CN101915760B

CN101915760B - 一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法

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Publication number: CN101915760B
Application number: CN 201010221020
Authority: CN
Inventors: 徐洪耀; 严正权; 光善仪; 柯福佑
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: CN101915760A

Abstract

本发明涉及一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，包括：制备显色剂并配制半胱氨酸标准溶液；向10mL的容量瓶依次加入经稀释浓度为1.0×10^-6mol/L显色剂标准溶液1.0mL、0.01mol/L NaCl溶液1.0mL、0.01mol/L十二烷基磺酸钠溶液1.0mL、pH值为7.5的混合磷酸盐缓冲溶液1.0mL和待测样品1mL，定容，摇匀，试剂空白作参比，1cm比色皿，646nm波长处测定溶液的吸光度A，记录吸光度差值ΔA，计算得待测样品中半胱氨酸含量。本方法具有操作简单，响应速度快，选择性好，灵敏度高等优点，可快速，准确的用于合成样品和生物样品中半胱氨酸浓度的定量测定。

Description

一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法

技术领域

本发明属于检测半胱氨酸含量领域，特别涉及一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法。

背景技术

半胱氨酸是一种含巯基的天然氨基酸，是大多数肽和蛋白质的重要组成部分。在正常的生理条件下，由于高反应活性的巯基存在，半胱氨酸在许多生物学功能中具有非常重要的作用，如通过二硫键实现蛋白质分子内交联，以维持蛋白质分子的二级结构和功能；同时，半胱氨酸起到维持细胞内的氧化还原活性，异物代谢，细胞内的信号转导和基因调控等功能。但流行病学研究显示，细胞内半胱氨酸含量的改变，会伴随着产生各种各样的病症，例如，血液中的半胱氨酸含量偏高可导致冠心病、中风和血管疾病；半胱氨酸含量不足，则表现为头发脱色、浮肿、皮肤损伤、肝脏损伤、肌肉和脂肪的损伤以及嗜睡等症状。因此，半胱氨酸含量的检测具有重要理论和实践意义。最近几年半胱氨酸检测手段取得了较大进展，开发设计出多种测定半胱氨酸含量的分析技术，如分光光度法、高效液相色谱法、流动注射法、毛细管电泳法、电化学伏安法和气相色谱质谱分析。但是，这些方法中大多数测试过程复杂，包括繁琐的实验程序、样品预处理难，灵敏度及选择性不高，耗时长，所需的仪器价格昂贵等缺点，限制检测方法的实际应用。

近年来，比色法检测半胱氨酸含量的方法，实验成本，过程简单，甚至可以用肉眼代替复杂昂贵的分析仪器进行检测，已引起国内外越来越多的学者的关注。方酸菁染料由于其特殊的D-π-A-π-D刚性共轭结构，在可见光到近红外区域具有极强的吸收(ε≥10⁵L·mol^-1·cm^-1)，光稳定性高和易于合成等优点，是当今研究最多的比色法传感器之一，广泛用于半胱氨酸传感器，蛋白质传感器，寡核苷酸传感器和离子传感器等。特别是，2004年J V Ros-Lis和2008年A Ajayaghosh先后开发了一种基于方酸菁染料为传感器检测血浆中氨基硫醇含量的新方法后，为此类染料的实际应用奠定了坚实的基础。但是，这些染料由于活性基团的位阻较大，与硫醇反应速度慢，不能实现即时检测；同时检测要在酸性或碱性的条件下进行，不能满足生理pH条件下进行检测。因此，开发研制在生理pH条件下具有高灵敏度和高选择性半胱氨酸含量测定的即时检测，具有重要的理论及实践意义，这种检测方法将在生物或临床上具有潜在用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，该方法具有操作简单，响应速度快，选择性好，灵敏度高等优点，可快速，准确的用于合成样品和生物样品中半胱氨酸浓度的定量测定。

本发明的一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，包括：

(1)显色剂N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料的制备

称取摩尔比为2∶1的N-甲基-N-羟乙基苯胺和方酸，加入体积比为1∶1的正丁醇和甲苯混合物，在120℃回流反应8h，减压蒸除有机溶剂，得粗产品，再经柱层析分离，得蓝色晶体，产率89％；

(2)显色剂标准溶液的配制

将上述蓝色晶体溶于DMSO中，配制成浓度为1mmol·L^-1的N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料标准溶液，在4℃下避光保存；

(3)半胱氨酸标准溶液的配制

称取半胱氨酸0.0121g溶于去离子水，配置成浓度为1mmol L^-1的半胱氨酸标准溶液液，在4℃下保存；

(4)待测样品中半胱氨酸浓度的测定

向10mL的容量瓶依次加入经稀释浓度为1.0×10^-6mol/L显色剂标准溶液1.0mL、0.01mol/L NaCl溶液1.0mL、0.01mol/L十二烷基磺酸钠溶液1.0mL、pH值为7.5的混合磷酸盐缓冲溶液1.0mL和待测样品1mL，最后加水定容至刻度线，摇匀，试剂空白作参比，1cm比色皿，646nm波长处测定溶液的吸光度A，吸光度差值ΔA＝A₀-A，其中A₀为标准溶液吸光度值，通过回归方程为ΔA＝6.25×10^-2+4.50×10^-4c(nmol·L^-1)，计算得待测样品中半胱氨酸浓度。

所述步骤(1)中的显色剂N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料在646nm处有强吸收，吸光系数7.72×10⁵L·mo1^-1·cm^-1，半峰宽为35nm。

所述步骤(1)中的柱层析分离的条件为，载体为硅胶，洗脱机为1∶8v/v的氯仿和甲醇混合物。

所述步骤(1)中的正丁醇和甲苯混合物与N-甲基-N-羟乙基苯胺的比例为6～8ml∶1mmol。

本发明从反应原理入手，讨论了体系的pH值、离子强度、乳化剂、反应时间及共存物质的干扰等影响因素，确定了最佳测试条件：指示剂浓度为1.0×10^-6mol/L，阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)，氯化钠浓度均为1.0mmol/L，pH值为7.5的混合磷酸盐缓冲溶液测试的灵敏度最高。

最佳测试条件下，本方法能排除其他非巯基物质对半胱氨酸的干扰，采用UV分析仪即可对半胱氨酸进行即时检测，半胱氨酸检测的线性回归方程为ΔA＝6.25×10^-2+4.50×10^-4c(nmol·L^-1)，线性范围10～700nmol/L，相关系数(R)0.9984，检测限3.5nmol/L，样品中半胱氨酸回收率96％～102％之间，相对误差(RSD)小于3.2％。

有益效果

本发明在接近生理pH条件下即时对溶液中半胱氨酸含量的检测，显色剂的稳定性高，吸光系数大，所以分析的灵敏度高，重现性好，同时该方法使用的波长为646nm的可视红光，对有机体无伤害，有望用于生物免疫分析、检测等领域。

附图说明

图1为指示剂与半胱氨酸作用机理；

图2为pH对体系吸光度差值ΔA的影响；

图3为离子强度对体系吸光度差值ΔA的影响；

图4为乳化剂对体系吸光度差值ΔA的影响，其中a为不同乳化剂对体系吸光度差值ΔA的影响，b为不同浓度SDS对体系吸光度差值ΔA的影响；

图5为测试条件下体系的时间扫描曲线；

图6为半胱氨酸对指示剂的显色现象(a)及其他氨基酸的响应对比(b)；

图7为吸光度随半胱氨酸浓度的变化(a)及线性关系曲线(b)(c＝0，10，20，80，140，190，240，300，350，400，450，470，500，550，600，630，700nmol·L-1)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)显色剂N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料的制备

称取N-甲基-N-羟乙基苯胺(302mg，2mmol)和方酸(114mg，1mmol)置于配有分水装置的100mL三口中，再加入正-丁醇和甲苯混合物15mL(1∶1，v/v)，在120℃回流反应8h，减压蒸除有机溶剂，得粗产品，再经柱层析分离[硅胶为载体，氯仿和甲醇混合物(1∶8，v/v)为洗脱剂]，得蓝色晶体，产率89％；

IR(KBr)，υ(cm^-1)：3359(OH)，1585，1508(Ar)，1373(Ar-N(R₁R))，1168(C-O).¹H-NMR(DMSO-d₆，400Hz)δ(ppm)：8.11(d，J＝9.3Hz，2H，Ar-H)，7.02(d，J＝9.3Hz，2H，Ar-H)，3.65(t，J＝4.8Hz，4H，OCH₂)，3.18(t，J＝4.7Hz，4H，NCH₂)，2.09(s，6H，CH₃).

(2)显色剂标准溶液的配制

称取N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料0.0353g溶于适量的二甲亚砜(DMSO)中，再转移到100mL的容量瓶中，用DMSO定容，配置成浓度为1mmol L^-1的N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料储备液，在4℃左右下避光保存，使用时稀释到1.0×10^-6mol/L；

(3)半胱氨酸标准溶液的配制

称取半胱氨酸0.0121g溶于适量的去离子水中后，转移到100mL的容量瓶中，定容，配置成浓度为1mmol L^-1的半胱氨酸储备液，在4℃左右下保存，使用时稀释到所需浓度；

(4)实验条件的优化

从反应原理入手(见图附1)，讨论了体系的pH值(见附图2)、离子强度(见附图3)、乳化剂(见附图4)、反应时间(见附图5)及共存物质的干扰(见附图6和附表1)等影响因素，确定了最佳测试条件：指示剂浓度为1.0×10^-6mol/L，阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)，氯化钠浓度均为1.0mmol/L，pH值为7.5的混合磷酸盐缓冲溶液测试的灵敏度最高，共存的金属离子及非巯基生物分子对检测的影响均在误差范围内，优化结果见附图7所示。即最佳测试条件下，半胱氨酸检测的线性回归方程为ΔA＝6.25×10^-2+4.50×10^-4c(nmol·L^-1)，线性范围10～700nmol/L，相关系数(R)0.9984，检测限3.5nmol/L。

表1共存干扰物的影响

a.PB，pH 7.5；c_NaCl，1.0mmol·L^-1；c_SDS，1.0mmol·L^-1；cSQ，1.0μmol·L^-1；and c_Cys，200nmol·L^-1

b.μg/mL

(5)合成样品的制备过程

分别称取19种α-氨基酸(α-半胱氨酸除外，每种浓度为100nmol/L)各1μmol，再称取一定量的α-半胱氨酸，溶于适量的去离子水中后，转移到100mL的容量瓶中，定容，制备出含有干扰氨基酸存在的半胱氨酸待测试样。

(6)待测样品中半胱氨酸浓度的测定

向10mL的容量瓶依次加入显色剂标准溶液1.0mL、0.01mol/L NaCl溶液1.0mL、0.01mol/L十二烷基磺酸钠(SDS)溶液1.0mL、混合磷酸盐缓冲溶液(pH～7.5)1.0mL和合成样品1mL，最后加水定容至刻度线，摇匀，试剂空白作参比，1cm比色皿，646nm波长处测定溶液的吸光度A，计算吸光度差值ΔA＝A₀-A。

该方法成功的用于对合成样品中半胱氨酸的检测，结果见附表2。样品中半胱氨酸回收率96％～102％之间，相对误差(RSD)小于3.2％。

表2体系对合成试样的检测结果(n＝5)^a

a.PB，pH 7.5；c_NaCl，1.0mmol·L^-1；c_SDS，1.0mmol·L^-1；c_SQ，1.0μmol·L^-1

b.main interferes：A mixture of other 19 amino acids with each concentration of 100nmol·L^-1

c.Mean value±S.D.

Claims

1.一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，包括：

（1）显色剂N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料的制备

称取摩尔比为2:1的N-甲基-N-羟乙基苯胺和方酸，混合后加入体积比为1:1的正丁醇和甲苯混合物，在120℃回流反应8h，减压蒸除有机溶剂，再经柱层析分离，得蓝色晶体；

（2）显色剂标准溶液的配制

（3）半胱氨酸标准溶液的配制

称取半胱氨酸0.0121g溶于去离子水，配制成浓度为1mmol·L^-1的半胱氨酸标准溶液，在4℃下保存；

（4）待测样品中半胱氨酸浓度的测定

向10mL的容量瓶加入显色剂标准溶液1.0mL，使其在10mL容量瓶中的最终稀释浓度为1.0×10^-6mol/L，然后依次加入0.01mol/L NaCl溶液1.0mL、0.01mol/L十二烷基磺酸钠溶液1.0mL、pH值为7.5的混合磷酸盐缓冲溶液1.0mL和待测样品1mL，最后加水定容至刻度线，摇匀，试剂空白作参比，1cm比色皿，646nm波长处测定溶液的吸光度A，吸光度差值ΔA=A₀-A，其中A₀为标准溶液吸光度值，通过回归方程为ΔA=6.25×10^-2+4.50×10^-4c，其中c的单位为nmol·L^-1，计算得待测样品中半胱氨酸浓度。

2.根据权利要求1所述的一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的显色剂N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸菁染料在646nm处有强吸收，吸光系数7.72×10⁵L·mol^-1·cm^-1，半峰宽为35nm。

3.根据权利要求1所述的一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的柱层析分离的条件为，载体为硅胶，洗脱剂为体积比为1:8的氯仿和甲醇混合物。

4.根据权利要求1所述的一种比色法即时检测半胱氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的正丁醇和甲苯混合物与N-甲基-N-羟乙基苯胺的比例为6～8ml:1mmol。