CN102703386A

CN102703386A - 醛化鹅新鲜红细胞及其在无细胞百日咳ha试验中的应用

Info

Publication number: CN102703386A
Application number: CN2012101778073A
Authority: CN
Inventors: 赵伟; 胡业勤; 朱红伟; 薛红刚; 李新国; 项美娟
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明提供了一种醛化鹅新鲜红细胞及其制备方法和醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。本发明醛化鹅红细胞方法的具体条件为：1.25%戊二醛醛化40min，醛化鹅红细胞工作浓度为0.8%，用于无细胞百日咳的HA试验，取得与0.8%新鲜鹅红细胞一致的试验结果，但以醛化鹅红细胞取代新鲜鹅红细胞后，鹅红细胞保存期变长，实验结果更稳定，克服了现有技术需要使用的1%鹅新鲜红细胞存在的质脆易碎，保存期短的缺点。

Description

醛化鹅新鲜红细胞及其在无细胞百日咳HA试验中的应用

技术领域

本发明涉及一种无细胞百日咳检测工艺方法，对无细胞百日咳血凝实验HA(某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝试验HA)中所采用的鹅新鲜红细胞进行戊二醛化，以改进鹅新鲜红细胞质脆易碎、保质期短的问题，与鹅新鲜红细胞相比，保质期从7天左右提高到90天，减少了采集鹅血的频率，降低了工作强度。

背景技术

百日咳（pertussis, whooping cough）是一种儿童急性呼吸道传染病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续几个月，如无并发症出现，一般无高热或有轻度发热。本病最重要的并发症是继发感染，癫痫发作，脑病和死亡。百日咳在发病初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最有效的手段。目前市场上的百日咳疫苗主要有全菌体百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗两种，后者免疫效果好且副作用低，因此被广泛使用。在无细胞百日咳发酵培养中，常用的检测方法是HA试验(在微量凝集板上，每孔加人生理盐水50μL，然后第1孔加入百日咳菌液50μL，混匀．依次倍比稀释至第10孔，同时另作生理盐水对照，之后每孔各加人50μL 1％新鲜红细胞悬液。同时振荡1min混匀，室温下静置15min后观察结果)。在HA试验中，需要使用的1%鹅新鲜红细胞存在质脆易碎，保存期短的缺点。

发明内容

本发明的任务是提供一种醛化鹅新鲜红细胞及其制备方法和醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞是按以下方法制得的产物：

步骤一：用注射器吸取鹅静脉血约2～6mL，放入装有10mL生理盐水的离心管中混匀，离心机1500～2000 r/min 4℃，离心8分钟，弃上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500～2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500～2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜后得到的沉淀物即为鹅新鲜红细胞，将所得鹅新鲜红细胞于4℃保存备用；

步骤二：取鹅新鲜红细胞1mL，缓慢加入经4℃预冷的1.25%戊二醛溶液40mL，迅速摇匀, 置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌，反应40min后取出，得到鹅新鲜红细胞浓度为2.5%（体积比mL／mL）的醛化鹅新鲜红细胞悬液；

步骤三：将浓度为2.5%（体积比mL／mL）的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0.8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液。

本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤三：将浓度为2.5%（体积比mL／mL）的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0.8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液，此醛化鹅新鲜红细胞悬液置于4℃冰箱中放置保存，有效期为90天；

上述制备方法步骤二中所述的1.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液：将25%戊二醛用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1.25%戊二醛溶液，置于4℃冰箱中备用。

本发明提供的醛化鹅新鲜红细胞可用于无细胞百日咳HA试验。

实验资料：

１、采血

用注射器吸取鹅静脉血约2～6mL，放入装10mL生理盐水的离心管中混匀。

２、分离鹅红细胞

将离心管中的血液经离心机4℃，1500～2000 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入生理盐水10mL，混合均匀，再经1500～2000 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜。从沉淀物加入生理盐水至离心移去上清液，此过程重复2次。最后得到的沉淀物即为鹅新鲜红细胞，将所得鹅新鲜红细胞于4℃保存备用。

３、制备醛化鹅新鲜红细胞

本实验采用两种方法进行醛化。

第一种方法：取沉淀鹅新鲜红细胞1mL，缓慢加入4℃预冷的1.25-5％戊二醛溶液40ml，迅速摇匀, 置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌40~60min, 反应结束后，离心洗涤三次，沉淀加生理盐水得到醛化鹅新鲜红细胞悬液。

第二种方法：用生理盐水配成5%鹅新鲜红细胞悬液15mL，缓慢加入1.25-5％戊二醛生理盐水溶液15mL，置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌4-6h,反应结束后离心洗涤三次，沉淀加生理盐水得到醛化鹅新鲜红细胞悬液。

通过实验选择一种醛化鹅红细胞的方法，为无细胞百日咳的HA试验提供有效的试验试剂，使试验效果更加准确。

本发明实验从醛化鹅新鲜红细胞制备方法、工作浓度、保存时间三个方面进行了研究，最终确定上述第一种醛化方法优于第二种醛化方法，第一种醛化方法的具体条件为：1.25%戊二醛醛化40min，醛化鹅新鲜红细胞工作浓度为0.8%，用于无细胞百日咳的HA试验，取得与用0.8%新鲜鹅红细胞一致的试验结果，但本发明以醛化鹅新鲜红细胞取代新鲜鹅红细胞后，使鹅红细胞保存期变长，实验结果更稳定，克服了现有技术中存在的鹅新鲜红细胞质脆易碎，保存期短，实验结果不稳定的缺点。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例１

用前述的第一种醛化鹅新鲜红细胞方法制备醛化鹅新鲜红细胞

醛化鹅新鲜红细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤二：取沉淀鹅红细胞1mL，缓慢加入4℃预冷的1.25-5％戊二醛溶液40mL，迅速摇匀, 置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌，反应40min后取出20mL混合液，得到醛化40min的醛化鹅红细胞悬液。反应60min后取出20mL混合液，得到醛化60min的醛化鹅红细胞悬液。

步骤三：将浓度为2.5%的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0.8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液，此醛化鹅新鲜红细胞悬液置于4℃冰箱中放置保存，有效期为90天；

步骤二中所述的1.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液：将25%戊二醛用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1.25%戊二醛溶液，置于4℃冰箱中备用。

实施例２

用前述的第二种醛化鹅新鲜红细胞方法制备醛化鹅新鲜红细胞

步骤一：同实施例１

步骤二：5％鹅红细胞悬液15mL缓慢加入2.5％戊二醛生理盐水溶液15mL，置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌lh，取4mL，用生理盐水洗涤5次，每次2000 r／min，离心10 min，弃去上清液，配成5％的悬液．4℃保存备用，得到醛化1h的醛化鹅红细胞。剩余溶液继续分别搅拌2h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗涤，配成0.8％的悬液，4℃保存备用。分别得到醛化2h、5h、6h的醛化鹅红细胞。

实施例３

无细胞百日咳的HA试验

用实施例１制备的醛化鹅新鲜红细胞、用实施例２制备的醛化鹅新鲜红细胞以及用属于现有技术的0.8％新鲜鹅红细胞悬液分别进行无细胞百日咳的HA试验

主要物料和设备

百日咳球杆菌（本科室大罐培养），健康鹅血，25%戊二醛，高速冷冻离心机（Eppendorf），电子天平（梅特勒），96孔板。

具体过程：

醛化鹅新鲜红细胞的制备及最佳醛化时间确定：

第一种醛化方法：取沉淀鹅新鲜红细胞1mL，缓慢加入4℃预冷的1.25-5％戊二醛溶液40mL，迅速摇匀, 置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌，反应40min后取出20mL混合液，得到醛化40min的醛化鹅新鲜红细胞悬液。反应60min后取出20mL混合液，得到醛化60min的醛化鹅红细胞悬液。两种2.5%鹅红细胞浓度的醛化红细胞悬液分别稀释得到0.8%鹅红细胞浓度的醛化鹅细胞悬液。

第二种醛化方法：5％鹅红细胞悬液15mL缓慢加入2.5％戊二醛生理盐水溶液15mL，置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌lh，取4mL，用生理盐水洗涤5次，每次2000 r／min，离心10 min，弃去上清液，配成5％的悬液．4℃保存备用，得到醛化1h的醛化鹅红细胞。剩余溶液继续分别搅拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗涤，配成0.8％的悬液，4℃保存备用。分别得到醛化2h、5h、6h的醛化鹅红细胞。

两种方法同时用0.8％鹅新鲜红细胞悬液做对照，用三批大罐培养百日咳杆菌菌液（批号分别为：201111Z088-YD₂;201111Z090-YD₂;201111Z092-YD₂）重复做血凝试验,评价出最优的醛化鹅新鲜红细胞时间。

醛化鹅红细胞的优化试验

溶血性观察

将新鲜鹅红细胞悬液与醛化后的鹅红细胞悬液分别放置4℃保存，每日观察并记录鹅红细胞保存期内的溶血现象。

不同戊二醛浓度醛化鹅红细胞及不同醛化鹅细胞浓度的血凝试验对比

将25%的戊二醛溶液分别1:4；1:9；1:19稀释成5%、2.5%、1.25%浓度戊二醛生理盐水溶液三份。

第一种醛化方法：分别取1mL沉淀鹅红细胞3份，分别加入到40mL5%、2.5%、1.25%浓度戊二醛溶液中反应，置于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌，醛化反应时间按最佳醛化时间进行，反应结束后，离心洗涤三次，沉淀加生理盐水分别配制成2%，1.67%，1%，0.8%鹅红细胞浓度的醛化鹅细胞悬液。

第二种醛化方法：5%、2.5%、1.25%浓度戊二醛生理盐水溶液各40mL分别缓慢加入到40mL5%细胞浓度的红细胞中反应，醛化反应时间按最佳醛化时间进行，反应结束后，离心洗涤三次，沉淀醛化红细胞分别配制成2%，1.67%，1%，0.8%鹅红细胞浓度的悬液，两种方法同时用0.8％新鲜鹅红细胞悬液做对照，用三批大罐培养百日咳杆菌菌液（批号分别为：201111Z088-YD₂;201111Z090-YD₂;201111Z092-YD₂）重复做血凝试验．评价出最优的戊二醛反应浓度及醛化细胞工作浓度。

实验结果

1、溶血性观察结果

将新鲜鹅红细胞于4℃条件下放置保存，7d出现部分溶血．第10d已经全部溶血，而醛化鹅红细胞不出现溶血，性质不变。在醛化红细胞保存的90天中，戊二醛醛化的鹅红细胞均不出现溶血现象。

2、最佳醛化时间确定

表1第一种醛化方法醛化鹅红细胞实验结果（操作完成后20min后观察）

表2 第二种醛化方法醛化鹅红细胞实验结果（操作完成后20min后观察）

由表1、2可见，醛化时间40min、60min血凝效价结果基本相同，而且与0.8%新鲜鹅红细胞的血凝效价结果最接近。醛化时间1h到5h之间，血凝效价随醛化时间增长而增加，醛化6 h后，血凝效价与醛化5 h的相差不大。因此．采用戊二醛醛化方法最佳醛化时间为40min。

3、不同戊二醛浓度醛化鹅红细胞及不同醛化细胞浓度的血凝试验结果

表 3 采用第一种醛化方法的不同戊二醛浓度醛化鹅红细胞及不同醛化细胞浓度的血凝试验结果

由表3可见，与新鲜鹅红细胞血凝试验结果一致的醛化红细胞的最佳工作浓度为0.8%，戊二醛醛化浓度为1.25%。

表 4 采用第二种醛化方法的不同戊二醛浓度醛化鹅红细胞及不同醛化细胞浓度的血凝试验结果

由表4可见，采用第二种醛化方法的醛化鹅红细胞与新鲜鹅红细胞血凝试验结果差异大，相差最小的醛化红细胞的工作浓度为0.8%，戊二醛醛化浓度为1.25%。

上述实验结果说明，采用第一种醛化方法制备的醛化鹅新鲜红细胞，即醛化反应40min，醛化红细胞的工作浓度为0.8%，戊二醛醛化浓度为1.25%的方法制备的醛化鹅新鲜红细胞，能为无细胞百日咳的HA试验提供有效的试验试剂，使试验效果更加准确。

Claims

1.醛化鹅新鲜红细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤三：将浓度为2.5%的醛化鹅新鲜红细胞悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到浓度为0.8%的醛化鹅新鲜红细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的醛化鹅新鲜红细胞的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的1.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液：将25%戊二醛用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1.25%戊二醛溶液，置于4℃冰箱中备用。

3.一种醛化鹅新鲜红细胞，其特征在于按以下方法制得的产物：

4.根据权利要3所述的醛化鹅新鲜红细胞，其特征在于，步骤二中所述的1.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液：将25%戊二醛用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1.25%戊二醛溶液，置于4℃冰箱中备用。

5.权利要求1或２所述的方法制备的醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。

6.权利要求3或4所述的醛化鹅新鲜红细胞在无细胞百日咳HA试验中的应用。