CN116941603A - 一种新型醛化鸡红细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型醛化鸡红细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：使用血球保护液对新鲜鸡静脉血进行处理；步骤2：使用醛化液对步骤1制备的鸡红细胞进行处理；步骤3：将步骤2醛化的鸡红细胞进行换液处理，得到的鸡红细胞置于2～8℃保存备用。本发明的方法具有以下优点：对目前诊断用红细胞的制备工艺改进，质控方式从传统的体系压积改进为红细胞计数方式，质控方式更准确可控；红细胞制备可实现批量化生产，降低制备成本；红细胞储存的稳定性提升，提高试剂利用率；本方法制备的鸡红细胞除检测诊断用途外，还为生物学实验中鸡红细胞制备提供了可选方案。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测试剂领域，具体涉及一种新型醛化鸡红细胞的制备方法及其应用。
背景技术
病毒、细胞凝集素和抗体等能够引起的红细胞凝集，成为红细胞凝集现象。利用该原理开发的血凝实验和血凝抑制实验广泛运用于各类动物病毒性疾病的检测、诊断。目前，临床长期保存细胞的方法主要是-80℃和液氮超低温保存，但以冷冻保存的方式通常需要添加甘油等冷冻保护剂来阻止细胞内外冰晶的产生，避免细胞在冻融时出现不可逆的机械性损伤。
在临床应用过程中，通常采用新鲜的红细胞作为指示细胞，在红细胞保存过程中,由于保存条件的不同和随着保存时间的延长，红细胞表面会发生一系列结构性与功能性的变化，从而致使新鲜红细胞容易发生溶血、破裂，而且易吸附免疫球蛋白等物质，并且保存期较短，不利于实际临床检验和科研应用。醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状，但几乎不影响红细胞凝集作用。
现有文献中，对醛化红细胞有一定的研究(如姜金庆,李培庆,刘丽艳，安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2006,34(20):5265-5266)，本发明人对其配方也进行了重复研究，其2～8℃的保存期只有约30天，并没有文章中所描述的1年甚至7年的保质期。因此，有必要对现有的制备方法进行改进，以提高其保存期等。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目在于提供一种新型醛化鸡红细胞的制备方法及其应用。
因此，本发明一方面提供了一种新型醛化鸡红细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：使用血球保护液对新鲜鸡静脉血进行处理；
步骤2：使用醛化液对步骤1制备的鸡红细胞进行处理；
步骤3：将步骤2醛化的鸡红细胞进行换液处理，得到的鸡红细胞置于2～8℃保存备用；
其中步骤1中的血球保护液配方为：葡萄糖2.20g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.50g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，用10％的枸橼酸调整pH至6.0～6.3；
步骤2中的醛化液配方为：甲醛1-4.0mL，葡萄糖3.30g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.5g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，调整pH至7.0～7.2。
优选地，本发明所述的步骤1的具体过程为：取新鲜鸡静脉血与血球保护液1:2混合，制备抗凝血悬液，1000rpm离心10min，小心吸取上清弃去，得到红细胞压积，随后，采用10倍压积体积PBS洗涤细胞3次，每次均以1000rpm/min离心10min以除去杂细胞。
优选地，本发明所述的步骤2的具体过程为：将步骤1中洗涤好的红细胞压积按10倍体积比加入醛化液中混匀，混匀后将混合液置于2～8℃冰箱中48h，每6h震荡一次；
优选地，本发明所述的步骤3的具体过程为：取出步骤2中醛化完成的醛化细胞混合液于1000rpm/min离心10min，弃上清；利用10倍压积红细胞体积比PBS溶液洗涤3次，每次均以1000rpm/min离心10min，最后加入10倍压积红细胞体积比PBS溶液小心吹打混匀细胞，在2～8℃冰箱中保存备用。
优选地，本发明所述的步骤2中的醛化液中的甲醛最适添加量为2mL，此时配制的为2％醛化液。
优选地，本发明所述的醛化鸡红细胞最适细胞工作浓度为5-7×107个/mL。
再一方面，本发明还提供了一种所的方法在制备醛化鸡红细胞中的应用。
本发明的有益效果是：1.对目前诊断用红细胞的制备工艺进行改进，质控方式从传统的体系压积改进为红细胞计数方式，质控方式更准确可控；2.红细胞制备可实现批量化生产，降低商品化鸡红细胞试剂制备成本；3.红细胞储存的稳定性提升，提高试剂利用率；4.本方法中所有试剂均可在普通实验室内进行，同时实现红细胞的长期保存，避免无菌操作的复杂流程；5.本方法制备的鸡红细胞除检测诊断用途外，还为生物学实验中鸡红细胞制备提供了可选方案。
附图说明
图1显微镜下各组分鸡红细胞形态。
图2不同醛化液浓度下鸡红细胞血凝试验。
图3 37℃下细胞加速老化试验。
图4细胞加速老化下血凝试验。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：新型醛化鸡红细胞的制备
步骤1：取新鲜鸡静脉血与血球保护液1：2混合，制备抗凝血悬液，1000rpm离心10min，小心吸取上清弃去，得到红细胞压积，随后，采用10倍压积体积PBS洗涤细胞3次，每次均以1000rpm/min离心10min以除去杂细胞；
其中血球保护液配方为：葡萄糖2.20g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.50g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，用10％的枸橼酸调整pH至6.0～6.3。
其中PBS洗涤液配方为：氯化钠8.0g，氯化钾0.22g，无水磷酸氢二钠1.20g，磷酸二氢钾0.24g，加蒸馏水至1L混匀，高压灭菌后备用。
步骤2：将步骤1中洗涤好的红细胞压积按10倍体积比加入醛化液中混匀，混匀后将混合液置于2～8℃冰箱中48h，每6h震荡一次；
其中：醛化液配方为：甲醛1-4.0mL，葡萄糖3.30g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.5g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，调整pH至7.0～7.2。本醛化液也可用商品化的多聚甲醛溶液代替甲醛，同时按比例加入上述其他成分，用纯化水稀释至浓度相等。
需要说明的是，按照上述配方进行醛化液配制时，当甲醛添加量为1mL时，则醛化液为1％醛化液，依次类推配制2％醛化液、3％醛化液、4％醛化液。
步骤3：取出步骤2中醛化完成的醛化细胞混合液于1000rpm/min离心10min，弃上清；利用10倍压积红细胞体积比PBS溶液洗涤3次，每次均以1000rpm/min离心10min，最后加入10倍压积红细胞体积比PBS溶液小心吹打混匀细胞，在2～8℃冰箱中保存备用。
采用红细胞计数板进行细胞计数，计数时以新鲜1％红细胞作为计数对照；
如图1所示，通过不同浓度细胞醛化液醛化后的细胞形态的显微镜下观察，与新鲜鸡红细胞相比，1％醛化液浓度下的醛化红细胞在形态方面最为接近，2％，3％，4％浓度下的醛化鸡红细胞体积稍显增大，细胞表面更加光滑，具备鸡红细胞典型特征。
根据红细胞计数说明书进行红细胞计数，实验用新鲜鸡红细胞工作浓度为6.7-7×107个/mL，1％-4％醛化鸡红细胞浓度分别为，6.4×107个/mL，6.8×107个/mL，5.9×107个/mL，4.7×107个/mL。同时，将各组分细胞浓度定为血凝试验工作浓度，确定醛化鸡红细胞最适细胞工作浓度为5-7×107个/mL。
实施例2：新型醛化鸡红细胞与新鲜1％红细胞的比较试验研究
1.鸡红细胞血凝试验(禽流感抗原Re7-3株)
将实施例1中计数完毕的醛化红细胞悬液进行红细胞血凝试验，试验方法参考SN/T 1182-2010《禽流感检疫技术规范》，试验抗原选择禽流感抗原Re7-3株(品牌：哈兽研批号：2021006)。
鸡红细胞血凝试验如图2所示，以新鲜鸡红细胞悬液为对照，禽流感抗原Re7-3株血凝效价为27，与产品说明书所标抗原效价一致，其中2％醛化红细胞血凝效价为28-7，结果与新鲜鸡红细胞血凝试验结果最为接近，确定以2％醛化液作为鸡红细胞最适醛化液。
2.保存期试验
将实施例1中计数完毕的新鲜红细胞、醛化红细胞悬液置于37℃培养箱中存放1天、3天观察细胞形态，细胞计数后进行红细胞血凝试验，试验方法参考SN/T 1182-2010《禽流感检疫技术规范》。
结果显示，将新鲜红细胞、2％醛化红细胞分别放置于37℃培养箱中进行加速老化1天和3天，新鲜红细胞在37℃下存放1天观察已出现明显红细胞裂解；而2％醛化红细胞可在37℃下存放3天均无明显红细胞裂解。血凝试验结果如图3所示，并且对试验结果无明显影响。
将实施例1中计数完毕的新鲜红细胞、2％醛化红细胞悬液以及37℃培养箱中存放3天2％醛化红细胞悬液进行新城疫、禽流感(H7Re-3)抗体的血凝抑制试验，比较差异性。
结果显示，1％新鲜红细胞、2％醛化后红细胞悬液以及37℃培养箱中存放3天2％醛化后红细胞悬液对新城疫、禽流感(H7Re-3)抗体红细胞血凝抑制试验的HI差异性在±log2以内，为可接受，同时后期可适当调整红细胞浓度进行修正。(鸡新城疫抗原(青岛立见批号：10132101)，鸡新城疫阳性血清(青岛立见批号：10152102),(禽流感(H7Re-3)抗原(哈兽研批号：2021006)，禽流感(H7Re-3)阳性血清(鸡)(哈兽研批号：2021001))。
表1血凝抑制抗体检测结果
实施例3：与其他产品比较试验
将实施例1中计数完毕的新鲜红细胞悬液、2％醛化红细胞悬液和某商品化的醛化红细胞悬液置于4℃冰箱中存放7天、14天、21天、28天、35天、49天、56天、63天、72天观察红细胞悬液的颜色；并分别在14天、49天、72天对上述液体观察细胞形态，细胞计数。
结果显示，将新鲜红细胞悬液在存放14天颜色已经出现较为明显溶血的红色；2％醛化红细胞悬液在存放56天颜色无明显变化，72天呈现轻微红色；商品化的醛化红细胞悬液在存放28天颜色转浅红，49天已出现较为明显的红色。
在14天、49天、72天显微镜观察，新鲜红细胞悬液视野中红细胞碎片明显增加；2％醛化红细胞悬液未见明显细胞碎片、细胞数量少量降低；市销的醛化红细胞悬液49天时出现明显细胞碎片，细胞数量明显降低。细胞碎片、计数结果如表2所示，保存期稳定性实验表明，本发明较新鲜红细胞、商品化的醛化红细胞悬液有明显的延长(2～8℃保存条件下，新鲜红细胞悬液保存期一般为14天，商品化的醛化红细胞悬液保存期一般为30天，本发明制备的2％醛化红细胞悬液保存期至少为60天)。
表2 4℃条件下保存稳定性
需要说明的是，本发明在血球保护液和醛化液中添加一定量的腺嘌呤和甘露醇，对醛化鸡红细胞的保存期具有较长的延长作用。本发明人比较了未添加这2种成分制备的醛化鸡红细胞和添加了这2种成分的醛化鸡红细胞的保存期，未添加这2种成分制备的醛化鸡红细胞的保存期与商品化的醛化鸡红细胞的保存期一致，但添加这2种成分制备的醛化鸡红细胞的保存期较长(如实施例3结果所示)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种新型醛化鸡红细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：使用血球保护液对新鲜鸡静脉血进行处理；
步骤2：使用醛化液对步骤1制备的鸡红细胞进行处理；
步骤3：将步骤2醛化的鸡红细胞进行换液处理，得到的醛化鸡红细胞置于2～8℃保存备用；
其中步骤1中的血球保护液配方为：葡萄糖2.20g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.50g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，用10％的枸橼酸调整pH至6.0～6.3；
步骤2中的醛化液配方为：甲醛1～4.0mL，葡萄糖3.30g，腺嘌呤0.012g，甘露醇0.5g，二水柠檬酸钠0.85g，柠檬酸0.056g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL混匀，调整pH至7.0～7.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1的具体过程为：取新鲜鸡静脉血与血球保护液1：2混合，制备抗凝血悬液，1000rpm离心10min，小心吸取上清弃去，得到红细胞压积，随后，采用10倍压积体积PBS洗涤细胞3次，每次均以1000rpm/min离心10min以除去杂细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2的具体过程为：将步骤1中洗涤好的红细胞压积按10倍体积比加入醛化液中混匀，混匀后将混合液置于2～8℃冰箱中48h，每6h震荡一次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3的具体过程为：取出步骤2中醛化完成的醛化细胞混合液于1000rpm/min离心10min，弃上清；利用10倍压积红细胞体积比PBS溶液洗涤3次，每次均以1000rpm/min离心10min，最后加入10倍压积红细胞体积比PBS溶液小心吹打混匀细胞，在2～8℃冰箱中保存备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2中的醛化液中的甲醛最适添加量为2mL，此时配制的为2％醛化液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醛化鸡红细胞最适细胞工作浓度为5-7×107个/mL。
7.一种如权利要求1所的方法在制备醛化鸡红细胞中的应用。
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