CN103454231A - 一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法 - Google Patents

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周武平
张涛
姚佳
刘聪
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Abstract

本发明公开了一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，所述方法将反应结束后的溶液吸光度细分为剩余试剂吸光度、消耗的试剂吸光度、生成物吸光度、样品残余物吸光度四个部分，通过选择特定的次波长可初步估算出试剂空白，并估算出样品浓度后，从反应结束的溶液吸光度中减去消耗的试剂的吸光度、生成物吸光度、样品残余物吸光度后，再次估算得到精确的试剂空白。采用本发明技术方案，无需实际测试试剂空白，原理清晰明了，计算结果准确可靠，估算误差小于1%，特别适用于无法直接测试试剂空白的仪器。

Description

一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法
技术领域
本发明属于检验医学技术领域，具体涉及一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法。
背景技术
目前，由于科技的发展和个人、家庭、乡村医院、野外等各方面的迫切需要，便携式医疗设备(POCT，Point of Care Test)已成为医疗设备发展的主要趋势之一。在检验医学领域，微流控技术与试剂冻干技术的结合，更是实现了在微流控芯片上实现微量全血的离心分离、定量、传输和几个甚至几十个生化指标的同时检测。且此类设备体积小、成本低、操作简单、结果即时可得，已成为检验医学领域便携式检验设备的最主要发展趋势。
常规的生化检测终点法测试中，在样品没有加入反应杯之前，首先测量反应杯中试剂空白的吸光度A1，再加入样品，一定时间之后再次测量反应结束后的吸光度A2，通过这两次测量的光强值可以计算出样品的浓度C=a*(A2-A1)，其中a为给定的摩尔吸收系数。而在POCT仪器中，为了简化操作步骤，降低人为因素对测量结果的影响，将生化试剂冻干并封装于微流控芯片的比色杯中，微量全血经离心分离后，血清与缓冲液混合进入封装有冻干试剂的比色杯内将冻干试剂复溶并反应，通过比色法计算样品浓度。此过程中无法直接测试试剂空白，因此，一种能对试剂空白的精确估算的方法对于便携式检验医学设备具有非常重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
在具体实施步骤之前，本发明首先提出一种反应终点混合液等效组成方法：
首先，认为反应结束的混合液的吸光度                                                
Figure 2013103766643100002DEST_PATH_IMAGE001
由剩余试剂吸光度
Figure 659374DEST_PATH_IMAGE002
、生成物吸光度
Figure 2013103766643100002DEST_PATH_IMAGE003
、样品残余物吸光度组成，
Figure 2013103766643100002DEST_PATH_IMAGE005
。
然后，认为剩余试剂吸光度
Figure 293935DEST_PATH_IMAGE002
为试剂空白吸光度
Figure 689144DEST_PATH_IMAGE006
减去反应消耗的试剂吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE007
，
Figure 939735DEST_PATH_IMAGE008
。
接着，认为生成物和反应消耗的试剂都与待测样品的浓度成正比，即
Figure 762197DEST_PATH_IMAGE010
。设定一综合吸光度并令其为
Figure DEST_PATH_IMAGE011
，
Figure 966914DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 165814DEST_PATH_IMAGE014
为单位浓度对应的吸光度。
进一步的，以样品空白吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE015
近似代替残余物吸光度
Figure 772376DEST_PATH_IMAGE004
。
最终，得到反应终点混合液吸光度可等效为
Figure 765740DEST_PATH_IMAGE016
三部分组成，即：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure 457752DEST_PATH_IMAGE009
为样品浓度。
基于此等效，本发明提出一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，该方法需同时测试反应杯、样品空白杯主次波长处结束吸光度，次波长选择在
Figure 194764DEST_PATH_IMAGE018
处；具体估算步骤如下：
步骤1）使用两相同比色杯同时进行测试，其中一个放置样品与试剂，另一个放置样品空白，同时测得反应结束主、次波长处吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE019
、
Figure 154367DEST_PATH_IMAGE020
和样品空白的主、次波长处的吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE021
、
Figure 584212DEST_PATH_IMAGE022
； 
步骤2）忽略
Figure 763520DEST_PATH_IMAGE014
，初步估算试剂空白在次波长处的吸光度，进而估算试剂空白在主波长处的吸光度为
Figure 38644DEST_PATH_IMAGE024
，
Figure DEST_PATH_IMAGE025
为试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数，定值 ，可事先测定；
步骤3）由朗伯-比尔定律，根据估算的试剂空白，预估算样品浓度
Figure 619798DEST_PATH_IMAGE026
，
Figure DEST_PATH_IMAGE027
为计算浓度时的相关系数，定值，由试剂说明书给出；
步骤4）由浓度
Figure 954964DEST_PATH_IMAGE028
、综合吸光度和样品空白
Figure 621569DEST_PATH_IMAGE030
，通过从终点吸光度中扣除综合吸光度和样品吸光度，精确估算试剂空白在主波长处的吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE031
。
进一步的，所述步骤（1）-（4）在测定待测样品之前，需测定以下参数：
（1）测定单位浓度的综合吸光度谱线
Figure 700383DEST_PATH_IMAGE014
：使用浓度
Figure 634579DEST_PATH_IMAGE032
已知无杂物的标准品测试，比色杯同前。通过直接测量试剂空白
Figure DEST_PATH_IMAGE033
和终点吸光度
Figure 406226DEST_PATH_IMAGE034
，得到单位浓度综合吸光度为
Figure DEST_PATH_IMAGE035
；
（2）测定纯试剂空白的吸光度谱线
Figure 294548DEST_PATH_IMAGE036
；选择主、次波长
Figure DEST_PATH_IMAGE037
、
Figure 177053DEST_PATH_IMAGE038
，通过直接测试试剂空白在主次波长处的吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE039
计算系数
Figure 467220DEST_PATH_IMAGE040
。
进一步的，所述步骤（1）需选择主次两个波长同时进行测试，并将次波长选择在综合吸光度
Figure 409768DEST_PATH_IMAGE018
的处。
进一步的，在所述步骤（2）中，试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数为定值，并由此通过次波长处的吸光度计算主波长处的吸光度。 
进一步的，其特征在于，在所述步骤（3）中，由终点吸光度扣除样品吸光度、预估试剂空白吸光度，得到吸光度变化并计算样品浓度。
进一步的，在所述步骤（4）中，通过在结束吸光度中扣除综合吸光度、样品吸光度，得到试剂空白吸光度。
本发明的有益效果: 
采用本发明技术方案，无需实际测试试剂空白，原理清晰明了，计算结果准确可靠，估算误差小于1%，特别适用于无法直接测试试剂空白的仪器。
附图说明
图1是本发明的试剂空白吸光度谱线与综合吸光度谱线图；
图2是本发明的具体测试及估算步骤流程图；
图3是本发明的单位浓度的综合吸光度谱线图；
图4是本发明的纯试剂空白的吸光度谱线图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，以双缩脲法总蛋白的测试过程来详细说明本发明。
一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，该方法需同时测试反应杯、样品空白杯主次波长处结束吸光度，次波长选择在
Figure 206003DEST_PATH_IMAGE018
处；具体估算步骤如下：
步骤1）使用两相同比色杯同时进行测试，其中一个放置样品与试剂，另一个放置样品空白，同时测得反应结束主、次波长处吸光度
Figure 678573DEST_PATH_IMAGE019
、
Figure 792022DEST_PATH_IMAGE020
和样品空白的主、次波长处的吸光度、，见附表1； 
步骤2）忽略，初步估算试剂空白在次波长处的吸光度
Figure 723627DEST_PATH_IMAGE023
，进而估算试剂空白在主波长处的吸光度为
Figure 73837DEST_PATH_IMAGE024
，为试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数，定值 ，可事先测定，见附表1；
步骤3）由朗伯-比尔定律，根据估算的试剂空白，预估算样品浓度，为计算浓度时的相关系数，定值，由试剂说明书给出，见附表1；
步骤4）由浓度
Figure 310597DEST_PATH_IMAGE028
、综合吸光度
Figure 876708DEST_PATH_IMAGE029
和样品空白
Figure 116059DEST_PATH_IMAGE021
，通过从终点吸光度中扣除综合吸光度和样品吸光度，精确估算试剂空白在主波长处的吸光度
Figure 476633DEST_PATH_IMAGE031
，见附表1。
进一步的，所述步骤（1）-（4）在测定待测样品之前，需测定以下参数：
（1）测定单位浓度的综合吸光度谱线：使用浓度
Figure 233554DEST_PATH_IMAGE032
已知无杂物的标准品测试，比色杯同前。通过直接测量试剂空白和终点吸光度
Figure 357422DEST_PATH_IMAGE034
，得到单位浓度综合吸光度为
Figure 966258DEST_PATH_IMAGE035
；测试所得谱线见附图3；
（2）测定纯试剂空白的吸光度谱线
Figure 139750DEST_PATH_IMAGE036
，见附图4；选择主、次波长、
Figure 56071DEST_PATH_IMAGE038
，通过直接测试试剂空白在主次波长处的吸光度计算系数
Figure DEST_PATH_IMAGE041
，且主次波长分别为546nm、850nm为测试的主、次波长，计算系数
Figure 801490DEST_PATH_IMAGE042
，见附表1。
进一步的，所述步骤（1）需选择主次两个波长同时进行测试，并将次波长选择在综合吸光度
Figure 666678DEST_PATH_IMAGE018
的处。
进一步的，在所述步骤（2）中，试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数
Figure 805535DEST_PATH_IMAGE025
为定值，并由此通过次波长处的吸光度计算主波长处的吸光度。 
进一步的，其特征在于，在所述步骤（3）中，由终点吸光度扣除样品吸光度、预估试剂空白吸光度，得到吸光度变化并计算样品浓度。
进一步的，在所述步骤（4）中，通过在结束吸光度中扣除综合吸光度、样品吸光度，得到试剂空白吸光度。
附表1：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，所述方法需同时测试反应杯、样品空白杯在主次波长处终点吸光度，具体估算步骤如下：
步骤1）使用两个比色杯同时进行测试，其中一个放置样品与试剂，另一个放置样品空白；同时测得反应结束主、次波长吸光度                                               、
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
和样品空白的主、次波长处的吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE006AA
、
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
；
步骤2）初步估算试剂空白在次波长处的吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE010A
，进而估算试剂空白在主波长处的吸光度为，
Figure DEST_PATH_IMAGE014AA
为试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数 ，由事先测定；
步骤3）根据朗伯-比尔定律，由估算的试剂空白，预估算样品浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE016A
，
Figure DEST_PATH_IMAGE018A
为浓度计算中的相关系数，由试剂说明书给出；
步骤4）由预估浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE020A
、综合吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE022AA
和样品空白；精确估算试剂空白在主波长处的吸光度。
2.根据权利要求1所述的精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，所述步骤（1）-（4）在测定待测样品之前，需测定以下参数：
（1）测定单位浓度的综合吸光度谱线
Figure DEST_PATH_IMAGE026A
：使用浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE028A
已知、无杂物的标准品测试，比色杯同前；通过直接测得试剂空白和终点吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE032A
，进而得到单位浓度综合吸光度为
Figure DEST_PATH_IMAGE034A
；
（2）测定纯试剂空白的吸光度谱线
Figure DEST_PATH_IMAGE036A
：选择主、次波长
Figure DEST_PATH_IMAGE038A
、
Figure DEST_PATH_IMAGE040A
，通过直接测试试剂空白在主次波长处的吸光度；计算得到主次波长处吸光度比例系数
Figure DEST_PATH_IMAGE044A
。
3.根据权利要求1所述的精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，所述步骤（1）需选择主次两个波长同时进行测试，并将次波长选择在综合吸光度
Figure DEST_PATH_IMAGE046A
的处。
4.根据权利要求1所述的精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，试剂空白在主次波长处的吸光度比例系数
Figure DEST_PATH_IMAGE014AAA
为定值，并由此通过次波长处的吸光度计算主波长处的吸光度。
5.根据权利要求1所述的精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，由终点吸光度扣除样品吸光度、预估试剂空白吸光度，得到吸光度变化并计算样品浓度。
6.根据权利要求1所述的精确估算终点法试剂空白吸光度的方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，通过在结束吸光度中扣除综合吸光度、样品吸光度，得到试剂空白吸光度。
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