CN112924693B - 一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于鉴定与配基分子有相互作用的蛋白质。取等份蛋白质样品，分别加入和不加入配基分子，孵育后在特定温度下进行加热，然后分离加热后得到的上清液和沉淀，最后对加入和不加入配基分子的上清样品和沉淀样品分别进行酶解以及定量蛋白质组学分析来确定与配基分子相互作用的靶蛋白。由于可以在同一个温度点进行加热使得整个实验操作过程变的非常简单，并且得益于综合利用了上清样品和沉淀样品中蛋白质的互补信息，本发明相比于传统的蛋白质热稳定性分析方法具有更高灵敏度和选择性。因此可用于不同亲和力的配基分子和蛋白质的相互作用研究。

Description

一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向蛋白质与配基分子相互作用技术领域，具体涉及一种高灵敏度、高选择性鉴定药物靶蛋白的方法及其应用。
背景技术
药物靶蛋白和脱靶蛋白的高灵敏度鉴定一直是药物研究领域一个重大的挑战。长期以来，传统的基于靶点的方法和基于表型的方法一直被沿用，但是这两种方法都存在着非常明显的缺陷，已经不能满足需求。
近年来，随着质谱技术的高速发展，几种基于质谱的蛋白质组学技术开始被应用到药物靶蛋白的鉴定中。除了具有较高的通量之外，这些技术在不需要对药物分子进行任何修饰的情况下，可以较好的鉴定出药物分子的直接靶蛋白和非直接靶蛋白。其中包括：药物亲和力响应靶点稳定性方法(DARTS)(Target identification using drug affinityresponsivetarget stability(DARTS),Proc.Natl Acad.Sci.USA.106,21984–21989(2009))、限制性酶切方法(LIP)(A Map of Protein-Metabolite Interactions RevealsPrinciples of Chemical Communication，Cell,172,358-372.e23(2018))、蛋白质氧化速率稳定性方法(SPROX)(Thermodynamic analysis of protein-ligand bindinginteractions in complex biological mixtures using the stability of proteinsfrom rates of oxidation.Nat.Protoc.8,148–161(2013))和蛋白质热稳定性分析方法(TPP)(Tracking cancer drugs in living cellsby thermal profiling of theproteome，Science,346,1255784(2014))。前三种方法的主要缺点是需要鉴定并且定量到特定的肽段，由于蛋白质丰度、样品复杂度和质谱鉴定的影响，这是相当困难的。
蛋白质热稳定性分析方法利用蛋白质在不同的温度下具有不同的热稳定性，由于部分热量会用于将药物分子从蛋白质上解离下来，导致与药物分子结合的蛋白质和没有与药物分子结合的蛋白质在相同的温度下具有不同的热稳定性，加热之后沉淀出来的蛋白质的量不同。蛋白质热稳定性分析方法被广泛应用于蛋白质和药物分子、蛋白质和代谢物、蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质等之间的相互作用。但是传统的蛋白质热稳定性分析方法设置较多的温度点进行实验，操作繁琐，利用TMT标记定量，不仅价格昂贵而且耗费大量的质谱使用时间。除此之外，传统的方法也存在着鉴定灵敏度不够高的问题，拟合熔化曲线计算ΔTm的方法没有办法高选择性地将变化的靶蛋白和没有变化的非靶蛋白区分开。为了提高靶蛋白鉴定效率，所有对于鉴定有利的信息都应该被利用，加热之后的沉淀样品中同样包含很多有意义的信息，不应该被遗漏。
为了在解决传统蛋白质热稳定性分析方法操作复杂、价格昂贵等问题的同时提高药物分子靶蛋白鉴定的灵敏度和选择性，我们拟发展一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于配基分子靶蛋白的高灵敏和高选择性鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种流程简单、高灵敏度和高选择性的配基和蛋白质相互作用研究的新方法。
1.本发明提供的方法是利用加热沉淀后蛋白质在上清样品和沉淀样品中定量信息互补的性质，结合基于质谱的定量蛋白质组学技术寻找差异蛋白，实现了配基分子靶蛋白的高灵敏和高选择性鉴定。
2.本发明采用如下技术方案：
(a)蛋白质溶液分别与配基分子进行孵育；
(b)通过在特定温度下加热变性引起蛋白质发生沉淀；
(c)分离加热后的上清液和沉淀，分别进行酶解和定量蛋白质组学分析；
(d)综合分析上清样品和沉淀样品中蛋白质的定量结果，筛选出配基分子的靶蛋白。
3.所述的蛋白质样品可以是细胞提取液，组织提取液，血液等蛋白质混合物或者纯化的蛋白质等；所述的蛋白质样品必须保持蛋白质完整的天然结构，不能发生变性。应采取一些温和的提取蛋白质的方法，包括：液氮反复冻融法、液氮研磨法和匀浆法等；所用的裂解液也应该能够维持蛋白质的结构，包括磷酸缓冲液(PBS)等。
4.所述的配基分子可以是活性药物、代谢物、核酸分子、金属离子、肽段、蛋白质以及其它可能与蛋白质发生相互作用的各类分子。
5.所述的蛋白质溶液被平均分为两组，其中一组加入一定终浓度的配基分子作为配基组，另一组加入等体积的空白溶剂作为空白组，进行孵育。但不局限于两组，配基组也可以加入一系列不同终浓度的配基，空白组也可以是结构相似的配基或空白。
6.所述的特定加热温度应该是能引起配基的靶蛋白发生沉淀，并且在配基组和空白组沉淀出来的蛋白质的量不同的温度点，优选温度区间为44-62℃。
7.所述的引起蛋白质变性发生沉淀的方法是加热，但是不局限于加热，其他可以使蛋白质发生沉淀的方法均可。
8.所述的定量蛋白质组学分析方法包括无标记定量和标记定量，可根据实际样品数目选择合适的定量方法。
9.所述的综合分析蛋白质在上清样品和沉淀样品中的定量信息具体步骤是：对质谱分析得到的raw文件使用蛋白质组学分析常规软件进行搜库，设置相应的定量方法。对于得到的定量结果，上清样品和沉淀样品分别进行显著性检验。综合分析上清样品和沉淀样品中蛋白质定量信息时，将在上清样品和沉淀样品中p-value均小于一定阈值的蛋白挑选出来，确定蛋白质在上清样品和沉淀样品中的差异倍数的阈值，筛选出配基分子的靶蛋白。
10.所述的显著性检验方法为统计学常用的一些方法，优选Student’s T Test。
11.综合分析上清样品和沉淀样品中蛋白质定量信息时，用于筛选的p-value可根据情况调整，可以是p-value小于0.05,0.01或者0.001等。
12.所述的差异倍数的阈值不限定于某一个数值，需要根据不同情况进行选择；蛋白质在上清样品和沉淀样品中的差异倍数的阈值可以相同也可以不同。
本发明的优点如下：
1.通量高。在不需要对配基分子进行任何修饰的情况下，利用质谱定量的方法可以高通量地筛选配基分子的靶蛋白；
2.操作简单。只选择加入配基组的蛋白质与空白组的蛋白质热稳定性差异较大的温度点作为实验温度点，极大程度上简化了实验步骤，使得实验操作更加简单，也节约了大量的质谱时间。
3.灵敏度高，特异性好，应用范围广。相比较传统的方法，得益于本发明综合分析了加热之后上清样品和沉淀样品里蛋白质的互补信息，二者相互验证，大大提高了靶蛋白鉴定的灵敏度和选择性。可应用于亲和力不同的配基分子靶蛋白的筛选。
附图说明
图1为所述上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法流程图。
图2为所述上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于鉴定甲氨蝶呤靶蛋白DHFR的实验结果。a.单独分析上清样品的火山图(横坐标为log2(drug/vehicle)，纵坐标为-log10(p-value)，红色点代表靶蛋白，灰色点代表非靶蛋白)，b.单独分析沉淀样品的火山图(横坐标为log2(drug/vehicle)，纵坐标为-log10(p-value),红色点代表靶蛋白，灰色点代表非靶蛋白)，c.综合分析上清样品和沉淀样品所得的散点图(横坐标为蛋白质在上清样品中的log2(drug/vehicle)，纵坐标为蛋白质在沉淀样品中的log2(drug/vehicle)，红色点代表药物分子靶蛋白)。
图3为所述上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于鉴定SNS-032靶蛋白的实验结果。a.单独分析上清样品的火山图(横坐标为log2(drug/vehicle)，纵坐标为-log10(p-value)，红色点代表靶蛋白，灰色点代表非靶蛋白)，b.单独分析沉淀样品的火山图(横坐标为log2(drug/vehicle)，纵坐标为-log10(p-value),红色点代表靶蛋白，灰色点代表非靶蛋白)，c.综合分析上清样品和沉淀样品所得的散点图(横坐标为蛋白质在上清样品中的log2(drug/vehicle)，纵坐标为蛋白质在沉淀样品中的log2(drug/vehicle)，红色点代表药物分子靶蛋白)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性方法用于甲氨蝶呤(MTX)的靶蛋白研究：
(1)取1皿HEK-293T细胞样品，重悬在含600μL PBS缓冲溶液(磷酸缓冲液)中，加入终浓度为1％(v/v)的蛋白酶抑制剂(AEBSF、抑肽酶、苯丁抑制素、E-64、亮抑酶肽和胃酶抑素A组成的混合物的二甲亚砜(DMSO)溶液)，通过液氮反复冻融三次后，20000g,4℃离心10min,收集上清样品；
(2)将得到的蛋白质溶液平均分为两份，其中一份加入终浓度为100μM的甲氨蝶呤(甲氨蝶呤的DMSO溶液)，另一份加入等体积的DMSO，两个样品同时在室温下孵育30min；
(3)各取50μL样品于200μL的PCR管中，53℃加热3min，室温冷却2min后，在4℃条件下，20000g离心10min分离上清液和沉淀；
(4)各取40μL上清液于一个新的600μL EP管中，加入120μL含有66mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)和8M Gua-Hcl(盐酸胍)的缓冲液。沉淀用预冷的PBS洗涤两次后，加入160μL含有50mM Hepes和6M Gua-Hcl的缓冲液，超声溶解；
(5)向上述蛋白质溶液中加入终浓度10mM的TCEP(三(2-羧乙基)膦)和终浓度40mM的CAA(氯代乙酰胺)，95℃水浴加热5min；
(6)将蛋白质溶液转移至截留分子量为10K的超滤管上，在14000g离心力下进行超滤离心，用20mM NH4HCO3(碳酸氢铵)洗涤两次后，加入150μL 20mM NH4HCO3和5μg胰蛋白酶，37℃水浴中酶解16h；
(7)14000g离心得到肽段溶液，超滤膜用100μL 20mM NH4HCO3洗涤，对应的洗涤液和上述肽段溶液合并冻干；
(8)将上述得到的肽段混合物用0.1％(v/v)甲酸复溶进行RP LC-MS/MS分析，每个样品重复进样三次。
图2为蛋白质的定量结果经过Student’s t test处理后的结果图。单独分析上清样品(a)或者单独分析沉淀样品(b)时，若考虑p-value<0.01为发生显著性变化的蛋白，那么分别有57个和107个蛋白发生变化，这些蛋白绝大部分都不是甲氨蝶呤的靶蛋白，存在较大的干扰和假阳性率。但是当把在上清样品和沉淀样品中均满足p-value<0.01的蛋白质挑选出来，利用蛋白质的差异倍数绘制散点图后，背景变的非常干净，干扰蛋白显著减少，只有甲氨蝶呤已知的靶蛋白DHFR有比较明显的变化，说明甲氨蝶呤引起了蛋白DHFR热稳定性的变化。证明上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法有很好的选择性，可以大大降低干扰，提高靶蛋白鉴定的灵敏度。
实施例2
上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性方法用于SNS-032的靶蛋白研究：
药物SNS-032的操作流程同实施例1甲氨蝶呤的处理流程，只是对应的药物分子更换为SNS-032。
图3为蛋白质的鉴定结果，SNS-032是一个广谱的CDK家族蛋白的抑制剂，其理论的靶蛋白应该是CDK家族的激酶。可以看出若考虑p-value<0.01为显著性变化的蛋白，单独分析上清样品(a)或者单独分析沉淀样品(b)时，有些靶蛋白的变化被比较多的非靶蛋白掩盖，存在较大的背景干扰。但是当把在上清样品和在沉淀样品中均满足p-value<0.01的蛋白质挑选出来综合分析时，干扰蛋白显著减少，只有CDK家族的几个蛋白和激酶GSK3A、GSK3B有比较大的变化。说明上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法确实有很好的选择性，不仅适用于特异性强的配基分子，也适用于特异性较弱的配基分子并且效果更加明显，可以很大程度上降低背景干扰和假阳性率，提高靶蛋白鉴定的准确性和选择性。

Claims (9)

1.一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析方法，其特征在于：
利用加热沉淀后蛋白质在上清样品和沉淀样品中定量信息互补的性质筛选与配基分子有相互作用的靶蛋白；
该方法的步骤为：
(a) 蛋白质溶液分成二组以上，一组以上与含配基分子的溶剂进行孵育，作为配基组，另一组与等体积的空白溶剂进行孵育，作为空白组；
(b) 通过在44-62℃温度下加热变性引起蛋白质发生沉淀；
(c) 分离加热后的上清液和沉淀，分别进行酶解和定量蛋白质组学分析；
(d) 综合分析上清样品和沉淀样品中蛋白质的定量结果，筛选出配基分子的靶蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)所述的蛋白质溶液是细胞提取液，组织提取液，血液来源的蛋白质混合物或者纯化的蛋白质中的一种或二种以上；所述的蛋白质溶液必须保持蛋白质完整的天然结构，不能发生变性，应采取一些温和的提取蛋白质的方法，包括：液氮反复冻融法、液氮研磨法和匀浆法中的一种或二种以上；所用的裂解液能够维持蛋白质的结构，包括磷酸缓冲液（PBS）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)所述的配基分子是活性药物、代谢物、核酸分子、金属离子、肽段、蛋白质以及其它可能与蛋白质混合物中的蛋白质发生相互作用的各类分子中的一种或二种以上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)所述的蛋白质溶液被平均分为两组，其中一组加入一定终浓度的配基分子作为配基组，另一组加入等体积的空白溶剂作为空白组，进行孵育；或者步骤(a)所述的蛋白质溶液被平均分为两组以上，其中分别加入一系列不同终浓度的配基作为配基组，加入结构相似的配基或空白作为空白组。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(c)的定量蛋白质组学分析方法包括无标记定量或分别标记定量。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：
对质谱分析得到的raw文件使用蛋白质组学分析软件进行搜库，设置相应的定量方法；对于得到的定量结果，上清样品和沉淀样品分别进行显著性检验，认为在上清样品和沉淀样品中P-value均小于0.05 的蛋白质作发生显著变化的蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
综合分析上清样品和沉淀样品中蛋白质定量信息时，将在上清样品和沉淀样品中p-value均小于0.05的蛋白挑选出来，利用蛋白质在上清样品和沉淀样品中的差异倍数绘制散点图，最后选取在上清样品中差异倍数大于0.5并且在沉淀样品中差异倍数也大于0.5的蛋白质，认为是可信的配基分子的靶蛋白。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
显著性检验方法为统计学方法。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
蛋白质在上清样品和沉淀样品中的差异倍数的阈值相同或不同。
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