PT96398B - Processo de preparacao de uma composicao poli-hemoglobina estabilizada por meio de derivados da purina e de glutationa, e de substituto do sangue. - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se a substitutos do sangue e a processos para a sua preparação. Mais particularmente, refere-se a uma nova composição de hemoglobina, a qual é eficaz para manter a vida após hemorragia grave em animais de diversas espécies, potencialmente em humanos, e é isenta de toxicidade.

Antecedentes do Invento sangue desempenha muitas funções, todas elas vitais. Contudo, a hemorragia grave põe em risco a vida por duas razões principais: (1) a queda do volume de sangue circulante reduz a perfusão nos tecidos (isquémia); e (2) a redução no transporte de oxigénio prejudica a oxigenação dos tecidos (hipóxia). 0 sistema circulatório reage a estas alterações por vasoconstrição, o que agrava ainda mais a isquémia e a hipóxia. Por último, desenvolvem-se alterações da função e do metabolismo celular, que levam ao choque e à morte.

Neste contexto, um substituto do sangue não é uma preparação que possa substituir o sangue em todas as suas funções, mas um fluido ressuscitante de emergência que seja capaz de (a) repôr o volume sanguíneo, (b) transportar oxigénio e, (c) reduzir a vasoconstrição. Obviamente, este fluido tem de estar isento de efeitos secundários tóxicos, bem como isento de agentes de doença, tais como bactérias e vírus.

A hemoglobina como substituto do sangue

Durante mais de 50 anos, os esforços dirigidos para o desenvolvimenbto de um substituto do sangue têm-se focado na hemoglobina (Hb), porque esta é a única substância capaz de fixar oxigénio suficiente do ar atmosférico, para poder servir como um transportador fisiológico do oxigénio. A hemoglobina exerce, em adição, a mesma pressão coloidal-osmótica que a albumina sérica e pode, portanto, servir como um expansor do volume plasmático. Estes esforços não têm, contudo, tido sucesso devido ao número de problemas que tiveram um reconhecimento tardio e à dificuldade na

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sua resolução, contaminação da hemoglobina com (a) endotoxinas bacterianas do ambiente, (b) fosfolípidos do estroma e (c) proteínas e péptidos não-berne; (2) elevada afinidade da hemoglobina em solução para o oxigénio, o que interfere com a libertação do oxigénio para os tecidos; (3) instabilidade da molécula de Hb com tendência para a extravasão e rápida excreção renal; (4) tendência da hemoglobina para se submeter a auto-oxidação com produção de met-Hb (Hb não funcional) e de radicais livres de oxigénio tóxicos; e (5) capacidade da Hb, como um subproduto sanguíneo, de transmitir doenças relacionadas com o sangue, tais como hepatite e SIDA.

Historicamente, o primeiro a ser reconhecido foi o problema da toxicidade, i.e., uma capacidade da parte das soluções de Hb de activar a coagulação intravascular do sangue e provocar lesão renal. Nos anos 60, Rabiner popularizou a noção de que tal toxicidade era povocado pelo estroma dos glóbulos vermelhos (fragmentos das membranas dos glóbulos vermelhos) e não pela Hb. Ele salientou a necessidade de uma hemoglobina isenta de estroma. Contudo, ao longo dos anos, não se produziu ainda uma hemoglobina verdadeiramente isenta de todos os elementos do estroma. Foram já identifiçados os factores tóxicos da membrana dos glóbulos vermelhos como sendo os aminofosfolípidos fosfatidil etanolamina (PE) e -serina (PS), que residem normalmente no seu lado citoplasmático (M. Feola e col., Toxic factors in the red blood cell membrane, The Journal of Trauma. Vol. 29: pp. 1065-1075, 1989). Verificou-se que estes compostos têm uma afinidade peculiar para a Hb (são mais difíceis de remover da solução de Hb que os outros componentes do estroma), e quando Hb contaminada com PE e PS ê infundida em animais de experiência (coelhos e macacos) em volumes significativos pelo menos 1/3 do vot lume do sangue de animal calculado, provoca uma reacção inflamatória sistémica caracterizada pela activação da coagulação intravascular e do complemento, activação de leucócitos e de plaquetas, e desenvolvimento de lesões isqóémicas-ínflamatórias nos órgãos vitais (M. Feola e col., Toxicity of polymerized hemoglobin Solutions, Surgery, Gynecology and Obstetrics, Vol. 166: pp. 211-222,· 1988; M, Feola e col., Complement activation

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-4and the toxicity of stroma-free hemoglobin Solutions in primates, Circulatory Shock, Vol» 25: pp. 275-290, 1988).

problema que só recentemente foi reconhecido, é a fácil contaminação das soluções de Hb com endotoxinas bacterianas do ambiente. Até ao desenvolvimento do teste de lisado da amoebocite limulus, a farmacopeia dos EUA confiava no teste de pirogenicidade do coelho como o ensaio para a detecção de endotoxinas. Os artigos acima referenciados relatam também que a hemoglobina contaminada com endotoxinas em concentrações bastante abaixo do nível de pirogenicidade, provoca o mesmo tipo de toxicidade do que a hemoglobina contaminada com aminofosfolípidos (o componente tóxico da endotoxina é, de facto, um lípido, o lípido A). As endotoxinas bacterinas podem ser removidas das soluções biológicas pelo uso de colunas de cromatografia de afinidade, tais como colunas Detoxi-Gel (Pierce Chemical Co.)» Contudo, estas colunas não podem remover toda a endotoxina, se o material de partida tiver mais de 2 unidades de endotoxina por mililitro (como determinado pelo uso do teste quantitativo cromogénico limulus (0CL-1OOO, Whittaker 1*1.D. Bioproducts), segundo o qual 1 EU = 0,1 nanogramas de lipopolissacárido bacteriano).

A hemoglobina tem de ser purificada das proteínas e péptidos não-heme. Embora não se tenha relacionado qualquer toxicidade com de qualquer proteína em particular, a purificação é pela necessidade de reduzir a imunogenicidade das Hb. Além disso, tem-se colocado a hipótese de que há responsável pelo efeito vasoconstritõr , das soluções de Hb encontrado em c^gãos isolados (coração e rim) e em artérias isoladas. São conhecidos na arte uma variedade de métodos para tal purificação. Estes incluem: (1) centrifugação e filtração (Doczi, Patente U.S. NS. 3 991 181); (2) extracção com tolueno (Bonsen e col.. Patentes U.S» NS. 4 001 200 e NS. 4 001 401); (3) ultrafiltração (Kothe e col., Patente U.S. N2. 4 526 715); (4) ultrafiltração mais precipitação com ácido (Sonhard e col., Patentes U.S. NS. 4 136 093 e N2» 4 336 248); (5) cromatografia de permuta iónica (Meiller, Patente U.S. NS. 4 100 149); (6) precipitação com zinco (Tye, Patentes U.S. NS. 4 473 494 e NS.

a presença mandatária soluções de um péptido

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529 719); e (7) cristalização (DeVenuto e col., Journal of Laboratory and Clinicai Medicine. Vol. 89= 509-514, 1977). Contudo, os métodos 1-4 têm limitações intrínsecas em relação à capacidade de separar completamente a Hb das outras proteínas, enquanto que os métodos 5-7 não se prestam a purificação em grande escala.

Um problema que se reconheceu nos anos 70 foi a elevada afinidade para o oxigénio da Hb em solução. Esta é a propriedade que regula a capacidade da hemoglobina de captar oxigénio do ar nos pulmões e de o libertar nos tecidos. Uma expressão desta propriedade é o valor P^q (a tensão parcial do oxigénio ã qual a Hb está saturada a 50¾). Guanto mais baixo ο P5Q, maior a capacidade da hemoglobina de se ligar ao oxigénio, o que se traduz numa reduzida capacidade de o libertar para os tecidos. 0 ^p50 ^do sangue humano é de ~28 mmHg, enquanto que o P5Q de Hb humana em solução é de ~13 mmHg. A diferença deve-se ao facto de que dentro do glóbulo vermelho, a Hb reage com a 2,3-difosforoglicerato (2,3-DPG), o que reduz a afinidade da Hb para o oxigénio. Fora do glóbulo vermelho, essa interacção perde-se. Como consequência, a Hb liga-se ao 0₂ tão fortemente que perde a sua função como um transportador do 0₂. Para resolver este problema, Benesch e col. desenvolveram uma reacção covalente da Hb com piridoxal-5’-fosfato, um análogo do 2,3-DPG. Esperou-se, ao princípio que tal reacção reduziria a afinidade para o oxigénio e estabilizaria a molécula de Hb na forma tetramérica. Contudo, não se conseguiu concretizar. Contudo, a hemoglobina bovina em solução tem o mesmo valor P5Q que o sangue humano, e a sua afinidade para o oxigénio é regulada por cloretos e não pela 2,3-DPG (M. Feola e col., Development of a bovine stroma—free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, Vol. 157: pp. 399-408, 1983). Considerando esta propriedade favorável, mais a disponibilidade em grande escala de GV bovinos e a baixa antigenicidade da hemoglobina pura entre os mamíferos, há vantagens no uso de hemoglobina de bovino como a base para um substituto do sangue.

Outro problema que foi reconhecido nos anos 70, é a rápida

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extravasão da hemoglobina com curta persistência intravascular. Isto é atribuído, geralmente, a uma tendência dos tetrâmeros de Hb, ^a2®2> ^se dissociarem em dímeros, 2αβ, que passam com maior facilidade através dos capilares sanguíneos. Pensa-se agora que a carga eléctrica da superfície da proteína tem também um papel importante, favorecendo a electronegatividade e o baixo ponto isoeléctrico, a persistência intravascular. A extravasão da hemoglobina tem diversos efeitos indesejáveis= (1) o efeito de expansor volumétrico do plasma é de curta duração; (2) a passagem de Hb através dos glomérulos renais produz um efeito diurético osmótico, o que reduz, em vez de manter, o volume plasmático; (3) a reabsorção de Hb nos túbulos renais provoca lesões às células tubulares; e (4) a passagem de Hb para os fluidos intersticiais provoca edema e lesão celular. A arte anterior deu atenção exclusivamente à prevenção da dimerização da Hb. Com esta finalidade, desenvolveram-se três tipos de modificações da Hb: (a) reticulação intermolecular (polimerização); (b) conjugação da Hb com outras moléculas; e (c) reticulação intramolecular de cadeias a. ou β. 0 processo mais largamente usado é o da reticulação intermolecular da Hb com glutaraldeído (Bonsen e col., U.S. Patentes NQ. 4 001 200, NQ. 4 001 401, e MQ 4 053 590; Morris e col., U.S. Patente NQ. 4 061 736; Bonhard e col., U.S. Patente NQ. 4 136 093). Há, contudo, diversos problemas com este processo: (1) o glutaraldeído é intrinsecamente tóxico, e desconhece—se a toxicidade potencial dos seus produtos secundários metabólicos; (2) o composto é muito reaetivo e tende a formar múltiplas pontes com diversos locais da molécula de Hb (grupos ae ε-amino e grupos sulfidrilo), levando à formação de um número imprevisível de espécies moleculares; (3) o processo de polimerização é difícil de controlar e parece continuar durante o armazenamento a 4°C, levando à formação de polímeros cada vez maiores, com viscosidade e afinidade para o oxigénio aumentadas; (4) a natureza não específica da reticulação pode ainda permitir a presença de dímeros da Hb na solução. A Hb tem sido ligada, como uma alternativa, com moléculas grandes, tais como dextrano e goma de hidroxietilõ. (Patente U.S. NQ. 4 064 118), polietiieno ou polipropileno glicóis (Patente U.S. NQ. 4 412 936), inulina

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(Patente U.S. N2. 4 377 512) e óxido de poli-alquileno (Patente U.S. N2. 4 670 417), Estas hemoglobinas conjugadas têm, contudo, afinidade para o oxigénio aumentada, e tendem a adquirir propriedades desfavoráveis peculiares às substâncias a juntar. Conseguiu-se a reticulação intramolecular pelo uso de ésteres diaspirin (Tya, Patente U.S. N2. 4 529 719; Walder, patente U.S. N2. 4 598 004) e de trifosfato de adenosina oxidada por periodato (o-ATP) (F. J. Scannon, Molecular modification of hemoglobin, Criticai Care Medicine, Vol. 10: pp. 261-265, 1982; A. G. Greenburg e P. W. Maffuid, Modification of hemoglobin Ring opened diols, Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss, Nova Iorque, 1983: pp. 9-17), Contudo, as hemoglobinas-diaspirina ainda têm persistência intravascular curta (semi-vida de 3-4 horas), enquanto que as hemoglobinas-ATP se têm mostrado insatisfatórias, devido aos elevados níveis de met-Hb e da elevada afinidade para o oxigénio, combinado com uma semi-vida curta.

Foram descritos progressos significativos por investigadores que reagiram Hb humana com piridoxal-5’-fosfato e glutaraldeído para Hb piridoxalada polimerizada (poli-PLP-hemoglobina), i.e. uma hemoglobina alegadamente com baixa afinidade para o oxigénio e persistência intravascular prolongada (G. S, Moss e col,, Hemoglobin solution - From tetramer to polymer, Biomaterials, Artificial Cells and Artifical Organs, Vol, 16(1-3): pp. 57-69, 1988; F. DeVenuto ε A. Zegna, Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human henoglobin, Journal of ~ Surgical Research, Vol, 34: pp. 205-212, 1983). Verificou-se, contudo, que a piridoxalação interfere com a polimerização, Assim, verifica-se que a Hb piridoxalada com reduzida afinidade para ο O2, é rapidamente excretada por via renal, enquanto que a Kb polimerizada com semi-vida prolongada tem elevada afinidade para o oxigénio. Em conclusão, o problema da estabilização da Hb sem compromisso da função de transporte do oxigénio, não foi resolvido,

Durante os últimos anos, têm-se levantado questões referentes a uma toxicidade intrínseca da hemoglobina. As observações

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experimentais têm descrito um efeito vasoconstritQx?. ·. Tem-se também especulado que, como a Hb tende a auto-oxidar-se para met-Hb (i.e_, a oxidação do ferro do heme do estado ferroso +3 para o estado férrico +2, um processo que produz radicais livres de oxigénio tóxicos), possa actuar como um pró-oxidante quando infundida na circulação. Este efeito produziria lipoperoxidação das membranas celulares e lesão das estruturas celulares. Ambos estes efeitos, vasoconstrição e produção de radicais livres de oxigénio, agravariam, em vez de diminuir, as lesões isquémicas-hipóxicas provocadas pela hemorragia. Estão descritos resultados de estudos experimentais que mostram que tanto a vasoconstrição como a produção de radicais, podem ser controlados por três etapas: (1) purificação completa da Hb; (2) preparação e estabilização da molécula de Hb com formação de baixos níveis de met-Hb; e (ã) adição de radicais depuradoíésoxigénio (M. Feola e col,, Biocompatibility of hemoglobin Solutions. I. Reactions of vascular endothelial cells to pure and impure hemoglobins, Artificial Organs, Vol. 13(3): pp. 209-215, 1989),

Finalmente, as soluções de Hb transportam o risco de doenças transmissíveis por produtos sanguíneos. Enquanto que as bactérias e os parasitas podem ser facilmente removidos por filtração ou por ultrafiltração, os vírus representam um problema mais grave» São conhecidos na arte dois processos de inactivação dos vírus. Um é um processo físico, que consiste na pasteurização da hemoglobina na forma desoxi a 60°C e a pH 7,5 durante 10 horas. Este processo tem mostrado capacidade em inactivar vírus modelo (sindbis, polio, pseudo-raiva) bem como o virus da imunodeficiência humana (HIV) (T. N. Estep e col., Virus inactivation in hemoglobin Solutions by heat, Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, Vol. 16(1-3): PP-, 129-134, 1988), 0 outro é um processo químico, que consiste no tratamento com clorofórmio (S. M. Feinston e col., Inactivation of hepatitis B virus and non-A non-B hepatitis by chloroform, Infection and Immunity, Vol» 41: pp. 816-821, 1983). Contudo, ambos os processos produzem desnaturação significativa da hemoglobina, a não ser que se tomem medidas especiais.

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Sumário do Invento presente invento refere-se a uma composição com importância e ao respectivo processo de preparação o qual tem utilidade como substituto do sangue, A composição compreende hemoglobina (Hb) de mamífero (de preferência bovina), a qual é= (a) total e completamente purificada; (b) reticulada, intramolecularmente com ATP oxidado com periodato (o-ATP) e intermolecularmenmte com adenosina oxidada com periodato (o-adenosina); (c) reagida com glutationa reduzida (GSH); e (d) dissolvida numa solução salina electroliticamente equilibrada enriquecida com cloreto de magnésio (MgCl2) e manitol. Como o o-ATP e a o-adenosina são dois derivados da purina (Ρ), o produto é aqui denominado por Hb-PP-GSH.

A preparação de hemoglobina combina as propriedades favoráveis dos seus constituintes: (1) é um transportador de oxigénio eficaz, visto que a Hb bovina tem naturalmente uma baixa afinidade para o oxigénio (valor P5Q de 28 mmHg) que não é afectada pelas diversas reacções químicas; (2) é um expansor do volume plasmático eficaz em virtude do facto da hemoglobina reticulada, intramolecularmente e intermolecularmente, ter uma persistência intravascular prolongada (semi-vida de 24 horas);

(3) tem propriedades vasodilatadoras devido ao facto de ambas as purinas relaxarem a vasoconstrição induzida pela norepinefriná; e (4) não exerce num efeito pró-oxidante, devido à presença de glutationa reduzida e manitol.

Foram já demonstradas as propriedades favoráveis da hemoglobina bovina (M, Feola e col., Development of a bovine stromafree hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, Vol, 157: pp. 399-408, 1983). Ã parte da sua disponibilidade em larga escala e da ausência de doenças transmissíveis peculiares do sangue humano (SIDA em particular), a Hb bovina tem um valor P5Q superior ao dobro do da Hb humana (28 versus 13 mmHg), e não necessita da modulação da 2,3-DPG. De acordo com o presente invento, a afinidade para o oxigénio da Hb bovina pode ser depois baixado por concentrações aumentadas de iões cloreto. Em relação aos potenciais problemas imunológicos, a

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-10praticabilidade de transfusões de Hb entre mamíferos de espécies diferentes foi já bem demonstrada. De facto, foi administrada hemoglobina bovina pura, repetidamente (até 6 vezes), a coelhos e macacos em volumes correspondendo a 1/3-1/2 dos volumes sanguíneos calculados, sem evidência clínica de reacção e sem formação de anticorpos detectáveis pelo teste de Ouchterlony (M. Feola e col., Immunologic biocompatibility of hemoglobin Solutions, Trasfusione del sangue (Italiano), Vol. 33: pp. 121-128, 1988).

Para produzir uma solução de Hb isenta de endotoxinas bacterianas, a estratégia usada no presente processo de preparação é de prevenir em vez de corrigir a contaminação. Dada a afinidade da endotoxína para a hemoglobina, e uma vez ocorrida contaminação significativa, é extremamente difícil, senão impossível, de atingir a purificação. A prevenção requer que: (1) o material de partida esteja minimamente contaminado; (2) as etapas preparativas sejam efectuadas numa forma de sistema fechado; (3) todas as superfícies que vão estar em contacto com a Hb estejam estéreis e isentas de pirogénios; (4) todos os produtos químicos sejam puros; (5) todas as soluções sejam estéreis e isentas de pirogénios; e (6) seja instituída qualidade de controlo em cada etapa. 0 processo mais sensível -para a detecção de endotoxína é o teste cromogénico quantitativo limulus (QLC-1000, Whittaker Bioproducts). Se se verificar que o material de partida, ou a hemoglobina em qualquer etapa preparatória, contém mais de 2 EU/ml, então é rejeitada. Mantendo um baixo nível de contaminação ao longo do processo, pode-se conseguir a purificação completa pela passagem final da solução através de uma coluna de cromatografia de afinidade, tal como a Detoxi-Gel (Pierce Chemical Company).

Aplica-se o mesmo princípio para evitar a contaminação global juntamente com a purificação final, para a remoção de fosfolípidos do estroma (aminofosfolípidos em particular). Para obviar a contaminação do estroma, o presente processo adapta um processo de diálise e ultrafiltração de glóbulos vermelhos originalmente apresentado por J. R. DeLoach e col» em Analytical Biochemistry, Vol. 157: pp. 191-198, 1986. De acordo com este

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processo, os G.V. são primeiro dialisados contra uma solução hipotónica de fosfato até que a suspensão atinja uma osmolaridade de 160 mOsm/L. Nesta altura, os G.V. assumem uma forma esférica e os poros da membrana celular ficam alargados. As células são então submetidas a ultrafiltração através de filtros Amicon com poros de 0,1 u sob uma pressão . déçecS&in^- de 10 psi. Assim, a hemoglobina é es~premida“ para fora das células sem rompimento das membranas celulares. De acordo com o presente invento, usa-se um processo de sistema fechado simples para ambâs a ultrafiltração e diálise dos G.V., que é estéril, isento de pirogénios e descartável. Em adição, o fluido de diálise consiste de água estéril, desionizada isenta de pirogénios, ajustada para um pH de 8,2 com solução Tham, em vez de uma solução de fosfato, o que reduz a oxidação da hemoglobina. 0 resultado deste processo é uma solução de Hb que contém aproximadamente 3-5 mg/dl de fosfolípidos (medido pelo conjunto do teste fosfolípido, Boeringer-Manheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), só com vestígios dos aminofosfolípidos PE e PS (como determinado pela cromatografia em camada fina). Os fosfolípidos residuais são removidos pela extracção com clorofórmio. Devido ao baixo nível de fosfolípidos presentes, esta etapa pode ser efectuada usando baixas concentrações de clorofórmio para centrifugações curtas. Assim, previne-se a desnaturação da hemoglobina.

Aplica-se o mesmo princípio à purificação da hemoglobina de proteínas e péptidos não-heme. Neste caso, a primeira etapa é representada pela remoção de todas as proteínas plasmáticas durante a purificação dos glóbulos vermelhos. Na segunda, o processo de extracção da Hb dos G.V. sem ruptura em grande escala das membranas celulares dos glóbulos vermelhos, previne a contaminação com as proteínas do estroma. Finalmente, consegue-se a pyrificação pela precipitação térmica selectiva (ver: Ρ. A. Belter, E. L. Cussler, W. S. Hu, Eds., Bioseparations, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1988: pp. 227-229). As bases científicas deste processo residem no facto de que a desnaturação (e precipitação) das proteínas pela temperatura é seguida de cinética química de primeiro grau com uma dependência da

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temperatura de Arrhenius:

diPl ₌ -k|P| dt na qual P é a concentração da proteína dissolvida. A constante k é dada por k = k₀ e^/RT na qual k_o é uma constante caracteristica e é a energia de activação de desnaturação e T é a temperatura. A energia de desnaturação varia de uma proteína para outra. Como E aparece exponencialmente na equação, tem um grande efeito quando a temperatura se altera mesmo só um pouco. Esta energia é também afectada por alterações no pH. Verificou-se também que a hemoglobina saturada com monóxido de carbono (HbCQ) é resistente à precipitação induzida pela temperatura a pH 7,6-7,8, Verificou-se que a pasteurização a 60°C durante 9 horas, seguida de pasteurização a 70°C durante 1 hora, a pH 7,6-7,8, de uma solução de hemoglobina na forma carboxi à concentração de 10 g/dl, precipita todas as proteínas não-heme com escassa desnaturação da hemoglobina. Verificou-se a ausência de proteínas que não a hemoglobina na solução, como preparada pelo processo presente, pelo uso de focagem isoeléctrica (IEF) e por cromatografia liquida de elevada pressão (HPLC) de exclusão por tamanhos e de permuta aniónica. A ausência de desnaturação na hemoglobina recuperada é demonstrada pela ausência de manchainento de bandas focadas em IEF e pela manutenção da função de transporte de oxigénio (curvas de dissociação do oxigénio, P5Q, efeito de Bohr).

Um subproduto do processo de purificação é a inactivação dos virus. De facto, a extracção com clorofórmio mostrou inactivar um certo número de virus envolvidos por lípidos, tais como virus da hepatite B, da hepatite não-A não-B, vacina e do pox, tanto no plasma como no soro (Feinston e col,, acima referenciado), Alguns virus sem lípidos (Reovirus) podem também ser parcialmente inactivados com clorofórmio. Por outro lado, demonstrou-se que a pasteurização a 60°C durante 10 horas inactiva um certo número de

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-13virus com envelope não lipídico, bem como o virus da imunodeficiência adquirida (HIV) (Τ. N. Estep e col., acima referenciado).

Devido aos efeitos indesejáveis da polimerização com glutaraldeído, o presente processo estabiliza a molécula de Hb na forma tetramérica pelo uso do derivado dialdeido da 5’-trifosfato de adenosina (o-ATP)„ A molécula de ATP tem três componentes básicos: a base purina adenina, o açúcar D-ribose e uma cadeia de trifosfato:

NH₂ z^c\ z\

Ç CH Adenina kA a / % Z \ /

N N

Trifosfato de adenosina (ATP)

A oxidação do ATP com periodato de sódio abre o anel ribose no local 2’,3^,-cis e transforma o 2’,3’—diol no di-aldeido correspondente (Ρ. N. Lowe e col., Preparation and Chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds, Biochemical Society Transactions, Vol. 7: pp. 1131-1133, 1979):

Cada grupo aldeído da molécula o-ATP pode reagir com o grupo ε-amino da lisina, para formar um aditivo de base Schiff:

(HB)-NH2 + OCH-ATP -> (HB)-N = CH-ATP

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Como a bolsa 2,3-DPG da hemoglobina (a região dentro da molécula de Hb que liga 2,3-DPG) contém duas lisinas, é possível usar o o-ATP para reticular estes grupos, estabilizando assim a molécula na forma tetramérica. A presença da cadeia de trifosfato aumenta a especificidade desta reacção, tendo-se demonstrado tal especificidade para outros polifosfatos tais como piridoxal-5’-fosfato. A vantagem do ATP sobre outros compostos é proporcionada pela porção adenina. A hidrólise in vivo do ATP para ADP, AMP e finalmente para adenosina mostrou produzir efeitos farmacológicos benéficos, principalmente vasodilatação tanto na circulação sistémica ^^pulmonar.Têm-se demonstrado efeitos benéficos adicionais quando o ATP é dado em combinação com cloreto de magnésio (MgCl2) na instalação do choque hemorrágico. Estes incluem o melhoramento da mícrocirculação, melhoramente da função da membrana celular e um efeito de iniciação na restauração de nucleótidos adenina intracelulares (I. H. Chaudry e A. E. Baue, OverView of henmorrhagic shock, Pathophysiology of shock, anoxia and ischemia, R. A. Cowley e B., F. Trump, editores, Williams e Wilkins, Baltimore, MD, 1982: pp. 203-219).

Como acima indicado, as tentativas prévias de reticular a Hb com o-ATP não têm sido bem sucedidas porque a reacção química produz níveis inaceitáveis de met-Hb (até 30%), e a hemoglobina modificada com o-ATP tem ainda uma persistência intravascular curta. 0 ATP tem, adicionalmente, uma tendência indesejável para quelar catiões divalentes do sistema vascular.

Verificou-se que o efeito oxidante do o-ATP é devido aos vestígios de iodato (IO4 e IO3) presentes no composto. De facto, a purificação completa do o-ATP (ver Exemplo 1) corrige esse problema. Verificou-se que a formação de met-Hb pode ser minimizada reagindo o-ATP com carboxi-Hb (Hb saturada com monóxido de carbono) em vez.de com desoxi-Hb, como previamente efectuado. Verificou-se que a reacção de o-ATP com carboxi-Hb se efectuará se o pH da solução for reduzido para cerca de 7,20. Em relação ao efeito quelante de catião, confirmou-se a publicação de Chaudry e Baue (ver acima) em que a adição de cloreto de magnésio (MgClo) em quantidades equimolares com ATP, eliminou

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-15esse problema. Fica, contudo, o problema da curta persistência intravascular. Verificou-se que a Hb reticulada intramolecularmente, na forma tetramérica, seria ainda filtrada através do glomérulo renal e provocaria lesão nos tubulos renais. Portanto, foi necessário reticular a hemoglobina intermolecular e intramolecularmente, se se atingirem tempos de retenção intravasculares adequados.

presente invento utiliza um segundo derivado da purina, o derivado dialdeído da adenosina ou adenosina oxidada com periodato (o-adenosina), como um segundo agente de reticulação. Como a molécula de Hb transporta 44 grupos amina lisina na sua superfície, é possível usar o-adenosina para fazer uma ponte entre dois ou mais destes grupos, e ligar dois ou mais tetrâmeros de Hb. Há várias vantagens de adenosina sobre os outros compostos. Em primeiro lugar, devido à presença da adenina, a adenosina tem um efeito vasodilatador semelhante ao do ATP (C. Su, Extracellular functions of nucleotides in heart and Blood vessels, Annual ' Review of Physiology, Vol. 47: pp. 665-676, 1985). Em adição, a adenosina inibe a agregação das plaquetas e melhora a filtração glomerular no rim, sendo ambos os efeitos benéficos após a hemorragia e a reperfusão (R. M. Berne: Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, MA, 1983). A reacção da hemoglobina com o-adenosina é desconhecida da arte anterior. É também importante que a reacção seja efectuada com a hemoglobina na forma carboxi de maneira a reduzir a formação de met-Hb. Finalmente, a reacção prossegue muito lentamente a 4°C, de forma que possa ser interrompida em qualquer altura após a formação do agregado molecular desejado. Esta característica permite a preparação de polímeros da Hb de diferentes tamanhos moleculares de uma forma planeada e reprodutível (que não pode ser feita com o uso de outros agentes de reticulação, tal como glutaraldeído). A reticulação da hemoglobina com o-adenosina é interrompida pela adição de glutationa reduzida (GSH), a qual, tal como a lisina, transporta um grupo ε-amino. Entrando nesta reacção, a GSH torna-se parte da composição de Hb.

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A escolha da GSH é baseada no conhecimento de que este composto é abundante nos glóbulos vermelhos, onde a sua principal função é de trabalhar como uma armadilha oxidante que protege a hemoglobina do stress oxidante (A. Larsson: Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinicai

Aspects, Ravsn Press, Nova Iorque, 1983). Verificou-se que a GSH protege a hemoglobina em solução bem como dentro do ambiente eritrocítico. Verificou-se também que a reticulação com o-adenosina seguida pela reacção com GSH produz um aumento das cargas electronegativas sobre a superfície da molécula de Hb, com redução do ponto isoeléctrico da Hb de 6,8 para 6,1-6,2. Isto contribui para a estabilização da hemoglobina no sentido de que prolonga a persistência intravascular e impede a filtração através do rim.

o-ATP e a o-adenosina podem-se obter de fontes comerciais (Sigma Chemical Co., St. Louis, MQ) ou podem-se preparar de acordo com os processos descritos abaixo como Exemplo 1 e Exemplo 2. A glutationa reduzida é obtida de fonte comercial.

Após estas reacções e após a reconversão da carboxi-Hb para oxi-Hb, o novo composto (Hb-PP-GSH) é dissolvidõ numa solução salina electroliticamente equilibrada enriquecida com cloreto de magnésio (MgCl2) e com manitol. Adiciona-se o MgCl2 numa quantidade equimolar com o ATP. Isto tem diversos efeitos benéficos: (1) controla o efeito quelante do catião divalente do ATP; (2) complementa o ATP nos seus efeitos benéficos sobre a micr©circulação; e (3) proporciona um excesso de iões cloreto, o que modula para baixo ã afinidade da Hb para o oxigénio (ajuda a manter um valor P50 elevado). Adiciona-se manitol em pequenas quantidades, com base no conhecimento de que actua como um depurador dos radicais QH (os radicais livres mais tóxicos derivados do oxigénio), e talvez também de outros radicais (Β. A. Freeman e J. D. Crapo, Free radicais and tissue injury, Laboratory Investigation. Vol. 47: pp. 412-426, 1982).

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar um composto químico útil como um substituto do sangue, i.e., capaz

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de: (a) repor e manter o volume plasmático, (b) fornecer oxigénio aos órgãos vitais,, e (c) aliviar a vasoconstrição após a hemorragia»

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar um tal substituto do sangue que seja isento de toxicidade.

Constitui também um objectivo do presente invento proporcionar um processo para a preparação de um substituto do sangue a partir da hemoglobina.

Outros objectivos , factos e vantagens do invento serão evidentes tendo em conta a seguinte descrição detalhada de uma concretização exemplar preferida, de acordo com o presente invento.

Breve descrição dos desenhos

A figura 1 mostra uma Análise Espectral de hemoglobina bovina pura, obtida por HPLC com coluna de exclusão por tamanhos. 0 cromatograma mostra um só pico localizado a 9,4 minutos, identificando a hemoglobina na forma tetramérica (64 000 daltons).

A figura 2 mostra uma Análise Espectral de hemoglobina bovina pura obtida por HPLC com coluna DEAE. 0 cromatograma mostra vários picos, localizados entre 20 e 36 minutos, correspondendo a diferentes pontos isoeléctricos de diversos componentes da Hb.

A figura 3 A-B mostra o índice Espectral da hemoglobina bovina antes (3A) e depois (3B) da purificação por pasteurização (HPLC com coluna DEAE, comprimendo de onda do espectro de 230-599 nm). Na figura 3A, são visíveis proteínas não-Hb, localizadas nos tempos de retenção de 17 e 51 minutos. Na figura 3B, as partículas não-Hb já não são visíveis»

A figura 4 mostra uma Análise Espectral por HPLC de exclusão de tamanho de Hb bovina reticulada intramolecularmente com o-ATP e intermolecularmente com o-adenosina, e combinada com glutationa reduzida» 0 cromatograma mostra um agregado molecular de Hb

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contendo seis picos.

A figura 5 mostra a Análise Espectral por coluna HPLC-DEAE de hemoglobina bovina modificada como na figura 4. 0 cromatograma mostra um sõ pico no tempo de retenção de 51 minutos. 0 ponto isoeléctríco da Hb foi desviado (em comparação com a Kb não modificada) devido ao aumento em cargas electronegativas de superfície.

A figura 6 mostra o exame por focagem isoeléctrica (IEF-Pharmacia).

A figura 7 mostra a absorvância a 258 nm de fracções sucessivas do ο-ΑΤΡ ε de mistura reaccional de periodato de sódio eluida,a partir de uma coluna de Sephadex.com água.

A figura 8 mostra as absorvências a 258 e 232 nm de fracções sucessivas da mistura reaccional de o-adenosina e periodato de sódio, eluida a partir de uma coluna de permuta aniónica com Eluente A.

Descrição da Concretização preferida

EXEMPLO I processo preferido para a preparação do produto complexo, de acordo com o presente invento, compreende cinco etapas: (A) purificação dos glóbulos vermelhos; (B) extracção da hemoglobina; (C) purificação da hemoglobina; (D) modificação da hemoglobina (reacção com o-ATP, o-adenosina ε glutationa); e (E) preparação do produto final (Hb-PP-GSH)_n.

A. Purificação dos glóbulos vermelhos (G.V.)

Pelas razões acima descritas, o material de partida preferido é representado pelo sangue bovino. Contudo, o processo de preparação pode ser usado partindo de sangue de outros mamíferos, incluindo o homem. Pode-se obter sangue bovino de múltiplos dadores saudáveis, ou de animais individuais seleccionados do matadouro. No primeiro caso, prende-se uma vaca adulta, o pescoço é tricotomizado e a pele é preparada com um sabão anti-séptico. □ sangue é extraído por punção da veia jugular externa sob

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condições de assepsia. Pode-se obter cerca de 1 500 ml de sangue de um animal, recolhendo num frasco isento de pirogénio, estéril, vazio, de 2 litros, contendo 200 ml de anti-coagulante ACD (Virbac, Inc., Lenexa, Kansas). Mo segundo caso, após o animal ser atordoado antes da matança, prepara-se rapidamente um lado do pescoço e insere-se, percutaneamente um trocater na artéria carótida. Podem-se remover, de cada vaca adulta, aproximadamente ·>

litros de sangue. 0 sangue de animais diferentes não é misturado. Os frascos são mantidos em gelo durante o transporte para o laboratório»

É importante, particularmente quando se parte de sangue bovino, que os G.V. (eritrócitos) sejam completamente separados dos glóbulos brancos (leucócitos), plaquetas e plasma. Esta etapa reduz a carga de proteínas não-heme e de outras substâncias das quais a hemoglobina tem de ser purificada em último lugar. Além disso, a remoção de todos os leucócitos remove os vírus associados a estas células, em particular os linfdcitos (citomegalovirus, vírus da imunodeficiência humana e outros).

Os G. V. são purificados por um processo de filtro-frio-centrifugador. A etapa de centrifugação consiste de múltiplas centrifugações efectuadas numa forma de sistema fechado pelo uso de um separador de células de banco de sangue, tal como o sistema DIDECO (Electromedics Inc,, Englewood, Colorado), da seguinte forma:

1. Centrifugação a 1 100 rpm, a 15°C, durante para remover plaquetas e plasma;

2. Centrifugação a 4 500 rpm, a 15°C, durante para uma mais completa remoção do plasma;

minutos, minutos.

3. Lavagem (4x) com solução salina isotónica (G.V. /solução salina 1:4) por centrifugação a 4 100 rpm, a 4°C, durante 10 minutos;

4. Lavagem final com solução isotónica de Tham, pH 8,1-8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois), Isto permite a suspensão dos G.V. lavados numa solução de

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-20elevado pH, isenta de electrólitos, hemoglobina da oxidação.

Para a parte fria do processo, os G.V. são armazenados dentro de pacotes de transferência (contentores de plástico estéreis, isentos de pirogénios, feitos por Fenwal Laboratories, Deerfield, Illinois) a 4°C durante a noite, ou durante 18 horas. A baixa temperatura, os glóbulos brancos tendem a agregar-se em pequenos rolhões. Para a etapa de filtro, as células são passadas através de um filtro de celulose de 20 u, tal como o filtro de transfusão de elevada capacidade feito por Fenwal, que remove os agregados de leucócitos.

Para garantir a ausência de leucócitos e de plaquetas, efectuam-se contagens de células usando um contador de células Coulter, e a ausência de proteínas na suspensão é verificada por processos químicos de rotina. A presença de endotoxinas bacterianas é determinada pelo uso do teste limulus cromogénico quantitativo (QCL-1000, Whittakér Bioproducts, Walkersville, Maryland).

B. Extracção da hemoglobina

A extracção da hemoglobina dos G.V. é efectuada em duas etapas. Primeiro, suspende-se um litro de G.V. em solução isotónica Tham, pH 8,1-8,2, à concentração de 20¾ (hematocrito 0,20), é dialisado contra 10 litros de solução hipotónica Tham (230 mOsm/L) por meio de um rim artificial com porosidade de 0,20 IA, tal como o Módulo de Filtração Krosflo II com 304,8 cm^ de área (Microgon Inc., Laguna Hills, CA). A diálise é efectuada até o dialisado se tornar de cor avermelhada (tingido de hemoglobina). Nesta altura, os G.V. ficam inchados, de forma esférica, e as membranas celulares esticadas tornam-se permeáveis à Hb. Como segunda etapa, aplica-se uma pressão de 10 psi ao rim artificial, espremendo a Hb para fora das células, sem romper as membranas celulares. As membranas fantasma são rejeitadas após uma passagem. À medida que a hemoglobina entra para o reservatório da solução hipotónica, o volume no reservatório dos G.V. é

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mantido pela adição de solução Tham, 230 mOsm/L, A hemoglobina extraída é filtrada através de um filtro de 0,20 u, tal como o Posidyne I.V. Filter (PALL Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico), para remover os restos em partículas residuais ou os contaminantes microbianos, e armazenados em pacotes de transferência a 4°C.

-J resultado deste processo é uma solução de Hb que. contém 3-5 mg/dl de fosfolípidos (medido com o “equipamento de teste para fosfolipido, Boeringer-Manheim Diagnostics, Indianapolis, Indiana), somente com vestígios de aminofosfolípidos PE e PS (determinado por cromatografia em camada fina).

C. Purificação da hemoglobina

É efectuada em quatro etapas:

1. Pasteurização da hemoglobina na forma carboxi (HbCQ), É efectuada dentro de um reactor biológico, isento de pirogénios, pré-esterilizado, tal como o bio-reactor Microlift de 15 litros, esterilizável no local com o sistema de controlo NBS Modelo ML-4100 (New Brunswick Scientific Co., Edison, New Jersey). É um recipiente fechado com múltiplos locais de entrada para gases e líquidos, orifícios para colheita de amostras, um agitador para misturar e controlos de temperatura. 0 biaMeactor está instalado sob uma tampa de vapor de escape. A hemoglobina é saturada com monóxido de carbono (pureza de 99,99%, Criogenic Rare Gas Co., Hanahan, South Carolina) por lavagem sequencial com gás esterilizado a 760 mmHg, 4°C, com agitação lenta. Verifica-se a saturação total usando um cooxímetro (Modelo 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts). 0 processo dura aproximadamente 15 minutos. A solução é mantida sob C0 a 760 mmHg. Efectua-se então a pasteurização elevando , gradualmente a temperatura, dentro do reactor, de 4 para 60°C e deixando-a a esse nível durante 9 horas, e elevando-a depois para 70°C durante 1 hora. Após estes intervalos, a temperatura é gradualmente baixada de novo para 4°C.

2. Centrifugação com clorofórmio. Para esta etapa, a solução de Hb é filtrada através de um filtro de 0,20 u para frascos de

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centrifugação isentos de pirogénios, estéreis, de 250 ml, selados com tampas apropriadas (frascos polyallomer resistente a clorofórmio, proteínas e álcool, obtidos de Sorvall Division, Du Pont Co., Wilmington, Delaware).

Efectua-se uma série de três centrifugações, usando uma centrifugadora Sorvall (Modelo 0TD75B com rotor TFA 20.250), da seguinte forma:

a. Centrifugação de hemoglobina misturada com clorofórmio na proporção de 15:1 (para cada frasco: Hb, 232 ml; clorofórmio 18 ml), a 760 x g, a 4°C, durante 30 minutos. 0 sobrenadante é passado para uma segunda série de frascos usando tubos estéreis, isentos de pirogénios, e uma bomba peristáltica, sob uma tampa de fluxo laminar.

b. Centrifugação de Hb misturada com clorofórmio na proporção de 16:1 a 1 600 x g, 4°C, durante 15 minutos, e a 3 800 x g durante 15 minutos, 0 sobrenadante é transferido para uma terceira série de frascos.

c, Centrifugação sem clorofórmio a 61 400 x g, durante 60 minutos.

Após a terceira centrifugação, a solução de Hb é transferida para frascos vazios, isentos de pirogénios, estéreis, de 1 000 ml (Abbott Laboratories) com barras de agitação, nos quais os vestígios restantes de clorofórmio são removidos da solução, lavando com gás C0 esterilizado, com agitação lenta, a 4°C, durante 2 horas.

clorofórmio usado nesta etapa é do grau para HPLC com cut off U.V. a 244 nm (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey), Os frascos são re-utilizáveis após tratamento com (a) sabão E-TOXA-Clean (Sigma Chemicals), (b) etanol retificado a 190° e (c) esterilização a 120°C durante 80 minutos.

Estas séries de centrifugação removem não só todos os fosfolípidos, mas também separa a hemoglobina purificada das proteínas não - heme que desnaturaram e precipitaram na etapa prévia de pasteurização»

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-233, Filtração através de coluna de cromatografia de afinidade para endotoxina, A solução de Hb é passada através de uma coluna de cromatografia de afinidade, tal como a coluna Detoxi-Gel (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois), usando pacotes de transferência de entrada e de saída e uma bomba peristáltica, criando assim um sistema fechado. 0 processo é efectuado sob uma válvula de fluxo laminar Classe 100.

Com esta etapa, pode-se reduzir a concentração de endotoxina de 2,0-2,5 EU/ml a < 0,10 EU/ml.

4. Diálise. A solução de Hb é dialisada, numa proporção de 1:10, contra água desionizada, isenta de pirogénios, estéril, ajustada para um pH de 7,20 pela adição de solução Tham. Efectua-se a diálise usando um rim artificial com porosidade de 6 000 dalton, tal como o 90 SCE - Artificial Kidney (C-DAK Co,, Miami Lakes, FL). Esta etapa: (a) elimina pequenas moléculas, (b) concentra a hemoglobina para 10 g/dl, e (c) baixa o pH da solução de Hb de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 7,2.

Nesta altura do processo, a hemoglobina pura foi já produzida, i.e., hemoglobina completamente isenta de (a) endotoxinas bacterianas, (b) lípidos e fosfolípidos do estroma, e (c) proteínas não-heme. Além disso, presume-se que as filtrações repetidas através de filtros de 0,20 μ. em diversos pontos do processo, tenham eliminado todos os contaminantes microbianos, enquanto se espera que a pasteurização e o tratamento com clorofórmio tenham inactivado ambos os virus com envólucro lipídico e não lipídico. Além disso, o uso de hemoglobina na forma carboxi permite a sua purificação com um baixo grau de oxidação (1-2,5¾ de formação de met-hemoglobina).

D. Modificação da hemoglobina

Efectua-se a reacção da hemoglobina com o-ATP, o-adenosina e glutationa reduzida, dentro do reactor biológico, da seguinte forma. A hemoglobina no estado carboxi, 10 g/dl em água ajustada com Tham para um pH de 7,20, é re-introduzida no bia-reactor e mantida a 4°C, com agitação lenta, sob uma atmosfera de monóxido de carbono.

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o-ATP, preparado de acordo com o Exemplo III é armazenado sob a forma de pó, é dissolvido em água isenta de pirogénios, estéril, ajustada para um pH de 7,20, e adicionada imediatamente à solução de Hb numa proporção molar de Hb/o-ATP de 1:3. Deixa-se a reacção prosseguir a 4°C, com agitação de 150 rpm, sob CO, durante 24 horas. Tomam-se amostras da solução de 6 em 6 horas, e examinam-se por HPLC, com uma coluna de exclusão por tamanhos, para verificar o aumento no peso molecular da hemoglobina, e com uma coluna de permuta aniónica para verificar a alteração na carga eléctrica. Usa-se um sistema HPLC Waters, que compreende um Controlador Waters 600 E System, um injector Waters 712, um Detector Waters 990 Photodiode e um computador NEC Power Mate 2. A coluna de exclusão por tamanho (Proteína Pak 300 SW) e a coluna de permuta aniónica (DEAE-5 PW) são também obtidos a partir de Waters (Waters Chromatography Division, Millipore Co., Milford, MA). As condições ideais de retiéulação ocorrem cerca das 24 horas, quando a observação por HPLC de permuta aniónica revela que 90-95¾ de o-ATP foi consumido na reacção química. Como resultado, produz-se um agregado molecular que é constituído por:

1. Tetrâmeros de hemoglobina

2. Octâmeros da hemoglobina

3. Dodecâmeros da hemoglobina (P. Mol. 64 kdaltons) 70¾ ( 130 ) 21¾ (“ 195 ) 8¾

Por outras palavras, sob as condições da reacção, o o-ATP produz, principalmente, reticulação intramolecular, mas também alguma reticulação intermolecular. Isto não interfere, contudo, com a reacção seguinte.

Após 24 horas, a o-adenosina, preparada de acordo com o Exemplo IV e armazenada sob a forma de pó, é dissolvida em água estéril, pH 7,20 pela adição de Tham, com algumas gotas de etanol. Este composto é adicionado à solução de Hb numa proporção molar de Hb para o-adenosina de 1:5, e deixa-se a reacção prosseguir sob as mesmas condições durante 24 horas. Nesta altura adiciona-se uma segunda dose de o-adenosina, na mesma proporção molar de 1:5, e deixa-se reagir durante mais 24 horas. Examinam-se amostras por HPLC, e a reacção química é lavada quando o

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-25nível de tetrâmeros de Hb reduziu de 70 para 30¾. Se a reacção prossegue muito para além deste ponto, produzem-se polímeros de tamanho excessivo. Adiciona-se então GSH dissolvido em água + Tham, pH 7,20, à solução de Hb numa proporção molar Hb/GSH de 1=20 e deixa-se reagir durante 16 horas.

Nesta altura, o agregado molecular de hemoglobina inclui:

-J

1.	Tetrâmeros	de	hemoglobina
2.	II	II	II	X	2
3»	II	II	II	X	3
4.	II	II	II	X	4

(P.	Mol	64 kdaltons)	30¾
C	II	130	)	20¾
C	II	195	)	20¾
x 6 (	II	256-390	)	30¾

Este agregado apresenta um só pico por HPLC-DEAE aos 50-51 minutos.

No final destas reacções químicas, a hemoglobina é reconvertida da forma carboxi para a forma oxi por lavagem repetida com oxigénio esterilizado a 35 psi, sob agitação suave a 4°C, e exposição a pulsos de 20 segundos de luz forte proporcionada por uma lâmpada quartzline DWY, 120 V, 650 W (General Electric Co., Cleveland, Ohio), ligada a um “molequartz tipo 4051 (Mole-Richardson Co., Hollywood, CA). A re-oxigenação da hemoglobina pode ser verificada pelo uso de um cooxímetro IL.

E. Preparação do produto final

Na etapa final, a solução de Hb é dialisada em primeiro lugar contra 50 mM de solução Tham, pH 8,1, e depois contra uma solução salina equilibrada com electrólitos (Normosol R, pH 7,4, contendo 140 mEq/L de sódio, 5 mEq/L de potássio, 3 mEq/L de magnésio, 98 mEq/L de cloreto, 27 mEq/L de acetato, e 23 mEq/L de gluconato; Abbott Laboratories). 0 perfil do tamanho molecular do agregado de Hb final é-

Tetrâmero de Hb	(P.	Mol.	64	000	daltons)
Tetrâmero de Hb x 2	C	II	130	000	” )
Tetrâmero de Hb x 3	(	II	195	000	)
Tetrâmero de Hb x 4	C	II	260	000	)
Tetrâmero de Hb x 5	(	II	325	000	)
Tetrâmero de Hb x 6	(	11	390	000	)

5¾

18¾

20¾

30¾

16¾

10¾

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-26Assim, a maior percentagem de espécies moleculares é constituída por quatro tetrâmeros de Hb, com um peso molecular de 260 000 daltons, 0 agregado apresenta um só pico por HPLC-DEAE aos 50-51 minutos, o que reflecte uma alteração no ponto isoeléctrico de 6,8 para 6,ΙΟ dialisado contendo a hemoglobina rejeitada, pode ser concentrado para 10 g/dl de Hb por diálise com um rim artificial de 6 000 dalton (rim artificial 90 SCE, C-DAK Co.) e re-usado para reticulação intramolecular com a o-adenosina.

'!

-~y

Na sua forma final, a hemoglobina modificada é dissolvida em Normosol R, pH 7,4, à concentração de 10 g/dl. Adiciona-se cloreto de magnésio (MgCl2), obtido a partir de Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio, numa quantidade equimolar com ATP. Adiciona-se manitol, obtido de GIBCO-Dexter Co., Chagrin Falis, Ohio, numa dose de 2 mg/ml de solução.

.1

J

EXEMPLO II

Usaram-se os processos seguintes para a caracterização do novo produto. Mediram-se as concentrações da hemoglobina, da met-Hb e da carboxi-Hb num cooxímetro (Cooxímetro modelo 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). As concentrações em electrólitos e a osmolaridade da solução foram determinados por meio de um dispositivo ASTRAL (Beckman Co., Paio Alto, Califórnia). Avaliou-se a pressão oncótica usando um oncómetro de Weil (Instrumentation Laboratories). Determinou-se a viscosidade a 37°C e velocidade de corte de 100/segundo, usando um viscósímetro de Brookfield (Brookfield Engineering Laboratories; Stoughton, MA). Avaliou-se, como acima descrito, a pureza da Hb em relação às outras proteínas, fosfolípidos e endotoxinas bacterianas. Calculou-se a capacidade de ligação ao oxigénio a partir da medição da concentração de Hb e conteúdo do volume de oxigénio obtido no cooxímetro. Obtiveram-se as curvas de dissociação de Hb e oxigénio num dispositivo Hem-0-Scan (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland). Os valores PgQ foram lidos nestas curvas sob condições padrão de temperatura (37°C), pH (7,40) e PCO2 (40 Torr). Efectuou-se a análise do conteúdo em

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-27fosfato pelo método de Fiske e Subbarow (Journal of Biological Chemistry, Vol. 66: pp, 375-380, 1925). Efectuou-se a determinação do conteúdo em GSH de acordo com o método de Reed e col. (Analytical Biochemistry, Vol. 106: pp. 55-62, 1980). Determinou-se o valor de adenosina usando HPLC, medindo a absorvância a 258 nm, e calculando a quantidade introduzida e a quantidade incorporada na hemoglobina. Calculou-se o ATP a partir da determinação de fosfato.

produto aqui caracterizado é identificado como (Hb-PP-GSH)_n, onde Hb = hemoglobina bovina purificada, PP = os dois derivados da purina o-ATP e o-adenosina, e GSH = glutationa reduzida. A molécula básica é a Hb na forma tetramérica, apresentada nas Figuras 1 e 2. A sua purificação de outras proteínas está ilustrada na figura 3. Para cada milimole (mM) de hemoglobina, o composto contém 1,05 mM de ATP, 10 mM de adenosina e 7 mM de GSH. Esta composição química e a análise HPLC efectuada a intervalos diversos durante a preparação, indicam que o o-ATP está principalmente envolvido na reticulação intramolecular da Hb, enquanto que a o-adenosina produz a reticulação intermolecular. Em adição, a o-adenosina fixa a molécula GSH à Hb. 0 composto está ilustrado nas figuras 4 e 5. A análise espectral por HPLC de exclusão por tamanho (Figura 4) revela que o composto consiste de seis espécies moleculares:

1.	Hb (tetrâmero) = < 5¾
2.	(Hb)2	= 18¾
3.	(Hb)3	= 20¾
4.	(Hb)4	= 30¾
5.	(Hb)5	= 16¾
6.	(Hb)6	= 10¾

De entre estas, a (Hb)4, i.e., o agregado de quatro tetrâmeros, parece ser a espécie predominante. A análise por coluna HPLC-DEAE (Figura 5) revela um só pico aos 50-51 minutos, indicando que o composto possui um ponto isoeléctríco uniforme, reduzido (em relação à Hb não modificada). A análise por focagem isoeléctrica (IEF) (Figura 6), mostra estas modificações da Hb de

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outra perspectiva.

Após a diálise com a solução salina electroliticarnente equilibrada, ajustada para um pH de 7,4 pela adição de solução Tham, e após a adição de MgCl2, e manitol, a solução final de hemoglobina tem a composição apresentada no quadro que se segue.

Λ concentração de 10 g/dl, esta solução de Hb, exposta ao ar atmosférico, transporta 13 volumes_?por cento,de oxigénio, o que indica uma capacidade de ligação ao oxigénio perto de 100¾ (1,3 volumes de oxigénio por 1 g de Hb). 0 valor P50 da solução é elevado (~28 mmHg) não obstante a polimerização devido à elevada concentração de cloreto. A osmolaridade é superior à do plasma, pressão elevada mas a viscosidade é inferior ã do sangue total. A coloido-osmótica é inferior à do plasma não obstante a concentração de hemoglobina (em comparação com a albumina), devido ao facto da hemoglobina estar polimerízada, de modo que o número de partículas de Hb” está reduzido.

QUADRQs Caracteristicas da Solução de Hemoglobina (Produto final)

1.	Hemoglobina g/dl	10,0 ± 0,5
2.	Met-Hb, % de hemoglobina	3,5 ± 0,5
3.	Carboxi-Hb, %	1,5 ± 0,5
4.	pH, unidades	7,40
5.	Sódio, mEq/L	140 ± 2,0
6.	Potássio, mEq/L	4,0 ± 0,5
7.	Magnésio, mM/mole de Hb	0,8 ± 0,2
8.	Cloreto, mEq/L	120 ± 5,0
9.	Manitol, mg/dl	200 + 5,0
10.	Pressão coloido-osmótica, mm Hg	22 ± 2,0
11.	Viscosidade, cP	1,74 ± 0,04
12.	Osmolaridade, mOsm/L	325 ± 10
13.	Proteínas não-Hb	não detectável
14.	Fosfolípidos e lípidos do estroma	II
15.	Endotoxinas bacterianas	II
16.	Esterilidade	estéril
17.	Estabilidade a -60°C	indefinido

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EXEMPLO III

Preparação em grande escala de o-ATP

É conhecido na arte o processo básico de preparação de o-ATP (ver: S. B. Easterbrook-Smith e col., Pyruvate Carboxylase: Affinity labelling of the magnesiurn adenosine triphosphate binding site, European Journal of Biochemistry, Vol. 62: pp, 125-130, 1976).

Efectuaram-se modificações de forma a produzir maiores quantidades de material e assegurar uma reacção química com a hemoglobina satisfatória.

foi eluida nucleotido,

Obtiveram-se o sal dissódico de adenosina 5’-trifosfato hidratado (ATP) F.W. 551,15, e periodato de sódio (NalO^.) pureza de 99%, F.W. 213,89 de Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Obtiveram-se dez colunas Sephadex G-10 de 120 ml de Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. Para cada coluna, dissolveram-se 550 mg de ATP em 15 ml de água estéril isenta de pirogénios (água para injecção, Abbott Laboratories), ajustada com solução Tham para um pH de 7,0, 0°C. Adicionou-se periodato de sódio numa proporção molar (ATP/NaI04) de 1:1,1, e deixou-se a solução repousar a 4°C, no escuro, durante uma hora. A reacção foi interrompida pela adição de etileno glicol numa proporção molar (ATP/etileno glicol) de 2:1 durante 15 minutos. A mistura reaccional foi carregada numa coluna de Sephadex G-10, previamente equilibrada com água pãea injecção a 4°C. A coluna com 200 ml de água. A metade liderante do pico fracçõs 20 a 30, como se mostra na fig. 7, foi reunida e imediatamente liofilizada com um Labconco Freeze-Dry System com Stoppering Tray Dryer (Labconco Co., Kansas City, M0), com vácuo < 10 p. Hg a -40°C. 0 pó foi armazenado em frascos escuros a -90°C até ser usado.

Determina-se a concentração de o-ATP medindo a absorvância a 258 nm, enquanto se avalia a presença de periodato medindo a absorvância a 232 nm. As colunas são lavadas com água para injecção durante 30 horas a 4°C, até que o eluído apresente uma absorvância inferior a 0,043 a 232 nm, i.e., até que todo o

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periodato tenha sido lavado, antes de ser re-utilizado.

Há duas medidas importantes para o propósito deste invento: (1) que só sejam recolhidas fracções contendo o-ATP sem qualquer vestígio de periodato; e (2) que estas fracções sejam imediatamente liofilizadas e congeladas a -90°C. Estas medidas impedirão a oxidação da hemoglobina aquando da reacção química.

EXEMPLO IV

Preparação em grande escala de o-adenosina

É conhecido na arte o processo básico de preparação de o-adenosina (ver: j. χ. Khym e W. E. Cohn Characterizations and some Chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides, Journal of American Chemical Society, Vol. 82: pp. 6380-6386, 1960). Efectuaram-se modificações de forma a produzir quantidades maiores de material e de forma a assegurar uma reacção química satisfatória com a hemoglobina.

Obteve-se adenosina a 98¾ de pureza de Sigma Chemical Co., enquanto que se obteve o periodato de sódio de Aldrich Chemical Co., Dissolveu-se adenosina, 6 g, em 200 ml de NaI04, 150 mM, em água à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A solução foi passada através de uma coluna de resina ds permuta aniónica de 300 ml, AG 1 -X- 8, malha de 100-200 sob à forma de acetato (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) previamente equilibrada com ácido acético 20 mM (Eluente A) obtido de Fisher Scientific Co., A coluna foi eluida com dois litros de Eluente A com uma velocidade de fluxo de 15 ml/minuto, ã temperatura de 4°C, obtendo fracções de 150 ml. Só se recolheram as fracções 2 a 15 (como se mostra na Fig. 8) que foram imediatamente liofilizadas e congeladas, como se fez para o o-ATP,

Antes da re-utilização, aplicaram-se seis litros de cloreto de amónio 10 mM (Eluente B) à coluna, de forma a libertar todo o periodato. Determinou-se a concentração do periodato nas fracções medindo a absorvância a 232 nm. Depois, a coluna foi lavada com seis litros de água para injecção, e foi então novamente equilibrada com ácido acético 20 mM.

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São importantes duas medidas para o propósito deste invento: (1) que só sejam recolhidas as fracções contendo o-adenosina sem qualquer vestígio de periodato; e (2) que estas fracções sejam imediatamente liofilizadas e congeladas a -90°C. Estas medidas impedirão a oxidação da hemoglobina aquando da reacção química.

DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES DO INVENTO

EXEMPLO V

Toxicidade em coelhos: a toxicidade da nova composição (Hb-PP-GSH) foi testada em coelhos, segundo um processo previamente descrito na literatura científica (M. Feola e col., Toxicity of polymerized hemoglobin Solutions, Surgery, Gynecology and Qbstetrics, Vol. 166: pp. 211-222, 1988).

Em doze coelhos da Nova Zelândia, com 4 kg de peso corporal, inseriram-se cânulas estéreis, sob anestesia total com lidocaína a 1%, na artéria central de uma orelha e na veia marginal da outra orelhá . Inseriu-se um catéter estéril na bexiga. Inseriram-se nos membros, sob anestesia local, uma sonda thermistor e agulhas-eléctrodos para ECG. Monitorizaram-se, o electrocardiograma (ECG), a pressão sanguínea, a temperatura corporal, e o débito urinário, continuamente durante três horas, após o qual os catéteres e os electrodos foram removidos e os animais foram devolvidos às suas gaiolas. Após 30 minutos de actividade basal (linha de base) removeram-se 80 ml de sangue, correspondendo a 1/3 do volume sanguíneo (volume sanguíneo calculado no coelho = = do peso corporal em kg) da via arterial durante um período de 5 minutos. Infundiu-se um volume igual de Hb-PP-GSH através da via venosa durante um período de 30 minutos. Este era igual a apoximadamente 2 gramas de hemoglobina. A remoção do sangue provocou uma queda na pressão sanguínea com um aumento da frequência cardíaca. Estas alterações foram rapidamente corrigidas. Além disso, a pressão de pulso (diferença entre a pressão sistólica e diastólica) que ficou estreita após a hemorragia, primeiro voltou ao normal e depois ficou superior à da linha de base indicando o efeito vasodilatador da solução de Hb» Este efeito manteve-se durante todo o período agudo de observação de

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três horas. 0 ECG não mostrou qualquer arritmia cardíaca. O débito urinário manteve-se normal, sem qualquer extravasão de hemoglobina, para a urina.

As amostras tomadas 30 minutos, 1, 3 e 24 horas após a substituição do sangue revelaram: (1) nenhuma redução de glóbulos brancos ou de plaquetas por excesso do efeito de hemodiluição; (2) nenhuma activação da coagulação intravascular e fibrinólise, como determinado pela medição do fibrinogénio sérico, do tempo de protrombina e dos produtos de degradação da fibrina; (3) nenhuma elevação da isoenzima cerebral da creatina fosfoquinase (CPK-BB) ou da isoenzima miocárdica (CPK-MB) que pudesse sugerir lesão cerebral ou miocárdica; (4) nenhuma elevação da transaminase glutâmica pirúvica sérica (TGP) sugestiva de lesão hepática; (5) gases sanguíneos arteriais normais indicando uma função pulmonar normal; e (6) creatinina sérica normal sugestiva de função renal normal. Amostras combinadas de sangue e urina ãs 3 e 24 horas revelaram uma depuração da creatinina mormal, indicando, novamente, uma normal função renal. As curvas de dissociação do oxigénio do sangue total não mostram quaisquer alterações no valor de Pso> i.e., nenhum aumento na afinidade do oxigénio devido à hemoglobina, 0 nível da Hb plasmática às 24 horas era de aproximadamente 50% do nível inicial sugerindo uma semi-vida da hemoglobina de 24 horas.

Os animais pareceram e comportaram-se normalmente durante 24 horas. Nesta altura foram mortos e os órgãos vitais foram examinados histologicamente. Não se encontraram qualquer das alterações patológicas previamente descritas na literatura cientifica no (a) coração, (b) pulmões, (c) fígado, e (d) rins. Estas observações contrastam nitidamente com as previamente descritas (ver referência acima) após o uso de hemoglobina não-pura, reticulada com glutaraldeído.

EXEMPLO VI

Eficácia em coelhos: testou-se a eficácia do produto como um substituto do sangue em coelhos. Após instrumentação semelhante à descrita no exemplo anterior, submete-se um grupo de controlo de

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-3310 coelhos da Nova Zelândia, com 4,0 kg de peso corporal, à remoção de 1/3 do volume sanguíneo calculado (volume sanguíneo = = 6¾ do peso corporal em kg)., seguido da remoção de outro 1/3 15 minutos depois» Sem tratamento, todos estes animais morreram dentro de uma hora» Um grupo experimental de 10 coelhos foi submetido ao mesmo processo, mas receber uma infusão de Hb-PP-GSH, num volume igual ao da perda de sangue total. Todos estes animais sobreviveram e reconstituíram o seu hematócrito de base (concentração de glóbulos vermelhos) dentro de alguns dias.

EXEMPLO VII

Vasodilatação após reposição do sangue em ratazanas: anestesiaram-se doze ratazanas Sprague-Dawley pesando 350-450 g, com injecção intra-peritoneal de pentobarbital de sódio, 45 mg/kg, e colocaram-se numa placa cirúrgica na posição supina. Exposeram-se, cateterizaram-se com catéteres de polietileno (modelo PE 50; Intramedic, Nova Iorque) a artéria femoral direita, a artéria carótida e a veia jugular externa. 0 catéter da jugular externa foi conduzido até à aurícula direita, enquanto se conduziu uma sonda thermistor (modelo IF, Columbus Instruments, Columbos, Ohio) ao longo da artéria carótida até ã aorta ascendente. Encheu-se cada catéter com solução salina contendo 5 lU/ml de heparina bovina. As linhas arterial>femoral e venosa jugular, foram ligadas a transductores de pressão. Inseriram-se, electrodos sob a forma de agulhas, subcutaneamente nos membros, e foram usados para monitorizar o electrocardiograma (ECG). Ajustaram-se lâmpadas de aquecimento para manter a temperatura corporal constante.

Determinou-se a frequência cardíaca a partir do traçado do ECG, mediu-se o débito cardíaco por termodiluição, injectando 200 Ul de solução salina mantida à temperatura ambiente (20-22°C) na aurícula direita, e registando uma curva de termodiluição a partir do thermistor aórtico» Calculou-se a resistência vascular sistémica como a pressão arterial média, menos a pressão na aurícula direita dividido pelo débito cardíaco.

Após o registo dos dados hemodinâmicos basais, removeu-se

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1/3 do volume sanguíneo calculado (volume sanguíneo na ratazana = = 7¾ do peso corporal em kg) da linha arterial durante um período de 5 minutos. Após 15 minutos, infundiu-se igual volume de Hb-PP-GSH na linha venosa. Mediram-se a frequência cardíaca, a pressão arterial média, e o débito cardíaco, e calculou-se a resistência vascular sistémica em condições basais (Τχ), 15 minutos após a remoção do sangue (T2), e 15 minutos após a infusão de hemoglobina (T3). Efectuou-se a análise estatística dos dados, usando-se o tes+e-t. de .Student para dadosem pares.

Os resultados, abaixo resumidos, mostram uma resistência vascular sistémica aumentada, após a remoção do sangue, seguido da redução para o normal e por vasodilatação, mesmo em relação à actividade basal, após a reposição do sangue.

QUADRO:

Perfis hemodinâmicos após reposição de sangue com Hb-PP-GSH

Linha de base Hemorragia Hemoglobina

Frequência cardíaca	320	+ : 5	390 ± :.10*	300	+ . 10*
(batidas /minuto) Pressão arterial mé	105	+: 5	90 1 3*	105	+ . 5*
dia (mm Hg) Débito cardíaco	425	+ :. 20	275 + .. 15*	455	í . 28*
(ml/kg/minuto) Resistência vascular	0	,23+0,02	0,33 +0,03*	o,	21+0,02*

sistémica (mm Hg/ /ml/kg/minuto)

Números = Valores Médios + Desvio Padrão; * = Diferença Estatisticamente significativa (P < 0,05) de intervlos de tempo anteriores.

EXEMPLO VIII

Produção de radicais livres de oxigénio em coelhos: sedaram~ -se doze coelhos da Nova Zelândia, com 4,0 kg de peso corporal, com cloropromazina (5 mg/kg intramuscularmente) e submeteram-se a instrumentação limitada. Inseriram-se cânulas de plástico esté71 935

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reis na artéria central e na veia marginal de uma orelha, e inseriram-se uma sonda thermistor e eléctrodos sob a forma de agulhas subcutaneamente nos membros. Removeu-se um terço do volume sanguíneo calculado (2% do peso corporal em kg) da linha arterial durante um período de cinco minutos e infundiu-se o mesmo volume de solução de Hb através da veia por um período de 30 minutos. Um grupo de controlo de seis coelhos recebeu Hb não-modifiçada, enquanto que o grupo experimental (seis coelhos) recebeu Hb-PP-GSH. Estudaram-se os efeitos em termos de níveis plasmáticos de peróxido de hidrogénio (H2O2) θ de peróxidos lipídicos, determinados em condições basais e 15 minutos, 1 hora, 3 horas e 24 horas após a infusão de Hb. Mediu-se também a Hb e a met-Hb plasmáticas nos mesmos intervalos.

H2O2 aumentou, no grupo que recebeu Hb não modificada, de ±2 para 70 ± 5 micromoles/mililitro após uma hora, e depois diminuiu para 50 ± 5 umol/ml às três horas e para 10 ± 5 umol/ml às 24 horas. No grupo experimental, ο H2O2 aumentou só de 2 ± 2 para 10 ± 2 umol/ml após uma hora e voltou para a linha de base após três horas, De forma semelhante, os peróxidos lipídicos aumentaram de 1,5 ± 0,9 nanomoles/mililitro a níveis basais, para

4,0 ±1,0 hmol/ml após uma hora no grupo de controlo. Não ocorreu qualquer aumento significativo no grupo experimental. A. met-Hb plasmática aumentou de 0 a 15¾ numa hora no grupo que recebeu Hb não modificada. Aumentou ds 0 a 5% no grupo que recebeu Hb-PP-GSH. Por análise estatística, a diferença nestas variáveis entre de os dois grupos, foi considerada significativa, testes-t/ Student para amostras pares e sem pares mais ANOVA.

Embora o invento tenha sido descrito em associação com a concretização específica acima, tornai—se-ão evidentes para os entendidos na arte muitas alternativas, variações e modificações, Essas alternativas, variações e modificações estão incluídas no espírito e alcance das reivindicações anexas.

Claims (23)

1. R.....E.....I.....V.....I.....M.....D.....X.....c.....A.....s.....Õ.....Ε.....s

   1 - Processo de preparação de uma composição destinada a ser usada como substituto do sangue, caracterizado por compreender a reticulação de hemoglobina activa, isenta de micróbios e substancialmente isenta de pirogénios com o-ATP e o-adenosina.
2. 2 - Processo de aoordo oom a reivindicação 1, caracterizado por se combinar ainda glutationa reduzida.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se combinar, ainda, cloreto de magnésio a uma concentração aproximadamente equimolar à do o-ATP.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o o-ATP compreender ATP oxidado com periodato e a o-adenosina compreender adenosina oxidada com periodato; e por a hemoglobina ser intramolecularmente reticulada com o ATP oxidado com periodato e íntermolecularmente reticulada com a adenosina oxidada com periodato, para formar poli-hemoglobina.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se combinar ainda glutationa, e no qual a hemoglobina, o o-ATP, a o-adenosina e a glutationa são reagidas em proporções molares de cerca de 1:1,05:10:7, respectivamente.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a hemoglobina reticulada ter um peso molecular de cerca de 130 a 390 quilodaltons.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por menos de 5% da hemoglobina ser constituída por met-hemoglobina.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

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   AZJ/MR

   -37por a hemoglobina compreender hemoglobina bovina»
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender separar sangue total numa mistura leucócito-eritrócito, plaquetas e plasma e suspender a mistura assim obtida numa solução aquosas arrefecer a solução compreendendo a mistura leucócito-eritrócito para agregar os leucócitos e remover o agregado de leucócitos;

   díalísar a solução substancíalmente isenta de leucócitos contra uma solução hipotónica para extractar a hemoglobina dos eritrócitos» para obter uma solução de hemoglobina e separar os eritrócitos da solução de hemoglobina por ultrafiltração sob elevada pressão hidrostática;

   converter a hemoglobina extractada na solução em earboxí-hemoglobina;

   pasteurizar a solução de hemoglobina para desnaturar e precipitar as proteínas não heme;

   remover os fosfolipidos e as proteínas não heme precipitadas da solução;

   remover as endotoxinas da solução de hemoglobina por cromatografia de afinidade;

   concentrar a hemoglobina na solução para uma concentração de cerca de lOg/dl;

   reagir a carboxi-hemoglobina» na solução concentrada» com o O-ATP» para efectuar reticulação predominantemente intramolecular da hemoglobina;

   reagir a carboxi-hemoglobina com O-adenosína numa quantidade eficaz para efectuar uma reticulação predominantemente intermolecular da hemoglobina e adicionar a glutationa à solução de hemoglobina reticulada para parar a reacção de reticulação oom O-adenosína; e converter a carboxi-hemoglobina reticulada na solução em oxi-hemoglobina reticulada»
10. 10 - Processo de preparaçao de um substituto do sangue, caracterizado por compreender a associação da composição da

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    AZJ/MR fez'

    -38reivindicação 1, com uma solução salina farmaceuticamente aceitável.,
11. 11 ~ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracter!gado por a hemoglobina reticulada ser dissolvida na solução salina.
12. 12 - Processo de extracção de hemoglobina purificada a pai— tir de sangue total, caracterizado por compreender:

    separar sangue total numa mistura de leucócito-erítrócíto, plaquetas © plasma, e suspender, a mistura assim obtida, numa solução aquosa;

    arrefecer a solução compreendendo a mistura leucócito-eritrócito para agregar os leucócitos e remover o agregado de leucócitos 5 díalísar a solução substancialmemte isenta de leucócitos contra uma solução hípotóníoa, para extractar a hemoglobina dos eritrócitos, para obter uma solução de hemoglobina e separar os eritrócitos da solução de hemoglobina por ultrafiltração sob elevada pressão hidrostática;

    converter a hemoglobina extractada na solução, em carboxi- hemoglobina;

    pasteurizar a solução de hemoglobina para desnaturar e precipitar proteínas nao heme;

    remover da solução os fosfolípidos e proteínas não heme precipitadas; e remover as endotoxinas da solução de hemoglobina por cromatografia de afinidade.
13. 13 - Processo de acordo oom a reivindicação 12, caracterizado por a O~adenosina e o O-ATP serem preparados por oxidação, oom periodato, da adenosina e do ATP; e por o periodato ser removido da O-adenosína e do O-ATP, antes de reagir o O-ATP e a adenosina com a hemoglobina.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracteríza

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    AZJ/MR do por a mistura leucócito-eritrócito ser separada das plaquetas e do plasma por centrifugação do sangue total.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por os leucócitos serem removidos por filtração.
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a hemoglobina ser convertida em carboxi-hemoglobína, descarregando monóxido de carbono sobre a solução.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por os fosfolípidos e as proteínas não heme precipitadas serem removidas da solução por extracção com solvente.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a solução de hemoglobina ser concentrada por diálise contra uma solução aproximadamente normotóriica.
19. 19 - Processo para a preparação de uma composição adequada para ser usada como um substituto do sangue, caracterizado por compreender converter a hemoglobina em solução em carboxi-hemoglobína; concentrar a solução de carboxi-hemoglobína até cerca de lOg/dl;

    reagir a carboxi-hemoglobína, na solução concentrada, com o O-ATP para efectuar reticulação predominantemente intramolecular da hemoglobina;

    reagir a carboxi-hemoglobína com Q-adenosína para efectuar reticulação, predominantemente, intermolecular da hemoglobina;

    adicionar glutationa à solução de carboxí-hemoglobina/O-adenosína, para parar a reacção de reticulação da O-adencsina;

    converter a. carboxi-hemoglobína reticulada em oxi-hemoglobina reticulada; e formar uma solução de hemoglobina reticulada farmaceuticamente aceitável.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteriza71 935

    AZJ/MR

    -40“ do por compreender, ainda, a adição de magnésio à solução de hemoglobina reticulada»
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender, ainda, a adição de manitol à solução»
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a hemoglobina purificada ser obtida a partir de sangue total pela separação do sangue total numa mistura de leucócito-eritrócito, plaquetas e plasma e suspensão da mistura assim obtida numa solução aquosa;

    arrefecimento da solução compreendendo a mistura de leucócito-eritrócito, para agregar os leucócitos, e remover o agregado de leucócitos;

    diálise da solução substancialmente isenta de leucócitos contra uma solução hipotónica, para extracção da hemoglobina dos eritrócitos, para obter uma solução de hemoglobina, e separação dos eritrócitos da solução de hemoglobina por ultrafiltração sob elevada pressão hidrostática;

    conversão da hemoglobina extractada na solução em carboxi-hemoglobina;

    pasteurização da solução de hemoglobina, para desnaturar e precipitar as proteínas não heme;

    remoção, da solução» dos fosfolípidos e das proteínas nao heme precipitadas; e remoção de endotoxinas, da solução de hemoglobina, por cromatografia de afinidade»
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o sangue total» a partir do qual se obtém a hemoglobina, compreender sangue bovino»