CN111381048A - 一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法。使用两种不同的烷基化试剂分别对抗体的游离巯基和参与形成二硫键的巯基进行烷基化，经蛋白质水解酶处理后，采用液质联用法分析同一肽段中同一位点半胱氨酸上两种烷基化修饰的情况，确定抗体中游离巯基位点和比例。该方法结果准确可靠、灵敏度高、成本低，可以准确分析抗体中游离巯基位点和比例，对理解抗体结构的完整性，稳定性和生物学功能有着重要意义。

Description

一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及抗体药物分析领域，尤其涉及一 种新的分析抗体游离巯基位点和比例的方法，本发明还涉及该方法在测定 抗体药物偶联物中抗体游离巯基位点和比例中的应用。
背景技术
抗体类药物具有靶向性强、副作用小等优势，已经成为当前生物技术 药物的研究热点。抗体是一类复杂的生物大分子，其通过各种链间和链内 的半胱氨酸连接在一起保持正确的高级结构，维持抗体的生物活性至关重 要。理论上抗体中所有的半胱氨酸均应与其他半胱氨酸形成链内或链间二 硫键，但随着抗体药物结构研究的深入和研究技术的提高，研究结果显示 大部分抗体分子内存在一定含量的游离巯基。在一个抗体的重链互补决定区(CDR)中，二硫键的不完全形成导致其与特异性抗原的结合亲和力降低 了50％，高比例的游离巯基会破坏抗体结构，进而对抗体的稳定性及生 物学功能等均可能造成影响。因此，充分分析抗体中游离巯基的分布和比 例对于理解抗体的结构完整性，稳定性和生物学功能有着重要意义。目前， 常用的游离巯基测定方法有Ellman's法、荧光分析法、ELISA法等。
Ellman's法是较早建立起的一种用于巯基检测的方法，由Ellman于 1959年创建，并一直被广泛使用，是光度分析法的代表，其原理是5,5- 二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm处没有吸收，与巯基反应后， 生成2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，TNB在412nm处有很强的吸收，可以 用于对肽段的游离巯基进行定量分析。Ellman's法是一种经典的游离巯基 定量分析方法，这种方法简单快速，反应条件温和，被中国药典收录为蛋 白质游离巯基分析方法。虽然该法可以测定总游离巯基，受到广泛使用， 但是，在实际操作中具有一定的局限性。首先，传统的紫外分光光度计检 测法需要的样品量较多，不适合少量样品的检测；其次，受限于仪器通量， 无法同时快速测定多个样品。
荧光分析法是目前研究最广泛的检测巯基的方法。其具有较高的选择 性和灵敏度，适用范围广等优点。由于小分子巯基化合物一般不发光也不 具备生色团，因此为了测定其含量通常需要对其进行衍生化处理，生成强 荧光物质以提高检测灵敏度。利用荧光分析法对巯基进行含量测定时，荧 光探针的选择是十分重要的一个环节。Chumsae等采用荧光标记和质谱 法对游离巯基进行荧光法定位，首先用5-碘乙酰氨基荧光素(5-IAF)对抗体的游离巯基进行标记，然后将抗体分子还原，再将还原产生的巯基用碘 乙酸(IAA)进行烷基化，这样就能够将包含于二硫键中的半胱氨酸区分开 来。虽然荧光分析法响应时间快，但前期荧光探针的合成和分离需要较多 的步骤和较长的时间，探针和巯基的衍生化反应过程较慢，因此荧光分析 法检测巯基化合物方法的前期准备和前处理过程往往耗时，从而增长了方 法的整体分析时长，限制了荧光分析法的应用。而且，这些方法仅能测定 抗体中的总游离巯基的含量，无法对游离巯基进行定位，并且检测限比较 高，对于检测总游离巯基含量比较低的抗体无能为力。Xiang等采用差别 烷基化12C、13C碘乙酸标记和质谱分析对抗体中的游离巯基进行定位及 定量。首先用12C碘乙酸对抗体中的游离巯基进行烷基化标记，然后将 抗体分子中的二硫键还原，对新产生的游离巯基用13C碘乙酸进行烷基 化标记，以此来区分包含于二硫键中的半胱氨酸残基。与上述方法类似， Pu等采用不同同位素标记的N-马来酰亚胺(NEM)和氘代的d5-NEM分别 对巯基进行标记。首先用NEM进行烷基化，然后将抗体分子中的二硫键 还原，对新产生的游离巯基采用d5-NEM进行烷基化，采用液质联用法进 行分析，通过比较同一肽段同一位点两种烷基化修饰的比例对游离巯基进行定位和定量。Chumsae和Pu对游离巯基进行定位和定量的质谱法，均 采用同位素标记的烷基化试剂进行分析，成本高，可及性不高，限制了该 方法的广泛应用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种采用液质联用法分析抗体游离巯基 位点和比例的方法，该方法结果准确可靠、灵敏度高，所试剂均为常见试 剂，成本低，可以准确分析抗体中游离巯基位点和比例，对理解抗体结构 的完整性，稳定性和生物学功能有着重要意义。
具体的，本发明提供了一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法，所 述的方法包括如下步骤：
1)变性
取PBS溶液置于超滤离心管中，离心后加入待测抗体，再次离心后 加入第一蛋白变性剂进行第一次孵育，得到变性后的待测抗体；
2)第一次烷基化
向变性后的待测抗体中继续添加第一烷基化试剂进行第一次烷基化 处理，经过第二次孵育后得到游离巯基被烷基化的待测抗体；
3)还原
将游离巯基被烷基化的待测抗体离心后，加入PBS溶液、第二蛋白 变性剂、还原剂进行二硫键的还原，经过第三次孵育后得到二硫键被还原 的待测抗体；
4)第二次烷基化
向二硫键被还原的待测抗体中添加第二烷基化试剂进行第二次烷基 化处理，经过第四次孵育后得到巯基完全烷基化的待测抗体；
5)酶解
将巯基完全烷基化的待测抗体离心后，添加蛋白质水解酶和缓冲溶液 进行酶解反应，甲酸终止反应，所述的待测抗体被酶解成肽段；
6)液质联用分析
采用电喷雾电离四级杆-飞行时间质谱进行分析，利用BioConfirm Workflow进行数据处理，得到第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度和 第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度；
7)游离巯基比例的确定
游离巯基比例(％)＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度/肽段总质 谱信号强度×100％；
其中，肽段总质谱信号强度＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度 +第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度。
进一步的，所述的步骤1)中所述的第一蛋白变性剂和步骤3)中所 述的第二蛋白变性剂独立的选自盐酸胍、尿素和RapiGest SF；所述的第 一蛋白变性剂和第二蛋白变性剂的浓度分别为6-9mol/L。第一蛋白变性 剂和第二蛋白变性剂可以相同也可以不同，优选的，所述的第一蛋白变性 剂为浓度为8mol/L的盐酸胍，所述的第二蛋白变性剂为浓度为8mol/L 的盐酸胍。
进一步的，所述的步骤1)中所述的PBS溶液的pH为6-7，浓度为 45-55mmol/L，PBS溶液与待测抗体的体积重量比为1:2-1:4，所述的第一 蛋白变性剂与待测抗体的体积重量比为1:2-1:4。
进一步的，所述的步骤1)中所述的超滤离心管的截留分子量为 5-15KDa；优选的，所述的超滤离心管的截留分子量为10KDa。
进一步的，所述的步骤2)和步骤4)中的第一烷基化试剂和第二烷 基化试剂独立地选自N-马来酰亚胺、碘乙酰胺；所述的第一烷基化试剂 和第二烷基化试剂的浓度分别为0.1-1.5mol/L；所述的第一烷基化试剂和 第二烷基化试剂可以相同也可以不同；优选的，所述的第一烷基化试剂和 第二烷基化不相同；所述的第一烷基化试剂与待测抗体的体积重量比为 1:50-1:70；所述的第二烷基化试剂与待测抗体的体积重量比为1:10-1:20。
进一步的，所述的步骤3)中所述的还原剂为抗体二硫键还原剂，所 述的还原剂的浓度为0.5-1.5mol/L；优选的，所述的还原剂选自二硫苏糖 醇，β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)磷；更优选的，所述的还原试剂为二硫苏 糖醇。
进一步的，所述的步骤3)中所述的PBS溶液的pH为6-7，浓度为 45-55mmol/L，PBS溶液与待测抗体的体积重量比为1:7-1:8，所述的第二 蛋白变性剂与待测抗体的体积重量比为1:5-1:7，所述的还原剂与待测抗 体的体积重量比为1:25-1:35。
进一步的，所述的步骤5)所述的蛋白质水解酶选自胰蛋白酶、内肽 酶GluC、内肽酶LysC；优选的，所述的蛋白质水解酶为胰蛋白酶；所 述的缓冲溶液为Tris-HCl溶液，所述的Tris-HCl溶液浓度为50mmol/L， pH为8。
进一步的，所述的酶解反应体系pH范围为7-8；所述的酶解反应温 度为36℃-38℃，酶解时间至少5h；所述的蛋白质水解酶与待测抗体的 重量比为1:10-1:40，优选的，所述的重量比为1:20。
进一步的，所述的步骤1)、步骤3)和步骤5)中所述的离心转速 为14000rpm/min，离心时间为5-20min。
进一步的，所述的步骤1)所述的第一次孵育的孵育温度为50-60℃， 孵育时间为30-50min；步骤2)所述的第二次孵育的孵育温度为30-40℃， 孵育时间为30-40min；步骤3)所述的第三次孵育的孵育温度为50-60℃， 孵育时间为30-50min；步骤4)所述的第四次孵育的孵育温度为20-30℃， 孵育时间为50-60min。
进一步的，所述的步骤2)反应体系的pH为6-7；所述的步骤4)反 应体系的pH为6-7。
优选的，本发明提供的一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法包括 如下步骤：
1)变性
取100μL浓度为50mmol/L、pH为6.5的PBS溶液置于10KDa的 超滤离心管中，14000rpm/min离心10-15min；向超滤离心管中加入含 300μg抗体的供试品溶液，14000rpm/min离心10-15min；加入95μl浓 度为8mol/L的盐酸胍溶液，56℃孵育40min，得到变性后的待测抗体；
2)第一次烷基化
向变性后的待测抗体中加入5μl浓度为0.1mol/L的N-马来酰亚胺溶 液，混匀后37℃孵育35min，得到游离巯基烷基化的待测抗体；
3)还原
将游离巯基烷基化的待测抗体，14000rpm/min离心10-15min后，加 入40μL浓度为50mmol/L、pH为6.5的PBS溶液，50μL浓度为8mol/L 的盐酸胍溶液，和10μL浓度为1mol/L的二硫苏糖醇，56℃孵育40min， 得到二硫键被还原的待测抗体；
4)第二次烷基化
向二硫键被还原的待测抗体中加入20μL浓度为1mol/L的碘乙酰胺 溶液，混匀后室温孵育45min，得到巯基完全烷基化的待测抗体；
5)酶解
将巯基完全烷基化的待测抗体14000rpm/min离心10-15min后，加 入胰蛋白酶进行酶解反应，所述的胰蛋白酶与待测抗体的重量比为1:20， 加入50mol/LpH为8的Tris-HCl溶液，使总体积为100μL，37℃酶解至 少5h；酶解完成后加入1μL甲酸终止酶解反应，所述的待测抗体被酶解 成肽段；
6)液质联用分析
采用电喷雾电离四级杆-飞行时间质谱(Agient,ESI/Q-TOF)进行分 析，利BioConfirmWorkflow谱(Agient,7.0)进行数据处理，得到第一 次烷基化修饰的肽段质谱信号强度和第二次烷基化修饰的肽段质谱信号 强度；
液质联用分析条件为常规的分析条件，优选的，所用的液质联用分析 条件为：
液相色谱条件：流速：0.3mL/min；进样量：15μL；检测波长：214nm； 流动相A:0.1％甲酸水溶液，流动相B:0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程 序如表1所示：
表1梯度洗脱程序
Time(min) A(％) B(％)
0 97 3
5 97 3
60 55 45
61 10 90
66 10 90
67 97 3
75 97 3
质谱条件：Gas Temp:325℃；Drying Gas:10L/min；Nebulizer:35 psig；Sheath GasTemp:380℃；Sheath Gas Flow:12L/min；Fragmentor: 175V；Skimmer:65V。
7)游离巯基比例的确定
游离巯基比例(％)＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度/肽段总质 谱信号强度×100％；
其中，肽段总质谱信号强度＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度 +第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度。
本发明还提供了所述的分析方法在分析抗体游离巯基位点中的应用。 由于抗体所有的天然氨基酸中只有半胱氨酸上有巯基，抗体通过上述处理 采用液质联用法分析，如果含半胱氨酸的肽段分子量比该肽段未加任何修 饰的理论值大125.0Da，说明该肽段在第一次烷基化中被修饰，该肽段中 存在游离巯基，且游离巯基位于该肽段的半胱氨酸上，因此所述的抗体中 游离巯基位点的分析方法为：
1)通过质谱获取第一次烷基化修饰的肽段实测m/z值(质荷比)；
2)推算出未加任何修饰的肽段理论m/z值(质荷比)；
3)若第一次烷基化修饰的肽段实测m/z值比未加任何修饰的肽段理 论m/z值大125.0Da，则我们认为该肽段的半胱氨酸上存在游离巯基。
其中，所述的未加任何修饰的肽段是指未经任何烷基化修饰的肽段。
本发明还提供了所述的分析方法在分析抗体药物偶联物中抗体游离 巯基位点和比例中的应用。
与现有技术相比，本发明的分析方法可以准确判断抗体存在游离巯基 的位点，此外还可以计算出每个位点上游离巯基的比例。可以帮助判断抗 体的稳定性，为抗体分子的早期筛选和稳定性研究等提供重要的信息。本 发明可以计算每个位点游离巯基的比例，对于游离巯基含量比较低的抗体 具有较好的灵敏度。本发明提供的抗体的结构信息更丰富，为游离巯基分 析提供了一种新途径。本发明方法结果准确可靠，灵敏度高，进一步拓展 了液质联用法在抗体类药物分析领域的应用。
附图说明
图1为通过第一次烷基化修饰(即NEM修饰)后的抗体重链肽段 (362)NQVSLTCLVK(371)的二级质谱图。
图2为通过第二次烷基化修饰(即IAM修饰)后的抗体重链肽段 (362)NQVSLTCLVK(371)的二级质谱图。
具体实施方式
缩写
除非另有说明，本发明使用的所有缩写具有本领域普通技术人员所理 解的相同含义。如本发明所用，常用的缩写及其定义如表2所示：
表2缩写
Figure BDA0002420682730000071
Figure BDA0002420682730000081
实施例
下面将通过实施例对本发明进行进一步地阐述，需要说明的是，以下 实施例是对本发明进行进一步地阐述和解释，而不应被看作是对本发明的 限制。
实施例1
我们采用本发明提供的分析方法检测某一抗体游离巯基位点和比例， 本实施例用的抗体为IgG4的单克隆抗体，分子量为147351Da。具体包括 如下步骤：
(1)取50mmol/L的PBS溶液(pH6.5)100μL，置于10KDa的超滤离心 管中，14000rpm/min离心10-15min；
(2)向超滤离心管中加入含300μg抗体的供试品溶液，14000rpm/min 离心10-15min；
(3)向超滤离心管中加入8mol/L的盐酸胍溶液95μL，56℃孵育 40min；
(4)向超滤离心管中加入第一烷基化试剂0.1mol/L的N-马来酰亚胺 (NEM)溶液5μL，混匀后37℃孵育35min；
(5)将上述溶液14000rpm/min离心10-15min，加入50mmol/L的PBS 溶液(pH6.5)100μL，继续离心，重复此过程三次；
(6)向超滤离心管中加入50mmol/L的PBS溶液(pH6.5)40μL，8mol/L 的盐酸胍溶液50μL，1mol/L的二硫苏糖醇(DTT)溶液10μL，56℃孵 育40min；
(7)向超滤离心管中加入第二烷基化试剂1mol/L的碘乙酰胺(IAM) 溶液20μL，混匀后室温避光孵育45min；
(8)将上述溶液14000rpm/min离心10-15min，加入胰蛋白酶溶液使 酶与抗体的重量比为1:20，加入50mmol/L的Tris-HCl溶液(pH8)使总体 积为100μL，37℃酶解5h；
(9)酶解完成后向超滤离心管中加入1μL甲酸终止反应，所述的待测 抗体被酶解成肽段；
(10)采用电喷雾电离四级杆-飞行时间质谱(Agilent,ESI/Q-TOF)进行 分析，利用BioConfirm Workflow(Agilent,7.0)进行数据处理，我们通过 质谱获取第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度、第二次烷基化修饰的肽 段质谱信号强度、第一次烷基化修饰的肽段实测m/z值(质荷比)、第二 次烷基化修饰的肽段实测m/z值(质荷比)。
液相色谱质谱联用仪
液相色谱条件
流速：0.3mL/min；进样量：15μL；检测波长：214nm；流动相A:0.1％ 甲酸水溶液，流动相B:0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序如表3所示：
表3梯度洗脱程序
Time(min) A(％) B(％)
0 97 3
5 97 3
60 55 45
61 10 90
66 10 90
67 97 3
75 97 3
质谱条件
Gas Temp:325℃；Drying Gas:10L/min；Nebulizer:35psig；Sheath Gas Temp:380℃；Sheath Gas Flow:12L/min；Fragmentor:175V； Skimmer:65V。
(A)游离巯基位点的确定
为了更好的说明本发明提供的抗体游离巯基位点的分析方法，本实施 例列举了一个抗体重链肽段氨基酸序列为(362)NQVSLTCLVK(371)上游 离巯基位点的分析方法，其中b离子对应的氨基酸序列是从N到K，y 离子对应的氨基酸序列是从K到N。
图1为通过第一次烷基化修饰(即NEM修饰)后的抗体重链肽段 (362)NQVSLTCLVK(371)的二级质谱图，对应的b,y离子列表见表4。从 图1和表4可以看出该肽段(362)NQVSLTCLVK(371)的y4、y5、y6、y7 和y8离子的实测m/z值均比该肽段未加任何修饰的y4、y5、y6、y7和 y8理论m/z大125.0Da，说明重链的第368位半胱氨酸(C)被NEM修饰， 说明重链第368位的半胱氨酸(C)上存在游离巯基。
表4NEM修饰的重链肽段(362)NQVSLTCLVK(371)的b,y离子列表
Figure RE-GDA0002503998040000101
图2为通过第二次烷基化修饰(即IAM修饰)后的抗体重链肽段 (362)NQVSLTCLVK(371)的二级质谱图，对应的b,y离子列表见表5。 从图2和表5可以看出该肽段(362)NQVSLTCLVK(371)的y4、y5、y6、y7和y8离子的实测m/z比该肽段未加任何修饰的y4、y5、y6、y7和y8 理论m/z大57.0Da，说明重链的第368位半胱氨酸(C)被IAM修饰，被 IAM修饰的半胱氨酸(C)参与二硫键的形成。综上，被NEM修饰的肽段 是存在游离巯基的肽段，重链的第368位半胱氨酸(C)上存在游离巯基。 其它位点的游离巯基位点分析与此类似，此处未一一列举。
表5IAM修饰的重链肽段(362)NQVSLTCLVK(371)的b,y离子列表
Figure RE-GDA0002503998040000111
(B)游离巯基比例的确定
表6为抗体各半胱氨酸位点上游离巯基的比例，含有同一个半胱氨酸 的同一肽段被NEM和IAM分别烷基化，被第一次烷基化修饰(即NEM 修饰)的半胱氨酸上的巯基为游离巯基，被第二次烷基化修饰(即IAM 修饰)的半胱氨酸上的巯基参与形成二硫键。由(A)中得知，重链的第368 位半胱氨酸(C)上存在游离巯基。通过本实施例可以计算出，重链的第368位半胱氨酸(C)上存在游离巯基的比例为2.86％。
采用如下公式进行计算：
游离巯基比例(％)＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度/肽段质谱 总信号强度×100％
其中，肽段质谱总信号强度＝第一次烷基化修饰肽段质谱信号强度+ 第二次烷基化修饰肽段质谱信号强度。
表6半胱氨酸(C)游离巯基位点和比例
Figure RE-GDA0002503998040000121
本发明已通过各具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人 员能够理解，本发明并不限于各具体实施方式，普通技术人员在本发明的 范文内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术 特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型 均在本发明的范围之内。

Claims (15)

1.一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)变性
取PBS溶液置于超滤离心管中，离心后加入待测抗体，再次离心后加入第一蛋白变性剂进行第一次孵育，得到变性后的待测抗体；
2)第一次烷基化
向变性后的待测抗体中继续添加第一烷基化试剂进行第一次烷基化处理，经过第二次孵育后得到游离巯基被烷基化的待测抗体；
3)还原
将游离巯基被烷基化的待测抗体离心后，加入PBS溶液、第二蛋白变性剂和还原剂进行二硫键的还原，经过第三次孵育后得到二硫键被还原的待测抗体；
4)第二次烷基化
向二硫键被还原的待测抗体中添加第二烷基化试剂进行第二次烷基化处理，经过第四次孵育后得到巯基完全烷基化的待测抗体；
5)酶解
将巯基完全烷基化的待测抗体离心后，添加蛋白质水解酶和缓冲溶液进行酶解反应，甲酸终止反应，所述的待测抗体被酶解成肽段；
6)液质联用分析
采用电喷雾电离四级杆-飞行时间质谱进行分析，利用BioConfirm Workflow进行数据处理，得到第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度和第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度；
7)游离巯基比例的确定
游离巯基比例(％)＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度/肽段总质谱信号强度×100％；
其中，肽段总质谱信号强度＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度+第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述的第一蛋白变性剂和步骤3)中所述的第二蛋白变性剂独立的选自盐酸胍、尿素和RapiGest SF；所述的第一蛋白变性剂和第二蛋白变性剂的浓度分别为6-9mol/L。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述的PBS溶液的pH为6-7，浓度为45-55mmol/L，PBS溶液与待测抗体的体积重量比为1:2-1:4，所述的第一蛋白变性剂与待测抗体的体积重量比为1:2-1:4。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于,步骤1)中所述的超滤离心管的截留分子量为5-15KDa；优选的，所述的超滤离心管的截留分子量为10KDa。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2)和步骤4)中的第一烷基化试剂和第二烷基化试剂独立地选自N-马来酰亚胺、碘乙酰胺；所述的第一烷基化试剂和第二烷基化试剂的浓度分别为0.1-1.5mol/L；所述的第一烷基化试剂和第二烷基化试剂可以相同也可以不同；优选的，所述的第一烷基化试剂和第二烷基化不相同；所述的第一烷基化试剂与待测抗体的体积重量比为1:50-1:70；所述的第二烷基化试剂与待测抗体的体积重量比为1:10-1:20。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤3)中所述的还原剂为抗体二硫键还原剂，所述的还原剂的浓度为0.5-1.5mol/L；优选的，所述的还原剂选自二硫苏糖醇，β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)磷；更优选的，所述的还原试剂为二硫苏糖醇。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，步骤3)中所述的PBS溶液的pH为6-7，浓度为45-55mmol/L，PBS溶液与待测抗体的体积重量比为1:7-1:8，所述的第二蛋白变性剂与待测抗体的体积重量比为1:5-1:7，所述的还原剂与待测抗体的体积重量比为1:25-1:35。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤5)所述的蛋白质水解酶选自胰蛋白酶、内肽酶Glu C、内肽酶Lys C；优选的，所述的蛋白质水解酶为胰蛋白酶；所述的缓冲溶液为Tris-HCl溶液，所述的Tris-HCl溶液浓度为50mmol/L，pH为8。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，所述的酶解反应体系pH为7-8；所述的酶解反应温度为36℃-38℃，酶解时间至少5h；所述的蛋白质水解酶与待测抗体的重量比为1:10-1:40，优选的，所述的重量比为1:20。
10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤1)、步骤3)和步骤5)中所述的离心转速为14000rpm/min，离心时间为5-20min。
11.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)所述的第一次孵育的孵育温度为50-60℃，孵育时间为30-50min；步骤2)所述的第二次孵育的孵育温度为30-40℃，孵育时间为30-40min；步骤3)所述的第三次孵育的孵育温度为50-60℃，孵育时间为30-50min；步骤4)所述的第四次孵育的孵育温度为20-30℃，孵育时间为50-60min。
12.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤2)反应体系的pH为6-7；所述的步骤4)反应体系的pH为6-7。
13.根据权利要求1-12任一项所述的分析方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)变性
取100μL浓度为50mmol/L、pH为6.5的PBS溶液置于10KDa的超滤离心管中，14000rpm/min离心10-15min；向超滤离心管中加入含300μg抗体的供试品溶液，14000rpm/min离心10-15min；加入95μl浓度为8mol/L的盐酸胍溶液，56℃孵育40min，得到变性后的待测抗体；
2)第一次烷基化
向变性后的待测抗体中加入5μL浓度为0.1mol/L的N-马来酰亚胺溶液，混匀后37℃孵育35min，得到游离巯基被烷基化的待测抗体；
3)还原
将游离巯基被烷基化的待测抗体，14000rpm/min离心10-15min后，加入40μL浓度为50mmol/L，pH为6.5的PBS溶液，50μL浓度为8mol/L的盐酸胍溶液，和10μL浓度为1mol/L的二硫苏糖醇，56℃孵育40min，得到二硫键被还原的待测抗体；
4)第二次烷基化
向二硫键被还原的待测抗体中加入20μL浓度为1mol/L的碘乙酰胺溶液，混匀后室温孵育45min，得到巯基完全烷基化的待测抗体；
5)酶解
将巯基完全烷基化的待测抗体14000rpm/min离心10-15min后，加入胰蛋白酶进行酶解反应，所述的胰蛋白酶与待测抗体的重量比为1:20，加入50mol/L pH为8的Tris-HCl溶液，使总体积为100μL，37℃酶解至少5h；酶解完成后加入1μL甲酸终止酶解反应，所述的待测抗体被酶解成肽段；
6)液质联用分析
采用电喷雾电离四级杆-飞行时间质谱进行分析，利用BioConfirm Workflow进行数据处理，得到第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度和第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度；
7)游离巯基比例的确定
游离巯基比例(％)＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度/肽段总质谱信号强度×100％；
其中，肽段总质谱信号强度＝第一次烷基化修饰的肽段质谱信号强度+第二次烷基化修饰的肽段质谱信号强度。
14.权利要求1-13任一项所述的分析方法在分析抗体中游离巯基位点中的应用。
15.权利要求1-13任一项所述的分析方法在分析抗体药物偶联物中抗体游离巯基位点和比例中的应用。
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