CN112251490B - 一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用 - Google Patents

一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用，该回收试剂盒包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；所述细胞裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、乙基苯基聚乙二醇、氯化镁、氯化钠；所述细胞交联液为多聚甲醛溶液。本发明提供的回收试剂盒，具有操作简单、回收周期短、回收效率高等特点，其能够显著降低非特异背景回收，缩短回收时间，提高基因检测的准确度，进而有效解决了传统RNA技术回收操作复杂、回收周期长，回收背景高的问题。

Description

一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用。
背景技术
RNA pulldown技术的原理是在活细胞状态下固定RNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的RNA小片段，然后通过探针去回收此复合体，特异性地富集目的RNA结合的蛋白质、RNA或者DNA，通过对目的RNA片断结合物的纯化与检测，从而获得RNA与DNA、RNA或者蛋白质相互作用的信息。
这项技术通过RNA与DNA、RNA或者蛋白质互作来分析RNA与其他细胞分子的相互作用，被广泛应用于体内基因表达调控、基因稳定性调控和信号通路调控等方面的研究。该技术常与测序技术、质谱技术、DNA芯片和分子克隆技术相结合。
细胞中RNA通常和蛋白质、RNA或者DNA以复合物的形式存在。因此，研究RNA与上述分子的相互作用是了解细胞生物学功能和机制的基本途径。RNA pulldown技术是目前唯一研究体内RNA与其他细胞分子相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定RNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的RNA小片段，然后通过探针方法去回收此复合体，特异性地富集目的RNA结合的RNA、蛋白质或者DNA，通过对RNA结合物的纯化与检测，从而获得RNA与上述生物大分子相互作用的信息。RNA pulldown技术可以检测体内RNA与DNA的相互作用，还可以用来研究RNA结合与基因表达的关系。RNA pulldown技术还可以检测RNA与其他RNA的相互作用，比如和miRNA的结合，进而可以研究miRNA对基因表达的关系。RNA pulldown技术还可以检测体内RNA和蛋白质的相互作用，进而研究RNA对蛋白质功能的调控作用。由此可见，随着RNA pulldown技术的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
RNA pulldown技术是基于体内分析发展起来的方法。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合测序、质谱以及微阵列等技术研究基因表达调控机制，是深入分析癌症、心血管疾病以及中枢神经系统紊乱等疾病的主要通路的一种非常有效的工具。
但是，由于RNA pulldown回收涉及的步骤多、试剂多，因此很多研究者采用传统的RNA pulldown回收技术不能获得理想的回收结果，另外现在已有RNA pulldown回收技术还存在操作复杂、回收时间长、回收不稳定等缺点，因此对RNA pulldown技术的改进成为一种重要的需求。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种RNA pulldown的回收试剂盒，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种RNA pulldown的回收试剂盒，包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；
所述细胞裂解液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1％～10％、乙基苯基聚乙二醇0.1％～10％、氯化镁1～1000mmol/L、氯化钠1～1000mmol/L；以及
所述细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为0.1％～10％。
优选的，所述细胞裂解液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～100mmol/L、十二烷基硫酸钠0.5％～5％、乙基苯基聚乙二醇0.2％～1％、氯化镁1～10mmol/L、氯化钠10～500mmol/L；
所述细胞交联液中多聚甲醛的质量浓度为0.5％～5％。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述清洗液包括：
清洗液A；所述清洗液A包括以下按照摩尔浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、乙二胺四乙酸1～1000mmol/L、氯化钠1～5000mmol/L；以及
清洗液B；所述清洗液B包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1％～10％、乙二胺四乙酸1～1000mmol/L、氯化钠1～5000mmol/L。
优选的，所述清洗液A包括以下按照摩尔浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷10～100mmol/L、乙二胺四乙酸40～400mmol/L、氯化钠100～1000mmol/L；
所述清洗液B包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷10～100mmol/L、十二烷基硫酸钠1％～5％、乙二胺四乙酸40～400mmol/L、氯化钠100～500mmol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液中的一种或多种。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述RNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1％～10％、乙基苯基聚乙二醇0.1％～10％、氯化镁1～1000mmol/L、氯化钠1～1000mmol/L；
所述DNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1％～10％、氯化镁1～1000mmol/L、氯化钠1～1000mmol/L；
所述蛋白质洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1～1000mmol/L、氯化钠1～1000mmol/L、乙基苯基聚乙二醇0.1％～10％、脱氧胆酸钠0.1％～10％、十二烷基硫酸钠0.1％～10％、乙二胺四乙酸1～1000mmol/L。
优选的，所述RNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷10～100mmol/L、十二烷基硫酸钠2％～5％、乙基苯基聚乙二醇0.2％～1％、氯化镁2～10mmol/L、氯化钠100～500mmol/L；
所述DNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷10～100mmol/L、十二烷基硫酸钠1％～5％、氯化镁2～10mmol/L、氯化钠50～500mmol/L；
所述蛋白质洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷50～100mmol/L、氯化钠100～500mmol/L、乙基苯基聚乙二醇1％～5％、脱氧胆酸钠0.5％～2％、十二烷基硫酸钠0.1％～1％、乙二胺四乙酸40～400mmol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述回收磁珠为亲和磁珠。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的回收试剂盒在RNA与细胞分子相互作用中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述细胞分子为RNA、DNA和蛋白质中的任一种。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述应用包括以下步骤：
对细胞进行培养后，再用所述细胞交联液进行固定，并添加甘氨酸溶液中和所述细胞交联液；
将固定后的细胞与所述细胞裂解液进行混合后，再经超声和离心处理，得到样品；
将所述回收磁珠与所述细胞裂解液进行混合，得到磁珠悬浮液；
往样品中添加探针后，再与磁珠悬浮液进行混合，并置于磁力架进行分离，得到沉淀物；
用所述清洗液对沉淀物进行洗涤；
将洗涤后的沉淀物与所述洗脱液进行混合后，再添加或不添加蛋白酶，并置于磁力架进行分离，收集上清液；
对上清液中的细胞分子进行提纯。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的回收试剂盒在制备用于治疗和/或预防疾病的试剂盒中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述疾病为癌症、心血管疾病和中枢神经系统紊乱中的任一种。
本发明实施例提供的一种RNA pulldown的回收试剂盒，通过对各种试剂的配方和组合进行改进，具有操作简单、回收周期短、回收效率高等特点，其能够显著降低非特异背景回收，缩短回收时间，提高基因检测的准确度，进而有效解决了传统RNA技术回收操作复杂、回收周期长，回收背景高的问题。
附图说明
图1为实施例6提供的RNA相关RNA的回收方法与传统RNA pulldown技术的回收周期对比结果图。
图2为实施例6提供的RNA相关RNA的回收方法的回收结果图。
图3为传统RNA pulldown技术的RNA相关RNA回收结果图。
图4为实施例7提供的RNA相关DNA的回收方法与传统RNA pulldown技术的回收周期对比结果图。
图5为实施例7提供的RNA相关DNA的回收方法的回收结果图。
图6为传统RNA pulldown技术的RNA相关DNA回收结果图。
图7为实施例8提供的RNA相关蛋白质的回收方法与传统RNA pulldown技术的回收周期对比结果图。
图8为实施例8提供的RNA相关蛋白质的回收方法的回收结果图。
图9为传统RNA pulldown技术的RNA相关蛋白质回收结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒，其包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；清洗液包括清洗液A和清洗液B；洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液，需要说明的是，洗脱液也可以只包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液中的一种或两种，其可根据实际需求进行设置；回收磁珠为亲和磁珠。
其中，细胞裂解液是由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、乙基苯基聚乙二醇、氯化镁、氯化钠和水配制而成的，另外，细胞裂解液可用酸或碱将其pH调整至7。其中，细胞裂解液中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为10％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为10％、氯化镁的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L。
细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为0.1％。
清洗液A是由三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠和水配制而成的，另外，清洗液A可用酸或碱将其pH调整至7。其中，清洗液A中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为5000mmol/L。
清洗液B是由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钠和水配制而成的，另外，清洗液B可用酸或碱将其pH调整至7。其中，清洗液B中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为5000mmol/L。
RNA洗脱液是由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、乙基苯基聚乙二醇、氯化镁、氯化钠和水配制而成的，另外，RNA洗脱液可用酸或碱将其pH调整至7。其中，RNA洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为10％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为10％、氯化镁的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L。
DNA洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、氯化镁、氯化钠和水配制而成的，另外，DNA洗脱液可用酸或碱将其pH调整至7。其中，DNA洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为10％、氯化镁的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L。
蛋白质洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和水配制而成的，另外，蛋白质洗脱液可用酸或碱将其pH调整至7。其中，蛋白质洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L、乙基苯基聚乙二醇10％的质量百分比浓度为、脱氧胆酸钠10％的质量百分比浓度为、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为10％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1000mmol/L。
实施例2
该实施例提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒，其包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；清洗液包括清洗液A和清洗液B；洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液；回收磁珠为亲和磁珠。其中，各试剂的配制方法与实施例1相同，其区别如下：
细胞裂解液的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.1％、氯化镁的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1000mmol/L。
细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为10％。
清洗液A的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L。
清洗液B的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为10％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1mmol/L。
RNA洗脱液的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.1％、氯化镁的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1000mmol/L。
DNA洗脱液的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、氯化镁的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1000mmol/L。
蛋白质洗脱液的pH为9，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1000mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1000mmol/L、乙基苯基聚乙二醇0.1％的质量百分比浓度为、脱氧胆酸钠0.1％的质量百分比浓度为、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为1000mmol/L。
实施例3
该实施例提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒，其包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；清洗液包括清洗液A和清洗液B；洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液；回收磁珠为亲和磁珠。其中，各试剂的配制方法与实施例1相同，其区别如下：
细胞裂解液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为2％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.2％、氯化镁的摩尔浓度为1mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为10mmol/L。
细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为0.5％。
清洗液A的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为40mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为100mmol/L。
清洗液B的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为1％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为40mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为100mmol/L。
RNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为2％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.2％、氯化镁的摩尔浓度为2mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为100mmol/L。
DNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为1％、氯化镁的摩尔浓度为2mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为50mmol/L。
蛋白质洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为100mmol/L、乙基苯基聚乙二醇1％的质量百分比浓度为、脱氧胆酸钠0.2％的质量百分比浓度为、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.1％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为40mmol/L。
实施例4
该实施例提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒，其包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；清洗液包括清洗液A和清洗液B；洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液；回收磁珠为亲和磁珠。其中，各试剂的配制方法与实施例1相同，其区别如下：
细胞裂解液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为5％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为1％、氯化镁的摩尔浓度为10mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为500mmol/L。
细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为5％。
清洗液A的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为400mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为1000mmol/L。
清洗液B的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为5％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为400mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为500mmol/L。
RNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为5％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为1％、氯化镁的摩尔浓度为10mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为500mmol/L。
DNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为5％、氯化镁的摩尔浓度为100mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为500mmol/L。
蛋白质洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为100mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为800mmol/L、乙基苯基聚乙二醇5％的质量百分比浓度为、脱氧胆酸钠2％的质量百分比浓度为、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为1％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为400mmol/L。
实施例5
该实施例提供了一种RNA pulldown的回收试剂盒，其包括回收磁珠、清洗液、洗脱液、细胞裂解液和细胞交联液；清洗液包括清洗液A和清洗液B；洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液；回收磁珠为亲和磁珠。其中，各试剂的配制方法与实施例1相同，其区别如下：
细胞裂解液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为3％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.6％、氯化镁的摩尔浓度为5mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为250mmol/L。
细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为3％。
清洗液A的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为200mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为500mmol/L。
清洗液B的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为3％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为200mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为300mmol/L。
RNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为3％、乙基苯基聚乙二醇的质量百分比浓度为0.6％、氯化镁的摩尔浓度为6mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为300mmol/L。
DNA洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为50mmol/L、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为3％、氯化镁的摩尔浓度为50mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为250mmol/L。
蛋白质洗脱液的pH为8，其中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为80mmol/L、氯化钠的摩尔浓度为450mmol/L、乙基苯基聚乙二醇3％的质量百分比浓度为、脱氧胆酸钠1％的质量百分比浓度为、十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.5％、乙二胺四乙酸的摩尔浓度为200mmol/L。
实施例6
该实施例提供了一种上述实施例5提供的回收试剂盒在RNA与RNA相互作用中的应用，其中RNA相关RNA的回收方法包括以下步骤：
S1、对细胞进行培养后，再用上述细胞交联液进行固定，并添加甘氨酸溶液中和上述细胞交联液。
S2、将固定后的细胞预冷的PBS缓冲液洗3遍，接着，加入适量预冷的PBS缓冲液，用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中；然后，将上述细胞裂解液添加至离心管中与细胞进行混合，并置于冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞后，再经超声和13000g离心处理5min，取上清至2mL离心管中，得到样品。另取出部分样品作为Input样品用于后续检测。
S3、将上述回收磁珠采用上述清洗液A洗涤一次，去上清后，再与上述细胞裂解液进行混合，得到磁珠悬浮液。
S4、往上述样品和Input样品中添加探针后，再与磁珠悬浮液进行混合，并置于磁力架进行分离1min，非常小心地去除液体，切勿触及磁珠，得到沉淀物。
S5、依次用上述清洗液A对沉淀物进行洗涤2次，用上述清洗液B对沉淀物进行洗涤2次。
S6、将上述RNA洗脱液适当温浴解融后，再与洗涤后的沉淀物进行混合，接着，添加蛋白酶K混匀，于65℃孵育1小时，然后置于磁力架进行分离1min，收集上清液；另外，对上述Input样品，也加入蛋白酶K，于65℃孵育1小时。
S7、对上清液中的RNA用Trizol法进行提纯，得到RNA沉淀；接着，用少量去RNA酶水重悬RNA沉淀，设计检测引物进行定量PCR检测。
实施例7
该实施例提供了一种上述实施例5提供的回收试剂盒在RNA与DNA相互作用中的应用，其中RNA相关DNA的回收方法包括以下步骤：
S1、对细胞进行培养后，再用上述细胞交联液进行固定，并添加甘氨酸溶液中和上述细胞交联液。
S2、将固定后的细胞预冷的PBS缓冲液洗3遍，接着，加入适量预冷的PBS缓冲液，用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中；然后，将上述细胞裂解液添加至离心管中与细胞进行混合，并置于冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞后，再经超声和12000g离心处理5min，取上清至2mL离心管中，得到样品。另取出部分样品作为Input样品用于后续检测。
S3、将上述回收磁珠采用上述清洗液A洗涤一次，去上清后，再与上述细胞裂解液进行混合，得到磁珠悬浮液。
S4、往上述样品和Input样品中添加探针后，再与磁珠悬浮液进行混合，并置于磁力架进行分离1min，非常小心地去除液体，切勿触及磁珠，得到沉淀物。
S5、依次用上述清洗液A对沉淀物进行洗涤2次，用上述清洗液B对沉淀物进行洗涤2次。
S6、将上述DNA脱液适当温浴解融后，再与洗涤后的沉淀物进行混合，接着，添加蛋白酶K混匀，于65℃孵育1小时，然后置于磁力架进行分离1min，收集上清液；另外，对上述Input样品，也加入蛋白酶K，于65℃孵育1小时。
S7、对上清液中的DNA用酚氯仿法进行提纯，得到DNA沉淀；接着，用少量水重悬DNA沉淀，设计检测引物进行定量PCR检测。
实施例8
该实施例提供了一种上述实施例5提供的回收试剂盒在RNA与蛋白质相互作用中的应用，其中RNA相关蛋白质的回收方法包括以下步骤：
S1、对细胞进行培养后，再用上述细胞交联液进行固定，并添加甘氨酸溶液中和上述细胞交联液。
S2、将固定后的细胞预冷的PBS缓冲液洗3遍，接着，加入适量预冷的PBS缓冲液，用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中；然后，将上述细胞裂解液添加至离心管中与细胞进行混合，并置于冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞后，再经超声和14000g离心处理5min，取上清至2mL离心管中，得到样品。另取出部分样品作为Input样品用于后续检测。
S3、将上述回收磁珠采用上述清洗液A洗涤一次，去上清后，再与上述细胞裂解液进行混合，得到磁珠悬浮液。
S4、往上述样品和Input样品中添加探针后，再与磁珠悬浮液进行混合，并置于磁力架进行分离1min，非常小心地去除液体，切勿触及磁珠，得到沉淀物。
S5、依次用上述清洗液A对沉淀物进行洗涤2次，用上述清洗液B对沉淀物进行洗涤2次。
S6、将上述蛋白质脱液适当温浴解融后，再与洗涤后的沉淀物进行混合，并置于沸水中5min，然后置于磁力架进行分离5min，收集上清液。
S7、对上清液中的蛋白质进行提纯和检测。
实验例：
一、将实施例6提供的RNA相关RNA的回收方法与传统RNA pulldown技术进行回收周期对比，其结果如附图1所示，实施例6提供的RNA相关RNA的回收方法从原来的17小时缩短为8个小时，即可完成回收。另外，实施例6提供的RNA相关RNA的回收方法的回收效率和回收背景如附图2所示，传统RNA pulldown技术的回收效率和回收背景如附图3所示。图中，RNA Y:Y基因探针，Control:对照探针，C gene：Y基因相关RNA，D gene:无关基因RNA。从图1～3中可以看出，本发明实施例提供的回收试剂盒及RNA相关RNA的回收方法的回收周期较短，回收效率较高，回收背景较低。
二、将实施例7提供的RNA相关DNA的回收方法与传统RNA pulldown技术进行回收周期对比，其结果如附图4所示，实施例7提供的RNA相关DNA的回收方法从原来的17小时缩短为8个小时，即可完成回收。另外，实施例7提供的RNA相关DNA的回收方法的回收效率和回收背景如附图5所示，传统RNA pulldown技术的回收效率和回收背景如附图6所示。图中，RNA X:X基因探针组，Control:对照探针组，A gene：X基因相关基因DNA，B gene:无关基因DNA。从图4～6中可以看出，本发明实施例提供的回收试剂盒及RNA相关DNA的回收方法的回收周期较短，回收效率较高，回收背景较低。
三、将实施例8提供的RNA相关蛋白质的回收方法与传统RNA pulldown技术进行回收周期对比，其结果如附图7所示，实施例8提供的RNA相关蛋白质的回收方法从原来的16小时缩短为8个小时，即可完成回收。另外，实施例8提供的RNA相关蛋白质的回收方法的回收结果如附图8所示，传统RNA pul ldown技术的回收结果如附图9所示。图中，Probe Z:Z基因探针，CTL:对照探针，Gene Z：Z基因蛋白，GAPDH:无关基因。从图7～9中可以看出，本发明实施例提供的回收试剂盒及RNA相关蛋白质的回收方法的回收周期较短，回收效率较高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种RNA pulldown的回收试剂盒，包括回收磁珠、清洗液和洗脱液，其特征在于，还包括：
细胞裂解液；所述细胞裂解液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1%~10%、乙基苯基聚乙二醇0.1%~10%、氯化镁1~1000mmol/L、氯化钠1~1000mmol/L；以及
细胞交联液；所述细胞交联液为多聚甲醛溶液，其质量浓度为0.1%~10%；
所述清洗液包括：
清洗液A；所述清洗液A包括以下按照摩尔浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、乙二胺四乙酸1~1000mmol/L、氯化钠1~5000mmol/L；以及
清洗液B；所述清洗液B包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1%~10%、乙二胺四乙酸1~1000mmol/L、氯化钠1~5000mmol/L；
所述洗脱液包括RNA洗脱液、DNA洗脱液和蛋白质洗脱液中的一种或多种；
所述RNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1%~10%、乙基苯基聚乙二醇0.1%~10%、氯化镁1~1000mmol/L、氯化钠1~1000mmol/L；
所述DNA洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、十二烷基硫酸钠0.1%~10%、氯化镁1~1000mmol/L、氯化钠1~1000mmol/L；
所述蛋白质洗脱液包括以下按照摩尔浓度或质量百分比浓度计的组分：三羟甲基氨基甲烷1~1000mmol/L、氯化钠1~1000mmol/L、乙基苯基聚乙二醇0.1%~10%、脱氧胆酸钠0.1%~10%、十二烷基硫酸钠0.1%~10%、乙二胺四乙酸1~1000mmol/L；
所述回收磁珠为亲和磁珠。
2.一种如权利要求1所述的回收试剂盒在检测RNA与细胞分子相互作用中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种应用，其特征在于，所述细胞分子为RNA、DNA和蛋白质中的任一种。
4.根据权利要求3所述的一种应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
对细胞进行培养后，再用所述细胞交联液进行固定，并添加甘氨酸溶液中和所述细胞交联液；
将固定后的细胞与所述细胞裂解液进行混合后，再经超声和离心处理，得到样品；
将所述回收磁珠与所述细胞裂解液进行混合，得到磁珠悬浮液；
往样品中添加探针后，再与磁珠悬浮液进行混合，并置于磁力架进行分离，得到沉淀物；
用所述清洗液对沉淀物进行洗涤；
将洗涤后的沉淀物与所述洗脱液进行混合后，再添加或不添加蛋白酶，并置于磁力架进行分离，收集上清液；
对上清液中的细胞分子进行提纯。
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