CN105548040A - 一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用标准曲线法快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，包括以下步骤：(1)用缓冲溶液配制不同浓度的L-半胱氨酸标准溶液，添加显色剂显色后用分光光度计测定其在412nm处的吸光度，并绘制其吸光度与L-半胱氨酸浓度的标准曲线；(2)先将面团用缓冲溶液溶解后取上清液，再加入显色剂显色后用分光光度计测定其吸光度，再依据第一步中所得的标准曲线计算得到面团中游离巯基的含量；(3)面团溶液用巯基乙醇还原二硫键，通过三氯乙酸沉淀，再用缓冲溶液复溶，测定总巯基含量，通过计算得到面团中二硫键含量。本发明具有测量快速方便、精密度、准确度高，重现性好、设备比较简单、实用性强等特点。

Description

一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及一种利用标准曲线法快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法。
背景技术
面筋蛋白是小麦粉中蛋白质的总称，其一个重要特点就是在结构中含有巯基，面筋的性质和巯基二硫键的含量及其存在方式很大关系。研究表明，小麦粉在水和氧气的作用下，经过搅拌和醒发，麦醇溶蛋白和麦谷蛋白中二硫键重新组合；部分游离的巯基会发生氧化，通过二硫键交联形成有序的纤维状大分子聚合体，小麦面团面筋网络逐渐形成。当游离巯基较多时，面筋蛋白结构中的二硫键结合点无法固定，面筋缺乏弹性，面团发粘不易操作。因此，许多面粉改良采用氧化剂将面粉中游离巯基氧化为二硫键来增加面团的弹性。所以，测定面团中游离巯基及二硫键含量对于研究面制品的改良有很重要的作用。
不同的研究所报道的同种物质的游离巯基及二硫键含量差别很大，造成差异的原因除了研究人员在各自的研究中使用了不同品种的原料和不同的蛋白质提取方法外，最主要原因来自于测试方法的不同。另外也有研究人员发现很多蛋白质的游离巯基与DTNB不能完全反应，通过朗伯比尔定律计算出的巯基含量可能会有一定偏差。因此，发明一种操作简单、成本低廉、灵敏度高、快速简单的测定面团中游离巯基和二硫键的方法，成为一个需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺点和不足，本发明旨在提供一种操作简单、成本低廉、灵敏度高、快速简单的测定面团中游离巯基和二硫键的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、绘制L-半胱氨酸标准曲线：用0.2MTris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成不同浓度的标准溶液，测定不同浓度的L-半胱氨酸在412nm处的吸光度，以吸光度值为横坐标，对应的L-半胱氨酸标准溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
b、测定面团中游离巯基含量：取新鲜小麦粉面团，研磨后溶解于0.2MTris-Gly缓冲溶液中，离心得到上清液；上清液显色后于波长412nm处测定吸光度；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面团中游离巯基的含量。
c、测定面团中二硫键含量：取步骤b中上清液，加入β-巯基乙醇和缓冲液溶液，然后加入12％三氯乙酸溶液，离心得到蛋白质沉淀；用12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于缓冲溶液中，混和均匀显色后测定吸光度；以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面团中总巯基和二硫键含量。
进一步的，按照如下步骤绘制L-半胱氨酸标准曲线：用0.2MTris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成2mmol/L的标准溶液，并稀释为浓度为0、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mmol/L的标准液；以蒸馏水溶液为空白，分别别取4mL稀释后的不同浓度标准液加入10mmol/LDTNB0.1mL，室温下显色20min，412nm测定吸光度值；以吸光度值为横坐标，对应的，L-半胱氨酸标准溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，求出回归方程。进一步的，按照如下步骤测定面团中游离巯基含量：取500mg(以干粉重计)新鲜小麦粉面团，用研钵研磨，溶解于10mL的0.2MTris-Gly缓冲溶液中，4000r/min离心15min，得到上清液；取4ml上清液，加入10mmol/L的DTNB溶液0.1mL，混和均匀，显色20min后，于波长412nm处测定吸光度；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中游离巯基的含量。进一步的，所述面团按照以下重量份混合组成：小麦粉100份，蒸馏水30-50份；面团重量2-6份，缓冲溶液100份。
进一步的，按照如下步骤测定面团中二硫键含量：取步骤b中上清液1mL，加入0.1mLβ-巯基乙醇和4mL缓冲液溶液，混合液在25℃下保温1h，然后加入10mL12％三氯乙酸溶液，混合液25℃下保温1h后，4500r/min离心15min；用5mL12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于10mL缓冲溶液中，然后加入0.1mL10mmol/L的DTNB，混和均匀显色20min后，于波长412nm处测定吸光度。以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中总巯基和二硫键含量。
优选地，所述Tris-Gly缓冲溶液，其规格为：pH8.0，8M尿素，1％SDS，3mMEDTA。
优选地，所述小麦粉指标符合中华人民共和国国家标准GB/T1355-1986，并随国家标准更新而变化。
方法学验证
精密度试验
测定样品溶液的吸光度值，连续测定6次，结果如表1。游离巯基和总巯基的精密度试验RSD分别为0.10％和0.34％(n＝6)，均小于1％，符合《药物分析》的中的要求，表明所用仪器精密度高。
表1精密度试验结果
重复性试验
测定6份面团样品溶液的吸光度值，由回归方程，求得面团中游离巯基和二硫键含量，结果如表2。可知游离巯基和二硫键的RSD分别为0.81％和1.88％(n＝6)，说明本方法重复性良好。
表2重复性试验结果
加标回收率试验
面团样品中游离巯基和总巯基含量用加入法测定。游离巯基回收率测定步骤如下：分别取2mmol/L的L-半胱氨酸标准溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL于10mL比色管中，然后依次用1.2.2.2中样品溶液定容至4mL，摇匀显色20min用分光光度计测定其在412nm处的吸光度值，通过L-半胱氨酸工作曲线得到游离巯基含量、计算回收率。总巯基回收率测定步骤如下：分别取2mmol/L的L-半胱氨酸标准溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL于10mL比色管中，然后将1.2.2.3中沉淀用缓冲溶液溶解后定容至10mL，后面步骤同游离巯基回收率的测定。样品中游离巯基含量、总巯基含量和回收率测定结果，见表3。
表3加标回收率试验
本发明的优点是：
(1)本发明研制的标准曲线法测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，主要是通过L-半胱氨酸标准曲线校准面团中巯基含量，更适合于面团中游离巯基和二硫键含量的测定，具有创新性。
(2)本发明研制的标准曲线法测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，准确快速，操作简单、精密度高，能够用于面制品的研究中，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为L-半胱氨酸工作曲线。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不局限于下面的实施例。
实施例1
选用市售优质特一粉，称取100g面粉，添加32％(v/w)的蒸馏水，中速搅拌和面5min，使料坯手握成团，经轻轻搓揉仍能成为松散的颗粒面团状，盖上4层湿纱布，置于温度为25℃的生化培养箱中醒发20min，用压片机压片成型后，在小型压面机逐渐压至1mm共压6道。取400mg(以干粉重计)新鲜小麦粉面团，用研钵研磨，溶解于10mL的0.2MTris-Gly缓冲溶液(pH8.0，8M尿素，1％SDS，3mMEDTA)中，4000r/min离心15min，得到上清液。取4ml上清液，加入10mmol/L的DTNB溶液0.1mL，混和均匀，显色20min后，于波长412nm处测定吸光度。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中游离巯基的含量。取上清液1mL，加入0.1mLβ-巯基乙醇和4mL缓冲液溶液，混合液在25℃下保温1h，然后加入10mL12％三氯乙酸溶液，混合液25℃下保温1h后，4500r/min离心15min。用5mL12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于10mL缓冲溶液中，然后加入0.1mL10mmol/L的DTNB，混和均匀显色20min后，于波长412nm处测定吸光度。以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中总巯基和二硫键含量。
实施例2
选用市售优质特一粉100g，添加40％(v/w)的蒸馏水，中速搅拌和面5min，使料坯手握成团，经轻轻搓揉仍能成为松散的颗粒面团状，盖上4层湿纱布，置于温度为25℃的生化培养箱中醒发20min，用压片机压片成型后，在小型压面机逐渐压至1mm共压6道。取500mg(以干粉重计)新鲜小麦粉面团，用研钵研磨，溶解于10mL的0.2MTris-Gly缓冲溶液(pH8.0，8M尿素，1％SDS，3mMEDTA)中，4000r/min离心15min，得到上清液。取4ml上清液，加入10mmol/L的DTNB溶液0.1mL，混和均匀，显色20min后，于波长412nm处测定吸光度。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中游离巯基的含量。取上清液1mL，加入0.1mLβ-巯基乙醇和4mL缓冲液溶液，混合液在25℃下保温1h，然后加入10mL12％三氯乙酸溶液，混合液25℃下保温1h后，4500r/min离心15min。用5mL12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于10mL缓冲溶液中，然后加入0.1mL10mmol/L的DTNB，混和均匀显色20min后，于波长412nm处测定吸光度。以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中总巯基和二硫键含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、绘制L-半胱氨酸标准曲线：用0.2MTris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成不同浓度的标准溶液，测定不同浓度的L-半胱氨酸在412nm处的吸光度，以吸光度值为横坐标，对应的L-半胱氨酸标准溶液浓度为纵坐标，绘制L-半胱氨酸标准曲线。
b、测定面团中游离巯基含量：取新鲜小麦粉面团，研磨后溶解于0.2MTris-Gly缓冲溶液中，离心得到上清液；上清液显色后于波长412nm处测定吸光度；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面团中游离巯基的含量。
c、测定面团中二硫键含量：取步骤b中上清液，加入β-巯基乙醇和缓冲液溶液，然后加入12％三氯乙酸溶液，离心得到蛋白质沉淀；用12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于缓冲溶液中，混和均匀显色后测定吸光度；以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量。通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面团中总巯基和二硫键含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照如下步骤绘制-半胱氨酸标准曲线：用0.2MTris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成2mmol/L的标准溶液，并稀释为浓度为0、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mmol/L的标准液；以蒸馏水溶液为空白，分别别取4mL稀释后的不同浓度标准液加入10mmol/LDTNB0.1mL，室温下显色20min，412nm测定吸光度值；以吸光度值为横坐标，对应的，L-半胱氨酸标准溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，求出回归方程。
3.根据上述权利要求所述的方法，其特征在于，按照如下步骤测定面团中游离巯基含量：取500mg(以干粉重计)新鲜小麦粉面团，用研钵研磨，溶解于10mL的0.2MTris-Gly缓冲溶液中，4000r/min离心15min，得到上清液；取4ml上清液，加入10mmol/L的DTNB溶液0.1mL，混和均匀，显色20min后，于波长412nm处测定吸光度；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中游离巯基的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述面团按照以下重量份混合组成：小麦粉100份，蒸馏水30-50份；面团重量2-6份，缓冲溶液100份。
5.根据上述权利要求所述的方法，其特征在于，按照如下步骤测定面团中二硫键含量：取步骤b中上清液1mL，加入0.1mLβ-巯基乙醇和4mL缓冲液溶液，混合液在25℃下保温1h，然后加入10mL12％三氯乙酸溶液，混合液25℃下保温1h后，4500r/min离心15min；用5mL12％三氯乙酸洗沉淀两次，然后将沉淀物溶于10mL缓冲溶液中，然后加入0.1mL10mmol/L的DTNB，混和均匀显色20min后，于波长412nm处测定吸光度；以L-半胱氨酸标准曲线校准，得到总巯基的含量；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面条中总巯基和二硫键含量。
6.根据上述权利要求所述的方法，其特征在于，所述Tris-Gly缓冲溶液，其规格为：pH8.0，8M尿素，1％SDS，3mMEDTA。
7.根据上述权利要求所述的方法，其特征在于，所述小麦粉指标符合中华人民共和国国家标准GB/T1355-1986，并随国家标准更新而变化。
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