CN115029414A

CN115029414A - 绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法

Info

Publication number: CN115029414A
Application number: CN202210637026.1A
Authority: CN
Inventors: 刘志静; 惠远远; 周勋
Original assignee: Tianjin Nuohe Medical Examination Institute Co ltd
Current assignee: Tianjin Nuohe Medical Examination Institute Co ltd
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本发明公开了一种绝对定量翻译组Ribosome‑seq建库方法。该建库方法包括以下步骤：S1，对待测样品中的核糖体构象进行固定，对待测样品进行裂解，收集裂解产物；S2，利用酶切及分子排阻色谱法对裂解产物进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；S3，去除RNA样品中的rRNA；S4，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；S5，利用磷酸化后的RNA样品构建得到翻译组Ribosome‑seq绝对定量RNA测序文库。应用本发明的技术方案，能够为翻译组学进行深入精准的研究提供可靠的数据结果。

Description

绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法

技术领域

本发明涉及生命科学技术领域，具体而言，涉及一种绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法。

背景技术

在生命的各个领域中，蛋白质都是由核糖体在翻译过程中合成的。翻译调节占整个调控幅度的54％，超过了转录、mRNA降解和蛋白质降解之和。因此，有必要在全局范围内对翻译进行研究。与其他“组学”方法一样，翻译组学研究翻译过程中的所有成分，包括但不限于翻译mRNAs、核糖体、tRNAs、调节性RNA和新生多肽链。近年来的技术进步在全球范围内对这些成分的研究取得了突破性进展，包括它们的组成和动力学。这些方法已被应用于越来越多的研究中，以揭示翻译控制的多个方面。翻译的过程并不局限于将mRNA编码序列转化为多肽链，它还以一种精细而敏感的方式控制蛋白质组的组成。因此，翻译组学在蛋白质组学、癌症研究、细菌应激反应、生物节律性和植物生物学等领域都具有独特的创新能力。

翻译组学的研究是指正在翻译的RNA分子的高通量分析技术的泛称，常用的翻译组学研究方法是基于核糖体印迹分析(Ribosome Profiling)进行高通量测序分析。而Ribo-seq即是目前翻译组学研究的主流方法，其具体方法是用低浓度RNase处理核糖体-新生肽链复合物，降解掉无核糖体覆盖的RNA片段，再去除核糖体，最后利用二代测序技术检测被核糖体保护的约～30bp的正在翻译RNA小片段。这些被核糖体保护的RNA片段，准确指示了核糖体正在进行翻译的“足迹”，因此这些被核糖体保护的RNA片段，又被称为核糖体足迹(ribosome footprints，简称RPFs)。相比传统的转录组测序(RNA-seq)，Ribo-seq的关键特点是：只针对与核糖体结合，长度约为28-30nt，正在被翻译的RNA片段进行富集、测序和定量。由于RFs直接代表正在被翻译的序列，因此对RFs进行测序，可以精确告诉我们细胞中蛋白翻译的丰富信息(包括翻译区域、翻译丰度、翻译速率等)。

在二代测序技术中的建库及测序环节，通常需要进行一定次数的PCR扩增，以满足测序所需的文库量。然而，由于扩增的偏好性以及扩增倍数的不确定性(在PCR扩增时，所有的文库片段并非以同等速率等量的扩增，扩增速率受到片段长度、GC含量、片段浓度等多方面的影响，容易扩增的片段极大的被富集，一些含量较低的片段或碱基偏好严重的片段甚至完全丢失，最终影响测序结果的准确性)，导致各个片段被扩增的倍数是不一定相同的，这种因PCR扩增产生的重复reads即为Duplication。Duplication存在会导致后续分析中各个基因表达量和真实情况不一致，降低了结果的可信度。

发明内容

本发明旨在提供一种绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，以提高检测出与核糖体结合的mRNA信息的准确性，提高Ribo-seq建库数据质量。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法。该建库方法包括以下步骤：S1，对待测样品中的核糖体构象进行固定，对待测样品进行裂解，收集裂解产物；S2，利用酶切及分子排阻色谱法对裂解产物进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；S3，去除RNA样品中的rRNA；S4，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；S5，利用磷酸化后的RNA样品构建得到翻译组Ribosome-seq绝对定量RNA测序文库。

进一步地，S1中，采用放线菌酮对待测样品中的核糖体构象进行固定。

进一步地，待测样品来源于植物、动物或微生物；和/或，待测样品为植物、动物的组织、细胞、组织裂解物或细胞裂解物。

进一步地，S1包括：对待测样本进行组织研磨、放线菌酮对核糖体构象进行固定、细胞清洗、细胞收集以及细胞裂解得到裂解产物，并进行质检的步骤。

进一步地，S2包括，向裂解产物中加入核糖核酸酶I，室温混匀孵育，然后加入RNA酶抑制剂，终止酶切反应。

进一步地，S2中，采用微型层析分离柱层析柱进行分离纯化RPF。

进一步地，S5中在还构建绝对定量RNA测序文库之前还包括：使用Qubit检测磷酸化后的RNA样品的核酸RPF浓度，RPF的浓度应≥40ng/μl，总量应≥1ug，满足建库条件，则进行构建绝对定量RNA测序文库；若核酸RPF浓度在40-20ng/μl，总量在1ug>M≥500ng，则尝试风险建库；若核酸RPF浓度低于20ng/μl，总量低于500ng，则重新进行RNA样本提取。

进一步地，S3包括：S3.1，于无核酸酶的微量离心管中，用无核酸酶的水将RNA样品稀释，冰上放置备用，并将RNA样品与探针杂交，用移液器吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中进行反应，然后瞬时离心将样品收集至管底，并置于室温；S3.2，向S1的产物中加入去核糖核酸磁珠吹吸混匀，阶段性震荡；S3.3，将S2的产物置于磁力架上静置5min，转移上清至新的微量离心管中，置于磁力架上静置1min，转移上清至新的无核酸酶的EP管中，冰上放置。

进一步地，S4包括：S4.1，配置5’磷酸化反应体系；S4.2，将上述配制好的5’磷酸化反应体系放置在PCR仪中，37℃反应60分钟，70℃反应10分钟；S4.3，将S4.2的产物进行纯化回收。

进一步地，S5中构建绝对定量RNA测序文库包括：依次进行3’接头连接，5’接头连接，反转录，磁珠纯化，PCR扩增，磁珠纯化，回收目的片段，文库定量及进行质检；优选的，PCR扩增包括UMI及index扩增。

应用本发明的技术方案，可以以植物、动物或微生物为样本，优选利用cycloheximide进行核糖体构像固定，通过酶切及分子排阻色谱法分离核糖体包裹的mRNA、然后去除rRNA、进行5’磷酸化反应、绝对定量文库构建及库检，该技术方案在获取RPF后通过构建绝对定量文库，将文库构建过程及上机测序过程中产生的PCR dup进行精准去除，与常规的小片段文库相比，具有定量更准，序列测序更准，低拷贝序列定量更准的优势，确保RPF定量结果无偏差，能够为翻译组学进行深入精准的研究提供可靠的数据结果。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明一实施方式的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法的步骤流程图；

图2示出了实施例1构建的RNA文库2100质检图；

图3示出了对比例1构建的RNA文库2100质检图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

在Ribo-seq的建库环节，为了克服短片段文库PCR dup导致的定量偏差，提高与核糖体结合的mRNA的检出量，本申请提出了绝对定量翻译组Ribo-seq建库方法，以能够准确检测出与核糖体结合的mRNA信息，提高Ribo-seq建库数据质量。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法。该建库方法包括以下步骤：S1，对待测样品中的核糖体构象进行固定，对待测样品进行裂解，收集裂解产物；S2，利用酶切及分子排阻色谱法对裂解产物进行RPF(核糖体保护的RNA片段)的分离和提取，获得RNA样品；S3，去除RNA样品中的rRNA；S4，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；S5，利用磷酸化后的RNA样品构建绝对定量RNA测序文库。

在本申请一典型的实施方式中，S1包括：对待测样本进行组织研磨、放线菌酮对核糖体构象进行固定、细胞清洗、细胞收集以及细胞裂解得到裂解产物，并进行质检的步骤。

优选的，S2中，采用MicroSpin S-400Column层析柱进行分离纯化RPF，不需要昂贵的仪器和收集装置，只需要低温高速离心机及小于1个小时的操作时间即可完成批量收集。

根据本发明一种典型的实施方式，S5中在还构建绝对定量RNA测序文库之前还包括：使用Qubit检测磷酸化后的RNA样品的核酸RPF浓度，RPF的浓度应≥40ng/μl，总量应≥1ug，满足建库条件，则进行构建绝对定量RNA测序文库；若核酸RPF浓度在40-20ng/μl，总量在1ug>M≥500ng，则尝试风险建库；若核酸RPF浓度低于20ng/μl，总量低于500ng，则重新进行RNA样本提取。

根据本发明一种典型的实施方式，S3包括：S3.1，于无核酸酶的微量离心管中，用无核酸酶的水将RNA样品稀释，冰上放置备用，并将RNA样品与探针杂交，用移液器吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中进行反应，然后瞬时离心将样品收集至管底，并置于室温；S3.2，向S1的产物中加入去核糖核酸磁珠吹吸混匀，阶段性震荡；S3.3，将S2的产物置于磁力架上静置5min，转移上清至新的微量离心管中，置于磁力架上静置1min，转移上清至新的无核酸酶的EP管中，冰上放置

根据本发明一种典型的实施方式，S5中构建绝对定量RNA测序文库包括：依次进行3’接头连接，5’接头连接，反转录，磁珠纯化，PCR扩增，磁珠纯化，回收目的片段，文库定量及进行质检；优选的，PCR扩增包括UMI及index扩增。本发明的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法中在两端接头连接后，通过磁珠将单端接头及接头自连产物有效去除，因此，能够降低建库过程中的接头自连的干扰，且不再使用含有有毒试剂的PAGE胶进行文库片段筛选，增加实验的准确性和安全性，从而更加适合快速、精准地对多个样本进行建库工作。

因为，对于段片段文库的构建而言，PCEdup能达到60％以上，而UMI标记技术是一种可以准确识别并去除PCR产生的Duplication的技术手段，在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签(Unique Identifier，UMI或UID)，也称为数字标签。数字标签会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。同一个片段经过PCR扩增出来的产物均带有相同的数字标签，测序完成后利用UMI追溯每一个片段的来源，将相同来源的片段(具有相同的序列和UMI)进行合并，就能准确去除PCR扩增重复，一比一准确还原样本扩增前的原始状态。在此过程中，PCR扩增和测序错误同样可以被纠正：扩增和测序的错误会使得相同UMI标签对应多个不同的序列，那么只需比较这些序列的相似性，即可纠正这些错误。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

参考图1所示的流程，本实施例中绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法包括如下步骤：

步骤S1，以植物组织为例，利用cycloheximide(放线菌酮)进行组织固定及裂解，这里需说明的是，样本可来源于植物、动物或微生物的细胞、组织，本发明仅以植物组织为例，并不以此为限。

具体的，步骤S1进一步包括：

S1.1，组织裂解液制备：

取0.3g植物组织(玉米叶片)，用液氮充分研磨至粉末状；

快速将粉末转移至2ml离心管中，加入1ml的裂解液(200mM Tris pH＝7.4，200mMNaCl，15mM MgCl，1mM DTT，100μg/ml放线菌酮，1％Triton-100)，充分吹打混匀；

冰上孵育10min，并定时颠倒混匀；

4℃、20000g离心10min，将上清液转移至冰上预冷的新离心管中，得到裂解产物。

利用分子排阻色谱法对待测样品进行RPF的分离，获得RNA样品。

具体地，步骤S2进一步包括：

S2.1，DNA和RNA消化反应：取200μl裂解液加入核糖核酸酶I(RNase I)(100U/μl)，室温混匀孵育45min，然后加入10μl SUPERase*In RNase inhibitor(Thermo)，充分混匀，终止消化反应。

S2.2，核糖体分离：采用MicroSpin S-400Column(尺寸色谱柱，GE)进行分离纯化RPF，具体操作如下：

S2.2.1，轻轻颠倒混匀层析柱的树脂，轻弹管壁除去气泡；

S2.2.2，打开柱子的两端，让树脂中液体自然流出；

S2.2.3，往柱子中加入500μl Polysome Buffer让其在重力的作用下自然流出，期间不断补充Polysome Buffer，不要让柱料干掉。

S2.2.4，待酶切结束前，600g离心4分钟室温，去除Polysome Buffer；

S2.2.5，600g离心4分钟室温；

S2.2.6，弃流出液；

S2.2.7，将柱子置于2ml离心管中；

S2.2.8，往柱子中加入200μl消化后的RPF；

S2.2.9，600g离心2分钟；

S2.2.10，收集流出液。

S2.3，RPF纯化：使用RNA Clean&Concentrator-25Kit方法纯化RPF RNA样品，并用核酸定量仪器NanoDrop进行质检。具体操作如下：

S2.3.1，将RNA、Binding Buffer和无水乙醇混匀，具体配比见表1：

表1

试剂	体积
		RNA Binding Buffer	400μl
无水乙醇	900μl
		RPF样本	200μl

S2.3.2，将Zymo-Spin^TMIIC Column放置在收集管中，将样品转移至柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液；

S2.3.3，加入400μl RNA Prep Buffer到柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液；

S2.3.4，加入700μl RNA Wash Buffer到柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液；

S2.3.5，加入400μl RNA Wash Buffe到柱子中，10,000～16,000g离心2min，将柱子转移至新的无RNA酶离心管中；

S2.3.6，用28μl NF-H₂O洗脱样本，以得到25μl样本；

S2.3.7，用NanoDrop定量，RPF的浓度应≥40ng/μl，总量应≥1ug，满足建库条件；若浓度在40-20ng/μl，总量在1ug>M≥500ng，可尝试风险建库；若浓度低于20ng/μl，总量低于500ng，不推荐进行后续实验，应继续用未使用的裂解产物继续进行纯化。

步骤S3，rRNA去除，在本发明具体实施例中，采用核糖体探针杂交后利用生物素标记的磁珠来去除rRNA。

具体地，步骤S3进一步包括：

S3.1，Nuclease free微量离心管中加入10μlRPF，5μl rRNA Binding Buffer；

S3.2，在上步管中每管加入5μl的rRNA Removal Mix，具体分为动物和植物两种Mix，根据物种选择对应的Mix加入。本发明具体实施例中，使用rRNA Removal Mix–Plant。

S3.3混匀，瞬时离心，68℃孵育10min(PCR仪)，总体系20μl。

S3.4，待程序结束后立即移除反应管，室温放置1min。

S3.5，继续加入35μl RRB-rRNA Removal Beads，充分混匀；

S3.6，室温静置3min，置于磁力架上1min。转移上清50μl至新PCR管中，3000rpm离心1min，用枪头轻轻吹打混匀，置于磁力架上1min，转移上清45μl至1.5mlEP管中。

S3.7，用RNA Clean&Concentrator–5Kit方法纯化处理的RPF RNA样本：

S3.7.1，将RNA(NF-H₂O补足体积至100μl)、Binding Buffer和无水乙醇混匀，具体配比如表2：

表2

试剂	体积
		RNA Binding Buffer	200μl
无水乙醇	450μl
		RPF样本	100μl

S3.7.2，将Zymo-Spin^TMIIC Column放置在收集管中，将样品转移至柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液；

S3.7.3，加入400μl RNA Prep Buffer到柱子中，10,000～6,000g离心30s，弃收集液；

S3.7.4加入700μl RNA Wash Buffer，到柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液；

S3.7.5，加入400μl RNA Wash Buffer，到柱子中，10,000～16,000g离心2min，将柱子转移至新1.5ml离心管中；

S3.7.6，用11μl NF-H₂O洗脱样本，以得到10μl样本；

步骤S4，将去除rRNA的RNA进行5’磷酸化反应。

具体地，步骤S4过程如下：

S4.1，按下表3来配制反应体系：

表3

试剂	体积(μl)
		RNA样品	10
NF-H<sub>2</sub>O	33
		T4 PNK buffer	5
SUPERase*In(20U/μl)	1
		T4 PNK(10U/μl)	1

S4.2，PCR仪上反应37℃-1h，70℃-10min；

S4.3，每个样品用NF-H₂O将体积调成100μl，进行RNA回收；

S4.4，将RNA、Binding Buffer和无水乙醇混匀，配比见表4：

表4

S4.5，将Zymo-Spin^TMIIC Column放置在收集管中，将样品转移至柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液。

S4.6，加入400μl RNA Prep Buffer到柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液。

S4.7，加入700μl RNA Wash Buffer，到柱子中，10,000～16,000g离心30s，弃收集液。

S4.8，加入400μl RNA Wash Buffer，到柱子中，10,000～16,000g离心2min，将柱子转移至新的无RNA酶离心管中。

S4.9，用8μl NF-H₂O溶解样本，以得到6μl样本。

S5，利用磷酸化后的RNA样品构建绝对定量RNA测序文库。

具体地，步骤S5进一步包括：

S5.1将下表5所列试剂按照顺序进行添加(在冰上操作)，然后吹打15-20次，充分混匀，瞬时离心：

表5

试剂	体积(μl)
		RNA样品	5
3‘Adapter	1
		R1	1
3‘Ligase	1
		3‘Buffer	2
Ligation Activator	10
		总计	20

S5.2，PCR仪上执行下表6中的程序。

表6

S5.3，将下表7中的试剂按照顺序进行添加(在冰上操作)，然后吹打15-20次，充分混匀，瞬时离心：

表7

试剂	体积(μl)
		3‘连接产物	20
NF-H<sub>2</sub>O	15
		5‘Adapter	1
R1	1
		5‘Ligase	1
3‘Buffer	2
		总计	40

S5.4，PCR仪上执行下表8中的程序：

表8

温度	时间
		28℃	30min
65℃	20min
		4℃	至少5min

S5.5，向上述产物中加入2μl RT Initiator，吹打15-20次充分混匀，然后瞬时离心；

S5.6，PCR仪上执行下表9程序：

表9

S5.7，将下表10中的试剂按照顺序进行添加(在冰上操作)，然后吹打15-20次，充分混匀，然后瞬时离心；

表10

试剂	体积(μl)
		RT Initiator产物	42
NF-H<sub>2</sub>O	2
		RT Primer(RT引物)	2
RT Buffer(RT缓冲液)	12
		R1	1
RT Enzyme(RT酶)	1
		总计	60

S5.8，PCR仪上执行下表11中的程序：

表11

温度	时间
		50℃	1h
70℃	15min
		4℃	至少5min

S5.9，取143μl的QMN Beads到cDNA的反应体系中，涡旋3s，然后瞬时离心；

S5.10，室温下放置5min，将离心管置于磁力架上约4min，直至磁珠完全被吸附，溶液澄清，保持样品在磁力架上，丢弃上清。

S5.11，依然保持样品在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，立即取出，并丢弃乙醇溶液。重复上述步骤，加入200μl 80％的乙醇，立即取出后，丢弃乙醇，使用10μl枪头丢弃剩余的所有乙醇。

S5.12，保持样品在磁力架上，室温干燥10min后，向样品中加入17μl NF-W，小心吹打，使磁珠充分重悬，瞬时离心后，在室温放置2min。

S5.13，将样品放置在磁力架上保持2min，直至溶液澄清，磁珠完全被吸附。吸取15μl上清液至新的离心管中。

S5.14将下表12试剂按顺序添加(在冰上操作)，吹打12次充分混匀，然后瞬时离心：

表12

试剂	体积(μl)
		cDNA	15
Library Buffer	16
		HotStarTaq DNA Polymerase	3
Forward Primer	2
		Index Primer	2
NF-H<sub>2</sub>O	42
		总计	80

S5.15，PCR仪上执行下表13中的程序：

表13

S5.16，反应结束后，瞬时离心80μl的PCR反应体系，取75μl(1×)置于含有磁珠的离心管中，涡旋3s，充分混匀，瞬时离心。

S5.17，室温放置5min后，将样品置于磁力架上约4min，直至磁珠被完全吸附，溶液澄清；

S5.18，吸取145μl上清至新的离心管中，取130μl QMN Beads加入上清中，涡旋3s，充分混匀后瞬时离心；

S5.19，室温放置5min后将样品置于磁力架上5min，直至磁珠被完全吸附，溶液澄清。保持样品在磁力架上，小心吸取并丢弃上清。

S5.20，依然保持样品在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，立即取出，并丢弃乙醇溶液。重复上述步骤，加入200μl 80％的乙醇，立即取出后，丢弃乙醇，使用10μl枪头丢弃剩余的所有乙醇。保持样品在磁力架上，室温干燥10min；

S5.21，向样品中加入17μl NF-H₂O，小心吹打，使磁珠充分重悬，瞬时离心后，在室温放置2min；

S5.22，将样品放置在磁力架上保持2min，直至溶液澄清，磁珠完全被吸附。吸取15μl上清液至新的离心管中，即为Ribo-seq文库原液。

文库构建，质检：DNA片段和浓度检测均合格，即目的片段大小为184-193bp，

浓度≥0.7ng，体积≥10μl，无接头污染后即可上机检测，库检图如图2所示。因为在接头连接后使用磁珠有效去除实验体系中的未连接接头。PCR扩增后再次使用磁珠进行文库回收，有效降低了接头污染的可能性。文库下机数据中无接头数据污染，有效数据占比高。

实施例2

与实施例1基本相同，不同之处在于样本不同，实施例2的样本为玉米籽粒。

对比例1

与实施例1基本相同，不同之处在于使用PAGE胶回收Ribo-seq文库，库检图如图3所示。

对比例1库检图：使用PAGE胶回收Ribo-seq文库库检图，因为接头自连比例高而导致使用片段无法有效区分。在回收的文库中较大比例会出现一定程度的接头污染。该部分序列会在测序中被优先扩增，从而在数据产出中占有一定比例，影响有效数据占比。

对比例2

与实施例1基本相同，不同之处在于使用目前常用的去除核糖体方式(RnaseH酶切消化)，去除核糖体后的文库中，一般会有较大比例的核糖体占比，核糖体的去除效率低。样本与实施例2相同，为玉米籽粒。

而实施例1中的去除核糖体的方式及建库方式，数据有效率率明显提高，具体比较如下表14：

表14

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

本发明的技术方案，可以以植物、动物或微生物为样本，优选利用cycloheximide进行核糖体构像固定，通过酶切及分子排阻色谱法分离核糖体包裹的mRNA、然后去除rRNA、进行5’磷酸化反应、绝对定量文库构建及库检，该技术方案在获取RPF后通过构建绝对定量文库，将文库构建过程及上机测序过程中产生的PCR dup进行精准去除，与常规的小片段文库相比，具有定量更准，序列测序更准，低拷贝序列定量更准的优势，确保RPF定量结果无偏差，能够为翻译组学进行深入精准的研究提供可靠的数据结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，对待测样品中的核糖体构象进行固定，对所述待测样品进行裂解，收集裂解产物；

S2，利用酶切及分子排阻色谱法对所述裂解产物进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；

S3，去除所述RNA样品中的rRNA；

S4，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；

S5，利用磷酸化后的RNA样品构建得到翻译组Ribosome-seq绝对定量RNA测序文库。

2.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S1中，采用放线菌酮对所述待测样品中的核糖体构象进行固定。

3.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述待测样品来源于植物、动物或微生物；和/或，所述待测样品为植物、动物的组织、细胞、组织裂解物或细胞裂解物。

4.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S1包括：对所述待测样本进行组织研磨、放线菌酮对核糖体构象进行固定、细胞清洗、细胞收集以及细胞裂解得到所述裂解产物，并进行质检的步骤。

5.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S2包括，向所述裂解产物中加入核糖核酸酶I，室温混匀孵育，然后加入RNA酶抑制剂，终止酶切反应。

6.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S2中，采用微型层析分离柱层析柱进行分离纯化RPF。

7.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S5中在构建绝对定量RNA测序文库之前还包括：使用Qubit检测所述磷酸化后的RNA样品的核酸RPF浓度，RPF的浓度应≥40ng/μl，总量应≥1ug，满足建库条件，则进行构建所述绝对定量RNA测序文库；若核酸RPF浓度在40-20ng/μl，总量在1ug>M≥500ng，则尝试风险建库；若核酸RPF浓度低于20ng/μl，总量低于500ng，则重新进行RNA样本提取。

8.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S3包括：

S3.1，于无核酸酶的微量离心管中，用无核酸酶的水将所述RNA样品稀释，冰上放置备用，并将所述RNA样品与探针杂交，用移液器吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中进行反应，然后瞬时离心将样品收集至管底，并置于室温；

S3.2，向所述S1的产物中加入去核糖核酸磁珠吹吸混匀，阶段性震荡；

S3.3，将所述S2的产物置于磁力架上静置5min，转移上清至新的微量离心管中，置于磁力架上静置1min，转移上清至新的无核酸酶的EP管中，冰上放置。

9.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S4包括：

S4.1，配置5’磷酸化反应体系；

S4.2，将上述配制好的所述5’磷酸化反应体系放置在PCR仪中，37℃反应60分钟，70℃反应10分钟；

S4.3，将所述S4.2的产物进行纯化回收。

10.根据权利要求1所述的绝对定量翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述S5中构建绝对定量RNA测序文库包括：依次进行3’接头连接，5’接头连接，反转录，磁珠纯化，PCR扩增，磁珠纯化，回收目的片段，文库定量及进行质检；

优选的，所述PCR扩增包括UMI及index扩增。