CN116904557A - 一种微量翻译组建库产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微量翻译组建库产品，涉及生物医药和分子生物学领域。所述产品包括细胞裂解组件、核酸酶及酶解缓冲液组件、逆转录试剂组件、文库DNA纯化组件；细胞裂解组件用于裂解样本细胞，提取样本细胞的RNC；核酸酶及酶解缓冲液组件用于对所述RNC进行酶解处理，得到RPF‑RNA；逆转录试剂用于将RPF‑RNA片段逆转录成相应的DNA；文库DNA纯化产品包括电泳试剂、碎胶装置、过滤纯化产品。本发明提供的产品及方法对样本需求较小，适用于珍贵样本或非常有限的特殊来源样本，这意味着研究人员可以利用该方法从少量样本中获取足够的RPF‑RNA用于翻译组文库的构建，无需担心样本耗尽或浪费。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学领域，更具体地，涉及一种微量翻译组建库产品。
背景技术
翻译组研究可帮助科研人员发现及鉴定新蛋白，从翻译水平探究基因表达对疾病影响的机制以及解释转录水平与蛋白水平结果不一致的问题。近年来，翻译组的应用越来越广泛，研究人员结合翻译组与转录组的数据，在探究肿瘤发生发展机制、发育调控、神经科学等领域产出了不少科研成果。想要研究翻译组数据需要获取正在翻译的核糖体上结合保护的mRNA信息，目前，已开发出利用低浓度的核糖核酸酶 (RNase) 处理细胞裂解物以降解mRNA，但受核糖体保护的RNA片段被保留。然后，通过下一代测序 (NGS) 分析被核糖体保护的片段（22-35nt mRNA片段，核糖体足迹，RPF）以获取mRNA翻译的信息。现有的翻译组分析建库的方法有很多，例如2009年Weissman课题组开发的Ribo-seq，2021年Michael开发的单细胞核糖体测序技术（scRibo-seq）以及颉伟课题组开发的超灵敏翻译组测序技术Ribo-lite等。但是这些方法存在以下缺点：
1.现有的常规的Ribo-seq需要昂贵的试剂盒，如rRNA去除试剂盒，且只能针对小鼠和人类来源的样本，且对细胞需求大，针对特殊临床样本及特殊类群的细胞，如包含但不限于人类睾丸及小鼠睾丸组织中精原干细胞群体，样本量极低，无法满足常规Ribo-seq建库；
2.现有的单细胞及其他低样本量的翻译组对高昂仪器设备需求高，建库试剂盒成本高，且存在如单细胞测序的丰度低等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种微量、低成本的翻译组建库产品，所述产品实现对磁珠或流式分选的微量细胞的翻译终止处理；对翻译终止处理的细胞样品进行裂解释放RNA及微球核酸酶消化处理获得核糖体保护的RNA片段；在1个PCR小管中完成所有对核糖体保护的RNA的建库流程；通过TBE凝胶选择170~185bp长度的文库组分，对选择的文库进行纯化处理，进一步用于高通量测序。
本发明公开一种微量翻译组建库产品，所述产品包括细胞裂解组件、核酸酶及酶解缓冲液组件、逆转录试剂组件、文库DNA纯化组件；
所述细胞裂解组件用于裂解样本细胞，提取样本细胞的RNC（Ribosome Nascent-chain Complex，核糖体-新生肽链复合物）；所述核酸酶及酶解缓冲液组件用于对所述RNC进行酶解处理，得到RPF-RNA；
所述逆转录试剂用于将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
所述文库DNA纯化组件包括电泳试剂、碎胶装置、过滤纯化产品，将所述电泳试剂配制成凝胶用于逆转录生成的DNA进行电泳，将凝胶中的目标区域割胶后置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA。
进一步，所述碎胶装置包括压胶装置、第一离心管和第二离心管，所述压胶装置为带橡胶的注射器内杆，所述第一离心管管底用有直径0.5~1mm的小孔，所述第二离心管位于第一离心管外围，压胶装置在第一离心管内挤压凝胶，凝胶通过小孔流入第二离心管，得到碎胶。
进一步，所述产品还包括蛋白合成抑制剂，所述蛋白合成抑制剂用于加入获取的样本细胞中得到翻译抑制的细胞，翻译抑制的细胞再进行细胞裂解，所述蛋白质合成抑制剂选自下列中的一种或多种：氯霉素、卡那霉素、新霉素、放线菌酮、四环素、土霉素、嘌呤霉素、白喉霉素。
进一步，所述细胞裂解组件采用下列方法中的一种或几种的组合裂解细胞：化学法、酶解法、物理法。
进一步，核酸酶及酶解缓冲液组件包括核酸酶、酶解缓冲液、酶消终止缓冲液；
所述核酸酶包括下列中的一种或几种：微球核酸酶、RNA酶I、广谱非限制性核酸酶、RNase A、RNase R；
所述酶解缓冲液包括下列中的一种或几种：pH缓冲液、钙盐、镁盐、酶稳定剂；
所酶消终止缓冲液包括下列中的一种或几种：EGTA、EDTA、蛋白酶K、GuSCN。
进一步，所述逆转录试剂组件包括：3’端连接反应液、逆转录引物缓冲液、5’端连接反应液、逆转录反应液、PCR反应液。
进一步，所述逆转录引物缓冲液中含有逆转录引物，所述引物序列为：ACACGACGCTCTTCCGA；
所述3’端连接反应液中含有预腺苷化3’端接头，所述预腺苷化3’端接头序列为：5rApp/AGAUCGGAAGAGCGUCGUG/3SpC3；
所述5’端连接反应液中含有5’端接头，所述5’端接头序列为：/5Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG/3SpC3。
进一步，所述文库DNA纯化组件还包括cDNA纯化产品，所述cDNA纯化产品对逆转录的DNA进行纯化得到纯化后的DNA。
进一步，所述过滤纯化产品包括凝胶过滤产品、含玻璃纤维滤膜的过滤柱。
本发明公开一种微量翻译组建库方法，包括：
获取样本细胞，通过细胞裂解，提取样本细胞的RNC，所述样本细胞数量为100-500个；
对所述RNC在核酸酶及酶解缓冲液中进行酶解处理得到RPF-RNA；
采用逆转录试剂将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
将逆转录生成的DNA进行凝胶电泳，选取凝胶中的目标区域割胶，置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA。
本发明的优点：
1.传统的翻译组建库方法需要大量的RPF-RNA样本，本发明提供的产品及方法对样本需求较小，适用于珍贵样本或非常有限的特殊来源样本，这意味着研究人员可以利用该方法从少量样本中获取足够的RPF-RNA用于翻译组文库的构建，无需担心样本耗尽或浪费。
2.本发明提供的产品及方法的实验流程可以在常规实验室中完成，对于高端仪器设备的需求较低，这使得更多的实验室可以轻松地采用该方法进行翻译组文库的构建，无需投入大量的资金购买昂贵的仪器设备。
3.与传统的翻译组建库产品及方法相比，本发明提供的产品及方法无需使用昂贵的试剂盒，通过优化实验步骤和选择经济实惠的试剂，实现大幅降低建库的成本，这对于预算紧张的研究项目或实验室是一个重要的优势。
4.传统的翻译组建库产品及方法中，非特异性的RNA片段和rRNA占据较大的比例，导致RPF-RNA的reads占比较低，而本发明提供的产品及方法通过采用特定的实验步骤和优化的实验条件，可以提高RPF-RNA的reads占比，这意味着在测序过程中可以更充分地利用测序容量，减少非特异性片段的reads数量，从而降低测序成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获取其他的附图。
图1是一种本发明实施例提供的微量翻译组建库产品使用流程示意图；
图2是一种本发明实施例提供的微量翻译组建库方法的流程示意图；
图3、图4和图5是一种本发明实施例提供的微量翻译组建库实验操作流程图；
图6是一种本发明实施例提供的不同细胞量建库的电泳图，左起第1、5、7、9、10条泳道是Marker的条带，最左侧标有条带大小，单位bp，其余泳道为不同细胞量下的跑出的条带，左起第2泳道无条带是因为未加核酸酶消化；
图7是一种本发明实施例提供的不同核酸酶消化建库的电泳图，左起第1、5、9、10条泳道是Marker的条带，左起第2、3、4条泳道是加入RNA酶I消化的样本的电泳条带，RNA酶I的浓度自左到右依次为2U/ul、2.5U/ul和0.5U/ul，左起第6、7、8条泳道是加入微球核酸酶消化的样本的电泳条带，微球核酸酶的浓度自左到右依次为10U/ul、5U/ul和1.25U/ul，相同浓度下， 使用微球核酸酶的条带更亮，因此，在微量蛋白组建库实验中，优选微球核酸酶；
图8是一种本发明实施例提供的微量翻译组建库与常规翻译组建库两种不同的建库方式测序后RPF reads数的箱线图，Y轴是测序获取的片段reads数，在该实施例中，代表着在30G测序数据量下获得的有效数据量，微量为本方法，常规为一般经典的大量细胞方法；
图9是一种本发明实施例提供的微量翻译组建库数据质控的结果图，图9中的A是测序去除接头后比对到基因组上的reads长度分布情况，理论上RPF保护的片段是24~35nt，主峰在30nt左右，上述结果与理论一致，Y轴是片段数量，X轴是RPF保护的RNA片段长度；图9中的B是比对到基因组的reads在基因组的主要位置分布，核糖体理论上结合的是mRNA的CDS区，翻译组建库测序得到的reads主要映射到CDS区域和5’-UTR，很少会映射到3’-UTR；图9中的C和D为P-site分析结果示意图，符合经典的高低低3nt规则分布，表明本微量建库方法质控好，代表了翻译组的精确信息。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
在本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的描述的一些流程中，包含了按照特定顺序出现的多个操作，但是应该清楚了解，这些操作可以不按照其在本文中出现的顺序来执行或并行执行，操作的序号如S101、S102等，仅仅是用于区分开各个不同的操作，序号本身不代表任何的执行顺序。另外，这些流程可以包括更多或更少的操作，并且这些操作可以按顺序执行或并行执行。需要说明的是，本文中的“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的消息、设备、模块等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获取的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
图1是本发明实施例提供的微量翻译组建库产品使用流程示意图，所述微量翻译组建库产品包括：细胞裂解组件、核酸酶及酶解缓冲液组件、逆转录试剂组件、文库DNA纯化组件；
所述产品的使用流程包括：
S11：获取细胞样品；
在一个实施例中，通过THY1+磁珠分选获取出生四天小鼠睾丸组织中100~500个精原干细胞。
THY1是一个细胞表面分子，也被称为CD90。它是一种高度保守的糖蛋白，在多种细胞类型中广泛表达，包括肌肉细胞、神经细胞、免疫细胞和干细胞。在免疫学中，THY1通常被用作标记肿瘤干细胞、免疫干细胞以及其他干细胞的标志物。通过使用THY1阳性（THY1+）磁珠对细胞进行分选，可以富集THY1表达的细胞亚群，从而进行后续的实验研究或应用。
在一个实施例中，所述产品还包括蛋白质合成抑制剂，所述蛋白质合成抑制剂用于加入获取的小鼠精原干细胞中得到翻译抑制的细胞，翻译抑制的细胞再进行细胞裂解，所述蛋白质合成抑制剂选自下列中的一种或多种：氯霉素、卡那霉素、新霉素、放线菌酮、四环素、土霉素、嘌呤霉素、白喉霉素。
氯霉素（Chloramphenicol）是一种广谱抗生素，通过抑制细菌的蛋白质合成来阻止细菌生长，它结合到细菌的核糖体上，阻止氨基酸的连接，从而阻碍了蛋白质合成；卡那霉素（Kanamycin）是一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰细菌的蛋白质合成来抑制细菌生长；新霉素（Neomycin）是一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰细菌的蛋白质合成来杀死细菌；放线菌酮（Streptomycin）是一种氨基糖苷类抗生素，被用于治疗结核病等细菌感染；四环素（Tetracycline）是一类抗生素，用于治疗多种细菌感染，它们通过阻止氨基酸与核糖体上的RNA结合来抑制蛋白质合成；土霉素（Erythromycin）是一种大环内酯类抗生素，用于治疗细菌感染，通过阻止核糖体上的RNA链的延伸来干扰蛋白质合成；嘌呤霉素（Puromycin）是一种氨基酸似物，能够与正在合成的蛋白质链结合，导致蛋白质的早期终止，因而抑制蛋白质合成；白喉霉素（Diphtheria Toxin）是一种毒素，能够与蛋白质合成的终止因子EF-2结合，导致蛋白质合成终止，引起毒素性感染。
S12：使用所述细胞裂解组件裂解样本细胞，提取样本细胞的RNC；
在一个实施例中，所述细胞裂解组件采用下列方法中的一种或几种的组合裂解细胞：化学法、酶解法、物理法。
细胞裂解是生物学和生物技术领域中常用的一项实验操作，用于破坏细胞膜并释放细胞内的细胞器、蛋白质、核酸等细胞成分。
化学法包括表面活性剂法和高渗透法。其中，表面活性剂法是利用表面活性剂（如Triton X-100、SDS）破坏细胞膜的疏水区域，使细胞破裂，操作简单，裂解效果好，适用于多种细胞类型，但是表面活性剂会对蛋白质和核酸的理化性质产生影响，需要进行后续实验处理，增加实验操作；高渗透法通过加入高浓度的盐溶液或葡萄糖溶液，使细胞内外的渗透压差产生破裂细胞的压力，简单易行，适用于柔软的细胞类型，但裂解效果可能不均匀，浓度的控制不好把握。
酶解法是利用特定的酶，如蛋白酶、葡萄糖酶，破坏细胞膜的结构，使细胞裂解，操作方便，适用于特定的细胞类型，存在酶对细胞其他成分有影像的风险。
物理法包括超声波裂解、高压均质法和冻融法。其中，超声波裂解是在超声波的高频振动作用下，产生高压和低压的交替波动，从而破坏细胞膜，操作简单，裂解效果好，适用于多种细胞类型，然而，超声波裂解容易产生热量，可能导致样品中的蛋白质和核酸变性；高压均质法是利用高速运动的活塞将细胞样品穿过狭窄的孔，从而产生高压和剪切力，使细胞破碎，使用于较坚硬的细胞类型，但设备较昂贵，操作相对复杂；冻融法是将细胞样本冷冻至低温，然后迅速融化，利用冻融过程中产生的机械压力和温度变化破裂细胞，简单易行，适用于柔软的细胞类型，但裂解效果可能不均匀。
S13：使用核酸酶及酶解缓冲液组件对所述RNC进行酶解处理，得到RPF-RNA；
在一个实施例中，所述核酸酶及酶解缓冲液组件包括核酸酶、酶解缓冲液、酶消终止缓冲液；
所述核酸酶包括下列中的一种或几种：微球核酸酶、RNA酶I、广谱非限制性核酸酶、RNase A、RNase R；
微球核酸酶（Micrococcal Nuclease）是一种切割DNA和RNA的非特异性内切酶，可以在较宽的pH范围和低离子强度下活性稳定，用于裂解细胞并释放细胞内的核酸、去除线性DNA或RNA片段、切割DNA或RNA；RNA酶I是一种特定的核酸酶，能够剪切RNA分子的磷酸二酯键，产生短片段的RNA；广谱非线性性核酸酶（Broad-Spectrum Endonuclease）是一种切割DNA和RNA的非特异性内切酶，在不同的pH值和温度条件下都具有较强的酶解能力；RNaseA是一种酶解RNA的特异性核酸酶，用于去除DNA样品中的RNA残余；RNase R是一种3’-5’外切核酸酶，酶解RNA，用于出去线性RNA，保留环状RNA或非编码RNA。
所述酶解缓冲液包括下列中的一种或几种：pH缓冲液、钙盐、镁盐、酶稳定剂；
pH缓冲液是一种可以维持溶液pH值稳定的溶液，用于在特定pH条件下进行酶解反应或其他生化实验，通过调整缓冲液中的酸碱配比来维持溶液的酸碱度，使酶能够在特定的酸碱环境中保持最佳的活性，常用的缓冲液有Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液；钙盐和镁盐是常用的离子盐，可以作为酶催化反应的辅助因子，促进酶的活性，在一些酶解反应中，钙盐和镁盐的存在可以增强酶的稳定性和催化效率；酶稳定剂是一种能够增强酶的稳定性和抗蛋白质降解的化合物，用于保护酶在酶解反应中的活性，常用的酶稳定剂有牛血清蛋白、葡萄糖、甘油等。
在一个实施例中，酶解缓冲液的成分见表1。
表1.裂解缓冲液成分
所述酶消终止缓冲液包括下列中的一种或几种：EGTA、EDTA、蛋白酶K、GuSCN。
EGTA（Ethylene Glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraaceticacid）是一种螯合剂，通常用于在生物化学和细胞生物学实验中螯合钙离子；EDTA（Ethylenediaminetetraacetic acid）也是一种螯合剂，广泛用于生物化学、分子生物学和医学实验中与金属离子（如钙、镁、铁等）形成稳定的络合物，从而防止它们对实验产生干扰；蛋白酶K是一种蛋白水解酶，具有高度特异性，可以用于蛋白质的裂解和鉴定；GuSCN（Guandinium thiocyanate）是一种化学试剂，常用于核酸提取和分析，用来分离RNA和DNA。
在一个实施例中，酶消终止缓冲液的成分见表2。
表2.酶消终止缓冲液成分
样本在经过酶消终止缓冲液处理后，再加入RNA末端修复缓冲液，一种在分子生物学中用于修复RNA分子末端的溶液。在RNA分子的制备和分析过程中，由于一些实验步骤可能导致RNA末端的破损或不完整，需要使用RNA末端修复缓冲液来修复这些损伤。
在一个实施例中，RNA末端修复缓冲液的成分见表3。
表3. RNA末端修复缓冲液成分
S14：使用逆转录试剂将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
在一个实施例中，所述逆转录试剂组件包括：3’端连接反应液、逆转录引物缓冲液、5’端连接反应液、逆转录反应液、PCR反应液。
3’端连接反应液是在分子生物学中用于将适配器或引物连接到DNA或RNA分子的试剂，其对于后续的测序、扩增等分子操作具有重要作用；逆转录引物缓冲液是用于逆转录反应的一种溶液，逆转录是将RNA逆转录为DNA的过程，逆转录引物用于启动这个过程；5’端连接反应液类似于3’端连接反应液，但是它用于连接适配器或引物到DNA或RNA分子的5’端；逆转录反应液包含了逆转录酶、核苷酸和缓冲液等成分，用于将RNA模板转录成相应的DNA，为后续的PCR扩增等步骤提供材料；PCR反应液是聚合酶链反应（PCR）所需的溶液，其中包括DNA模板、引物、聚合酶、核苷酸和缓冲液，PCR是一种在分子生物学中用于扩增DNA片段的技术。
所述3’端连接反应液中含有预腺苷化3’端接头，所述预腺苷化3’端接头序列为：5rApp/AGAUCGGAAGAGCGUCGUG/3SpC3；
在一个实施例中，3’端连接反应液的成分见表4。
表4. 3’端连接反应液成分
所述逆转录引物缓冲液中含有逆转录引物，所述引物序列为：ACACGACGCTCTTCCGA；
在一个实施例中，逆转录引物缓冲液的成分见表5。
表5. 逆转录引物缓冲液成分
所述5’端连接反应液中含有5’端接头，所述5’端接头序列为：/5Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG/3SpC3。
在一个实施例中，5’端连接反应液成分见表6。
表6. 5’端连接反应液成分
在一个实施例中，逆转录反应液的成分见表7。
表7.逆转录反应液成分
在一个实施例中，PCR反应液的成分见表8。
表8.PCR反应液成分
S15：使用文库DNA纯化产品包括电泳试剂、碎胶装置、过滤纯化产品，将所述电泳试剂配制成凝胶用于逆转录生成的DNA进行电泳，将凝胶中的目标区域割胶后置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA；
在一个实施例中，所述碎胶装置包括压胶装置、第一离心管和第二离心管，所述压胶装置为带橡胶的注射器内杆，所述第一离心管管底用有直径0.5~1mm的小孔，所述第二离心管位于第一离心管外围，压胶装置在第一离心管内挤压凝胶，凝胶通过小孔流入第二离心管，得到碎胶。
在一个实施例中，所述文库DNA纯化组件还包括cDNA纯化产品，所述cDNA纯化产品对逆转录的DNA进行纯化得到纯化后的DNA。
在一个实施例中，所述过滤纯化产品包括凝胶过滤产品、含玻璃纤维滤膜的过滤柱。
S16：将得到的文库DNA送给测序公司测序。
图2是本发明实施例提供的微量翻译组建库方法的流程图，所述微量翻译组建库方法包括：
S21：获取样本细胞，通过细胞裂解，提取样本细胞的RNC，所述样本细胞数量为100-500个；
S22：对所述RNC在核酸酶及酶解缓冲液中进行酶解处理得到RPF-RNA；
S23：采用逆转录试剂将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
S24：将逆转录生成的DNA进行凝胶电泳，选取凝胶中的目标区域割胶，置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA。
在一个实施例中，微量翻译组建库方法的实验步骤包括，实验操作步骤的流程图见图3、图4和图5：
步骤1：获取细胞100~500个细胞为优，将细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中或组织来源细胞适宜的已知培养液，并加入放线菌素D（CHX）至100ug/ML~200ug/ML终浓度，并置于37摄氏度孵育处理5min~15min。
步骤2：300g~500g 离心细胞3~5min，使用PBS清洗细胞一遍。
步骤3：300g~500g 离心细胞3~5min，小心去除PBS，向管底加入10~20ul裂解缓冲液，重悬细胞，并置于冰上孵育20~30min。
步骤4：取3份2~5ul裂解液置于低吸附的PCR小管中，-80保存用于微量转录组分析备用，取1ul 细胞裂解液用于翻译组建库。
步骤5：取低吸附PCR小管，向管中加入5~10ul 矿物质油，瞬时离心。
步骤6：向步骤5中含矿物质油PCR管中加入0.5~1ul细胞裂解液，瞬时离心，在管底可见油水分离的小圆滴，余下裂解液-80保存用于备用及重复。
步骤7：向步骤6中加入新鲜配制的1ul含微球核酸酶裂解液，瞬时离心，置于PCR仪器中37℃ 消化RNA 30min。
步骤8：向步骤7中加入新鲜配制的0.5~1ul终止反应液，瞬时离心，置于PCR仪器中37℃ 30~40min以及55℃ 5~10min，hold 4℃终止核酸酶消化。
步骤9：向步骤8中加新鲜配制的RNA末端修复缓冲液0.5~1ul，瞬时离心，置于PCR仪器中在37℃ 反应1h, 反应结束后置于冰上。
步骤10：向步骤9中加入4~6ul新鲜配制的3’端连接反应液，瞬时离心，放置4℃冰箱过夜孵育，约16h。
步骤11：向步骤10中加入0.5~1ul新鲜配制的逆转录引物缓冲液，瞬时离心，置于PCR仪器中在65℃ 反应1min, 37℃ 2min，25℃ 2min，反应结束后置于冰上。
步骤12：向步骤11中加入3~4ul新鲜配制的5’端连接反应液，瞬时离心，置于PCR仪器中在37℃ 反应2h, 反应结束后置于冰上。
步骤13：向步骤12中加入15~18ul 逆转录反应液，瞬时离心，置于PCR仪器中在50℃ 反应1h，随后在70℃终止反应15min, 反应结束后置于冰上。
步骤14：向步骤13中加入60~70 µl PCR反应液，瞬时离心，置于PCR仪器中按如下程序进行PCR扩增反应：①98℃反应30s；②98 °C 反应15 s, 65 °C 反应30 s, 72 °C 反应30 s，进行10个②循环反应；③72℃反应5min；反应结束后置于冰上，也可−20 °C保存。
步骤15：将PCR小管置于1.5ml 离心管中，在4度离心机中以2000g 速度离心2min，离心结束后收集PCR管中下层水相。
步骤16：使用ZYMO DNA Clean & Concentrator-5 column (DNA-5) #D4014试剂盒纯化文库DNA。步骤按试剂盒说明书进行，具体步骤为：①将15中水相转移至1.5ml 低吸附离心管中，加入5倍水相体积的DNA结合缓冲液，涡旋混匀10~20s。②将步骤16-①中结合缓冲液加入吸附管中，10000g 离心30s。③去除离心液，向步骤16-②吸附管中加入500ul洗涤缓冲液，10000g 离心30s；随后再使用200ul洗涤缓冲液洗涤1次，10000g 离心30s。④将步骤16-③中吸附管转移至新的低吸附离心管中，加入6ul 无核酸酶水，室温孵育2~5min，10000g 离心30s-60s，随后使用6~8ul无核酸酶水重复洗脱一次，合并两次洗脱液。
步骤17：使用8% TBE胶分离文库DNA。具体步骤为：①配制8% TBE胶，（预制胶有效期短，昂贵）②160V 预电泳10min；取16中样本10ul，加入5ul 6x loading混匀；按loadingmarker loading sample loading marker loading顺序进行上样，以160V电压进行电泳60min，蓝色条带未200bp左右，根据条带位置停滞电泳。③使用向1X TBE buffer中加入2ulSYBR gold 核酸染料，混匀后转移至10cm细胞培养皿中；并将电泳完的胶块置于其中，避光孵育10min。④在agarose 显影仪上垫上一次性PE手套，将染色后的凝胶置于显影仪中显影，根据marker条带在紫外灯下切胶 RPF 范围：170-185bp。
步骤18：准备500ul离心管，并在离心管底提前用注射器针头开孔，将步骤17中切下的胶置于500ul离心管中，并将500ul离心管置于1.5ml离心管中，使用1ml注射器推杆将胶块从500lul离心管底挤压进1.5ml离心管中。
步骤19：向步骤18中1.5ml离心管的胶中加入300ul无核酸酶水，置于37℃的震荡孵育仪中以1300rpm速度孵育过夜。
步骤20：将步骤19中溶胶液转移至含有滤膜的离心柱中，该含有滤膜的离心柱的结构见图5，在室温下以13200rpm离心2min，收集滤液，向离心柱的胶中再次加入200ul 无核酸酶水，再次离心收集滤液，合并两次滤液转移至新的低吸附离心管中。
步骤21：将步骤20中滤液转移至500ul体积的10 KDa的超滤管中，以13500g室温离心5min浓缩文库DNA，使用移液枪轻轻吹吸超滤管中剩余液体，随后将超滤管倒置于新的离心管中，以2000g室温离心2min收集滤液，最终体积约70ul~80ul。
步骤22：使用ZYMO DNA Clean & Concentrator-5 column试剂盒将21中滤液进行纯化回收，步骤同16，唯一区别是最后使用8ul无核酸酶水进行两次洗脱文库DNA，合并文库DNA，约15ul。保存于-80℃。
步骤23：将步骤22中文库送测序公司进行双端测序，测序数据量为30G。
步骤24：对步骤23中测序的数据进行分析。
在上述实验步骤中，实验耗材的优选方案为：
大号离心管(1.5ml-蛋白质低吸附管；优选epprnforf 目录编号 0030108116)；中号离心管(0.5ml-蛋白质低吸附管；优选epprnforf 目录编号 0030108094)；低吸附PCR管（核酸低吸附PCR管-200ul，优选Axygen PCR-02-L-C）；DNA纯化吸附柱（优选zymo货号D4014）、碎胶装置（1ml胰岛素注射器内杆，中号离心管（管底用注射器针头开孔，开孔直径0.5~1mm），大号离心管）、凝胶过滤柱（大号离心管，内管包含0.45μm孔径醋酸纤维膜，灭菌；优选康宁 货号8162）、玻璃纤维滤膜（内径10mm，优选GE 1823-010）、10K超滤管（优选密理博 Amicon UFC5010BK）、文库胶TBE胶）。
在上述实验步骤中，实验试剂的优选方案为：
放线菌素D: Cell Signaling Technology #2112、矿物质油：sigma、RNaseINPlus：Promega、微球核酸酶：New England Biolabs、Thermolabile Proteinase K：NewEngland Biolabs、EGTA：Sigma-Aldrich、EDTA：Ambion、guanidium thiocyanate（GuSCN）：Sigma-Aldrich、T4 Polynucleotide Kinase ：New England Biolabs、T4 RNA Ligase 2Truncated KQ：New England Biolabs、Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix ：New England Biolabs、SuperScript III：invitrogen、T4 RNA Ligase 1：New EnglandBiolabs。
TBE胶配方10ml体系为8.0%的丙烯酰胺，其由2.666ml 30%的丙烯酰胺、1ml 10×TBE、6.334ml ddH2O、5ul TEMED和50ul 10%的过硫酸铵配制而成。
上述实验步骤所涉及的试剂中，丙烯酰胺30%为29：1（质量比，丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺）（优选sigma#A3574）；TEMED 可以加到1ul/ml（优选sigma#T9281）；10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,1g;超纯水,9ml.溶解后，-20℃保存（优选sigma#AA3678）；所有试剂原始包装分装保存，遵循RNase free原则，10X TBE 优选invitrogen#AM9863。
上述实验步骤中所使用的PCR引物包括以下任意一对或几对：
第1对：
PCR-R1#（SEQ ID NO:1） AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR-F1#（SEQ ID NO:2） CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
第2对：
PCR-R2#（SEQ ID NO:3） AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR-F2#（SEQ ID NO:4） CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
第3对：
PCR-R3#（SEQ ID NO:5） AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCTCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR-F3#（SEQ ID NO:6） CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
第4对：
PCR-R4#（SEQ ID NO:7） AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR-F4#（SEQ ID NO:8） CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCATGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
第5对：
PCR-R5#（SEQ ID NO:9） AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR-F5#（SEQ ID NO:10） CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCTCAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
在一个实施例中，通过上述实验操作选择不同细胞量（个）进行建库，所述细胞仍选择出生四天小鼠睾丸组织中的精原干细胞，细胞量选择100、1000、3000与5000四种不同细胞量，电泳结果见图6，可以发现在选择100个细胞时，即可得到目的DNA片段，当细胞数大于等于1000个时，拖带明显，背景噪音大，因此，基于实验数据，本产品及方法最优的细胞量范围为100~500。
在一个实施例中，选择不同浓度的RNA酶I与微球核酸酶对同样细胞量的样本进行建库，在通过上述实验操作，在PCR扩增8个循环后，电泳结果见图7，发现在相同浓度下，微球核酸酶的扩增效果更好。进一步，将常规翻译组建库测序后的RPF reads数与微量翻译组建库测序后的RPF reads进行比较，目标reads数目的差异见图8，显而易见，微量翻译组建库的目标RPF reads是远高于常规翻译组建库的。图9是使用本产品方法进行翻译组测序的数据质控的结果，图9中的A是测序去除接头后比对到基因组上的reads长度分布情况，理论上RPF保护的片段是24~35nt，主峰在30nt左右，上述结果与理论一致，Y轴是片段数量，X轴是RPF保护的RNA片段长度；图9中的B是比对到基因组的reads在基因组的主要位置分布，核糖体理论上结合的是mRNA的CDS（蛋白编码）区，翻译组测序得到的reads的分布特征主要是在CDS区最多，3’-UTR最少，表示质控好；图9中的C和D为P-site分析结果示意图，P-site分析，三碱基周期特征，两种展示分别显示不同片段长度分布的3nt特征以及片段与起始密码子距离的3nt特征。翻译过程中，核糖体相对于RNA以密码子长度（3 nt）为单位移动。因此，以 P 位点为基准，来源于正常翻译过程的 RPF 片段应该在 RNA 上呈现 3 碱基的周期性分布。这是判断一个 RNA 是否被翻译的直接证据。理论上核糖体移动以3个碱基为一个密码子周期性移动，在数据上表现为高低低的分布。
以上对本发明所提供的一种微量翻译组建库产品及其方法进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种微量翻译组建库产品，其特征在于，所述产品包括细胞裂解组件、核酸酶及酶解缓冲液组件、逆转录试剂组件、文库DNA纯化组件；
所述细胞裂解组件用于裂解样本细胞，提取样本细胞的RNC；
所述核酸酶及酶解缓冲液组件用于对所述RNC进行酶解处理，得到RPF-RNA；
所述逆转录试剂用于将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
所述文库DNA纯化组件包括电泳试剂、碎胶装置、过滤纯化产品，将所述电泳试剂配制成凝胶用于逆转录生成的DNA进行电泳，将凝胶中的目标区域割胶后置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA。
2.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述碎胶装置包括压胶装置、第一离心管和第二离心管，所述压胶装置为带橡胶的注射器内杆，所述第一离心管管底用有直径0.5~1mm的小孔，所述第二离心管位于第一离心管外围，压胶装置在第一离心管内挤压凝胶，凝胶通过小孔流入第二离心管，得到碎胶。
3.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述产品还包括蛋白质合成抑制剂，所述蛋白质合成抑制剂用于加入获取的样本细胞中得到翻译抑制的细胞，翻译抑制的细胞再进行细胞裂解，所述蛋白质合成抑制剂选自下列中的一种或多种：氯霉素、卡那霉素、新霉素、放线菌酮、四环素、土霉素、嘌呤霉素、白喉霉素。
4.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述细胞裂解组件采用下列方法中的一种或几种的组合裂解细胞：化学法、酶解法、物理法。
5.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述核酸酶及酶解缓冲液组件包括核酸酶、酶解缓冲液、酶消终止缓冲液；
所述核酸酶包括下列中的一种或几种：微球核酸酶、RNA酶I、广谱非限制性核酸酶、RNase A、RNase R；
所述酶解缓冲液包括下列中的一种或几种：pH缓冲液、钙盐、镁盐、酶稳定剂；
所酶消终止缓冲液包括下列中的一种或几种：EGTA、EDTA、蛋白酶K、GuSCN。
6.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述逆转录试剂组件包括：3’端连接反应液、逆转录引物缓冲液、5’端连接反应液、逆转录反应液、PCR反应液。
7.根据权利要求6所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述逆转录引物缓冲液中含有逆转录引物，所述逆转录引物的序列为：ACACGACGCTCTTCCGA；
所述3’端连接反应液中含有预腺苷化3’端接头，所述预腺苷化3’端接头的序列为：5rApp/AGAUCGGAAGAGCGUCGUG/3SpC3；
所述5’端连接反应液中含有5’端接头，所述5’端接头的序列为：/5Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG/3SpC3。
8.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述文库DNA纯化组件还包括cDNA纯化产品，所述cDNA纯化产品对逆转录的DNA进行纯化得到纯化后的DNA。
9.根据权利要求1所述的微量翻译组建库产品，其特征在于，所述过滤纯化产品包括凝胶过滤产品、含玻璃纤维滤膜的过滤柱。
10.一种微量翻译组建库方法，其特征在于，所述方法包括：
获取样本细胞，通过细胞裂解，提取样本细胞的RNC，所述样本细胞的数量为100-500个；
对所述RNC在核酸酶及酶解缓冲液中进行酶解处理得到RPF-RNA；
采用逆转录试剂将RPF-RNA片段逆转录成相应的DNA；
将逆转录生成的DNA进行凝胶电泳，选取凝胶中的目标区域割胶，置入碎胶装置内碎胶，将碎胶中加入无核酸酶水得到的溶胶液通过过滤纯化产品进行纯化，得到文库DNA。
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