｈｂ）を適当なｐＨと生理学的電解質レベルを持つダイアフィルトレーション溶液でダイアフィルトレーションして、安定ポリ（Ｈｂ）のｐＨと電解質を生理学的レベルに戻すことにより、安定重合化ヘモグロビン代用血液を得ることができる。このダイアフィルトレーション溶液は緩衝剤溶液であることが好ましい。ポリ（Ｈｂ）を還元剤で還元した場合、このダイアフィルトレーション溶液は酸性ｐＨ（好ましくは約４〜約６）を持つ。また、最終的な重合化ヘモグロビン代用血液の安定性を増進するために、酸素除去剤として、非毒性スルフヒドリル化合物を安定ポリ（Ｈｂ）溶液に加える。このスルフヒドリル化合物は、ダイアフィルトレーション溶液の一部として加えることができ、及び／又は、別個に加えることもできる。ある量のスルフヒドリル化合物の添加によって、貯蔵期間中メトヘモグロビン含量を約１５％未満に維持する程度に酸素を除去するスルフヒドリル濃度とする。そのスルフヒドリル化合物は、ＮＡＣであることが好ましい。通例、添加するスルフヒドリル化合物の量は、約０．０５重量％〜約０．２重量％のスルフヒドリル濃度を与えるのに十分な量である。本発明の方法によって製造される好適な安定重合化ヘモグロビン代用血液の仕様を表Ｉに記載する。ａ− 重合化前にＨｂにおいて測定次に、安定代用血液を、それぞれ低酸素環境を持つ短期間貯蔵容器又は滅菌貯蔵容器に保存する。また、貯蔵期間中の蒸発による代用血液の有意な濃縮を防止するため、貯蔵容器は、水蒸気の通過に対して十分に不透過性でなければならない。代用血液の有意な濃縮とは、代用血液の１又はそれ以上のパラメーターが仕様を超えて高くなるような濃縮をいう。好適な容器には、密閉ステンレス鋼容器と密閉ガラス容器がある。アルミニウムなどの金属フィルムの層を組み込んだ酸素遮断複合フィルムを用いて窒素雰囲気下でうわ包装されたプラスチック製貯蔵バッグ（例えばKAPAK タイプ50303; K APAK Corporation，ミネソタ州ミネアポリス）が、貯蔵容器として好ましい。これらのうわ包装バッグは、AUDIONVAC 密封装置（Audion Electro B.V.，Weesp-H olland）を用いて密封することができる。任意に、貯蔵に先立って代用血液をプレフィルター及び精密フィルターに通してもよい。０．５μｍ又はそれ以下のポリプロピレンプレフィルターと０．２μ ｍ滅菌フィルターを、それぞれプレフィルター及び精密フィルターとして使用することができる。本発明の方法に従って製造される安定重合化ヘモグロビン代用血液の合成については、さらに実施例１で説明する。本発明の方法によって製造される代用血液を受容することができる脊椎動物には、ヒト、ヒト以外の霊長類、犬、猫、ラット、馬又は羊などの哺乳動物が含まれる。また、該代用血液を受容できる脊椎動物には、胎児（胎児期の脊椎動物）、出生後の脊椎動物又は誕生時の脊椎動物が含まれる。本発明の代用血液は、脊椎動物の循環系に１又はそれ以上の注射法で代用血液を直接及び／又は間接的に注射することによって、循環系に投与することができる。直接注射法の例には、静脈内注射や動脈内注射のような血管内注射と心臓内注射がある。間接注射法の例には、腹腔内注射、代用血液がリンパ系によって循環系に輸送されるような皮下注射、トロカール又はカテーテルを用いた骨髄への注射がある。好ましくは、代用血液を静脈内に投与する。処置される脊椎動物は、代用血液の注入前、注入中及び／又は注入後に低血液量状態、正常血液量状態又は高血液量状態のいずれであってもよい。代用血液は、例えばトップローディング（top loading）のような方法や交換法で循環系に導入することができる。代用血液は、多くの異なる原因（循環系の一部又は循環系全体におけるＲＢＣ流の減少、貧血及びショックを含む）によってもたらされる脊椎動物内の低酸素症の組識を処置するために、治療的に投与することができる。また、脊椎動物内の組識の酸素欠乏（これは脊椎動物の組識に対するＲＢＣ流若しくは循環系全体のＲＢＣ流の減少が考えられる又は予測される場合に起こりうる）を防止するために、代用血液を予防的に投与することもできる。低酸素症（特に部分動脈閉塞又は微小循環系の部分閉塞によるもの）を治療的又は予防的に処置するためのヘモグロビンの投与に関するさらなる考察は、１９９５年３月２３日に出願された同時係属米国特許出願番号０８／４０９，３３７（これはそのまま参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載されている。通例、代用血液の適当な投与量又は投与量の組み合わせは、それが血漿内に含まれる時に、脊椎動物の血液中の総ヘモグロビン濃度を約０．１〜約１０グラムＨｂ／ｄ１（大量の血液損失を補う必要があるならそれ以上）にするような量である。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。これらの及び他の全てのそのような均等物は、下記請求の範囲の範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月２２日【補正内容】ヒドロキシアパタイトを用いる非重合化ヘモグロビンからの重合化ヘモグロビンの分離発明の背景血液の損失（例えば、急性出血からの又は外科手術の間）から生じる、貧血（例えば、悪性貧血又は鎌状赤血球貧血）により生じる、若しくはショック（例えば、容量欠乏ショック、アナフィラキシーショック、敗血症性ショック又はアレルギー性ショック）により生じる低酸素症を治療し、又は防止するために、代用血液が必要とされている。これらの役割のための血液及び血液画分の代用血液としての使用は、不利な点を伴っている。例えば、全血の使用は、しばしば、肝炎生産ウイルス及びＡＩＤＳ生産ウイルスの伝達のリスクをともない、それは患者を完全に回復させることができるが又患者を死亡させることもできる。さらに、全血の使用は、免疫血液学的な問題及びドナー間の不適合性を避けるために血液型及び交差試験を必要とする。代用血液としてのヒトヘモグロビンは、浸透活性並びに酸素輸送及び酸素転移の能力を有しているが、腎臓経路により及び血管壁を通して循環系から急速に排出されるという欠点を有しており、非常に短命であり、従って典型的に不十分な半減期に終わっている。さらに、また、ヒトヘモグロビンは毒性レベルのエンドトキシン、細菌及び／又はウイスルでしばしば汚染される。非ヒトヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンと同じ欠点を欠点として持っている。さらに、また、非ヒト材料由来のヘモグロビンは、典型的に抗体等の蛋白質で汚染され、そのことは受容者における免疫系応答の原因となりえる。請求の範囲１．ヒドロキシアパタイトを充填したクロマトグラフィーカラムに溶液を供給し、重合化ヘモグロビンを回収することからなる、重合化ヘモグロビン及び非重合化ヘモグロビンを含有する重合化ヘモグロビン溶液から重合化ヘモグロビンを分離する方法。２．クロマトグラフィーが高性能液体クロマトグラフィーである請求項１記載の方法。３．ヘモグロビン溶液を重合化し、それによって重合化ヘモグロビン及び非重合化ヘモグロビンを含有する重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程をさらに有する請求項２記載の方法。４．重合化を架橋剤の存在下で行なう請求項３記載の方法。５．架橋剤がジアルデヒドである請求項４記載の方法。６．ジアルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項５記載の方法。７．さらに以下の工程を有する、架橋剤がジアルデヒドであり、重合化ヘモグロビン溶液が不安定基を含有する請求項５記載の方法、ａ）重合化ヘモグロビン溶液をアルカリ性溶液と接触させる工程であって、それにより重合化ヘモグロビン溶液を塩基性化する工程、及びｂ）塩基性化した重合化ヘモグロビン溶液を還元剤と接触させる工程であって、それにより不安定結合を還元し、それにより安定重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程。８．該還元剤が水素化ホウ素ナトリウムを含有する請求項７記載の方法。９．低酸素環境下で工程を維持する工程をさらに有する請求項３記載の方法。１０．血液がヒト血液、ウシ血液、霊長類血液、ヒツジ血液、ブタ血液及び遺伝子導入法で生産した血液からなる群より選ばれる請求項２記載の方法。１１．以下の工程を有する、ヒト又は他の脊椎動物に投与することができる安定重合化ヘモグロビン代用血液の製造方法、ａ）哺乳類血液を抗凝固剤と混合して、血液溶液を調製する工程、ｂ）血液溶液を等張溶液で希釈する工程、ｃ）該希釈血液溶液を濾過して、赤血球からより小さい血漿成分を分離する工程、ｄ）該濾過した血液溶液を遠心して、赤血球から白血球を分離する工程、ｅ）表面に赤血球を導入し、赤血球の少なくとも一部分の細胞膜を破壊してヘモグロビン溶液を調製する工程、ｆ）ヘモグロビン溶液を限外濾過して、ヘモグロビン溶液から大きい細胞残渣を取り除く工程、ｇ）ヘモグロビン溶液を限外濾過して、ヘモグロビン溶液から小さい細胞残渣を取り除く工程、ｈ）ｐＨ勾配溶出液及びヘモグロビンからエンドトキシンのイオン交換親和性分離のためのパッキングを用いた高性能液体クロマトグラフィーにより、クロマトグラフィー的に該濾過したヘモグロビン溶液を処理し、ヘモグロビン溶出液を調製する工程、ｉ）該ヘモグロビン溶出液を脱酸素化し、脱酸素化ヘモグロビン溶液を調製する工程、ｊ）該脱酸素化ヘモグロビン溶液をスルフヒドリル化合物と混合し、酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を調製する工程、ｋ）該酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を架橋剤と混合し、重合化反応混合物を調製する工程、ｌ）重合化反応混合物を重合化し、それにより重合化ヘモグロビン溶液を調製する方法、ｍ）重合化ヘモグロビン溶液をアルカリ性溶液と接触させ、それにより、重合化ヘモグロビン溶液を塩基性化する工程、ｎ）塩基性化した重合化ヘモグロビン溶液を水素化ホウ素ナトリウムと接触させ、それによって不安定結合を還元し、それにより安定な重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程、及びｏ）混合物をヒドロキシアパタイトＨＰＬＣカラムと接触させ、それにより該安定重合化ヘモグロビン代用血液を調製する工程。１２．請求項１に記載の方法により調製された安定重合化ヘモグロビン代用血液。１３．請求項１２に記載の方法により調製された安定重合化ヘモグロビン代用血液。１４．ヘモグロビンがヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、霊長類ヘモグロビン、ヒツジヘモグロビン、ブタヘモグロビン、及び遺伝子導入法で生産されたヘモグロビン及び組換え的に生産されたヘモグロビンからなる群より選ばれる、請求項１３記載の代用血液。１５．請求項１記載の方法により調製された安定重合化ヘモグロビン代用血液の有効量を脊椎動物の循環系に導入する工程からなる、対象となる脊椎動物の組織内の組織酸素化を増加させる方法。１６．深刻な副作用なしに、ヒトの循環系に重合化ヘモグロビンを導入する工程からなる、ヒト組織内で組織酸素化を増加させる方法であって、ヘモグロビン代用血液が請求項１記載の方法により調製される、組織酸素化の増加方法。１７．該ヘモグロビンがウシ血液由来である請求項１６記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒドロキシアパタイトを充填したクロマトグラフィーカラムに溶液を供給し、重合化ヘモグロビンを回収することからなる、重合化ヘモグロビン及び非重合化ヘモグロビンを含有する重合化ヘモグロビン溶液から重合化ヘモグロビンを分離する方法。２．クロマトグラフィーが高性能液体クロマトグラフィーである請求項１記載の方法。３．実質的に純粋なヘモグロビン溶液を重合化し、それによって重合化ヘモグロビン及び非重合化ヘモグロビンを含有する重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程をさらに有する請求項２記載の方法。４．重合化を架橋剤の存在下で行なう請求項３記載の方法。５．架橋剤がジアルデヒドである請求項４記載の方法。６．ジアルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項５記載の方法。７．さらに以下の工程を有する、架橋剤がジアルデヒドであり、重合化ヘモグロビン溶液が不安定基を含有する請求項５記載の方法、ａ）重合化ヘモグロビン溶液をアルカリ性溶液と接触させる工程であって、それにより重合化ヘモグロビン溶液を塩基性化する工程、及びｂ）塩基性化した重合化ヘモグロビン溶液を還元剤と接触させる工程であって、それにより不安定結合を還元し、それにより安定重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程。８．該還元剤が水素化ホウ素ナトリウムを含有する請求項７記載の方法。９．低酸素環境下で工程を維持する工程をさらに有する請求項３記載の方法。１０．該実質的に純粋な重合化ヘモグロビン代用血液が超純粋である請求項２記載の方法。１１．血液がヒト血液、ウシ血液、霊長類血液、ヒツジ血液、ブタ血液及び遺伝子導入法で生産した血液からなる群より選ばれる請求項２記載の方法。１２．以下の工程を有する、ヒト又は他の脊椎動物に投与することができる超純粋安定重合化ヘモグロビン代用血液の製造方法、ａ）哺乳類血液を抗凝固剤と混合して、血液溶液を調製する工程、ｂ）血液溶液を等張溶液で希釈する工程、ｃ）該希釈血液溶液を濾過して、赤血球からより小さい血漿成分を分離する工程、ｄ）該濾過した血液溶液を遠心して、赤血球から白血球を分離する工程、ｅ）表面に赤血球を導入し、赤血球の少なくとも一部分の細胞膜を破壊してヘモグロビン溶液を調製する工程、ｆ）ヘモグロビン溶液を限外濾過して、ヘモグロビン溶液から大きい細胞残渣を取り除く工程、ｇ）ヘモグロビン溶液を限外濾過して、ヘモグロビン溶液から小さい細胞残渣を取り除く工程、ｈ）ｐＨ勾配溶出液及びヘモグロビンからエンドトキシンのイオン交換親和性分離のためのパッキングを用いた高性能液体クロマトグラフィーにより、クロマトグラフィー的に該濾過したヘモグロビン溶液を処理し、超純粋ヘモグロビン溶出液を調製する工程、ｉ）該超純粋ヘモグロビン溶出液を脱酸素化し、脱酸素化ヘモグロビン溶液を調製する工程、ｊ）該脱酸素化ヘモグロビン溶液をスルフヒドリル化合物と混合し、酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を調製する工程、ｋ）該酸化安定化脱酸素化ヘモグロビン溶液を架橋剤と混合し、重合化反応混合物を調製する工程、ｌ）重合化反応混合物を重合化し、それにより重合化ヘモグロビン溶液を調製する方法、ｍ）重合化ヘモグロビン溶液をアルカリ性溶液と接触させ、それにより、重合化ヘモグロビン溶液を塩基性化する工程、ｎ）塩基性化した重合化ヘモグロビン溶液を水素化ホウ素ナトリウムと接触させ、それによって不安定結合を還元し、それにより安定な重合化ヘモグロビン溶液を調製する工程、及びｏ）混合物をヒドロキシアパタイトＨＰＬＣカラムと接触させ、それにより該超純粋安定重合化ヘモグロビン代用血液を調製する工程。１３．請求項１に記載の方法により調製された安定重合化ヘモグロビン代用血液。１４．請求項１２に記載の方法により調製された安定超純粋重合化ヘモグロビン代用血液。１５．ヘモグロビンがヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、霊長類ヘモグロビン、ヒツジヘモグロビン、ブタヘモグロビン、及び遺伝子導入法で生産されたヘモグロビン及び組換え的に生産されたヘモグロビンからなる群より選ばれる、請求項１４記載の代用血液。１６．請求項１記載の方法により調製された安定重合化ヘモグロビン代用血液の有効量を脊椎動物の循環系に導入する工程からなる、対象となる脊椎動物の組織内の組織酸素化を増加させる方法。１７．深刻な副作用なしに、ヒトの循環系に重合化ヘモグロビンを導入する工程からなる、ヒト組織内で組織酸素化を増加させる方法であって、ヘモグロビン代用血液が請求項１記載の方法により調製される、組織酸素化の増加方法。１８．該ヘモグロビンがウシ血液由来である請求項１７記載の方法。