ES2278450T3 - Procedimiento para purificar hemoglobina. - Google Patents
Procedimiento para purificar hemoglobina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2278450T3 ES2278450T3 ES99930467T ES99930467T ES2278450T3 ES 2278450 T3 ES2278450 T3 ES 2278450T3 ES 99930467 T ES99930467 T ES 99930467T ES 99930467 T ES99930467 T ES 99930467T ES 2278450 T3 ES2278450 T3 ES 2278450T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- solution
- blood
- column
- hemoglobin
- approximately
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B15/00—Layered products comprising a layer of metal
- B32B15/04—Layered products comprising a layer of metal comprising metal as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material
- B32B15/08—Layered products comprising a layer of metal comprising metal as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material of synthetic resin
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
- B32B27/06—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material
- B32B27/08—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material of synthetic resin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61J—CONTAINERS SPECIALLY ADAPTED FOR MEDICAL OR PHARMACEUTICAL PURPOSES; DEVICES OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR BRINGING PHARMACEUTICAL PRODUCTS INTO PARTICULAR PHYSICAL OR ADMINISTERING FORMS; DEVICES FOR ADMINISTERING FOOD OR MEDICINES ORALLY; BABY COMFORTERS; DEVICES FOR RECEIVING SPITTLE
- A61J1/00—Containers specially adapted for medical or pharmaceutical purposes
- A61J1/05—Containers specially adapted for medical or pharmaceutical purposes for collecting, storing or administering blood, plasma or medical fluids ; Infusion or perfusion containers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un procedimiento para producir un producto de hemoglobina purificada, que comprende las etapas de: (a) introducir una solución de hemoglobina en una columna de cromatografía de intercambio aniónico; e (b) inyectar al menos una solución de tampón de acetato de tris(hidroximetil) aminometano en la columna, teniendo dicha solución tampón un pH inferior al de la columna, con lo cual se eluye de la columna un producto de hemoglobina purificada.
Description
Procedimiento para purificar hemoglobina.
Existe una necesidad de un sustituto de la
sangre para tratar o prevenir la hipoxia resultante de la pérdida
de sangre (por ejemplo, de hemorragia aguda o durante operaciones
quirúrgicas), resultante de la anemia (por ejemplo, anemia
perniciosa o anemia de las células falciformes), o resultante de un
choque (por ejemplo, choque de deficiencia volumétrica, choque
anafiláctico, choque séptico, o choque alérgico). El uso de la
sangre y de fracciones de la sangre como en calidad de sustituto de
la sangre está cargado de desventajas. Por ejemplo, el uso de
sangre total a menudo está acompañado por el riesgo de transmisión
de virus que producen hepatitis y virus que producen SIDA que
pueden complicar la recuperación del paciente o dar como resultado
muerte de los pacientes. Adicionalmente, el uso de sangre total,
requiere el tipificado de la sangre y el emparejamiento cruzado
para evitar problemas inmunohematológicos e incompatibilidad entre
donantes.
La hemoglobina humana, como sustituto de la
sangre, posee actividad osmótica y la capacidad de transportar y
transferir oxígeno, pero tiene la desventaja de la eliminación
rápida de la circulación mediante la vía renal y a través de las
paredes vasculares, dando como resultado una
semi-vida muy corta, y por lo tanto, típicamente
insatisfactoria. Además, la hemoglobina humana también se combina
frecuentemente con niveles tóxicos de endotoxinas, bacterias y/o
virus.
La hemoglobina no humana sufre las mismas
deficiencias que la hemoglobina humana. Además, la hemoglobina de
fuentes no humanas también está contaminada típicamente con
proteínas, tales como anticuerpos, que podrían causar una respuesta
del sistema inmune en el receptor.
Anteriormente, se han utilizado al menos cuatro
tipos diferentes de sustitutos de la sangre, incluyendo productos
químicos perfluorados, análogos sintetizados de hemoglobina,
hemoglobina encapsulada en liposomas, y hemoglobina modificada
químicamente. Sin embargo, muchos de estos sustitutos de la sangre
han tenido típicamente tiempos de retención intravascular cortos,
eliminándose por el sistema circulatorio como sustancias extrañas o
alojándose en el hígado, bazo, y otros tejidos. Además, muchos de
estos sustitutos de la sangre han sido biológicamente incompatibles
con los sistemas vivos.
La invención se refiere a un procedimiento para
producir un producto de hemoglobina purificada de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 10.
De acuerdo con la presente invención, el
procedimiento incluye introducir una solución de hemoglobina en una
columna de cromatografía de intercambio aniónico. Se inyecta al
menos una solución tampón de tris(hidroximetil) aminometano
acetona en la columna, teniendo la solución tampón un pH inferior
que el de la columna, con lo cual se eluye de la columna un
producto de hemoglobina purificada.
En una realización preferida, la solución de
hemoglobina se introduce en una columna de intercambio aniónico,
equilibrándose inicialmente la columna a un pH mayor de
aproximadamente 8,7. Después se inyecta al menos una solución
tampón en la columna, teniendo la solución tampón un pH que es
inferior a aproximadamente 8,6, con lo cual se eluye de la columna
el producto de hemoglobina purificada.
Otra realización preferida más incluye
introducir la solución de hemoglobina en una columna de
cromatografía de intercambio aniónico. Al menos once volúmenes
vacíos de columna de solución de tampón de equilibrado, que tiene
un pH en el intervalo de entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente
8,6, se inyectan después en la columna. Después se inyecta en la
columna una solución tampón que tiene un pH inferior al de la
solución tampón de equilibrado, con lo cual se eluye de la columna
un producto de hemoglobina purificada.
En otra realización preferida más, la solución
de hemoglobina se introduce en una columna de cromatografía de
intercambio aniónico que se ha calibrado inicialmente a un pH mayor
de aproximadamente 8,7. Después se introducen en la columna al
menos once volúmenes vacíos de columna de una solución tampón de
equilibrado de acetato de tris(hidroximetil) aminometano,
que tiene un pH en un intervalo de entre aproximadamente 8,2 y
aproximadamente 8,6. Después se inyecta en la columna una solución
tampón de acetato de tris(hidroximetil) aminoetano, que
tiene un pH inferior a aproximadamente 8,2, con lo cual se eluye de
la columna la solución de hemoglobina purificada.
El procedimiento de esta invención consigue
ventajosamente un producto de hemoglobina que está sustancialmente
libre de materiales proteicos recalcitrantes tales como anhidrasa
carbónica. El procedimiento también puede obtener un rendimiento
relativamente alto de hemoglobina de una solución que incluye muchos
contaminantes. Por tanto, la hemoglobina obtenida de una especie
puede usarse con éxito en diferentes especies como sustituto de la
sangre sin que las especies receptoras sufran efectos secundarios
significativos.
Las características y otros detalles del
procedimiento de la invención se describirán ahora más
particularmente con referencia a los dibujos acompañantes y
señaladas en las reivindicaciones. Se entenderá que las
realizaciones particulares de la invención se muestran a modo de
ilustración y no como limitaciones de la invención. Las principales
características de la invención pueden emplearse en diversas
realizaciones sin alejarse del alcance de la presente
invención.
La invención se refiere a un procedimiento para
producir un producto de hemoglobina purificada sustancialmente
libre de otros componentes proteicos de la sangre y de
contaminantes, que emplea una columna cromatográfica. El
procedimiento se caracteriza por el uso de un gradiente de pH para
eluir el componente de hemoglobina.
La solución de Hb concentrada obtenida de la
disrupción, fraccionamiento y/o ultrafiltración de glóbulos rojos,
se introduce en una o más columnas cromatográficas paralelas para
separar adicionalmente la hemoglobina mediante cromatografía de
líquidos de alta resolución de otros contaminantes tales como
anticuerpos, endotoxinas, fosfolípidos, enzimas (tales como
anhidrasa carbónica), virus y agentes de encefalopatía espongiforme
transmisibles. La columna cromatográfica contiene un medio de
intercambio aniónico adecuado para separar Hb de proteínas no
hemoglobina. Los medios de intercambio aniónico adecuados incluyen,
por ejemplo, gel de sílice, alúmina, titanio, dextrano reticulado,
agarosa o un resto derivatizado, tal como poliacrilamida, un
polihidroxietil-metacrilato, o un estiren
divinilbenceno, que se han derivatizado con una función química
catiónica, tal como un grupo dietilaminoetilo o aminoetilo
cuaternario. Un medio de intercambio aniónico adecuado y los
eluyentes correspondientes para la absorción selectiva y la
desorción de Hb en comparación con otras proteínas y contaminantes,
que es probable que estén en una fase RBC lisada, se determinan
fácilmente por un especialista en la técnica.
En una realización más preferida, se usa un
procedimiento para formar un medio de intercambio aniónico a partir
de gel de sílice que se trata hidrotérmicamente para aumentar el
tamaño de poro, se expone a \gamma-glicidoxi
propilsilano para formar grupos epóxido activos y después se expone
a C_{3}H_{7}(CH_{3})_{2}NCl para formar un
medio de intercambio aniónico de amonio cuaternario. Este
procedimiento se describe en el Journal of Chromatography,
120: 321-333 (1976), que se incorpora en este
documento como referencia en su totalidad. En una realización, la
columna o columnas cromatográficas, se equilibran primero a un pH
mayor de aproximadamente 8,7. Preferiblemente, la columna
cromatográfica se equilibra a un pH en un intervalo de entre
aproximadamente 8,7 y aproximadamente 10,0. En una realización
particularmente preferida, el pH de equilibrado está en un
intervalo de entre aproximadamente 8,7 y aproximadamente 9,3 y, lo
más preferiblemente, en un intervalo de entre aproximadamente 8,9 y
aproximadamente 9,1. Preferiblemente, el tampón empleado para
equilibrar inicialmente la columna es acetato de
tris(hidroximetil) aminometano
(Tris-acetato), y tiene una concentración de
aproximadamente 20 mmoles/litro (mM/l).
La solución de hemoglobina que, preferiblemente,
se ha dializado contra agua purificada (U.S.P.), y, también
preferiblemente, tiene una conductividad de aproximadamente 280
\muS/cm y un pH entre aproximadamente 6,75 y aproximadamente
7,75, se inyecta después en el medio en la columna para cargar la
columna de este modo con hemoglobina. La concentración de solución
de hemoglobina que se introduce en la columna tiene típicamente una
concentración en un intervalo de entre aproximadamente 90 y
aproximadamente 200 gramos/litro. Preferiblemente, la concentración
de la solución de hemoglobina está en un intervalo de entre
aproximadamente 90 y aproximadamente 110 gramo/litro.
Preferiblemente, después de inyectar la solución de Hb concentrada,
la columna cromatográfica se lava durante aproximadamente 10
minutos (4 volúmenes vacíos de columna) con el
Tris-acetato para eluir los componentes no de
hemoglobina que no se unen a los medios, y para facilitar la unión
fuerte de la hemoglobina a los medios.
Se usa un gradiente de pH en la columna
cromatográfica para separar contaminantes de proteína, tales como
la enzima anhidrasa carbónica, fosfolípidos, anticuerpos, y
endotoxinas, de la Hb. El gradiente de pH puede ser un gradiente
continuo o un gradiente por etapas. Se inyectan secuencialmente
soluciones tampón que tienen diferentes valores de pH en la
columna, para crear un gradiente de pH del eluato en el tiempo. Se
prefiere que los tampones se filtren antes de la inyección, tal
como con una membrana de despirogenación de 10.000 Dalton. Las
soluciones tampón deben ser de tampones monovalentes que tengan una
fuerza iónica baja de modo que la elución de Hb y contaminantes no
de hemoglobina depende generalmente del pH y no depende
significativamente de la fuerza iónica. Típicamente, los tampones
con una concentración iónica de aproximadamente 50 mM, o menos,
tienen fuerzas iónicas bajas adecuadas.
Preferiblemente los contaminantes y la
hemoglobina de la solución de hemoglobina se separan mediante
elución de la columna en un gradiente por etapas, con lo cual se
emplea un tampón que tiene un pH entre aquel al que la hemoglobina
se introduce en la columna y un pH final, al que la hemoglobina se
eluye la columna. En una realización, el gradiente por etapas
incluye inyectar una solución tampón adecuada en la columna. La
solución tampón tiene un pH inferior al pH de la columna en el
momento en que la columna se cargó inicialmente con hemoglobina. La
columna se equilibra con la solución tampón. Preferiblemente, se
inyectan al menos aproximadamente seis volúmenes de columna de la
solución tampón en la columna. Un "volumen de columna", como se
define en este documento, es el volumen de la columna, sin incluir
ningún material de relleno. Típicamente, los rellenos de columna
adecuados, es decir medios de intercambio, para uso con la presente
invención, causan que la columna tenga una fracción vacía de
aproximadamente 0,525 del volumen total de la columna. Seis
volúmenes de columna, por lo tanto, es equivalente a
aproximadamente 11,7 "volúmenes vacíos de columna".
Generalmente, se inyectan al menos aproximadamente 11 volúmenes
vacíos de columna de solución de tampón en la columna.
Preferiblemente, el pH de la solución tampón es
inferior a aproximadamente 8,6. Más preferiblemente, el pH de la
solución tampón está en un intervalo de entre aproximadamente 8,2 y
aproximadamente 8,4. En una realización especialmente preferida, la
solución tampón es acetato de tris(hidroximetil) aminometano
(Tris-acetato). Los contaminantes de la solución de
hemoglobina se eluyen de la columna equilibrando la columna de esta
manera.
En lo sucesivo, se inyecta un tampón en la
columna para eluir hemoglobina. Preferiblemente, la solución de
tampón es de acetato de tris(hidroximetil) aminometano. Más
preferiblemente, la solución de Tris-acetato tiene
un pH en un intervalo de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente
7,5. El eluato de hemoglobina es el producto de hemoglobina
purificada.
En una realización preferida los primeros 3% a
4% del eluato de hemoglobina y los últimos 3%-4% del eluato de
hemoglobina se desechan para proporcionar la seguridad de la pureza
del eluato de Hb. Se prefiere que el eluato de Hb se pase a través
de un filtro estéril. Los filtros estériles adecuados incluyen
filtros de 0,22 \mum, tales como un filtro de Sartorius Sartobran
Nº de Catálogo 5232507 G1PH.
Donde las columnas cromatográficas deben usarse
de nuevo, los contaminantes de proteínas no hemoglobina y
endotoxinas que permanecen en las columnas se eluyen después
mediante un cuarto tampón. Un ejemplos de una solución tampón
adecuada es una solución de NaCl/Tris-acetato
(concentración de NaCl aproximadamente 1,0 M y
Tris-acetato aproximadamente 20 mM; pH de
aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4, preferiblemente
aproximadamente 8,9-9,1). En una realización más
preferida, todas las soluciones tampón son de acetato de
tris(hidroximetil) aminometano. Típicamente, las soluciones
tampón usadas están a una temperatura de un intervalo entre
aproximadamente 0ºC y aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la
temperatura del tampón es de aproximadamente
12,4 \pm 1,0ºC durante el uso. Además, los tampones se almacenan típicamente a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 9ºC y aproximadamente 11ºC.
12,4 \pm 1,0ºC durante el uso. Además, los tampones se almacenan típicamente a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 9ºC y aproximadamente 11ºC.
Como se define en este documento, un sustituto
de la sangre es una composición que lleva oxígeno basada en
hemoglobina para uso en seres humanos, mamíferos, y otros
vertebrados, que es capaz de transportar y transferir oxígeno a
órganos y tejidos vitales, al menos, y puede mantener una presión
oncótica intravascular suficiente. Un vertebrado es como se ha
definido clásicamente, incluyendo seres humanos, o cualquier otro
animal vertebrado que usa sangre en un sistema circulatorio para
transferir oxígeno al tejido. Adicionalmente, la definición de
sistema circulatorio es como se ha definido clásicamente, estando
constituido por el corazón, arterias, venas, y la microcirculación
incluyendo estructuras vasculares más pequeñas tales como
capilares.
Un sustituto de la sangre, formado mediante el
procedimiento de la invención, se prepara preferiblemente de
acuerdo con una realización de la invención y debe tener niveles de
endotoxinas, fosfolípidos, proteínas extrañas y otros contaminantes
que no provocarán una respuesta del sistema inmune significativa y
que no son tóxicos para el receptor. Preferiblemente, un sustituto
de la sangre es ultrapuro. "Ultrapuro" como se define en este
documento, significa que contiene menos de 0,5 EU/ml de endotoxina,
menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos y niveles pequeños a no
detectables de proteínas no hemoglobina, tales como albúmina del
suero o anticuerpos.
El término "endotoxina" se refiere a los
lipopolisacáridos unidos a la célula, producidos como parte de la
capa externa de las paredes celulares de bacterias gram negativas,
que en muchas condiciones son tóxicas. Cuando se inyectan a
animales, las endotoxinas pueden causar fiebre, diarrea, choque
hemorrágico, y otro daño tisular. La unidad de endotoxinas (EU) se
ha definido por la United States Pharmacopeial Convention de 1983,
página 3014, como la actividad contenida en 0,1 nanogramos del lote
de referencia patrón de los Estados Unidos EC-5. Un
vial de
EC-5 contiene 10.000 EU. Los ejemplos de medios adecuados para determinar las concentraciones de endotoxinas en un sustituto de la sangre incluyen el procedimiento "Kinetic/Turbidimetric Limmus Amebocytic Lystate (LAL) 5000 Methodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts.
EC-5 contiene 10.000 EU. Los ejemplos de medios adecuados para determinar las concentraciones de endotoxinas en un sustituto de la sangre incluyen el procedimiento "Kinetic/Turbidimetric Limmus Amebocytic Lystate (LAL) 5000 Methodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts.
"Hemoglobina polimerizada estable", como se
define en este documento, es una composición que transporta oxígeno
basada en hemoglobina que no aumenta o disminuye sustancialmente en
distribución de peso molecular y/o en contenido de metahemoglobina
durante periodos de almacenamiento a temperaturas de almacenamiento
adecuadas durante periodos de dos años o más, y preferiblemente
durante periodos de dos años o más, cuando se almacena en un
ambiente bajo en oxígeno. Las temperaturas de almacenamientos
adecuadas para almacenamiento de un año o más están entre
aproximadamente 0º y aproximadamente 40ºC. El intervalo de
temperatura de almacenamiento preferido está entre aproximadamente
0ºC y aproximadamente 25ºC.
Un entorno bajo en oxígeno adecuado, o un
entorno que esté sustancialmente libre de oxígeno, se define como
la cantidad de oxígeno acumulativa en contacto con el sustituto de
la sangre, durante un periodo de almacenamiento de al menos
aproximadamente 2 meses, preferiblemente al menos aproximadamente un
año, o más preferiblemente al menos aproximadamente dos años que
dará como resultado la concentración de metahemoglobina de menos de
aproximadamente el 15% en peso en el sustituto de la sangre. La
cantidad acumulativa de oxígeno incluye la filtración de oxígeno
hacia el interior del envase del sustituto de la sangre y el
contenido de oxígeno original del envase y del sustituto de la
sangre.
Durante todo este procedimiento, desde la
recogida de glóbulos rojos (RBC) hasta la polimerización de la
hemoglobina, la solución sanguínea, los RBC y la hemoglobina se
mantienen en condiciones suficientes para minimizar el crecimiento
microbiano, o la carga biológica, tal como mantener la temperatura a
menos de aproximadamente 20ºC y por encima de 0ºC. Preferiblemente,
la temperatura se mantiene a una temperatura de aproximadamente
15ºC o menos. Más preferiblemente, la temperatura se mantiene a 10
\pm 2ºC.
En este procedimiento, las porciones de los
componentes para el procedimiento para preparar un sustituto de la
sangre de hemoglobina polimerizada estable se desinfectan
suficientemente para producir un producto estéril. Estéril es como
se define en la técnica, específicamente, que la solución satisface
los requisitos de la United States Pharmacopeia para esterilidad
proporcionada en el documento USP XXII, Sección 71, páginas
1483-1488. Además, las porciones de componentes que
están expuestos a la cadena del procedimiento, se fabrican o
revisten normalmente con un material que no reaccionará o no
contaminará la cadena del procedimiento. Dichos materiales pueden
incluir acero inoxidable y otras aleaciones de acero, tales como
Inconel.
Las fuentes de RBC adecuadas incluyen sangre
humana, sangre bovina, sangre ovina, sangre porcina, sangre de
otros vertebrados y hemoglobina producida de forma transgénica, tal
como la Hb transgénica descrita en el documento
BIO/TECNOLOGY, 12; 55-59 (1994).
La sangre puede recogerse de donantes vivos o
recién sacrificados. Un procedimiento para recoger sangre total
bovina se describe en las Patentes de Estados Unidos 5.084.558 y
5.296.465, expedidas por Rausch y col. Se prefiere que la sangre se
recoja de manera sanitaria.
En o inmediatamente después de la recogida, la
sangre se mezcla con al menos un anticoagulante para prevenir la
coagulación significativa de la sangre. Los anticoagulantes
adecuados para la sangre se conocen clásicamente en la técnica e
incluyen, por ejemplo, citrato sódico, ácido
etilendiaminotetraacético y heparina. Cuando se mezcla con la
sangre, el anticoagulante puede estar en forma sólida, tal como un
polvo o en solución acuosa.
Se entiende que la fuente de solución sanguínea,
puede ser de una muestra recién recogida o de una muestra antigua,
tal como una sangre humana expedida de un banco sanguíneo. Además,
la solución sanguínea pudo haberse mantenido previamente en estado
congelado y/o líquido. Se prefiere que la solución sanguínea no se
congele antes de su uso en este procedimiento.
En otra realización, antes de presentar la
solución sanguínea a los anticoagulantes, se ensayan los niveles de
antibióticos, tales como penicilina, en la solución sanguínea. Los
niveles de antibiótico se determinan para proporcionar un grado de
seguridad de que la muestra sanguínea no está cargada con un
organismo infeccioso verificando que el donante de la muestra
sanguínea no estaba siendo tratado con un antibiótico. Los ejemplos
de ensayos adecuados para antibióticos incluyen un kit de ensayo de
penicilina (Difco, Detroit, MI) que emplea un procedimiento
titulado "Detección Rápida de Penicilina en la Leche". Se
prefiere que las soluciones sanguíneas contengan un nivel de
penicilina de menos de o igual a aproximadamente 0,008 unidades/ml.
Como alternativa, puede usarse un programa de gestión de manada
para controlar la falta de enfermedad en o el tratamiento con
antibióticos, del ganado.
Preferiblemente, la solución sanguínea se pasa a
través de un tamiz antes o durante la etapa de anticoagulado, por
ejemplo, pasándolo por un tamiz para eliminar grandes agregados y
partículas. Un tamiz de malla de 600 es un ejemplo de un tamiz
adecuado.
Los RBC en la solución sanguínea se lavan
después mediante medios adecuados tales como diafiltración o
mediante una combinación de dilución única y etapas de
concentración con al menos una solución, tal como una solución
isotónica, para separar RBC de proteínas del plasma extracelular,
tales como albúminas del suero o anticuerpos (por ejemplo,
inmunoglobulina IgG)). Se entiende que los RBC pueden lavarse en un
baño en modo de introducción continua.
Las soluciones isotónicas aceptables son como se
conocen en la técnica e incluyen soluciones tales como solución de
citrato/solución salina, que tiene un pH y una osmolaridad que no
rompe las membranas celulares de los RBC y que desplaza la porción
de plasma de la sangre total. Una solución isotónica preferida tiene
un pH neutro y una osmolaridad de entre aproximadamente
285-315 mOsm. En una realización, preferida, la
solución isotónica está constituida por una solución acuosa de
dihidrato de citrato sódico (6,0 g/l) y de cloruro sódico (8,0
g/l).
El agua que puede usarse en el procedimiento de
la invención incluye agua destilada, agua desionizada, agua para
inyección (WFI) y/o agua baja en pirógenos (LPW). La WFI que se
prefiere, es agua desionizada, destilada que satisface las
especificaciones farmacológicas de los Estados Unidos para agua para
inyección. La WFI se describe adicionalmente en el documento
Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991).
La LPW que se prefiere, es agua desionizada que contiene menos de
0,002 EU/ml.
Se prefiere que la solución isotónica se filtre
antes de añadirse a la solución sanguínea. Los ejemplos de filtros
adecuados incluyen una membrana de ultrafiltración de Millipore de
10.000 Dalton tal como un filtro Millipore Nº de Catálogo CDUF 050
G1 o una fibra hueca de A/G Technology de 10.000 Dalton (Nº de
catálogo
UFP-10-C-85).
En una realización preferida, los RBC en las
soluciones sanguíneas se lavan mediante diafiltración. Los
diafiltros adecuados incluyen membranas microporosas con tamaños de
poro que separan RBC de componentes de la solución sanguínea
sustancialmente más pequeños, tales como un filtro de 0,1 \mum a
0,5 \mum (por ejemplo, un filtro de fibra hueca de 0,2 \mum,
cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II). Simultáneamente,
se añade de forma continua (o en lotes) solución isotónica
filtrada, como ajuste, a una tasa igual a la tasa (o volumen) del
filtrado que se pierde a través del diafiltro. Durante el lavado de
RBC, los componentes de la solución sanguínea que son de diámetro
significativamente más pequeño que los RBC, o son líquidos tales
como el plasma, pasan a través de las paredes del diafiltro en el
filtrado. Los RBC, plaquetas y cuerpos mayores de la solución
sanguínea diluida, tales como glóbulos blancos se retienen y se
mezclan con la solución isotónica, que se añade forma continua o
por lotes para formar una solución sanguínea dializada.
En una realización más preferida, el volumen de
solución sanguínea en el tanque diafiltración se diluye inicialmente
mediante la adición de un volumen de una solución isotónica
filtrada al tanque de diafiltración. Preferiblemente, el volumen de
solución isotónica añadido es de aproximadamente igual al volumen
inicial de la solución sanguínea.
En una realización alternativa, los RBC se lavan
a través de una serie de etapas de dilución y concentración
secuenciales o (secuenciales inversas), en las que la solución
sanguínea se diluye añadiendo al menos una solución isotónica, y se
concentra fluyendo a través de un filtro, formando de este modo una
solución sanguínea dializada.
El lavado de RBC se completa cuando el nivel de
proteínas en el plasma que contaminan los RBC se ha reducido
sustancialmente (típicamente al menos aproximadamente el 90%).
Típicamente, el lavado de RBC se completa cuando el volumen de
filtrado drenado del diafiltro 34 iguala aproximadamente el 300%, o
más, del volumen de solución sanguínea contenido en el tanque de
diafiltración antes de diluir la solución sanguínea con solución
isotónica filtrada. Un lavado adicional de RBC puede separar
adicionalmente proteínas del plasma extracelular de los RBC. Por
ejemplo, la diafiltración con 6 volúmenes de solución isotónica
puede eliminar al menos aproximadamente el 99% de IgG de la
solución sanguínea.
La solución sanguínea dializada se expone
después a medios para separar los RBC en la solución sanguínea
dializada de los glóbulos blancos y las plaquetas, tales como
mediante centrifugado.
Se entiende que pueden emplearse otros
procedimientos conocidos generalmente en la técnica para separar RBC
de otros componentes sanguíneos. Por ejemplo, sedimentación, en la
que el procedimiento de separación no rompe las membranas celulares
de una cantidad significativa de los RBC, tal como menos de
aproximadamente el 30% de los RBC, antes de la separación de RBC de
los otros componentes sanguíneos.
Después de la separación de los RBC, se lisan
los RBC mediante un medio de lisado de RBC para liberar hemoglobina
de los RBC para formar una solución que contiene hemoglobina. Los
medios de lisis pueden usar diversos procedimientos de lisis, tales
como lisis mecánica, lisis química, lisis hipotónica u otros
procedimientos de lisis conocidos que liberen hemoglobina sin dañar
significativamente la capacidad de la Hb para transportar y liberar
oxígeno.
En otra realización más, la hemoglobina
producida de forma recombinante, tal como la hemoglobina producida
de forma recombinante descrita en el documento Nature, 356:
258-260 (1992), puede procesarse en el procedimiento
de la invención en lugar de RBC. Las células bacterianas que
contienen la hemoglobina se lavan y separan de contaminantes como
se ha descrito anteriormente. Estas células bacterianas se rompen
después mecánicamente mediante medios conocidos en la técnica,
tales como un molino de bolas, para liberar hemoglobina de las
células y para formar una fase celular lisada. Esta fase celular
lisada se procesa después como en la fase de RBC lisada.
Después de la lisis, la fase de RBC lisada se
ultrafiltra después para eliminar los grandes restos celulares,
tales como proteínas con un peso molecular por encima de
aproximadamente 100.000 Dalton. Generalmente, los restos celulares
incluyen todos los componentes completos y fragmentados celulares
con la excepción de Hb, las proteínas celulares más pequeñas,
electrolitos, coenzimas, e intermediarios metabólicos orgánicos. Los
ultrafiltros aceptables incluyen, filtros de 100.000 Dalton
fabricados por Millipore (Nº de catálogo CDUF 050 H1) y preparados
por A/G Technology (Needham, MA; Modelo Nº UFP100E55).
Se prefiere que la ultrafiltración continúe
hasta que la concentración de Hb en la fase de RBC lisada sea menos
de 8 gramos/litro (g/l) para maximizar el rendimiento de hemoglobina
disponible para polimerización. Otros procedimientos para separar
Hb de la fase de RBC lisada pueden emplearse, incluyendo
sedimentación, centrifugado, o microfiltración.
El ultrafiltrado de Hb puede ultrafiltrarse
después para eliminar restos celulares más pequeños, tales como
electrolitos, coenzimas, e intermediarios metabólicos y proteínas
menores de aproximadamente 30.000 Dalton de peso molecular, y agua
del ultrafiltrado de Hb. Los ultrafiltros adecuados incluyen un
ultrafiltro de 30.000 Dalton (Millipore Nº de Catálogo CDUF 050 T1
y/o Armicon Nº 540 430).
La solución de Hb concentrada puede después
introducirse en una o más columnas cromatográficas paralelas como
se ha descrito en más detalle anteriormente.
El eluato de Hb obtenido de la etapa de
cromatografía se desoxigena después preferiblemente antes de la
polimerización para formar una solución de Hb desoxigenada (en lo
sucesivo en este documento desoxi-Hb) por medios que
desoxigenan sustancialmente la Hb sin reducir significativamente la
capacidad de la Hb en el eluato de Hb para transportar y liberar
oxígeno, tal como podría ocurrir a partir de la desnaturalización o
formación de hemoglobina oxidada (met Hb).
En una realización, el eluato de Hb se
desoxigena mediante la transferencia de gas de un gas inerte a
través de una membrana de fase. Dichos gases inertes, incluyen por
ejemplo, nitrógeno, argón y helio. Se entiende que puede usarse
otros medios para desoxigenar una solución de hemoglobina, que se
conocen en la técnica, para desoxigenar el eluato de Hb. Dichos
otros medios pueden incluir, por ejemplo, purgado con nitrógeno del
eluato de Hb, retirada química con agentes reductores tales como
N-acetil-L-cisteína
(NAC), cisteína, ditionita o ascorbato sódico, o fotolisis por
luz.
Después de la elución de la columna
cromatográfica, el eluato de Hb se concentra preferiblemente para
mejorar la eficacia del procedimiento. El eluato de Hb se hace
circular de nuevo a través de un ultrafiltro para concentrar el
eluato de Hb para formar una solución de Hb concentrada. Los
ultrafiltros adecuados incluyen, por ejemplo, ultrafiltros de
30.000 Dalton o menos (por ejemplo, Millipore Helicon, Nº de
catálogo CDUF050G1 o Amicon Nº de catálogo 540430). Típicamente, la
concentración de eluato de Hb se completa cuando la concentración de
Hb está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 120 g/l.
Mientras se concentra el eluato de Hb, la temperatura del eluato de
Hb se mantiene preferiblemente a aproximadamente
8-12ºC.
Después se introduce tampón en la solución de
Hb, que se concentra preferiblemente, para ajustar la fuerza iónica
de la solución de Hb para potenciar la desoxigenación de Hb. Se
prefiere que la fuerza iónica se ajuste a entre aproximadamente 150
meq/l a aproximadamente 200 meq/l para reducir la afinidad por el
oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Los tampones adecuados
incluyen tampones con un pH que no provocarán una desnaturalización
significativa de la proteína Hb pero que tendrán una fuerza iónica
suficientemente alta para promover la desoxigenación de Hb. Los
ejemplos de tampones adecuados incluyen soluciones salinas con un
intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,9. Un
tampón preferido es una solución acuosa de NaCl 1,0 M,
Tris-acetato 20 mM con un pH de aproximadamente
8,9.
Preferiblemente, la solución de Hb tamponada
resultante se hace circular de nuevo después a través del
ultrafiltro, para concentrar de nuevo la solución de Hb para mejorar
la eficacia del procedimiento. En una realización preferida, la
concentración se completa cuando la concentración de Hb es de
aproximadamente 100 g/l a aproximadamente
120 g/l.
120 g/l.
Durante la desoxigenación, la solución de Hb se
hace circular a través de una membrana de transferencia de fase
adecuada. Las membranas de transferencia de fase adecuadas incluyen,
por ejemplo, un microfiltro de fibra hueca de polipropileno de 0,05
\mum (por ejemplo, Hoechst-Celanese Nº catálogo
5PCM-107). Simultáneamente se pasa un contraflujo
de un gas inerte a través de la membrana de transferencia de fase.
Los gases inertes adecuados incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón
y helio. El intercambio de gases a través de la membrana de
transferencia de fase arrastra de este modo el oxígeno fuera de la
solución de Hb.
La desoxigenación continúa hasta que la pO_{2}
de la solución de Hb se reduce a un nivel en el que el contenido de
Hb oxigenada (oxihemoglobina o HbO_{2}) es de aproximadamente el
20% o menos. En una realización preferida, el contenido de
HbO_{2} en la solución de Hb es de aproximadamente el 10% o
menos.
Durante la desoxigenación, la temperatura de la
solución de Hb se mantiene típicamente a un nivel que equilibrará
la tasa de desoxigenación contra la tasa de formación de
metahemoglobina. La temperatura se mantiene para limitar el
contenido de metahemoglobina a menos del 20%. Una temperatura óptima
dará como resultado menos de aproximadamente el 5% de contenido de
metahemoglobina, y preferiblemente menos de aproximadamente el 2,5%
de contenido de metahemoglobina, mientras que sigue desoxigenando la
solución de Hb. Típicamente, durante la desoxigenación, la
temperatura de la solución de Hb se mantiene entre aproximadamente
19ºC y aproximadamente 31ºC.
Durante la desoxigenación, y posteriormente
durante todas las etapas restantes del procedimiento de la
invención, la Hb se mantiene en un entorno bajo en oxígeno para
minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y para mantener un
contenido de HbO_{2} de menos de aproximadamente el 20%,
preferiblemente menos de aproximadamente el 10%.
La Hb desoxigenada se equilibra después
preferiblemente con un tampón de almacenamiento de bajo contenido
de oxígeno, que contiene un compuesto sulfhidrilo, para formar una
de desoxi-Hb estabilizada con respecto a la
oxidación. Los compuestos sulfhidrilo adecuados incluyen agentes
reductores no tóxicos, tales como
N-acetil-L-cisteína
(NAC) D,L-cisteína,
\gamma-glutamil-cisteína,
glutatión,
2,3-dimercapto-1-propanol,
1,4-butanoditiol, tioglicolato, y otros compuestos
sulfhidrilo biológicamente compatibles. El contenido de oxígeno de
un tampón de almacenamiento de bajo contenido de oxígeno debe ser
lo suficientemente bajo como para no reducir significativamente la
concentración de compuesto sulfhidrilo en el tampón y para limitar
el contenido de oxihemoglobina en la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación a aproximadamente el 20% o
menos, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%.
Típicamente, el tampón de almacenamiento tiene una pO_{2} de menos
de aproximadamente 6666,12 Pascales (50 torr).
En una realización preferida, el tampón de
almacenamiento debe tener un pH adecuado para equilibrar la
polimerización de Hb y la formación de hematoglobina, típicamente
entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente 7,9.
La cantidad de un compuesto sulfhidrilo mezclado
con la desoxi-Hb es una cantidad lo suficientemente
alta para aumentar la reticulación intramolecular de Hb durante la
polimerización y lo suficientemente baja como para no disminuir
significativamente la reticulación intermolecular de moléculas de
Hb, debido a una alta fuerza iónica. Típicamente, se necesita
aproximadamente un mol de grupos funcionales sulfhidrilo (-SH) para
estabilizar la oxidación de entre aproximadamente 0,25 moles y
aproximadamente 5 moles de la desoxi-Hb.
En una realización preferida, el tampón de
almacenamiento contiene aproximadamente 25-35 mM de
tampón de fosfato sódico (pH 7,7-7,8) y contiene
una cantidad de NAC tal que la concentración de NAC en la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
está entre aproximadamente el 0,003% y aproximadamente el 0,3% en
peso. Más preferiblemente, la concentración de NAC en la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
está entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 0,2% en
peso.
Preferiblemente, el tampón de almacenamiento se
filtra antes de mezclarlo con la desoxi-Hb, tal como
a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 Dalton
(Milipore Helicon Nº de catálogo CDUF050G1 o A/G Techonolgy Maxcell
Nº de catálogo
UFP-10-C-75).
En una realización, la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación fluye después a través de
un filtro opcional. Los filtros adecuados incluyen un prefiltro de
polipropileno de 0,2 \mum y un microfiltro estéril de 0,5 \mum
(Pall Profile II. Nº de catálogo ABIY005Z7 o Gelman Supor). La
desoxi-Hb se mantiene en una atmósfera
sustancialmente libre de oxígeno. Esto puede conseguirse, por
ejemplo, purgando y blanqueando el aparato del procedimiento con un
gas inerte, tal como nitrógeno, antes y después de llenarlo con
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la
oxidación.
Opcionalmente, antes de transferir la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación a
la polimerización, se añade una cantidad apropiada de agua al
reactor de polimerización. En una realización una cantidad apropiada
de agua es está cantidad que podría dar como resultado una solución
con una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100
g/l de Hb cuando se añade la desoxi-Hb estabilizada
con respecto a la oxidación al reactor de polimerización.
Preferiblemente, el agua está agotada en oxígeno.
Después de que la pO_{2} del agua en la etapa
de polimerización se reduce a un nivel suficiente para limitar el
contenido de HbO_{2} a aproximadamente el 20%, típicamente menos
de aproximadamente 6666,12 Pascales (50 torr), el reactor de
polimerización se blanquea con un gas inerte, tal como nitrógeno. La
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
se transfiere después al reactor de polimerización, que se blanquea
simultáneamente con un flujo apropiado de un gas inerte.
La temperatura de la solución de
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
en el reactor de polimerización se eleva hasta una temperatura para
optimizar la polimerización de la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación cuando se pone en contacto
con un agente reticulante. Típicamente, la temperatura de la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
es de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 45ºC, y preferiblemente
aproximadamente 41ºC a aproximadamente 43ºC durante toda la
polimerización. Un ejemplo de un medio de transferencia de calor
aceptable para calentar el reactor de polimerización es un sistema
calefactor con revestimiento que se calienta haciendo pasar
etilenglicol caliente a través del revestimiento.
La desoxi-Hb estabilizada con
respecto a la oxidación se expone después a un agente reticulante
adecuado a una temperatura suficiente para polimerizar la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
para formar una solución de hemoglobina polimerizada (poli-(Hb))
durante un periodo de aproximadamente 2 horas a
aproximadamente
6 horas.
6 horas.
Los ejemplos de agentes reticulantes adecuados
incluyen agente polifuncionales que reticularán proteínas de Hb,
tales como glutaraldehído, succindialdehído, formas activadas de
polioxietileno y dextrano, \alpha-hidroxi
aldehídos, tales como glicoaldehído, éster fenílico del ácido
N-maleimido-6-aminocaproil-(2'-nitro-4'-sulfónico),
N-hidroxisuccinimi-
da éster del ácido m-maleimidobenzoico, carboxilato de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-; carboxilato de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobenzolil-N-hidroxisulfosuccinimida, N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato, sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato, clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-fenilendimaleimida, y compuestos que pertenecen a la clase bisimidato, la clase de acil diazida o la clase dihaluro de arilo, entre otras.
da éster del ácido m-maleimidobenzoico, carboxilato de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-; carboxilato de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobenzolil-N-hidroxisulfosuccinimida, N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato, sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato, clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-fenilendimaleimida, y compuestos que pertenecen a la clase bisimidato, la clase de acil diazida o la clase dihaluro de arilo, entre otras.
Una cantidad adecuada de un agente reticulante
es esa cantidad que permitirá el reticulado intramolecular para
estabilizar la Hb y también el reticulado intermolecular para formar
polímeros de Hb, para aumentar de este modo la retención
intravascular. Típicamente, una cantidad adecuada de un agente
reticulante es esa cantidad en la que la proporción molar de agente
reticulante con respecto a Hb está en un exceso de aproximadamente
2:1. Preferiblemente, la proporción molar de agente reticulante con
respecto a Hb está entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente
40:1.
Preferiblemente la polimerización se realiza en
un tampón con un pH de entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente
7,9, que tiene una concentración de cloruro menor de o igual a
aproximadamente 35 mmolar.
En una realización preferida, se añade una
cantidad adecuada del agente reticulante a la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
que se mezclan después mediante un medio para mezclado con baja
cizalladura. Un medio de mezclado de baja cizalladura adecuado
incluye un mezclador estático. Un mezclador estático adecuado es,
por ejemplo, un mezclador estático "Kenics" obtenido de
Chemineer, Inc.
En una realización, hacer circular de nuevo la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación y
el agente reticulante a través del mezclador estático causa
condiciones de flujo turbulento con mezclado generalmente uniforme
del agente reticulante con la desoxi-Hb estabilizada
con respecto a la oxidación reduciendo de este modo el potencial de
formación de bolsillos de desoxi-Hb que contengan
altas concentraciones del agente reticulante. El mezclado
generalmente uniforme del agente reticulante y la
desoxi-Hb reduce la formación de polímeros de Hb de
alto peso molecular, es decir, polímeros que pesen más de 500.000
Dalton, y permite también el mezclado más rápido del agente
reticulante y la desoxi-Hb durante la
polimerización. Además, la reticulación intramolecular de Hb
significativa resultará durante la polimerización de Hb debida a la
presencia de un compuesto sulfhidrilo, preferiblemente NAC. Aunque
el mecanismo exacto de la interacción del compuesto sulfhidrilo con
glutaraldehído y/o Hb no se conoce, se presume que el compuesto
sulfhidrilo afecta a la unión química de Hb/agente reticulante de
manera que inhibe al menos parcialmente la formación de polímero de
Hb de alto peso molecular y preferiblemente forma Hb tetramérica
estabilizada.
Se define que poli(Hb) tiene una
reticulación intramolecular significativa si una porción sustancial
(por ejemplo, al menos aproximadamente el 50%) de la moléculas de
Hb están unidas químicamente en la poli(Hb), y solamente una
cantidad pequeña, tal como menos de aproximadamente el 15% están
contenidas dentro de las cadenas de hemoglobinas polimerizadas de
alto peso molecular. Las moléculas de poli(Hb) de alto peso
molecular son moléculas, por ejemplo, con un peso molecular por
encima de aproximadamente 500.000 Dalton.
En una realización preferida, se usa
glutaraldehído como agente reticulante. Típicamente se usan de
aproximadamente 10 a aproximadamente 70 gramos de glutaraldehído
por kilogramo de desoxi-Hb estabilizada con respecto
a la oxidación. Más preferiblemente, se añade glutaraldehído
durante un periodo de cinco horas hasta que se añaden
aproximadamente 29-31 gramos de glutaraldehído por
cada kilogramo de desoxi-Hb estabilizada con
respecto a la oxidación.
Después de la polimerización, la temperatura de
la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se
reduce típicamente a de aproximadamente 15ºC a aproximadamente
25ºC.
Donde el agente reticulante usado no es un
aldehído, la poli(Hb) formada es generalmente una
poli(Hb) estable. Donde el agente reticulante usado es un
aldehído, la poli(Hb) formada es generalmente no estable
hasta que se mezcla con un agente reductor adecuado para reducir
los enlaces menos estables en la poli(Hb) para formar
enlaces más estables. Los ejemplos de agentes reductores adecuados
incluyen borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, ditionita
sódica, trimetilamina, t-butilamina, borano de morfolina y
borano de piridina. Antes de añadir el agente reductor, la solución
de poli(Hb) se concentra opcionalmente mediante
ultrafiltración hasta que la concentración de la solución de
poli(Hb) aumenta entre aproximadamente 75 y aproximadamente
85 g/l. Un ejemplo de ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000
Dalton (por ejemplo, Millipore Helicon, Nº de catálogo CDUF050LT y
Amicon Nº de catálogo 540430).
El pH de la solución de poli(Hb) se
ajusta después al intervalo de pH alcalino para conservar el agente
reductor y para prevenir la formación de hidrógeno gas, que puede
desnaturalizar la Hb durante la posterior reducción.
En una realización, el pH se ajusta a más de 10.
El pH puede ajustarse añadiendo una solución tampón a la solución
de poli(Hb) durante o después de la polimerización. La
poli(Hb) se purifica típicamente para eliminar hemoglobina
no polimerizada. Esto puede realizarse mediante diafiltración o
cromatografía en hidroxiapatita (véase, por ejemplo, pendientes
junto con la presente los documentos U.S. 5.691.453, expedida el 25
de noviembre de 1997, cuyas enseñanzas se incorporan en este
documento como referencia).
Después del ajuste de pH, se añade al menos un
agente reductor, preferiblemente una solución de borohidruro sódico
a la etapa de polimerización típicamente a través del bucle de
desoxigenación. Típicamente, se añaden de aproximadamente 5 a
aproximadamente 18 moles de agente reductor por mol de tetrámero de
Hb (por 64.000 Dalton de Hb) en la poli(Hb). En una
realización preferida, por cada 9 litros de solución de
poli(Hb) en el subsistema de polimerización 98, se añade un
litro de solución de borohidruro sódico 0,25 M a una tasa de 0,1 a
0,12 lpm.
El pH y los electrolitos de la poli(Hb)
estable pueden restaurarse después a niveles fisiológicos para
formar un sustituto de la sangre de hemoglobina polimerizada
estable, diafiltrando la poli(Hb) estable con una solución
de diafiltración que tiene un pH y niveles de electrolitos
fisiológicos adecuados. Preferiblemente, la solución de
diafiltración es una solución tampón.
Donde la poli(Hb) se redujo mediante un
agente reductor, la solución de diafiltración tiene un pH ácido,
preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6.
También puede añadirse un compuesto sulfhidrilo
no tóxico a la solución de poli(Hb) estable como un aceptor
de oxígeno para potenciar la estabilidad del sustituto de la sangre
de hemoglobina polimerizada. El compuesto sulfhidrilo puede
añadirse como parte de la solución de diafiltración y/o puede
añadirse por separado. Se añade una cantidad de compuestos
sulfhidrilo para establecer una concentración de sulfhidrilo que
aceptará oxígeno para mantener el contenido de metahemoglobina en
menos de aproximadamente el 15% durante el periodo de
almacenamiento. Preferiblemente, el compuesto sulfihidrilo es NAC.
Típicamente la cantidad de compuesto de sulfhidrilo añadida es una
cantidad suficiente para establecer una concentración de sulfhidrilo
entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 0,2% en
peso.
En una realización preferida, el sustituto de la
sangre se envasa en condiciones de manejo asépticas mientras se
mantiene la presión con una atmósfera inerte sustancialmente libre
de oxígeno, en el reactor de polimerización y en los aparatos de
transporte restantes.
Las especificaciones para un sustituto de la
sangre de hemoglobina polimerizada estable formado mediante el
procedimiento de la invención se proporciona en la Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El sustituto de la sangre estable se almacena
después en un recipiente de almacenamiento a corto plazo o en
recipientes de almacenamiento estériles, que tienen cada uno un
entorno bajo en oxígeno como se ha descrito con detalle
anteriormente. El recipiente de almacenamiento debe ser también lo
suficientemente impermeable al paso de vapor de agua para prevenir
una concentración significativa del sustituto de la sangre mediante
la evaporación durante el periodo de almacenamiento. La
concentración significativa del sustituto de la sangre es una
concentración que da como resultado que uno o más de los parámetros
del sustituto de la sangre estén claramente fuera de la
especificación.
La síntesis de un sustituto de la sangre de
hemoglobina polimerizada estable, formado de acuerdo con el
procedimiento de la invención se describe adicionalmente en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.296.465.
Los vertebrados que pueden recibir el sustituto
de la sangre, formado mediante los procedimientos de la invención
incluyen mamíferos, tales como un ser humano, primate no humano, un
perro, un gato, una rata, un caballo o una oveja. Además, los
vertebrados que pueden recibir dicho sustituto de la sangre,
incluyen fetos (vertebrados prenatales), vertebrados
post-natales, o vertebrados en el momento del
nacimiento.
Un sustituto de la sangre de la presente
invención puede administrarse en el sistema circulatorio inyectando
el sustituto de la sangre directa o indirectamente en el sistema
circulatorio del vertebrado, mediante uno o más procedimientos de
inyección. Los ejemplos de procedimientos de inyección directa
incluyen inyecciones intravasculares, tales como inyecciones
intravenosas e intra-arteriales, e inyecciones
intracardiacas. Los ejemplos de procedimientos de inyección
indirecta incluyen inyecciones intraperitoneales, inyecciones
subcutáneas, de modo que el sustituto de la sangre será
transportado por el sistema linfático al sistema circulatorio,
inyecciones en la médula ósea por medio de un trócar o un catéter.
Preferiblemente, el sustituto de la sangre se administra por vía
intravenosa.
El vertebrado tratado puede ser normovolémico,
hipervolémico o hipovolémico antes de, durante, y/o después de la
infusión del sustituto de la sangre. El sustituto de la sangre puede
introducirse en el sistema circulatorio mediante procedimientos
tales como carga máxima y mediante procedimientos de
intercambio.
Puede administrarse un sustituto de la sangre
terapéuticamente para tratar tejido hipóxico dentro de un vertebrado
resultante de muchas causas diferentes incluyendo flujo de RBC
reducido en una porción de, o por todo el sistema circulatorio,
anemia y choque. Además, puede administrarse el sustituto de la
sangre de forma profiláctica para prevenir el agotamiento de
oxígeno del tejido en un vertebrado, lo que podría resultar de una
posible o esperada reducción en el flujo de RBC a un tejido o por
todo el sistema circulatorio del vertebrado. Una descripción
adicional de la administración de hemoglobina para tratar
terapéutica o profilácticamente hipoxia, particularmente a partir
de una obstrucción arterial parcial o de un bloqueo parcial en la
microcirculación, y las dosificaciones usadas en ella, se
proporciona pendiente junto con la presente en la solicitud de
Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/409.337, presentada el 23
de marzo de 1995, que se incorpora en este documento como
referencia en su totalidad.
Típicamente, una dosis o combinación de dosis de
sustituto de la sangre adecuada, es una cantidad que cuando está
contenida dentro del plasma sanguíneo da como resultado una
concentración de hemoglobina total en la sangre del vertebrado de
entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 gramos Hb/dl, o más,
si se requiere para compensar pérdidas de grandes volúmenes de
sangre.
La invención se describirá ahora adicional y
específicamente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo
1
Como se describe en la Patente de Estados Unidos
Nº 5.296.465, se recogieron muestras de sangre total bovina, se
mezclaron con un anticoagulante de citrato sódico para formar una
solución sanguínea, y se analizaron después los niveles de
endotoxinas.
Cada muestra de solución sanguínea se mantuvo
después de la recogida a una temperatura de aproximadamente 2ºC y
después se pasó a través de un tamiz para eliminar grandes agregados
y partículas con un tamiz de malla 600.
Antes de reunirlas, se ensayó el nivel de
penicilina en cada muestra de solución sanguínea con un kit de
ensayo adquirido de Difco, Detroit, Michigan usando el
procedimiento titulado "Detección Rápida de Penicilina en la
Leche" para asegurar que los niveles de penicilina en la solución
sanguíneas eran \leq 0,008 unidades/ml.
Después se reunieron las muestras de solución
sanguínea y se mezclaron con solución citrato sódico acuoso
despirogenado para formar una solución del 0,2% en peso de citrato
sódico en sangre total bovina (en lo sucesivo en este documento
"solución sanguínea de citrato sódico al 0,2%").
La solución sanguínea de citrato sódico al 0,2%
se pasó después, en serie, a través de filtros de polipropileno de
800 \mum y 50 \mum para eliminar grandes restos de la solución
sanguínea de un diámetro de aproximadamente 50 \mum o más.
Después se lavaron los RBC para separar
proteínas del plasma extracelular, tales como BSA o IgG, de los RBC.
Para lavar los RBC contenidos en la solución sanguínea, se diluyó
el volumen de solución sanguínea en el tanque de diafiltración
inicialmente mediante la adición de un volumen igual de una solución
isotónica filtrada al tanque de diafiltración. La solución
isotónica se filtró con una membrana de ultrafiltración de 10.000
Dalton de Millipore (Nº de catálogo CDUF 050 G1). La solución
isotónica estaba constituida por 6,0 g/l de dihidrato de citrato
sódico y 8,0 g/l de cloruro sódico en agua para inyección (WFI).
La solución sanguínea diluida se concentró
después de nuevo a su volumen original mediante diafiltración a
través de un diafiltro de fibra hueca de 0,2 \mum (cartucho de
microfiltración Microgon Krosflo II). Simultáneamente, se añadió
solución salina isotónica filtrada de forma continua, como ajuste, a
una tasa igual a la tasa de pérdida del filtrado a través del
diafiltro de 0,2 \mum. Durante la diafiltración, los componentes
de la solución sanguínea diluida que eran significativamente más
pequeños en diámetro que los RBC, o son líquidos tales como el
plasma, pasaron a través de las paredes del diafiltro de 0,2 \mum
con el filtrado. Los RBC, plaquetas y cuerpos mayores de la
solución sanguínea diluida, tales como glóbulos blancos, se
retuvieron con la solución isotónica añadida de forma continua para
formar una solución sanguínea dializada.
Durante el lavado de RBC, la solución sanguínea
diluida se mantuvo a una temperatura de entre aproximadamente 10 y
25ºC con una presión de líquidos en la entrada del diafiltro de
entre aproximadamente 172,36 kPa (25 psi) y aproximadamente 206,84
kPa (30 psi) para mejorar la eficacia del procedimiento.
El lavado de RBC se completó cuando el volumen
de filtrado drenado del diafiltro igualó aproximadamente el 600%
del volumen de solución sanguínea antes de diluir con la solución
isotónica filtrada.
La solución sanguínea dializada se bombeó
después de forma continua a una tasa de aproximadamente 4 lpm a una
Super Centrífuga Sharples, Modelo Nº AS-16, equipada
con un ringdam Nº 28. La centrífuga funcionaba mientras se
introducía de forma simultánea la solución sanguínea dializada, para
separar los RBC de los glóbulos blancos y las plaquetas. Durante el
funcionamiento, la centrífuga giraba a una velocidad suficiente para
separar los RBC en una fase de RBC pesada, mientras separaba
también una porción sustancial de los glóbulos blancos (WBC) y
plaquetas en una fase de WBC ligera, específicamente a
aproximadamente 15.000 rpm. Una fracción de la fase de RBC y de la
fase de WBC se descargaron por separado y de forma continua de la
centrífuga durante el funcionamiento.
Después de la separación de los RBC, se lisaron
los RBC para formar una solución que contenía hemoglobina. Una
porción sustancial de los RBC se lisó de forma mecánica mientras se
descargaban los RBC de la centrífuga. Las membranas celulares de
los RBC se rompieron después de chocar contra las paredes de la
tubería de descarga de la fase de RBC a un ángulo del flujo de fase
de RBC fuera de la centrífuga, liberando de este modo hemoglobina
(Hb) de los RBC en la fase RBC.
La fase de RBC lisada fluyó después a través de
la tubería de descarga de la fase RBC en un mezclador estático
(Kenics 1,27 cm (½ pulgada) con 6 elementos, Chemineer, Inc.). De
forma simultánea con la transferencia de la fase de RBC al
mezclador estático, se inyectó también una cantidad igual de WFI en
el mezclador estático, en la que la WFI se mezclaba con la fase
RBC. Los caudales de la fase de RBC y la WFI en el mezclador
estático son cada uno de aproximadamente 0,25 lpm.
La mezcla de la fase de RBC con WFI en el
mezclador estático produjo un coloide RBC lisado. El coloide RBC
lisado se transfirió después del mezclador estático a una Super
Centrífuga Sharples (Modelo Nº AS-16, Sharples
Division of Alfa-Laval Separation, Inc.) que era
adecuada para separar la Hb de los componentes de RBC no
hemoglobina. La centrífuga se hizo girar a una velocidad suficiente
como para separar el coloide RBC lisado en una fase de Hb ligera y
una fase pesada. La fase ligera está constituida por Hb y también
contenía componentes no de hemoglobina con una densidad
aproximadamente igual a o menor que la densidad de la Hb.
La fase de Hb se descargó de forma continua de
la centrífuga, a través de un microfiltro de 0,45 \mum Millipore
Pellicon Cassette Nº de Catálogo HVLP 000 C5, y a un tanque de
contención en preparación para la purificación de Hb. Los estromas
celulares se devolvieron después junto con el retentado del
microfiltro al tanque de contención. Durante la microfiltración, la
temperatura dentro del tanque de contención se mantuvo a 10ºC o
menos. Para mejorar la eficacia, cuando la presión de los líquidos
en la entrada del microfiltro aumentaba desde una presión inicial
de aproximadamente 68,94 kPa (10 psi) a aproximadamente 172,36 kPa
(25 psi), la microfiltración estaba completa. El microfiltrado de
Hb se transfería después del microfiltro al tanque de
microfiltrado.
Posteriormente el microfiltrado de Hb se bombeó
a través de un ultrafiltro 100.000 Millipore Nº de Catálogo CDUF
050 H1. Una porción sustancial de la Hb y del agua, contenidos en el
microfiltrado de Hb, penetraba a través del ultrafiltro de 100.000
Dalton para formar un ultrafiltrado de Hb, mientras que los restos
celulares más grandes, tales como proteínas con un peso molecular
por encima de aproximadamente 100.000 Dalton, se retenían y se
hacían circular de nuevo al tanque de microfiltrado.
Simultáneamente, se añadió de forma continua WFI al tanque de
microfiltrado como ajuste para la pérdida de agua en el
ultrafiltrado. Generalmente, los restos celulares incluyen todos
los componentes celulares completos y fragmentados con la excepción
de Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrolitos, coenzimas e
intermediarios metabólicos orgánicos. La ultrafiltración continuó
hasta la que la concentración de Hb en el tanque de microfiltrado
era menor de 8 gramos/litro (g/l). Mientras se ultrafiltraba la Hb,
la temperatura interna del tanque de microfiltrado se mantenía a
aproximadamente 10ºC.
El ultrafiltrado de Hb se transfirió en un
tanque de ultrafiltrado, en el que el ultrafiltrado de Hb se hizo
circular después de nuevo a través de un ultrafiltro de 30.000
Dalton Millipore Nº de Catálogo CDUF 050 T1 para eliminar los
componentes celulares más pequeños, tales como electrolitos,
coenzimas, intermediarios metabólicos y proteínas de menos de
aproximadamente 30.000 Dalton de peso molecular, y el agua del
ultrafiltrado de Hb, formando de este modo una solución de Hb
concentrada que contenía aproximadamente 100 gramos de Hb/l.
La solución de Hb concentrada se traspasó desde
el tanque de ultrafiltrado al medio contenido en columnas
cromatográficas paralelas (60,96 cm (2 pies) de longitud con un
diámetro interno de 20,32 cm (8 pulgadas)) para separar la Hb
mediante la cromatografía de líquidos de alta resolución. Las
columnas cromatográficas contenían un medio de intercambio aniónico
adecuado para separar Hb de las proteínas no hemoglobina. Los medios
de intercambio aniónico se formaban a partir de gel de sílice. El
gel de sílice se expuso a \gamma-glicidoxi
propilsilano para formar grupos epóxido activos y después se expuso
a C_{3}H_{7}(CH_{3})_{2}NCl para formar un
medio de intercambio aniónico de amonio cuaternario. Este
procedimiento pata tratar el gel de sílice se describe en el
documento Journal of Chromatography, 120:
321-333 (1976).
Cada columna se trató previamente lavando
abundantemente las columnas cromatográficas con un primero tampón
(Tris-acetato) que facilitaba la unión de Hb. El pH
del tampón era de aproximadamente 9,0 \pm 0,1. Después se
inyectaron 4,52 litros de la solución de Hb concentrada en cada
columna cromatográfica. Después de inyectar la solución de Hb
concentrada, las columnas cromatográficas se lavaron después pasando
soluciones tampón a través de las columnas cromatográficas para
producir un gradiente de pH por etapas de eluato de las columnas.
La temperatura de cada tampón durante el uso era de aproximadamente
12,4ºC. Los tampones se filtraron previamente a través de una
membrana de ultrafiltración de 10.000 Dalton antes de la inyección
en las columnas cromatográficas.
En particular, una primera solución tampón,
acetato de tris-hidroximetil aminometano
(Tris-acetato) 20 mM (pH aproximadamente de 8,4 a
aproximadamente 9,4), transportaba la solución de Hb concentrada en
agua purificada (U.S.P.) a los medios en las columnas
cromatográficas para unirse a la Hb. Un segundo tampón, que tenía un
pH de aproximadamente 8,3, ajustaba después el pH en las columnas
cromatográficas para eluir los componentes no hemoglobina
contaminantes de las columnas cromatográficas, mientras retenía la
Hb. El equilibrado con la segunda solución tampón continuó durante
aproximadamente 30 minutos a un caudal de aproximadamente 3,56 lpm
por columna, o aproximadamente 6,1 volúmenes de columna (11,7
volúmenes vacíos). El eluato del segundo tampón se desechó. Una
tercera solución tampón, Tris-acetato 50 mM (pH de
aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5), eluyó después la Hb de
las columnas cromatográficas en forma de un producto de hemoglobina
purificada.
El eluato de Hb se pasó después a través de un
filtro Sartobran de 0,22 \mu Nº de Catálogo 5232507 G1PH hasta un
tanque en el que se recogió el eluato de Hb. El primer 3 al 4% del
eluato de Hb y el último 3 al 4% de eluato de Hb se desecharon.
El eluato de Hb se continuó usando, si el eluato
contenía menos de 0,05 EU/ml de endotoxina y contenía menos de 3,3
nmoles/ml de fosfolípidos. A sesenta litros de eluato ultrapuro, que
tenía una concentración de 100 g de Hb/l, se le añadieron 9 l de
NaCl 1,0 M, Tris 20 mM (pH 8,9), formando de este modo una solución
de Hb con una fuerza iónica de 160 mM, para reducir la afinidad por
el oxígeno de la Hb en la solución de Hb. La solución de Hb se
concentró después a 10ºC, haciéndola circular de nuevo a través del
ultrafiltro, específicamente un filtro de 10.000 Dalton Millipore
Helicon, Nº de Catálogo CDUF050G1, hasta que la concentración de Hb
era de 110 g/l.
La solución de Hb se desoxigenó después, hasta
que la pO_{2} de la solución de Hb se redujo al nivel donde el
contenido de HbO_{2} era de aproximadamente el 10%, haciendo
circular de nuevo la solución de Hb a 12 lpm, a través de una
membrana de transferencia de fase de microfiltro de polipropileno de
Hoechst-Celanese Corporation Nº de Catálogo
G-240/40), para formar una solución de Hb
desoxigenada (en lo sucesivo en este documento
"desoxi-Hb"). Simultáneamente, se pasó un flujo
de gas de nitrógeno de 60 lpm a través del lado contrario de la
membrana de transferencia de fase. Durante la desoxigenación, la
temperatura de la solución de Hb se mantuvo entre aproximadamente
19ºC y aproximadamente 31ºC.
También durante la desoxigenación, y
posteriormente durante todo el procedimiento, se mantuvo la Hb en un
entorno bajo en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por
la Hb y para mantener un contenido de Hb oxigenada (oxihemoglobina
o HbO_{2}) de menos de aproximadamente el 10% en la
desoxi-Hb.
Los 60 l de desoxi-Hb, se
diafiltraron después a través de un ultrafiltro con 180 l de un
tampón de almacenamiento, que contenía el 0,2% en peso de
N-acetil cisteína, tampón de fosfato sódico 33 mM
(pH 7,8) que contenía un pO_{2} de menos de 6666,12 Pascales 50
torr, para formar una desoxi-Hb estabilizada con
respecto a la oxidación. Antes de mezclar con la
desoxi-Hb, el tampón de almacenamiento se
despirogenó con un filtro despirogenante de 10.000 Dalton Millipore
Helicon, Nº de Catálogo CDUF050G1.
El tampón de almacenamiento se añadió de forma
continua a una tasa aproximadamente equivalente a la pérdida de
líquido a través del ultrafiltro. La diafiltración continuó hasta
que el volumen de pérdida de líquido por diafiltración a través del
ultrafiltro era de aproximadamente tres veces el volumen inicial de
la desoxi-Hb. El material puede almacenarse en este
punto.
Antes de transferir la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación a un aparato de
polimerización, se añadió WFI agotada en oxígeno al reactor de
polimerización para purgar el aparato de pulverización de oxígeno
para prevenir la oxigenación de la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación. La cantidad de WFI
añadida al aparato de polimerización era esa cantidad que podría dar
como resultado una solución de Hb con una concentración de
aproximadamente 40 g de Hb/l, cuando se añadía la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación
al reactor de polimerización. La WFI se hizo circular de nuevo
después por todo el aparato de polimerización, para desoxigenar la
WFI mediante el flujo a través de una membrana de transferencia de
fase de microfiltro de propileno de 0,05 \mum
(Hoechst-Celanese Corporation Nº de Catálogo
5PCM-108, 7,43 m^{2} (80 pies cuadrados)) contra
un contraflujo de nitrógeno presurizado. Los caudales de WFI y gas
nitrógeno, a través de la membrana de transferencia de fase, eran
de aproximadamente 18 a 20 l/min y 40 a 60 l/min,
respectivamente.
Después de que la pO_{2} del WFI en el aparato
de polimerización se redujo a menos de aproximadamente 266,64
Pascales (2 torr) de pO_{2}, el reactor de polimerización se
blanqueó con nitrógeno mediante un flujo de aproximadamente 20
l/min de nitrógeno en el espacio superior del reactor de
polimerización. La desoxi-Hb estabilizada con
respecto a la oxidación se transfirió después al reactor de
polimerización.
La polimerización se realizó en un tampón
fosfato 12 mM con un pH de 7,8, que tenía una concentración de
cloruro menor que o igual a aproximadamente 35 mM, que se produjo
mezclando la solución de Hb con WFI.
Posteriormente, se mezclaron lentamente la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación y
la N-acetil cisteína con el agente reticulante de
glutaraldehído, específicamente 29,4 gramos de glutaraldehído por
cada kilogramo de Hb durante un período de cinco horas, mientras se
calentaba a 42ºC y se recirculaba la solución de Hb a través de un
mezclador estático Kenics de 2,54-1,27 cm
(1-1/2 pulgadas) con 6 elementos (Chemineer, Inc.),
para formar una solución de Hb polimerizada (poli(Hb)).
La recirculación de la desoxi-Hb
estabilizada con respecto a la oxidación y el glutaraldehído a
través del mezclador estático causó condiciones de flujo turbulento
con un mezclado generalmente uniforme de glutaraldehído con la
desoxi-Hb estabilizada con respecto a la oxidación,
reduciendo de este modo el potencial de formación de bolsillos de
desoxi-Hb que contenían altas concentraciones de
glutaraldehído. El mezclado generalmente uniforme de glutaraldehído
y la desoxi-Hb redujo la formación de
poli(Hb) de alto peso molecular (que tiene un peso molecular
de aproximadamente 500.000 Dalton) y permitió también el mezclado
más rápido de glutaraldehído y desoxi-Hb durante la
polimerización.
Además, se produjo un reticulado intramolecular
de Hb significativo durante la polimerización de Hb como un efecto
de la presencia de N-acetil cisteína después de la
polimerización de Hb.
Después de la polimerización, la temperatura de
la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se
redujo a una temperatura de entre aproximadamente 15ºC y
aproximadamente 25ºC.
La solución de poli(Hb) se concentró
después haciendo circular de nuevo la solución de poli(Hb) a
través del ultrafiltro hasta que la concentración de
poli(Hb) aumentó hasta aproximadamente 85 g/l. Un ultrafiltro
adecuado es un filtro de 30.000 Dalton (por ejemplo, Millipore
Helicon, Nº de Catálogo CDUF050LT).
Posteriormente, la solución de poli(Hb)
se mezcló después con 66,75 g de borohidruro sódico, a la solución
de poli(Hb) y después se hizo circular de nuevo a través del
mezclador estático. Específicamente, para cada nueve litros de
solución de poli(Hb), se añadió un litro de solución de
borohidruro sódico 0,25 M a una tasa de 0,1 a 0,12 lpm.
Antes de añadir el borohidruro sódico a la
solución de poli(Hb), el pH de la solución de poli(Hb)
se basificó ajustando el pH a un pH de aproximadamente 10 para
preservar el borohidruro sódico y para prevenir la formación de gas
de hidrógeno. El pH de la solución de poli(Hb) se ajustó
diafiltrando la solución de poli(Hb) con aproximadamente 215
l de tampón de borato sódico despirogenado, desoxigenado 12 mM, que
tiene un pH de aproximadamente 10,4 a aproximadamente 10,6. La
solución de poli(Hb) se diafiltró haciendo circular de nuevo
la solución de poli(Hb) del reactor de polimerización a
través del ultrafiltro de 30 kD. El tampón de borato sódico se
añadió a la solución de poli(Hb) a una tasa aproximadamente
equivalente a la tasa de líquido perdido a través del ultrafiltro
desde la diafiltración. La diafiltración continuó hasta que el
volumen de líquido perdido a través del ultrafiltro de
diafiltración era de aproximadamente tres veces el volumen inicial
de la solución de poli(Hb) en el reactor de
polimerización.
Después del ajuste de pH, se añadió la solución
de borohidruro sódico al reactor de polimerización para reducir los
enlaces de imina en la solución de poli(Hb) a enlaces de
quetimina y para formar poli(Hb) estable en solución.
Durante la adición de borohidruro sódico, la solución de
poli(Hb) en el reactor de polimerización se hacía circular
de nuevo de forma continua a través del mezclador estático y la
membrana de transferencia de fase de microfiltro de propileno de
0,05 \mum para eliminar el oxígeno y el hidrógeno disueltos. El
flujo a través del mezclador estático proporcionó también
condiciones de flujo de borohidruro sódico turbulentas que mezclaban
rápida y eficazmente el borohidruro sódico con la solución de
poli(Hb). Los caudales de solución de poli(Hb) y gas
nitrógeno a través de la membrana de transferencia de fase de 0,05
\mum eran de entre aproximadamente 2,0 y 4,0 lpm y
aproximadamente 12 y 18 lpm, respectivamente. Después de que se
completó la adición de borohidruro sódico, continuó la reducción en
el reactor de polimerización mientras un agitador contenido en su
interior giraba a aproximadamente 75 giros por
minuto.
minuto.
Aproximadamente una hora después de la adición
de borohidruro sódico, la solución de poli(Hb) estable se
hizo circular de nuevo desde el reactor de polimerización a través
del ultrafiltro de 30.000 Dalton hasta que la concentración de la
solución de poli(Hb) estable era de 110 g/l. Después de la
concentración, el pH y los electrolitos de la solución de
poli(Hb) estable se restauraron a niveles fisiológicos para
formar un sustituto de la sangre de Hb polimerizada, diafiltrando
la solución de poli(Hb) estable, a través del ultrafiltro de
30.000 Dalton, con un tampón filtrado, desoxigenado, de pH bajo que
contenía lactato sódico 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM, y
CaCl_{2} 1,36 mM en WFI, (pH 5,0). La diafiltración continuó hasta
que el volumen de líquido perdido en la diafiltración a través del
ultrafiltro era de aproximadamente 6 veces el volumen de
prediafiltración del producto de Hb concentrado.
Después de que el pH y los electrolitos se
restauraron a niveles fisiológicos, el sustituto de la sangre de Hb
polimerizada estable se diluyó después a una concentración de 5,0
g/dl añadiendo el tampón filtrado, desoxigenado de pH bajo al
reactor de polimerización. El sustituto de la sangre diluido se
diafiltró después haciéndolo circular de nuevo desde el reactor de
polimerización a través del mezclador estático y un filtro de
purificación de 100.000 Dalton contra un tampón filtrado
desoxigenado que contenía lactato sódico 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115
mM, KCl 4 mM y CaCl_{2} 1,36 mM en WFI, (pH 7,8). La diafiltración
continuó hasta que el sustituto de la sangre contenía menos de o
igual a aproximadamente el 10% de especies tetramérica modificada y
tetramérica no modificada por GPC cuando se realizaba en
condiciones de disociación.
El filtro de purificación se hacía funcionar en
condiciones de presión transmembrana baja con una tubería de
permeabilidad restringida. Después de la eliminación de cantidades
sustanciales de Hb tetramérica modificada y Hb tetramérica no
modificada, la recirculación del sustituto de la sangre continuó a
través del ultrafiltro de 30.000 Dalton hasta que la concentración
del sustituto de la sangre era de aproximadamente 130 g/l.
El sustituto de la sangre estable se almacenó
después en un recipiente adecuado que tenía un entorno bajo en
oxígeno y una baja filtración de oxígeno al interior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La concentración de endotoxinas en el producto
de hemoglobina se determina mediante el procedimiento
"Kinetc/Turbidimetric LAL 5000 Metodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole,
Massachusetts, J. Levin y col., J. Lab. Clin. Med., 75: 903-911 (1970). Se usaron después diversos procedimientos para ensayar la presencia de cualquier resto del estroma por ejemplo, un ensayo de precipitación, de inmunotransferencia, y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para una proteína o glicolípido de membrana celular específicos conocidos por los especialistas en la técnica.
"Kinetc/Turbidimetric LAL 5000 Metodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole,
Massachusetts, J. Levin y col., J. Lab. Clin. Med., 75: 903-911 (1970). Se usaron después diversos procedimientos para ensayar la presencia de cualquier resto del estroma por ejemplo, un ensayo de precipitación, de inmunotransferencia, y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para una proteína o glicolípido de membrana celular específicos conocidos por los especialistas en la técnica.
El recuento de partículas se determinó mediante
el procedimiento "Particulate Matter in Injections: Large Volume
Injections for Single Dose Infusions", U.S Pharmacopeia,
22: 1596, 1990.
Para determinar la concentración de
glutaralehído, se derivatizó una muestra representativa de 400
\mul del producto de hemoglobina con dinitrofenilhidrazina y
después se inyectó una alícuota de 100 \mul de la solución
derivada de una columna YMC AQ-303 ODS a 27ºC, a una
tasa de 1 ml/min, junto con un gradiente. El gradiente estaba
constituido por dos fases móviles, ácido trifluoroacético (TFA) al
0,1% en agua y TFA al 0,08% en acetonitrilo. El flujo de gradiente
estaba constituido por un 60% constante de TFA al 0,08% en
acetonitrilo durante 6,0 minutos, un gradiente lineal al 85% de TFA
al 0,08% en acetonitrilo durante 12 minutos, un gradiente lineal al
100% de TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 4 minutos y mantenido
al 100% de TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 2 minutos y
re-equilibrado al 45% de TFA al 0,1% en agua. La
detección ultravioleta se midió a 360 nm.
Para determinar la concentración de NAC, se
diluyó una alícuota de producto de hemoglobina 1:100 con fosfato
sódico desgasificado en agua y se inyectaron 50 \mul en una
columna YMC AQ-303 ODS con un gradiente. Los
tampones de gradiente estaban constituidos por una solución de
fosfato sódico en agua y una mezcla de acetonitrilo al 80% en agua
con TFA al 0,05%. El flujo de gradiente estaba constituido por
fosfato sódico al 100% en agua durante 15 minutos, después de un
gradiente lineal al 100% de mezcla de acetonitrilo al 80% y TFA al
0,05% durante 5 minutos, con un mantenimiento durante 5 minutos. El
sistema se re-equilibró después con fosfato sódico
al 100% durante 20 minutos.
El análisis de fosfolípidos se realizó mediante
un procedimiento basado en los procedimientos contenidos en los
siguientes dos documentos: Kolarovic y col., "A Comparison of
Extraction Methods for the Isolation of Phospholipids from
Biological Sources", Anal. Biochem., 156:
244-250, 1986 y Duck-Chong, C.G.,
"A Rapid Sensitive Method for Determining Phospholipid Phosphorus
Involving Digestion With Magnesium Nitrate", Lipids, 14:
492-497, 1979.
Se determinó la osmolaridad mediante un análisis
de un osmómetro de Advanced Cryomatic Osmometer, Modelo Nº 3C2,
Advanced Instruments, Inc., Needham, Massachusetts.
Las concentraciones de hemoglobina,
metahemoglobina y oxihemoglobina totales se determinaron en un
co-Oxímetro Nº de Modelo 482 de Instrumentation
Laboratory, Lexington, Massachusetts.
La concentración de Na^{+}, K^{+}, Cl^{-},
Ca^{++}, pO_{2} se determinó mediante un Perfil 4 de Novastat,
Nova Biomedical Corporation, Waltham, Massachusetts.
La constante de unión a oxígeno, P_{50} se
determinó mediante un Analizador Hemox, TCS Corporation,
Southhampton, Pennsylvania.
Southhampton, Pennsylvania.
La temperatura y el pH se determinaron mediante
procedimientos convencionales conocidos por los especialistas en la
técnica.
El peso molecular (P.M.) se determinó realizando
una cromatografía de permeación en gel (GPC) de los productos de
hemoglobina en condiciones de disociación. Se analizó la
distribución del peso molecular en una muestra representativa del
producto de hemoglobina. El producto de hemoglobina se diluyó a 4
mg/ml en una fase móvil de Bis-Tris 50 mM (pH 6,5),
MgCl_{2} 750 mM, y EDTA 0,1 mM. Este tampón sirve para disociar el
tetrámero de Hb en dímeros, que no se han reticulado con otros
dímeros de Hb a través de reticulaciones intramoleculares o
intermoleculares, de la poli(Hb). La muestra diluida se
inyectó en una columna TosoHaas G3000SW. El caudal era de 0,5
ml/min y la detección ultravioleta se registró a 280 nm.
Los resultados de los ensayos anteriores en
sustitutos de sangre de animales (OXYGLOBIN^{TM}) y humanos
(HEMOPURE^{TM} 2), formados de acuerdo con el procedimiento de la invención, se resumen en las Tablas II y III, respectivamente.
(HEMOPURE^{TM} 2), formados de acuerdo con el procedimiento de la invención, se resumen en las Tablas II y III, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El fin de este estudio era determinar los
efectos oncóticos in vivo, específicamente el volumen de agua
arrastrada en el espacio intravascular por gramo de hemoglobina
administrada, de sustituto de la sangre veterinario (OXYGLO-
BIN^{TM}) en perros beagle esplenectomizados midiendo el aumento del volumen de plasma después de una dosis de carga máxima. Además, también se determinó una dosis comparable de (RHEOMACRODEX^{TM}-Saline), fabricado por Pharmacia, que es Dextrano 40 al 10% y solución salina al 0,9%.
BIN^{TM}) en perros beagle esplenectomizados midiendo el aumento del volumen de plasma después de una dosis de carga máxima. Además, también se determinó una dosis comparable de (RHEOMACRODEX^{TM}-Saline), fabricado por Pharmacia, que es Dextrano 40 al 10% y solución salina al 0,9%.
Se introdujeron dos perros en este estudio
después de una exploración de salud rutinaria y un período de
aclimatación de al menos cuatro semanas. Se esplenectomizó a los
perros al menos 3 días antes del tratamiento. Se
pre-anestesiaron, con una combinación de atropina y
clorhidrato de meperidina, y se anestesiaron mediante la inhalación
de isofluorano. Se infundió solución de Ringer con lactato a
10-20 ml/kg/h durante el procedimiento
quirúrgico.
Los perros que recibieron el sustituto de la
sangre de Hb (40 ml/kg) a 20 ml/kg/h mediante un catéter encefálico
desechable. Se midió el hematocrito antes de la dosificación y a las
1/4, 1/2, 1, 2, 3, 4 horas después de la dosificación o más tarde
hasta que se estableció el punto más bajo del hematocrito.
Se esplenectomizaron los perros para asegurar un
volumen de plasma y una masa de RBC constantes para permitir la
medición exacta del cambio en el volumen del plasma después de la
dosificación.
El cálculo del cambio del volumen de plasma se
realizó usando la siguiente ecuación:
donde VP es el volumen de plasma,
Hct_{1} es el hematocrito inicial, y Hct_{2} es el hematocrito
final. Este cálculo se basaba en el cambio en el hematocrito,
suponiendo que la cantidad de RBC en el volumen de sangre en
circulación y el volumen corpuscular medio permanecían
constantes.
Como se muestra en la Tabla IV, el punto más
bajo del hematocrito se producía dos horas después de la
dosificación en los dos perros. El volumen corpuscular medio (MCV)
permanecía estable durante todo el estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El volumen de líquido que se arrastra por vía
intravascular después de la dosificación era de 6 ml/g de
hemoglobina y 9 ml/g de hemoglobina para los perros 3503C y 14
macho, respectivamente. La dosis de solución coloidal sintética
(Reomacrodex®-Saline) se calculó en base a una dosis que causa un
efecto oncótico similar. El Rheomacrodex arrastra aproximadamente
22 ml de líquido del intersticio por gramo administrado por vía
intravenosa.
La dosis comparable calculada de Rheomacrodex
era de 14 ml/kg y 7 ml/kg para 30 ml/kg y 15 ml/kg de sustituto de
la sangre de Hb, respectivamente.
El volumen de líquido arrastrado por vía
intravascular mediante el sustituto de la sangre de Hb
(Oxyglobin^{TM}) era de 8 ml de H_{2}O/gramo de hemoglobina.
Puesto que el volumen de la dosis era de 30 ml/kg, y la
concentración de hemoglobina en la dosis era de 13 g/dl, la
cantidad total de hemoglobina por dosis era de 3,9 g/kg y el
volumen total de líquido arrastrado en el espacio
intravascular/dosis por el sustituto de la sangre de Hb era de 31,2
ml.
La solución coloidal sintética arrastra
aproximadamente 22 ml de agua/gramo de Dextrano. La cantidad total
de Dextrano en la solución coloidal por dosis comparable de
sustituto de la sangre de Hb es de 1,4 g. Por tanto, el volumen
total de líquido arrastrado en el espacio intravascular/por dosis
comparable de solución coloidal es de 14 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este estudio se realizó para determinar el
efecto del fármaco y la respuesta a la dosis de sustituto de la
sangre de Hb veterinario (OXYGLOBIN^{TM}) de esta invención, en
comparación con una solución coloidal sintética, de
(RHEOMACRODEX^{TM}-Saline, Pharmacia) que es
Dextrano 40 al 10% y solución salina al 0,9%, con respecto al
contenido de oxígeno arterial en relación con la hemoglobina de los
glóbulos rojos caninos y el suministro de oxígeno en perros beagle
esplenectomizados, 60 minutos y 24 horas después de la hemodilución
normovolémica aguda.
La hemodilución normovolémica aguda es un modelo
experimental que imita una afección clínica de anemia debida a la
pérdida quirúrgica de sangre. Se produjo una anemia grave (Hct = 9%,
Hb = 3 g/dl) mediante este procedimiento para causar una necesidad
absoluta de apoyo en el transporte oxígeno. El suministro de oxígeno
y el contenido del oxígeno disminuyeron bruscamente con la
hemorragia masiva.
En el desarrollo del modelo de hemodilución
normovolémica, se descubrió que el tratamiento para restaurar el
suministro de oxígeno mediante el aumento del volumen en solitario,
como se hacia para los perros de control, o mediante expansión del
volumen junto con un aumento en el contenido de oxígeno arterial,
como ocurría para los perros tratados con la solución de
hemoglobina, tenia que producirse en aproximadamente 10 minutos
después de alcanzar un hematocrito del 9% para evitar descensos
irreversibles de la presión sanguínea y del gasto cardiaco que
provocaban después la muerte.
Dos de los 12 perros de control en este estudio
murieron durante o después de la dosificación incluso aunque su
volumen vascular aumentó con solución de Dextrano 40 a los 5 minutos
de alcanzar el hematocrito diana. La muerte de estos perros es un
reflejo de la gravedad del modelo experimental que a su vez
representa la afección clínica de pérdida sanguínea aguda
grave.
Se introdujeron treinta perros en este estudio
después de una exploración de salud rutinaria y un periodo de
aclimatación de al menos cuatro semanas. Se escalonó el tratamiento
usando tres réplicas de perros (A, B y C), cada replica contenía un
perro/sexo/grupo. Los perros se asignaron al azar a los 5 grupos (6
perros/grupo de 3 machos y 3 hembras) 32 días antes del primer día
del tratamiento. Los perros se asignaron a sus grupos respectivos
mediante aleatorización en bloque en base al peso corporal usando un
procedimiento que aseguraba una distribución equitativa entre los
grupos. Los machos y las hembras se aleatorizaron por separado.
Cualquier perro con datos anteriores al tratamiento inaceptables,
tales como síntomas clínicos anormales o datos de patología
clínica, se sustituyó con un perro de reserva que se mantenía en las
mismas condiciones ambientales.
Los artículos de ensayo/control se administraron
mediante una única infusión intravenosa. La tasa de infusión se
controlaba mediante una bomba de infusión. El volumen real infundido
por hora dependía del peso corporal más reciente de cada uno de los
perros.
La dosis más alta de solución de hemoglobina se
basaba en el límite superior seguro de los efectos cardiovasculares
agudos debidos al aumento de volumen en perros normovolémicos. La
dosis en la mitad del intervalo se eligió para definir la forma de
la curva de respuesta a la dosis. La dosis más baja se basaba en el
límite inferior de dosificación clínicamente relevante según se
define por el volumen y los efectos hemodinámicos en el perro.
Cada perro se esplenectomizó al menos 7 días
antes del tratamiento para evitar efectos en el modelo experimental
de una masa de RBC circulatoria aumentada debida a la contracción
esplénica. El día del tratamiento con solución de hemoglobina, cada
perro se anestesió mediante la inhalación de isoflurano y se
ventilaron mecánicamente usando aire del ambiente con un volumen
tidal de 20-25 ml/kg. La tasa de ventilación se
ajustó durante el procedimiento para mantener la pCO_{2} arterial
a aproximadamente 40 mmHg. La concentración expirada final de
isoflurano se midió y se controló para proporcionar una comparación
válida del plano de anestesia de perro a perro. Se colocaron
instrumentos a los perros para controlar la función hemodinámica y
los parámetros de transporte de oxígeno. La colocación de un
catéter dirigido por flujo en la arteria pulmonar se confirmó
mediante el análisis de presiones y los seguimientos de presión. Se
colocó un catéter de doble luz, con capacidad de termodilución del
gasto cardíaco, en la arteria femoral para proporcionar una línea
arterial para el control de la presión sanguínea y la retirada de
sangre. Se colocó un catéter en la vena cefálica, u otra vena si se
requería, para la sustitución del volumen y la administración de los
artículos de ensayo/control.
Cada perro recibía una inyección intramuscular
de antibióticos una vez al día (Procaína penicilina G) de forma
profiláctica un día antes de la cirugía, en el día de la cirugía y
durante 3 días después de la esplenectomía. Se aplicó
V-Esporina, un antibiótico tópico (Polimixina B,
Bacitracina, Neomicina) en el sitio de la cirugía una vez al día,
según era necesario.
Después de la colocación de los instrumentos, se
realizó la estabilización hemodinámica para alcanzar una pCO_{2}
de aproximadamente 40 mm de Hg y la recogida de las mediciones de
referencia. Después se produjo un modelo de hemodilución
normovolémica aguda extrayendo sangre a los perros y sustituyendo de
forma simultánea aproximadamente 1,6 a 2,3 veces los volúmenes
retirados con Solución de Ringer Lactato para mantener el estatus
isovolémico. El estatus isovolémico se consiguió manteniendo la
presión de la porción de la arteria pulmonar a aproximadamente los
valores de referencia. La sustitución del volumen de retirada
sanguínea duró aproximadamente 45 a 90 minutos hasta que la
concentración de hemoglobina era de aproximadamente 30 g/l (3,0
g/dl). La Solución de Ringer Lactato se infundió rápidamente usando
un conjunto intravenoso de gravedad y un manguito de presión
alrededor de la bolsa de infusión. Si la presión sanguínea sistólica
arterial era \leq 50 mmHg durante más de 5 minutos después de la
inducción de la anemia aguda y antes del comienzo de la
dosificación, se rechazaba el perro y se sustituía por un perro de
reserva mantenido en las mismas condiciones ambientales.
Las dosis de solución coloidal de control y de
hemoglobina se administraron como se muestra en la Tabla V. Las
mediciones hemodinámicas se realizaron antes de la extracción de
sangre, antes de la dosificación, inmediatamente después de la
dosificación, y a los 60 minutos y 24 horas después de la
dosificación. Después de la medición a los 60 minutos, el perro se
recuperaba de la anestesia y se le colocaban de nuevo los
instrumentos para las mediciones hemodinámicas, realizadas a las 24
horas después de la dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los parámetros hemodinámicos se analizaron
estadísticamente mediante el análisis de la varianza (ANOVA) o el
análisis de la covarianza (ANCOVA) con el valor de antes de la
extracción de sangre o antes de la dosificación como el covariado.
Se realizaron contrastes lineales específicos para ensayar los
efectos del volumen de la solución administrada, el volumen del
sustituto de la sangre de Hb (efecto del fármaco), y la respuesta a
la dosis del sustituto de la sangre de Hb (efecto de la dosis).
Estos ensayos se realizaron solamente para los parámetros para los
cuales la diferencia entre los grupos experimentales era
estadísticamente significativa al nivel de 0,05. Las comparaciones
de variables específicas en puntos temporales seleccionados se
realizaron mediante ensayos en t por parejas en cada grupo.
El contenido de oxígeno arterial era un criterio
de eficacia en este estudio. El contenido de oxígeno arterial es
una medida de la capacidad de transporte de oxígeno de la
hemoglobina celular y del plasma y del oxígeno disuelto en el
plasma. En ausencia de hemoglobina en el plasma, el contenido de
oxígeno arterial se calcula a partir de la cantidad de oxígeno
transportado por la hemoglobina celular saturada y la presión
parcial del oxígeno inspirado. Puesto que se esperaba que la
hemoglobina en el plasma contribuyera de forma significativa al
contenido de oxígeno en este estudio, el contenido de oxígeno se
midió directamente usando un instrumento Lex02Con-K
(Chestnut Hill, MA). No se administró aire enriquecido en oxígeno
durante el experimento puesto que no era necesario y para evitar
los efectos desconcertantes de una concentración de oxígeno
inspirado aumentada en la medición del contenido de oxígeno
arterial.
Los contenidos de oxígeno venoso y arterial
medio disminuyeron en aproximadamente cuatro y ocho veces,
respectivamente en todos los grupos después de la inducción de la
anemia. El contenido de oxígeno arterial aumentó significativamente
60 minutos después de la dosificación en comparación con los valores
antes de la dosificación en los grupos tratados con sustitutos de
la sangre de Hb y permanecieron aumentados de forma significativa a
las 24 horas después de la dosificación en los grupos de dosis
media y alta. El contenido de oxígeno venoso o arterial no cambió
después de la dosificación en el grupo de control.
Como se muestra en la Figura 2, el contenido de
oxígeno arterial aumentó de forma significativa en los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb en comparación a los
grupos de control a los 60 minutos y 24 horas después de la
dosificación. Se observó una respuesta a la dosis lineal a los 60
minutos y 24 horas después de la dosificación. Se detectó un efecto
de volumen significativo para el contenido de oxígeno arterial 60
minutos después de la dosificación.
El contenido de oxígeno venoso también aumentó
significativamente en grupos tratados con el sustituto de la sangre
de Hb en comparación con controles a los 60 minutos y 24 horas
después de la dosificación. El aumento mostró una respuesta a la
dosis lineal a los 60 minutos después de la dosificación pero no a
las 24 horas.
El efecto de la dosis observado para los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb en la diferencia de
contenido de oxígeno arterial-venoso
(A-V) a los 60 minutos después de la dosificación se
atribuyó a los efectos de volumen significativos basados en la
ausencia de un efecto del fármaco y las observaciones similares de
los efectos del volumen en grupos de control a los 60 minutos
después de la dosificación. Los grupos tratados con el sustituto de
la sangre de Hb mostraron un aumento significativo en la diferencia
de oxígeno A-V a las 24 horas en comparación con
los controles coloidales, con una respuesta a la dosis lineal
significativa. La diferencia de A-V debe
interpretarse en vista del gasto cardíaco. A las 24 horas después de
la dosificación, la diferencia A-V en los grupos de
control era significativamente más baja que la de los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb. Una posible
explicación para esta diferencia es que los perros del grupo de
control tenían que depender de un gasto cardíaco más alto para
satisfacer las necesidades de consumo de oxígeno de los tejidos
periféricos. Los grupos tratados con el sustituto de la sangre de Hb
mantenían una diferencia de A-V lo suficientemente
grande a las 24 horas después de la dosificación para satisfacer las
necesidades del tejido periférico sin causar un gasto cardíaco
aumentado.
Además del contenido de oxígeno arterial, se
examinaba en este estudio el contenido de oxígeno arterial total
normalizado en relación con la contribución de la hemoglobina RBC
canina (CaO_{2}/g Hb de RBC). Esta comparación se realizó para
demostrar las diferencias en el contenido de oxígeno arterial entre
los grupos de dosificación puesto que la hemoglobina de RBC era
constante en todos los grupos. La correlación potencial de la
concentración de plasma o de hemoglobina total y el contenido de
oxígeno arterial podría proporcionar una medición clínica útil de
la eficacia. Como se muestra en la Figura 3, a los 60 minutos y a
las 24 horas después de la dosificación, todos los grupos tratados
con el sustituto de la sangre de Hb (excepto el grupo de dosis más
baja a las 24 horas) mostraron un aumento significativo en la
CaO_{2}/g de hemoglobina de RBC con respecto a los valores de
antes de la dosificación. El contenido de oxígeno arterial en
relación con el aportado por la hemoglobina de RBC no difería
significativamente en los controles coloidales entre antes de la
dosis y 60 minutos o 24 horas después de la dosificación.
El contenido de oxígeno arterial total en
relación con el aportado por la hemoglobina de los glóbulos rojos
aumentaba significativamente en grupos tratados con el sustituto de
la sangre de Hb en comparación con controles coloidales a los 60
minutos después de la dosificación con una respuesta a la dosis
lineal significativa. También se producía un efecto de la dosis
significativo a las 24 horas después de la dosificación con una
respuesta a la dosis lineal significativa, pero el efecto del
fármaco no era lo bastante significativo (P < 0,06).
El suministro de oxígeno era otro criterio de
eficacia. El suministro de oxígeno se calcula en base al contenido
de oxígeno arterial y el gasto cardíaco. Por lo tanto, el suministro
de oxígeno está afectado por todos los factores fisiológicos que
influyen en el gasto cardíaco. El control elegido para este estudio
era el coloide sintético
(RHEOMACRODEX^{TM}-Saline, Pharmacia) que es
Dextrano 40 al 10% y solución salina al 0,9%, puesto que aumenta el
volumen intramuscular y no se le conoce transporte de oxígeno. El
control proporcionaba una comparación del aumento de volumen
equivalente a las propiedades coloidales de la hemoglobina en el
sustituto de la sangre de Hb.
Puesto que se esperaba que cada dosis de
sustituto de la sangre de Hb demostrara un efecto de volumen
distinto, se usaron dos dosis de solución de Dextrano como
controles para el efecto del volumen de modo que los datos pudieran
reflejar solamente el efecto del fármaco de diferentes dosis. Esta
comparación se realizó para las dosis baja y media. Las dosis de
controles coloidales se seleccionaron en base a las dosis de
Dextrano 40 que proporcionaban una comparación equivalente de los
efectos oncóticos in vivo de los artículos de ensayo de
dosis baja y media, según se ha determinado a partir de los
resultados del Ejemplo 2.
El efecto del volumen se definió
estadísticamente usando la diferencia en las medias entre la dosis
media coloidal (14 ml/kg) y la dosis baja coloidal (7 ml/kg). El
efecto del fármaco se determinó mediante la comparación de cada
grupo tratado con sustituto de la sangre de Hb con su control
coloidal correspondiente. Se estableció una respuesta a la dosis
lineal cuando se observó una diferencia estadísticamente
significativa entre los grupos tratados con sustituto de la sangre
de Hb de dosis baja y alta.
El suministro de oxígeno se calculó de acuerdo
con la ecuación: DO_{2} = CO x CaO_{2} x 10/kg donde CO es el
gasto cardíaco y CaO_{2} es el contenido de oxígeno arterial. Como
se esperaba, después de la inducción de la anemia en todos los
grupos de tratamiento, se produjo una disminución media en DO_{2}
de dos o tres veces en todos los grupos. El contenido de oxígeno
disminuyó lo suficiente para que el mantenimiento del consumo de
oxígeno de referencia tuviera que ser el resultado de un aumento en
el gasto cardíaco y una extracción aumentada de oxígeno, dando como
resultado un contenido de oxígeno venoso inferior. Como se muestra
en la Figura 4, el suministro de oxígeno aumentó aproximadamente en
el 30% en el grupo tratado con sustituto de la sangre de Hb a dosis
baja y más del 100% en los grupos tratados con sustituto de la
sangre de Hb a dosis media y alta a los 60 minutos después de la
dosificación en comparación con los valores anteriores a la dosis.
La diferencia fue significativa para los tres grupos de dosificación
(p < 0,05). Los grupos de control no mostraron diferencias
significativas durante este periodo. A los 60 minutos después de la
dosificación, el DO_{2} difería significativamente entre todos
los grupos con efectos de fármaco y de dosis significativos con una
respuesta a la dosis lineal. A las 24 horas, no se observaba
diferencia en el suministro de oxígeno entre los grupos. La mejora
en el suministro de oxígeno a los 60 minutos después de la
dosificación para todos los grupos tratados con el sustituto de la
sangre de Hb, en comparación con sus controles coloidales
correspondientes, se debía principalmente a un aumento relacionado
con la dosis en el contenido de oxígeno arterial además de un
modesto aumento en el gasto cardíaco.
El consumo de oxígeno se calculó de acuerdo con
la ecuación VO_{2} = CO x CaO_{2} x 10 kg. Se produjo una
disminución media en DO_{2} de dos o tres veces en todos los
grupos después de la inducción de la anemia. No se observaron
diferencias estadísticamente significativas entre los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb o los grupos de
control o entre un grupo cuando se comparaban valores anteriores a
la dosificación con posteriores a la dosificación.
La Proporción de Extracción de Oxígeno
(VO_{2}/DO_{2}) para todos los grupos mostró un aumento de
aproximadamente tres veces después de la inducción de la anemia.
Las proporciones de extracción de oxígeno disminuyeron de forma
significativa de manera dependiente de la dosis en todos los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb a los 60 minutos
después de la dosificación en comparación a los grupos de control.
No se observaron diferencias significativas entre los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb y los grupos de control
a las 24 horas después de la dosificación.
El gasto cardíaco medio aumentó entre el 10% y
el 39% en todos los grupos después de la inducción de la anemia. El
gasto cardíaco aumentó de forma significativa a las 24 horas después
de la dosificación en comparación con los valores anteriores a la
extracción de sangre en los grupos coloidales de control pero no en
los grupos tratados con el sustituto de la sangre de Hb. Un efecto
de volumen significativo que contribuía a las diferencias
significativas en el gasto cardíaco entre los grupos coloidales de
dosis baja y media era evidente a los 60 minutos después de la
dosificación. El aumento en el gasto cardíaco estaba relacionado
probablemente con un volumen de impulso aumentado debido al aumento
del volumen intravascular después de la dosificación o a un tono
simpático aumentado debido al estrés de la anemia grave. A los 60
minutos era evidente una respuesta a la dosis significativa entre
los grupos con dosis baja y media de sustituto de la sangre de Hb,
pero no a las 24 horas después de la dosificación. No se observó
diferencia en el gasto cardíaco entre los grupos tratados con el
sustituto de la sangre de Hb y los grupos de control coloidales a
los 60 minutos o a las 24 horas después de la dosificación.
La presión en la porción de la arteria pulmonar
(PAWP) no cambió de forma significativa durante la inducción de la
anemia. PAWP disminuyó de forma significativa en el grupo coloidal
de dosis baja y permaneció sin cambios en el grupo coloidal de
dosis media, 60 minutos después de la dosificación en comparación
con los valores antes de la dosificación. La PAWP en los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb de dosis media y alta
aumentó de forma significativa en una respuesta a la dosis lineal en
comparación con los valores anteriores a la dosificación a los 60
minutos después de la dosificación. La PAWP aumentada reflejaba un
aumento dependiente de la dosis en el volumen intravascular a los
60 minutos después de la dosificación. No se detectó efecto del
fármaco significativo entre los grupos tratados con el sustituto de
la sangre de Hb y los grupos de control a los 60 minutos o a las 24
horas después de la dosificación. Se detectó un efecto del volumen
significativo en los grupos de control coloidal a los 60 minutos
después de la dosificación.
La presión sanguínea arterial sistólica,
diastólica y media disminuyeron de forma significativa en todos los
grupos después de la inducción de la anemia, aumentando después de
forma significativa inmediatamente después de la dosificación. La
disminución en la presión arterial sistólica después de la inducción
de la anemia estaba relacionada probablemente con una disminución
en la resistencia vascular periférica debido a la viscosidad
sanguínea disminuida, una consecuencia de la anemia. A los 60
minutos después de la dosificación, las presiones sanguíneas
arteriales sistólica, diastólica y media de los grupos de control
coloidales no diferían significativamente de los valores anteriores
a la dosificación. Las presiones sistólica, diastólica y media del
control coloidal de dosis baja aumentaron de forma significativa en
comparación con los valores anteriores a la dosificación a las 24
horas después de la dosificación. Por el contrario, el aumento de
las presiones sistólica, diastólica y media era estadísticamente
significativo en todos los grupos tratados con el sustituto de la
sangre de Hb a los 60 minutos y 24 horas después de la dosificación
en comparación con los valores anteriores a la dosificación. Las
presiones sanguíneas sistólica, diastólica y media de los grupos
tratados con el sustituto de la sangre de Hb eran
significativamente más altas que las de los grupos de control
coloidales correspondientes a los 60 minutos después de la
dosificación, pero no a las 24 horas.
Se observaron aumentos significativos en las
presiones arteriales pulmonares sistólica, diastólica y media en
los grupos tratados con el sustituto de la sangre de Hb de dosis
media y alta 60 minutos después de la dosificación en comparación
con los valores anteriores a la dosificación. El aumento persistía a
las 24 horas después de la dosificación en el grupo tratado con el
sustituto de la sangre de Hb de dosis media para la presión
arterial pulmonar diastólica. Adicionalmente, el grupo coloidal de
dosis baja mostraba un aumento estadísticamente significativo a las
24 horas después de la dosificación en comparación con los valores
anteriores a la dosificación para la presión arterial pulmonar
media. Este aumento se consideró clínicamente significativo. Los
aumentos de la presión sanguínea arterial sistémica, sistólica y
diastólica 60 minutos después de la dosificación de sustituto de la
sangre de Hb, en comparación con los valores anteriores a la
dosificación, eran un efecto del fármaco directo del sustituto de
la sangre de Hb. La presión diastólica permaneció sin cambios en los
grupos de control coloidal lo que era probablemente un resultado de
la resistencia vascular periférica disminuida.
No se encontraron diferencias significativas
entre los grupos tratados con el sustituto de la sangre de Hb y los
de control para la presión arterial sistólica pulmonar a los 60
minutos o a las 24 horas después de la dosis. Por el contrario, las
presiones arteriales pulmonares diastólica y media eran
significativamente diferentes con respecto a los efectos de
volumen, fármaco, y dosis a los 60 minutos después de la
dosificación, pero no a las 24 horas.
La hemoglobina total disminuyó aproximadamente
cuatro veces o más con la extracción de sangre. Los grupos tratados
con el sustituto de la sangre de Hb mostraron un aumento dependiente
de la dosis en la inmunoglobulina total en comparación con los
grupos de control coloidales correspondientes a los 60 minutos y a
las 24 horas después de la dosificación.
Las concentraciones de hemoglobina en plasma
aumentaron de forma significativa de manera dependiente de la dosis
en los grupos tratados con el sustituto de la sangre de Hb en
comparación con los grupos de control coloidales correspondientes a
los 60 minutos y a las 24 horas después de la dosificación. Los
aumentos en las concentraciones de plasma y hemoglobina total
después de la dosificación en todos los grupos tratados con el
sustituto de la sangre de Hb, en comparación con sus controles
coloidales correspondientes, eran atribuibles al contenido de
hemoglobina del sustituto de la sangre de Hb. El aumento
significativo dependiente de la dosis persistió durante 24 horas,
lo que correlacionaba con el aumento persistente en el contenido de
oxígeno arterial.
En resumen, la respuesta al tratamiento con el
sustituto de la sangre de Hb fue lineal, es decir, a los 60 minutos
después de la dosificación, cuanto mayor era la dosis del sustituto
de la sangre de Hb mayor era la mejora en el suministro de oxígeno
y los parámetros hemodinámicos en comparación con los controles
coloidales correspondientes. El contenido de oxígeno arterial
sostenido y los síntomas clínicos normales, mientras se respiraba
aire ambiental, apoyan el efecto biológico benéfico del sustituto de
la sangre de Hb que dura 24 horas en los grupos tratados con el
sustituto de la sangre de Hb a la dosis de 30 ml/kg y 45 ml/kg. La
eliminación del sustituto de la sangre de Hb probablemente explica
los cambios observados en el suministro de oxígeno y en los efectos
hemodinámicos a las 24 horas después de la dosificación. En
conclusión, los resultados de este estudio apoyan la selección de
una dosis que varía de 30 a 40 ml/kg. Estos dos grupos de
dosificación mostraron diferencias estadísticamente significativas
con respecto a los grupos de control coloidales en los parámetros
de eficacia, y la respuesta a la dosis fue lineal.
El fundamento clínico de este intervalo de
dosificación se basa en el hecho de que un perro gravemente anémico
(por ejemplo, hematocrito inferior al 50% con síntomas clínicos
marcados) se beneficiaría de una dosis mayor como se demuestra
mediante la respuesta a dosis lineal del contenido de oxígeno
arterial y el suministro de oxígeno mejorados. Sin embargo, una
dosis más prudente podría ser indicada para un perro que puede estar
predispuesto a la sobrecarga de volumen intravascular. El aumento
transitorio dependiente de la dosis en la presión de la porción
arterial pulmonar y las presiones arteriales pulmonares observado 60
minutos después de la dosificación en grupos tratados con el
sustituto de la sangre de Hb limitaría el uso de una dosis mayor en
esta población de perros. Por lo tanto, un intervalo de
dosificación de 30-45 ml/kg sería eficaz en una
amplia población de perros en la que están definidos el grado de
anemia y estatus de volumen intravascular.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este estudio se realizó para evaluar la
seguridad y tolerancia de tasas en aumento de administración
intravenosa de sustituto de la sangre de Hb (en lo sucesivo HBOL)
sobre los parámetros hemodinámicos, neuroendocrinos y hematológicos
en seres humanos. Los sujetos del ensayo eran machos adultos sanos
normales (70-90 kg) entre las edades de
18-45 años. Durante el estudio, los sujetos de
ensayo se sometieron a dietas isocalóricas controladas de
carbohidratos al 55%, grasas al 30% (una proporción de grasas
poliinsaturadas a saturadas de 2:1), proteínas al 15% y 150 mEq de
sodio por día. La toma de líquidos era de al menos 3000 ml/día
evitando las bebidas que contenían cafeína. También se evitó el uso
concomitante de medicamentos. Además los sujetos de ensayo no usaron
alcohol ni tabaco durante el estudio.
Los 12 sujetos estudiados, se dividieron en tres
grupos de ensayo. En cada grupo de ensayo tres sujetos recibieron
HBOL y uno sirvió como control, recibiendo Solución de Ringer
Lactato. Cada grupo de ensayo tenía diferentes tasas de infusión de
HBOL. El estudio se realizó como un único estudio ciego de tasas
escalonadas durante un intervalo de treinta días.
En el día 1 del estudio, durante la fase de
hospitalización, cada sujeto tenía un catéter arterial de pequeño
calibre insertado en la arteria radial de la mano no dominante. El
punto de inserción se lavó con una solución aséptica (alcohol y/o
yodo) y después se inyectó por vía subcutánea una pequeña cantidad
de solución anestésica de lidocaína al 1%-2% en el sitio de la
arteria radial. El catéter arterial se insertó para controlar la
presión sanguínea y para facilitar las evaluaciones de gases
sanguíneos. Una o dos horas después, todos los sujetos tenían un
catéter intravenoso de gran calibre (aguja del calibre 16 en la fosa
antecubital) colocado en una vena en un brazo. Cada sujeto tenía
después una flebotomía de 750 ml (1,5 unidades) de retirada de
sangre total en menos de 15 minutos, a la que seguía después una
hemodilución isovolémica mediante la infusión de 2250 ml de lactato
de Ringer durante un período de 2 horas.
Después se infundieron por vía intravenosa
cuarenta y cinco gramos (346 ml) de HBOL usando una técnica estéril,
en series a través de un filtro sanguíneo de 80 micrómetros
convencional, un filtro de 5 micrómetros, y el catéter intravenoso
de gran calibre en la vena del brazo, en cada sujeto en los grupos
de ensayo 1, 2 y 3 a las tasas de 0,5 g/minuto, 0,75 g/minuto y 1,0
g/minuto, respectivamente.
Simultáneamente, cada sujeto tenía un control
invasivo mediante un catéter en la arteria radial, ensayos de la
función pulmonar serial, evaluación de la función cardiaca y ensayos
múltiples de hematología química y análisis urinario de laboratorio
que se realizaban de forma rutinaria y frecuente durante las
primeras 28 horas después de comenzar la infusión de HBOL.
Posteriormente, en la fase de paciente externo
(Días 2-29), se tomaron diariamente estudios de
laboratorio, signos vitales, ECG y sucesos médicos durante los
primeros cuatro días después de la descarga y después a intervalos
semanales durante un mes.
La hemodinámica era extraordinaria por unos
valores generalmente más altos de la presión arterial sistólica,
diastólica y media en los grupos tratados con HBOL (después de la
infusión) que en los controles durante el Día 1. Aunque había una
marcada variabilidad en los datos de la presión sanguínea en
proporción a la actividad del paciente (por ejemplo, durante las
comidas o cuando usaban el baño) y el ritmo diurno, los sujetos
tratados con HBOL generalmente tenían valores para la presión
sanguínea sistólica (aproximadamente 5-15 mm de Hg),
presión sanguínea diastólica (aproximadamente 5-10
mm de Hg) y presión arterial media (aproximadamente 10 mm Hg)
mayores que los controles solamente durante el transcurso del Día 1.
Los valores tendían a alcanzar efectos pico entre las horas
8-12 con retorno al punto de referencia durante el
sueño y después de la retirada del catéter arterial. El pulso
estaba generalmente en aproximadamente 10 pulsaciones por debajo en
todos los grupos tratados con HBOL en comparación con los controles
durante el Día 1. El punto más bajo del descenso de pulso se
observó en los primeros 15 minutos de la infusión. Los valores eran
similares en todos los grupos de ensayo después de la hora 24.
El índice cardíaco disminuyó aproximadamente
1-2 l/min/m^{2} durante la primera hora de
infusión y permaneció hasta 1 l/min/m^{2} más bajo que en los
controles hasta la hora 4, y después retornó al punto de referencia
en la hora 4. El índice cardíaco también aumentó durante los
momentos de actividad del paciente (como anteriormente).
La resistencia periférica total era paralela a
los cambios de presión sanguínea, sin embargo, los valores
retornaban al punto de referencia en dos horas. El aumento
transitorio en la presión sanguínea sistémica con un aumento en la
resistencia periférica total y una disminución en el índice cardíaco
no es inesperado. Es importante observar que no había diferencia en
la fase de administración y la magnitud de estas respuestas
hemodinámicas y que no se indicaba ninguna intervención.
Los ensayos de función pulmonar (incluyendo
determinaciones múltiples de la espirometría y volúmenes pulmonares)
y las mediciones del gas sanguíneo no eran extraordinarios. Lo que
era importante observar era la capacidad de difusión potenciada que
se observaba en los grupos tratados con HBOL. El aumento del
10-15% en la capacidad de difusión era
estadísticamente significativo en comparación con una disminución
del 10% en los grupos de control durante hasta 24 horas. Estos
descubrimientos son particularmente importantes por causa de la
magnitud de la flebotomía y la hemodilución que experimentaron
todos los grupos.
En los estudios hematológicos, a diferencia de
lo esperado, la disminución transitoria en la hemoglobina,
hematocrito, el recuento de glóbulos rojos y las proteínas en el
suero con los procedimientos de flebotomía y hemodilución, y los
ensayos de hematología y química del suero de laboratorio no fueron
extraordinarios. Las excepciones fueron el hierro y la ferritina en
el suero que mostraron valores pico a las horas 6 y 48,
respectivamente, después de que se administró la HBOL.
Las mediciones de la química del suero no fueron
extraordinarias, con la excepción de un sujeto (Nº 10) que tenía
aumentos transitorios en las transaminasas y lipasa del suero. Es
importante observar que este sujeto no había tenido ningún suceso
médico concomitante significativo clínicamente (por ejemplo,
disfagia o dolor abdominal) en proporción al tiempo de elevación de
estas enzimas. La etiología exacta de estas anormalidades de
laboratorio no está clara, pero estudios previos sugieren que los
espasmos subclínicos transitorios del esfínter de Oddi u otras
porciones de los sistemas conductores hepatobiliares y pancreáticos
pueden estar implicados. Es importante observar que estos cambios
fueron transitorios (y no estuvieron acompañados por incomodidad
abdominal) y sin secuelas aparentes. No se observó un cambio
significativo en el sujeto 10 después de una exploración por
ultrasonidos de la vesícula biliar después de la dosis.
El análisis urinario no fue extraordinario
durante todo el estudio. No había hemoglobina urinaria detectable
en los sujetos durante el estudio. Además, la eliminación de la
creatinina era ligeramente superior, como se esperaba, durante el
período de hemodilución), la proteína de unión a adenosina
desaminasa urinaria, los electrolitos (sodio, potasio, cloruro), el
hierro, la microalbúmina, NAG
(N-acetil-beta-glucosaminidasa)
y el nitrógeno en la urea urinaria no eran extraordinarios.
No se observaron cambios aparentes en la mayoría
de los parámetros farmacocinéticos como una función de la tasa de
administración. Se recogieron muestras sanguíneas secuenciales y
muestras de orina acumulativas antes de y después del inicio de la
infusión de HBOL para análisis cromatográfico de exclusión por
tamaños (SEC) (filtración en gel) de la hemoglobina total y las
fracciones de peso molecular aparente de hemoglobina. Solamente se
observaron concentraciones de fracciones diméricas en plasma
esporádicas que excluían cualquiera análisis farmacocinético. Las
únicas diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) se
observaron en el volumen del tetrámero de la distribución
(disminuciones con aumentos en la tasa), la concentración máxima de
tetrámero conseguida (aumentos con aumentos en la tasa) y el tiempo
de la producción de la concentración máxima de tetrámeros
(disminuciones con aumentos en la tasa).
Los sucesos médicos observados eran consecuentes
con los descubrimientos esperados con relación a la flebotomía (por
ejemplo, episodio vasovagal), ensayos de función pulmonar múltiple
(aerofagia), eructos o "gas" abdominal), inserción del tubo
arterial (por ejemplo, dolor u hormigueo en el sitio), o incomodidad
abdominal (por ejemplo, asociada con la ingestión del suplemento de
hierro). Aunque parecía haber un trasfondo de "gas" abdominal
transitorio no específico, no había casos de dolor abdominal o
disfagia. Además no había correlación de estos síntomas con
cualquier alteración en las transaminasas o lipasas del suero.
En resumen, la HBOL era bien tolerada. Aunque
había pequeños aumentos transitorios de la presión sanguínea y de
la resistencia periférica total con una disminución en relación con
el índice cardíaco durante las dos primeras horas de la infusión,
la hemodinámica no era extraordinaria. El aumento de la capacidad de
difusión era significativamente mayor en los grupos tratados con
HBOL que en los controles durante las primeras 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este estudio se realizó para evaluar la
capacidad de esfuerzo de sujetos a los que se les había administrado
una transfusión autóloga de HBOL. Los puntos finales específicos
incluían la función pulmonar (por ejemplo, capacidad de difusión y
niveles de ácido láctico y de pO_{2}), la hemodinámica (por
ejemplo, ritmo cardíaco, índice cardíaco y presión sanguínea) y la
tolerancia al ejercicio (por ejemplo, duración, trabajo y umbral
anaeróbico). Los sujetos eran seis seres humanos macho, sanos,
normales, edades de 18-45 años. Se sustituyó a un
sujeto en el estudio debido a la no consecución de la obtención del
volumen de flebotomía en menos de 15 minutos. El estudio se realizó
como un estudio de cruce de dos vías de ciego único
aleatorizado.
Todos los sujetos tenían flebotomía de 750 ml
seguida de Lactato de Ringer [3:1] y/o una transfusión autóloga
(ATX) o 45 g de HBOL. La ATX o HBOL se administró a 0,5 g/min
durante 90 minutos. Los ensayos de esfuerzo en bicicleta estática
se realizaron en el día antes de la flebotomía y aproximadamente 45
minutos después de la infusión de ATX o HBOL. Los mismos
procedimientos se repitieron una semana después y los sujetos se
cruzaron con el tratamiento opuesto.
En el día de las dosificaciones (Día 1 y 8),
todos los sujetos tuvieron la inserción de un tubo arterial en una
arteria radial, unida a la telemetría cardiaca y la cardiografía de
impedancia y después flebotomía (PBX) de 750 ml de sangre total
(< 15 minutos). Esto estaba seguido por una infusión de 2250 ml
de lactato de Ringer (RL) durante dos horas (la fase de
hemodilución isovolémica). Los sujetos recibieron después HBOL (45
g [aproximadamente 346-360 ml] a una tasa de 0,5
g/min durante 90 minutos) o una ATX (110-120 g de
hemoglobina [aproximadamente 750 ml] a la misma tasa y duración que
la HBOL). El BEST se realizó aproximadamente 45 minutos después del
fin de cada infusión. Se realizaron de forma intensiva mediciones
seriadas de los gases sanguíneos arteriales, la hematología, la
química y la orina durante el período de 24 horas en los Días 1 y 8.
Se realizó el seguimiento en serie en un régimen de paciente
externo entre las dosis y durante un mes después de que toda la
dosificación se completó.
Los sujetos eran capaces de esforzarse a niveles
similares durante los períodos de HBOL y ATX. La toma de oxígeno
(VO_{2}) y la producción de dióxido de carbono (VCO_{2}) en el
umbral anaeróbico eran prácticamente idénticas. El esfuerzo real en
METS, vatios, pulso (como un % del pulso máximo), tiempo hasta el
umbral anaeróbico, volumen tidal (VT) y ventilación por minuto (VE)
también eran similares. Los valores de gases sanguíneos arteriales
también eran similares durante los períodos de HBOL y ATX. Las
pequeñas reducciones en pH y bicarbonato con aumento en el ácido
láctico son coherentes con los descubrimientos esperados en el
umbral anaeróbico. Los resultados de estos ensayos de bicicleta
mostraron que la capacidad de esfuerzo (definida como el tiempo y
el esfuerzo para alcanzar el umbral anaeróbico) eran similares en el
punto de referencia y después de las infusiones de transfusión
autóloga o HBOL. Específicamente, la hemodinámica era extraordinaria
para valores ligeramente mayores (-5 mmHg) durante el período de
HBOL para la presión arterial sistólica, diastólica y media. En
relación con el aumento en la presión sanguínea había un aumento en
la resistencia periférica total, generalmente en las primeras 4
horas. El índice cardíaco disminuyó durante el período de HBOL (-0,5
l/min/m^{2}). El pulso estaba entre aproximadamente
5-10 pulsaciones por debajo durante el período de
HBOL que durante el período de ATX. Estos descubrimientos se han
observado en los estudios de HBOL y han sido de poco interés
clínico.
Los ensayos de la función pulmonar no eran
extraordinarios excepto por un aumento del 14% por encima del punto
de referencia en la capacidad de difusión después de la infusiones
de ATX y HBOL. Los sujetos eran capaces de alcanzar capacidad de
esfuerzo similar durante los periodos de HBOL y ATX. Las mediciones
del gas sanguíneo arterial durante los picos de ejercicio (umbral
anaeróbico) fueron similares en ambos periodos, pero la pO_{2}
arterial tendía a ser más alta durante el periodo de HBOL. Los
niveles de ácido láctico en el plasma eran inferiores durante el
periodo de HBOL que durante el de ATX. Las mediciones en reposo de
la técnica metabólica indicaban que el consumo de oxígeno, la
producción de hidróxido de carbono y el gasto de energía metabólica
fueron mayores durante el periodo de HBOL que durante el de ATX. La
comparación como se ha mencionado anteriormente es de
aproximadamente un gramo de HBOL a 3 gramos de ATX. La capacidad de
difusión acoplada con las observaciones acerca de VO_{2} y
VCO_{2} indican que se administra más oxígeno a nivel tisular por
gramo de HBOL que de ATX. Comúnmente se cree que la capacidad de
difusión varía directamente con el nivel de hemoglobina, sin
embargo, hay una sugerencia que de 1 gramo de hemoglobina en el
plasma puede aumentar la capacidad de difusión tanto como 3 gramos
de hemoglobina de RBC.
Los estudios de laboratorio fueron notables por
aumentos pequeños pero transitorios en ALT, AST,
5'-nucleosidasa, lipasa y creatina quinasa durante
el periodo de HBOL. No había descubrimientos urinarios
anormales.
Los estudios hemotológicos eran coherentes con
los del Ejemplo 5.
Los sucesos médicos observados eran coherentes
con los descubrimientos esperados relacionados con la flebotomía
(por ejemplo episodio vasovagal), ensayos de la función pulmonar
múltiple (eructo o "gas" abdominal) inserción de tubo arterial
(por ejemplo, dolor u hormigueo en el sitio de inserción) o
numerosas quejas habituales que pueden observarse en sujetos
normales durante el transcurso de un mes (por ejemplo, dolor de
cabeza, infección del tracto respiratorio superior o resfriado). Un
sujeto (sujeto nº 105) que tenia "gas" abdominal y presión en
el epigastrio medio, pero si disfagia sugiere otras quejas
gastrointestinales que se han observado en estudios previos de
HBOL. Se usó L-arginina como una medida terapéutica
basada en el concepto de que la hemoglobina puede impedir la
función del óxido nítrico endógeno (el óxido nítrico es un
integrante de la relajación del músculo liso gastrointestinal,
especialmente en el esófago y en los intestinos).
L-arginina es el sustrato a partir del cual la
óxido nítrico sintasa produce óxido nítrico. Teóricamente, si se
tiene una reducción en óxido nítrico a partir de la hemoglobina
(quizás uniendo hemo al óxido nítrico), entonces la administración
de L-arginina puede ser beneficiosa. Aparentemente
el sujeto consiguió un alivio marcado y transitorio de estos
síntomas con la L-arginina durante aproximadamente 2
horas. Este no es un descubrimiento inesperado, puesto que la
semivida en el plasma de la L-arginina es de
aproximadamente una hora. Desafortunadamente, se produjeron algunos
de los efectos secundarios (nauseas y vómitos) y la infusión se
detuvo. Se prefirió administrarle dos dosis de un fármaco
anticolinérgico antiespasmódico, hiosciamina. Esto continúo
reduciendo aparentemente los síntomas de "gas" y presión
abdominal. El sujeto no tuvo más que quejas o secuelas.
En resumen, HBOL estaba asociada con el
suministro de oxígeno mejorado y la utilización durante el ejercicio
y el descanso. HBOL produjo un espectro de hemodinámica, resultados
de seguridad de laboratorio, farmacocinética y sucesos médicos,
similar al que se había observado previamente. La intervención con
L-arginina puede producir una inversión de los
síntomas gastrointestinales, pero su uso estaba limitado por nauseas
y vómitos. Sin embargo, el uso de terapia anticolinérgica puede ser
valioso en el tratamiento para los síntomas gastrointestinales que
se presentan.
Los especialistas en la técnica reconocerán, o
serán capaces de determinar usando solamente experimentación
rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la
invención descritas en este documento. Estos y otros de dichos
equivalentes pretenden abarcar las siguientes reivindicaciones.
Claims (10)
1. Un procedimiento para producir un producto de
hemoglobina purificada, que comprende las etapas de:
- (a)
- introducir una solución de hemoglobina en una columna de cromatografía de intercambio aniónico; e
- (b)
- inyectar al menos una solución de tampón de acetato de tris(hidroximetil) aminometano en la columna, teniendo dicha solución tampón un pH inferior al de la columna, con lo cual se eluye de la columna un producto de hemoglobina purificada.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se inyectan al menos dos soluciones tampón de acetato de
tris(hidroximetil)aminometano de forma secuencial en
la columna, teniendo cada una de dichas soluciones tampón un pH
distinto, con lo cual la columna se somete a un gradiente de pH por
etapas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la columna se equilibra con al menos una solución tampón de
acetato de tris(hidroximetil)aminometano antes de la
elución del producto de hemoglobina.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la columna se equilibra a un pH en un intervalo de
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que se inyectan al menos once volúmenes vacíos de columna de la
solución tampón en la columna durante dicho equilibrado de la
columna.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la columna se equilibra
inicialmente a un pH en un intervalo de entre:
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la columna se equilibra inicialmente con acetato de
tris(hidroximetil) aminometano.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el producto de hemoglobina
se eluye con un tampón a un pH
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el medio de intercambio
aniónico se selecciona entre el grupo constituido por un gel de
sílice que contiene amina o amonio, gel de alúmina, gel de titanio,
dextrano reticulado, agarosa, una poliacrilamida, un
polihidroxietil-metacrilato o estiren
divinilbenceno.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el medio de intercambio aniónico es un gel de sílice que
contiene amina o amonio.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US113953 | 1998-07-10 | ||
| US09/113,953 US6150507A (en) | 1995-03-23 | 1998-07-10 | Method for producing a purified hemoglobin product |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2278450T3 true ES2278450T3 (es) | 2007-08-01 |
Family
ID=22352497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99930467T Expired - Lifetime ES2278450T3 (es) | 1998-07-10 | 1999-06-21 | Procedimiento para purificar hemoglobina. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150507A (es) |
| EP (1) | EP1097171B1 (es) |
| JP (1) | JP4581110B2 (es) |
| CN (1) | CN1166689C (es) |
| AT (1) | ATE347564T1 (es) |
| AU (1) | AU755280B2 (es) |
| CA (1) | CA2336808C (es) |
| DE (1) | DE69934312T2 (es) |
| DK (1) | DK1097171T3 (es) |
| ES (1) | ES2278450T3 (es) |
| HK (1) | HK1037643A1 (es) |
| NZ (1) | NZ509257A (es) |
| WO (1) | WO2000002921A1 (es) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001076507A2 (en) | 2000-04-11 | 2001-10-18 | The University Of Miami | Use of oxygen carriers to improve grafted cell survival in neural transplantation |
| FR2824568B1 (fr) * | 2001-05-11 | 2004-04-09 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique |
| US7038016B2 (en) | 2001-08-21 | 2006-05-02 | Apex Bioscience, Inc. | Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution |
| AU2003265994B2 (en) | 2002-09-11 | 2010-04-01 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| JP2006502231A (ja) * | 2002-10-03 | 2006-01-19 | ノースフィールド ラボラトリーズ、インコーポレイテッド | 大量失血を被っている患者の処置方法 |
| MXPA05007885A (es) * | 2003-01-29 | 2005-09-21 | Northfield Lab | Soluciones de hemoglobina polimerizada que tienen cantidad reducida de tetramero y metodo para prepararlas. |
| EP1712562A4 (en) * | 2003-12-26 | 2007-02-07 | Oxygenix Co Ltd | PROCESS FOR PURIFYING THE HEMOGLOBIN |
| US20090117207A1 (en) * | 2005-11-29 | 2009-05-07 | Zoltani Csaba K | Methods and compositions for treatment of poison-caused pathology |
| US20090004159A1 (en) * | 2006-01-24 | 2009-01-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi | Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells |
| US20070196810A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-23 | Northfield Laboratories Inc. | Polymerized Hemoglobin Media and its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells |
| CN101522884B (zh) * | 2006-08-15 | 2013-08-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 从生产细胞中分离蛋白质的方法 |
| JP2011207853A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Terumo Corp | 人工酸素運搬体製造に用いるヘモグロビン原料中間生成物 |
| JP6786917B2 (ja) * | 2016-07-08 | 2020-11-18 | 東ソー株式会社 | ヘモグロビン調製液及びヘモグロビン類測定液体クロマトグラフィー法 |
| US20200393472A1 (en) * | 2018-04-18 | 2020-12-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Haemoglobin analysis method |
| CN110128531B (zh) * | 2019-05-17 | 2022-03-08 | 润方（北京）生物医药研究院有限公司 | 一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法 |
| CN110563836A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-13 | 润方（北京）生物医药研究院有限公司 | 交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2449885C3 (de) * | 1974-10-21 | 1980-04-30 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat |
| US4059512A (en) * | 1974-12-27 | 1977-11-22 | Preventive Systems, Inc. | Process for removing endotoxin from biological fluids |
| US3959128A (en) * | 1974-12-27 | 1976-05-25 | Preventive Systems, Inc | Process for removing endotoxin from biological fluids |
| DK144800C (da) * | 1980-04-21 | 1982-10-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til udvinding af enzymer,fortrinsvis cu,zn-superoxid-dismutase (sod),catalase og carbonsyreanhydrase,fra blod |
| US4381239A (en) * | 1981-02-10 | 1983-04-26 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Method for reducing the pyrogen content of or removing pyrogens from substances contaminated therewith |
| US4473647A (en) * | 1981-02-27 | 1984-09-25 | Amf Inc. | Tissue culture medium |
| US4468330A (en) * | 1981-04-27 | 1984-08-28 | Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Filler for liquid chromatography useful for separating a hemoglobin variant in blood |
| US4584130A (en) * | 1985-03-29 | 1986-04-22 | University Of Maryland | Intramolecularly cross-linked hemoglobin and method of preparation |
| CA1244349A (en) * | 1985-06-26 | 1988-11-08 | Jen-Chang Hsia | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography |
| GB8600582D0 (en) * | 1986-01-10 | 1986-02-19 | Ca Minister Nat Defence | Purifying biological materials |
| US5084558A (en) * | 1987-10-13 | 1992-01-28 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| AU622610B2 (en) * | 1986-11-10 | 1992-04-16 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| CA1312009C (en) * | 1986-11-10 | 1992-12-29 | Carl W. Rausch | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| EP0379534A4 (en) * | 1988-06-15 | 1991-03-13 | Baxter International Inc. | Method of purifying cross-linked hemoglobin |
| CA1338244C (en) * | 1988-08-17 | 1996-04-09 | Xiang-Fu Wu | Purification of hemoglobin and methemoglobin by bioselective elution |
| US5128452A (en) * | 1989-04-19 | 1992-07-07 | Baxter International Inc. | Process for the production of crosslinked hemoglobin in the presence of sodium tripolyphosphate |
| US5234903A (en) * | 1989-11-22 | 1993-08-10 | Enzon, Inc. | Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute |
| HUT64571A (en) * | 1990-11-29 | 1994-01-28 | Upjohn Co | A method for producing hemoglobin preparatives containing imido ester cross bind |
| US5250665A (en) * | 1991-05-31 | 1993-10-05 | The University Of Toronto Innovations Foundation | Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation |
| US5264555A (en) * | 1992-07-14 | 1993-11-23 | Enzon, Inc. | Process for hemoglobin extraction and purification |
| US5578564A (en) * | 1993-07-23 | 1996-11-26 | Somatogen, Inc. | Nickel-free hemoglobin and methods for producing such hemoglobin |
| US5840851A (en) * | 1993-07-23 | 1998-11-24 | Plomer; J. Jeffrey | Purification of hemoglobin |
| US5665869A (en) * | 1993-11-15 | 1997-09-09 | Somatogen, Inc. | Method for the rapid removal of protoporphyrin from protoporphyrin IX-containing solutions of hemoglobin |
| EP1094079A3 (en) * | 1995-03-23 | 2001-05-02 | Biopure Corporation | Stable polymerized hemoglobin blood-substitute |
-
1998
- 1998-07-10 US US09/113,953 patent/US6150507A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-21 DK DK99930467T patent/DK1097171T3/da active
- 1999-06-21 AU AU47003/99A patent/AU755280B2/en not_active Ceased
- 1999-06-21 EP EP99930467A patent/EP1097171B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-21 WO PCT/US1999/013922 patent/WO2000002921A1/en active IP Right Grant
- 1999-06-21 AT AT99930467T patent/ATE347564T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-21 JP JP2000559150A patent/JP4581110B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-21 NZ NZ509257A patent/NZ509257A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-06-21 CN CNB998082864A patent/CN1166689C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-21 CA CA002336808A patent/CA2336808C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-21 DE DE69934312T patent/DE69934312T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-21 ES ES99930467T patent/ES2278450T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-12 HK HK01108725A patent/HK1037643A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002520338A (ja) | 2002-07-09 |
| JP4581110B2 (ja) | 2010-11-17 |
| ATE347564T1 (de) | 2006-12-15 |
| EP1097171A1 (en) | 2001-05-09 |
| US6150507A (en) | 2000-11-21 |
| NZ509257A (en) | 2003-03-28 |
| HK1037643A1 (en) | 2002-02-15 |
| CN1166689C (zh) | 2004-09-15 |
| CA2336808A1 (en) | 2000-01-20 |
| EP1097171B1 (en) | 2006-12-06 |
| DK1097171T3 (da) | 2007-04-10 |
| CA2336808C (en) | 2008-08-19 |
| CN1308636A (zh) | 2001-08-15 |
| DE69934312T2 (de) | 2007-07-12 |
| AU4700399A (en) | 2000-02-01 |
| AU755280B2 (en) | 2002-12-05 |
| DE69934312D1 (de) | 2007-01-18 |
| WO2000002921A1 (en) | 2000-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5691452A (en) | Method for preserving a hemoglobin blood substitute | |
| JP4382877B2 (ja) | 安定重合化ヘモグロビン代用血液 | |
| US6288027B1 (en) | Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap | |
| ES2278450T3 (es) | Procedimiento para purificar hemoglobina. | |
| US6610832B1 (en) | Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap | |
| ES2032802T5 (es) | Sucedaneo de sangre semisintetico extrapuro. | |
| US6271351B1 (en) | Method for preserving a hemoglobin blood substitute | |
| US5753616A (en) | Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute | |
| US20100209532A1 (en) | Targeted oxygen delivery via intravenous or intra-arterial infusion of oxygenated polymerized hemoglobin solutions | |
| US6541449B1 (en) | Increasing function of organs having reduced red blood cell flow | |
| US5955581A (en) | Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute | |
| Nho et al. | Peg-Bovine Hemoglobin: Safety en a Canine Dehydrated Hypovolemic-Hemorrhagic Shock Model | |
| PT96398B (pt) | Processo de preparacao de uma composicao poli-hemoglobina estabilizada por meio de derivados da purina e de glutationa, e de substituto do sangue. | |
| US20020065211A1 (en) | Increasing function of organs having reduced red blood cell flow | |
| KRISHNA et al. | A review on artificial blood: a source we need | |
| EP4041193A1 (en) | Stabilized hemoglobin compositions and pharmaceutical formulations thereof |