CN102221586A - 提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种生物检测技术领域的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法。包括如下步骤：交联固化细胞质蛋白：首先用戊二醛溶液处理完整细胞，使细胞质蛋白相互交联形成致密固体，离心收集戊二醛交联固化细胞；用蛋白酶解反应溶液悬浮戊二醛交联固化细胞，加入蛋白酶进行酶解反应；收集酶解多肽，进行除盐和富集，制备脱盐酶解多肽；用酶解多肽直接做LC-MS/MS检测，分析所得质谱数据，获得所需要的膜蛋白信息。本发明能够快速获得更多、更可靠的膜蛋白信息，有效减少LC-MS/MS检测中胞质蛋白的信号干扰。

Description

提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测技术领域的制备方法，具体地说，是一种提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法。

背景技术

细胞膜是细胞形态的基础，细胞与外界环境的屏障。膜蛋白是细胞内外物质、能量和信息传递的桥梁，承担着重要的生物学功能。因此细胞膜膜蛋白分析是研究健康与疾病、环境变化、基因异常等科学问题的基础。膜蛋白组学作为比较新的技术，在揭示细胞功能，解释基本生物学问题和发现新药物靶点等方面的研究中都有广泛应用。特别是质谱和液质联用等分析手段在蛋白组学研究领域的使用，使得复杂生物样品的组学分析逐渐走向高通量、高精度和高分辨率。

由于膜蛋白在水溶液中溶解度差，容易形成胶束，加上丰度低，容易被高丰度的胞质蛋白和内膜系统蛋白污染，既堵塞质谱分析通道能力，又成为膜蛋白分析信号的高背景噪音。质谱分析前对膜蛋白样品进行纯化富集和直接从实验材料中制备膜多肽是比较新颖的思路。Rodriguez-Ortega等人首先提出“Cell Shave”策略，用酶切下暴露在细胞膜材料表面的蛋白片段用于MS/MS分析，可提供细胞表面蛋白信息，避免溶解疏水蛋白的复杂操作(Nature Biotechnology，2006，24，191-197)。但在实际操作中很难保持细胞在酶解过程和后续离心操作中的完整性，不能避免胞质蛋白的污染。改良的方法之一是先提取细胞膜，再进行蛋白Shaving (Analytical Chemistry 2007，79，4613-4620)。虽然该实验效果有所提高，但是操作步骤也更加复杂。

可见，目前基于质谱检测的膜蛋白组学样品预处理方法或不能有效避免细胞质蛋白污染，或操作复杂、重复性低。因此，有必要开发一种操作简便快捷，有效降低细胞质蛋白多肽的影响，提高复杂样品中膜蛋白的质谱检测率和膜蛋白鉴定结果可靠性的样品预处理方法。

发明内容

本发明的目的在于克服复杂细胞膜蛋白质谱分析预处理中的技术难题，提供一种提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法。本发明是细胞膜蛋白在LC-MS/MS检测前的预处理方法，将胞质蛋白整体凝固，再进行细胞膜蛋白酶切处理制备肽段，降低了胞质蛋白肽段的产率和MS/MS信号水平，从而提高膜蛋白的检测率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括步骤如下：

第一步，交联固化细胞质蛋白：首先用戊二醛溶液处理完整细胞，使细胞质蛋白相互交联形成致密固体，离心收集戊二醛交联固化细胞；

所述的戊二醛溶液，是指体积比0.1％-1％的戊二醛溶液；

所述的戊二醛溶液，配制方法为：1％戊二醛溶液配制：25％戊二醛4ml，生理盐水57.6ml，去离子水32ml，0.15M Na₂HPO₄6.5ml，用0.15M KH₂PO₄调pH到8.2；

所述的处理完整红细胞，其处理方法为：红细胞泥在冰浴中加入预冷的戊二醛溶液，红细胞终浓度为2％；反应温度从4℃-37℃，反应时间为30min以上。反应结束后1000g离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤5次，得到棕红色细胞泥，即为戊二醛交联固化蛋白的细胞；

所述的交联，其反应温度为4℃-37℃，反应时间为30min以上。

第二步，用蛋白酶解反应溶液悬浮戊二醛交联固化细胞，加入蛋白酶进行酶解反应；

所述的酶解反应所使用的酶包括胰蛋白酶和蛋白内切酶GluC。

第三步，收集酶解多肽，进行除盐和富集，制备脱盐酶解多肽；

所述的收集酶解多肽，其方法为：先在4℃、1000g离心10min，去除残留细胞，再在4℃、1745g离心10min去除细胞残渣，收集含有多肽片段的上清液。

第四步，用酶解多肽直接做LC-MS/MS检测，分析所得质谱数据，获得所需要的膜蛋白多肽。

本发明将膜蛋白实验材料的准备步骤充分简化，省略了细胞膜的提取、膜蛋白的提取等复杂的提取步骤，直接获得可溶性的酶切肽段用于质谱分析，同时也省去了一般混合蛋白做质谱分析前的预处理步骤。本实验成本低，耗时短。膜蛋白组学分析结果比对照组得到更多膜蛋白信息，并且以功能蛋白为主，达到预期目的。

本发明中以红细胞为模型，使用戊二醛为交联剂处理完整红细胞，使胞质蛋白交联固化，用蛋白酶直接酶切细胞表面的蛋白，富集酶解肽段后直接进行LC-MS/MS分析。本发明能够快速获得更多、更可靠膜蛋白多肽的信息。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，如使用不同试剂作为交联剂，或者使用不同浓度的戊二醛溶液，或者使用不同的蛋白酶，或者处理不同来源的细胞等，这些等价形式同样属于本发明的范围。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

昆明鼠(雄性，体重250-300克，购自上海斯莱克实验动物中心)眼眶取血，接收入事先装有2％草酸钾溶液的试管中，迅速混匀。4℃1000g离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜。用两倍体积的生理盐水将沉淀的红细胞慢慢混合均匀，再次4℃1000g离心5min，弃上清，加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次。最后一次离心后的红细胞，弃上清，即为洗涤过的红细胞体。吸取红细胞50μl在冰浴中加入预冷的1％戊二醛溶液2450μl(红细胞终浓度为2％)，于4℃环境下缓慢旋转反应0.5小时。反应结束后，4℃1000g离心5min。沉淀细胞用生理盐水同法洗涤3次。得到1％戊二醛交联的红细胞体。取未经处理的红细胞、1％戊二醛交联的红细胞各10μl(约8.7×10⁷个)，加490μl 10mmol PBS(pH7.4)，加10μl 0.1μg/μl测序级胰蛋白酶。37℃烘箱中酶解2小时。收集酶解多肽，用C18Zip-tips枪头(Millipore Corp.)除盐和富集多肽。样品冻干后用于LC-LTQ(Michrom LC；Thermofisher LTQ XL)分析。所得质谱数据使用SEQUEST(v28，Bioworks 3.3 software package，Thermo Electron)进行数据库搜索；FilterI设置为ΔCn＞＝0.100；Xcorr(±1，2，3)＝1.90，2.20，3.75；#matches＝1；peptide probability＜＝1e-003；#different peptide＞＝2；Filter lI设置为ΔCn＞＝0.100；Xcorr(±1，2，3)＝1.90，2.20，3.75；#matches＝1；peptide probability＜＝1e-003。结果1％戊二醛交联处理的样品中检测到更多膜多肽、膜蛋白。表1显示了戊二醛交联前后检测到的膜多肽和膜蛋白的数量与比例：

表1

实施例2

吸取洗涤过的小鼠红细胞50μl在冰浴中加入预冷的0.1％戊二醛溶液2450μl(红细胞终浓度为2％)，于37℃环境下缓慢旋转反应0.5小时。反应结束后，4℃1000g离心5min。沉淀细胞用生理盐水同法洗涤3次。得到0.1％戊二醛交联的红细胞体。取未经处理的红细胞、实施例1制备的1％戊二醛交联固化的红细胞、0.1％戊二醛交联的红细胞各10μl(约8.7×10⁷个)，加490μl10mmol PBS(pH7.4)，加10μl 0.1μg/μl测序级胰蛋白酶。37℃烘箱中酶解14-16小时。收集酶解多肽，用C18Zip-tips枪头除盐和富集多肽。样品冻干后用于LC-LTQ分析。所得质谱数据使用SEQUEST进行数据库搜索；Trans-Proteomie Pipeline(ISB/SPC Proteomics Too1s-TPP V4.2)软件进行数据处理，设置多肽p＞0.05，蛋白FDR＜1％。结果戊二醛交联处理的样品中检测到更多膜多肽、膜蛋白，并且功能蛋白更多。特别地，Ras相关的信号转导蛋白在戊二醛处理的样品中比例明显提高。表2显示了戊二醛交联前后检测到的膜多肽和膜蛋白的数量与比例；表3显示了3种样品共同鉴定到的膜蛋白各自的肽段质谱数(可表征该蛋白在样品中的浓度高低)，表中每个膜蛋白由Swiss-Prot数据库中的唯一编号表示；表4显示了3种样品中信号膜蛋白信息，具体如下：

表2

表3

表4

实施例3

取未经处理的红细胞、实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化的红细胞各10μl(约8.7×10⁷个)，加490μl 50mmol Tris-HCl缓冲液，pH8.0，加10μl 0.1μg/μl测序级蛋白内切酶GluC(Endoproteinase Glu-C)。25℃环境中酶解14-16小时。收集酶解多肽，用C18 Zip-tips枪头除盐和富集多肽。样品冻干后用于LC-LTQ分析。所得质谱数据使用SEQUEST进行数据库搜索；Filter设置为ΔCn＞＝0.100；Xcorr(±1，2，3)＝1.90，2.20，3.75；#matches＝1。结果实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化处理的样品中检测到更高比例的膜蛋白。表5显示了戊二醛交联前后检测到的膜多肽和膜蛋白的数量与比例：

表5

	蛋白总数	膜蛋白数量	膜蛋白比例(％)
				对照组	40	9	22.5
实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化样品	25	6	24.0

实施例4

取未经处理的红细胞、实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化的红细胞、实施例1制备的1％戊二醛交联固化的红细胞各10μl(约8.7×10⁷个)，加490μl 10mmol PBS(pH7.4)，加10μl 0.1ug/μl测序级胰蛋白酶。37℃烘箱中酶解2小时。再平行做一组同样条件下酶解14-16小时。收集酶解多肽，用C18 Zip-tips枪头除盐和富集多肽。样品冻干后用于LC-LTQ分析。所得质谱数据使用Bioworks 3.3软件处理，Filter设置为ΔCn＞＝0.100；Xcorr(±1，2，3)＝1.90，2.20，3.75；#matches＝1peptide probability＜＝1e-003。结果戊二醛交联处理的样品中检测到更高比例的膜蛋白，并且酶解2小时得到的结果中膜蛋白比例高于酶解过夜的样品。但是酶解过夜处理鉴定到的总蛋白和膜蛋白数量更多，并且膜蛋白比例提高的幅度更大。表6显示了戊二醛交联前后、酶解不同时间检测到的膜多肽和膜蛋白的数量与比例：

表6

实施例5

取未经处理的红细胞、实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化的红细胞、实施例1制备的1％戊二醛交联固化的红细胞，各10μl(约8.7×10⁷个)，加480μl 10mmol PBS(pH7.4)，加20μl 0.1μg/μl测序级胰蛋白酶。37℃烘箱中酶解14-16小时。收集酶解多肽，用C18 Zip-tips枪头除盐和富集多肽。样品冻干后用于LC-LTQ分析。所得质谱数据使用Bioworks 3.3软件处理，Filter设置为ΔCn＞＝0.100；Xcorr(±1，2，3)＝1.90，2.20，3.75；#matches＝1。结果戊二醛交联处理的样品中鉴定到更高比例的膜蛋白。表7显示了交联前后鉴定到的膜蛋白数量和比例：

表7

	蛋白总数	膜蛋白数量	膜蛋白比例(％)
				对照组	67	20	29.8
实施例2制备的0.1％戊二醛交联固化样品	34	11	32.4
				实施例1制备的1％戊二醛交联固化样品	41	14	34.1

Claims (8)

1.一种提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，交联固化细胞质蛋白：首先用戊二醛溶液处理完整细胞，使细胞质蛋白相互交联形成致密固体，离心收集戊二醛交联固化细胞；

第二步，用蛋白酶解反应溶液悬浮戊二醛交联固化细胞，加入蛋白酶进行酶解反应；

第三步，收集酶解多肽，进行除盐和富集，制备脱盐酶解多肽；

第四步，用酶解多肽直接做LC-MS/MS检测，分析所得质谱数据，获得所需要的膜蛋白多肽。

2.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第一步，交联固化细胞质蛋白：首先用戊二醛溶液处理完整细胞，使细胞质蛋白相互交联形成致密固体，离心收集戊二醛交联固化细胞。

3.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第一步中所述的戊二醛溶液，是指体积比0.1％-1％的戊二醛溶液。

4.根据权利要求1或者3所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，所述的戊二醛溶液，配制方法为：1％戊二醛溶液配制：25％戊二醛4ml，生理盐水57.6ml，去离子水32ml，0.15M Na₂HPO₄6.5ml，用0.15M KH₂PO₄调pH到8.2。

5.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第一步中所述的处理完整红细胞，其处理方法为：红细胞泥在冰浴中加入预冷的戊二醛溶液，红细胞终浓度为2％；反应温度从4℃-37℃，反应时间为30min以上；反应结束后1000g离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤5次，得到棕红色细胞泥，即为戊二醛交联固化蛋白的细胞。

6.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第一步中所述的交联，其反应温度为4℃-37℃，反应时间为30min以上。

7.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第二步中所述的酶解反应所使用的酶包括胰蛋白酶和蛋白内切酶GluC。

8.根据权利要求1所述的提高膜蛋白检测率的膜蛋白多肽的制备方法，其特征是，第三步中所述的收集酶解多肽，其方法为：先在4℃、1000g离心10min，去除残留细胞，再在4℃、1745g离心10min去除细胞残渣，收集含有多肽片段的上清液。