JP7007197B2 - サイズによってdnaを分離する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、DNA分子のサイズ選択的単離の方法を提供する。本発明の方法は、シークエンシングライブラリーを調製するために、所望の最小長を有する標的DNA分子を単離するのに特に有用である。さらに、DNA分子のサイズ選択的単離に使用することができるキットが提供される。
核酸を単離するための種々の方法が先行技術において周知である。そのような方法は、目的の核酸を、他の試料構成成分、例えば、タンパク質夾雑物、または潜在的に、非標的核酸と称されることも多い他の核酸などから分離することを伴う。例えば、種々の試料材料から、DNAなどの核酸を、それらをカオトロピック塩の存在下でシリカ材料に結合させることによって単離するための方法が先行技術において周知であり、確立されている。前記原理に基づく典型的な方法は、例えば、EP0389063、WO03/057910、EP0757106、US6,037,465およびWO2006/084753に記載されている。
異なるサイズのDNA分子を含むDNA含有試料から標的サイズまたは標的サイズ範囲のDNAを単離するための方法を提供することは、本発明の目的である。特に、固体支持体材料の表面修飾に依存せずに、標的サイズまたは標的サイズ範囲の標的DNA分子を十分な収率で単離することを可能にするポリ(アルキレンオキシド)ポリマーに基づくサイズ選択的DNA単離方法を提供することが本発明の目的である。
(a)DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合したDNA分子を固相から溶出させるステップ
を含む方法が提供される。
(a)少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、8~10の範囲内に入るpH値を有する、結合用緩衝液、
(b)無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
(c)任意選択で、少なくとも1種の洗浄用溶液、および
(d)任意選択で、少なくとも1種の溶出用溶液
を含むキットが提供される。
本発明は、異なるサイズのDNA分子を含むDNA含有試料から標的DNA分子をサイズによって単離するための、ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーに基づくサイズ選択的方法を提供する。先行技術の方法とは対照的に、本発明の方法では、沈殿した標的DNA分子を結合させるために、無修飾のケイ素含有表面を有する固相を使用する。先行技術の方法と組み合わせると、DNA回収率が非常に低い(実施例を参照されたい)ので、無修飾固相の使用は実行可能ではなかった。本発明では、とりわけ、二価カチオンが結合用混合物中に存在し、結合用混合物のpHが8~10の範囲内に入るので、この問題が克服される。実施例により実証される通り、この特徴の組合せにより、沈殿および/または結合効率が増強され、その結果、特定のカットオフ値を上回るサイズを有する沈殿DNA分子が高収率で回収される。理論に束縛されることを望むものではないが、DNA回収に対するこの有利な効果についての可能性のある説明は、結合/沈殿プロセス中にアルカリ性pH値を使用すると、DNAの骨格がより負に荷電するというものである。無修飾ケイ素含有表面を有する固相の表面のより大きな画分もこれらの条件下ではより負に荷電するので、結合用混合物中の二価イオンが、このより負に荷電した表面と負に荷電したDNAの間の橋として機能し得、それにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子の回収が潜在的に増大する。
方法
(a)DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合したDNA分子を固相から溶出させるステップ
を含む方法が提供される。
1.所望の特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子(所望のDNA分子は、本明細書では「標的」DNA分子とも称される)を、ステップ(a)において前記標的DNA分子を固相に結合させることによって単離する。結合した標的DNA分子を分離し(ステップ(b))、任意選択で、洗浄し、溶出させる。この実施形態では、「片側だけ」、すなわち、カットオフ値によって決定される特定の最小サイズを有する標的DNA分子について、サイズ選択を実施することができる。しかし、標的DNA分子の最大サイズ(上限カットオフ値によって決定される)は規定されない。この実施形態は、例えば、所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子を、例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー、より短いDNA断片などの、望ましくない夾雑物を表す、より小さなDNA分子から単離、したがって、分離するために適している。
2.DNA含有試料から、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を取り出す。これらのより長いDNA分子を、ステップ(a)において固相に結合させ、ステップ(b)において分離し、したがって、残りの試料から取り出す。それにより、試料から、カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を効率的に枯渇させる。次いで、例えば、残りの試料中になお存在する核酸または他の構成成分を単離するために、残りの試料をさらに処理することができる。残りの試料を分析方法において直接使用することもできる。固相に結合した、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子は、目的のものでない場合には廃棄することもでき、例えば、場合によってそれらを洗浄し、溶出させることによってさらに処理することもできる。
3.特定のサイズ範囲のDNA分子を含む1つまたは複数の画分を得るために、DNA含有試料のサイズ分画を実施する。これは、本発明の教示に従ってサイズ選択を2ラウンドまたはそれ超実施することによって実現することができる。例えば、方法は、各ラウンドにおける結合用混合物中のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度を上昇させながら、ステップ(a)および(b)を繰り返すことを含んでよい。それにより、各ラウンドにおいてカットオフ値を低下させる。例えば、第1のラウンドにおいて、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を固相に結合させ、試料から分離する。第2のラウンドにおいて、ポリ(オキシアルキレンオキシド)ポリマーの濃度を上昇させ、それにより、第2のラウンドにおけるカットオフ値を低下させる。この第2のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が固相に結合し、残りの試料から分離される。第2のラウンドにおいて結合したDNA分子は、上限カットオフ値(第1のカットオフ値によって決定される)および下限カットオフ値(第2のカットオフ値によって決定される)に対してサイズ選択されたものであり、したがって、規定のサイズ範囲内のサイズを有する。各ラウンドにおいて固相に結合し、したがって、回収されたDNA分子は、廃棄するか、または、例えば、任意選択の洗浄ステップ後に溶出させることができる。このサイズ分画を、同じ原理を使用して3ラウンドまたはそれ超実施することもできる。これにより、シリカまたはガラス表面などの無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用して、DNA含有試料をサイズ分画すること、および長さが異なるDNA分子を異なる溶出液画分としてもたらすことが可能になる。
(a)DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記第1の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、標的DNA分子を含む残りの試料から分離するステップ、
(c)残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、第2の結合用混合物中のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度が第1の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)結合した標的DNA分子を残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を固相から溶出させるステップ
を含む。
i)二価カチオンとしてMg2+を、好ましくはMgCl2の形態で含む、
ii)ポリエチレングリコールを、好ましくは7%~45%、10%~40%、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含む、
iii)アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを、0.5M~2.75M、好ましくは、0.75M~2.5Mの範囲内に入る濃度で含む、
iv)少なくとも1種の緩衝剤を、100~550mMの範囲内に入る濃度で含む、
v)8.5~9.5の範囲内に入るpHを有する。
i)DNA含有試料は、抽出されたDNA、または、例えばせん断によってもしくは酵素反応によってさらに処理された抽出されたDNAの試料である、
ii)DNA含有試料は、酵素反応、好ましくは増幅反応またはリガーゼ反応、特にアダプターライゲーション反応後に得られたものである、
iii)DNA含有試料は、断片化されたDNA、例えば、せん断されたDNAを含む、
iv)DNA含有試料は、直鎖状、平滑末端の、異なるサイズのDNA断片を含む、
v)DNA含有試料は、増幅産物、好ましくは、PCR産物を含む、
vi)DNA含有試料は、アダプターライゲーションステップの結果として得られたアダプターライゲーション試料である、ならびに/または
vii)DNA含有試料は、(i)5’および/または3’にアダプターが隣接する二本鎖DNA分子、(ii)アダプター単量体および(iii)例えばアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物を含むアダプターライゲーション試料である。
(a)DNA含有試料、7.5%~15%、好ましくは、8%~13%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および7mM~40mM、好ましくは8mM~30mM、より好ましくは、8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl2を含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合したDNA分子を固相から溶出させるステップ
の通り実施される。
(a)DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記第1の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、標的DNA分子を含む残りの試料から分離するステップ、
(c)残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、第2の結合用混合物中のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度が第1の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)結合した標的DNA分子を残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を固相から溶出させるステップ
を含む。
(a)DNA含有試料、8.5%~9.5%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および、7mM~40mM、好ましくは8mM~30mM、より好ましくは、8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl2を含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、
使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、標的DNA分子を含む残りの試料から分離するステップ、
(c)残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、第2の結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度が第1の結合用混合物と比較して上昇しており、10%~12%の範囲内に入り、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)結合した標的DNA分子を残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合した標的DNA分子を固相から溶出させるステップ
の通り実施される。
(a)アダプターライゲーション試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8~10、好ましくは、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有し、沈殿したアダプターがライゲートしたDNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、アダプターがライゲートしたDNA分子が結合した固相が生じ、使用された結合条件下で、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を固相から溶出させるステップ
を含み得る。
(a)増幅された試料を、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触させることであって、前記結合用緩衝液が、結合用混合物をもたらすために8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿した標的カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合すること、
(b)結合した標的DNAを残りの試料から分離すること、
- 任意選択で、結合した標的DNAを洗浄すること、ならびに
- 任意選択で、結合した標的DNAを固相から溶出させること
を含む、サイズ選択ステップを実施する。
A)DNAを断片化するステップであって、任意選択でDNA断片を末端修復して、異なるサイズの平滑末端DNA断片を含む試料をもたらすステップ、
B)任意選択で、特定のカットオフ値を上回る断片サイズを有する標的DNAを単離するステップを実施するステップであって、前記任意選択のサイズ選択ステップが、
(a)異なるサイズのDNA断片を含む試料を、8~10の範囲内に入るpHを有し、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触することであって、対応する結合用混合物をもたらし、沈殿した標的カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合すること、
(b)結合した標的DNAを残りの試料から分離すること、
- 結合した標的DNAを洗浄すること、および
- 結合した標的DNAを固相から溶出させること、
を含む、ステップ
C)アダプターライゲーションステップを実施するステップであって、5’および/または3’にアダプターが隣接する二本鎖DNA分子を含む試料をもたらすステップ、
D)アダプターがライゲートした二本鎖DNA分子を、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、アダプターがライゲートした二本鎖DNA分子のサイズがより大きいことに基づいて単離するステップ、したがって、分離するステップであって、前記サイズ選択ステップが、
(a)アダプターライゲーション試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製することであって、前記結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、前記結合用混合物から沈殿したアダプターがライゲートしたDNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、アダプターがライゲートしたDNA分子が結合した固相が生じ、使用された結合条件下で、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は固相に実質的に結合しないこと、
(b)結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を残りの試料から分離すること、
- 結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を洗浄すること、および
- 結合したアダプターがライゲートしたDNA分子を固相から溶出させること、
を含む、ステップ、
E)任意選択で、アダプターがライゲートしたDNA分子を増幅するステップ
を含む方法を提供する。
- 第1のサイズ選択的DNA単離サイクルAにおいて、結合用混合物においてカットオフ値Aを決定する結合条件Aをもたらし、得られる溶出液Aから、カットオフ値Aを上回るサイズを有する標的DNA分子を主に含む画分がもたらされる、
- 第1のサイズ選択的DNA単離サイクルAのステップ(b)において得られる、分離された残りの試料から、第2のサイズ選択的DNA単離サイクルBのためのDNA含有試料がもたらされ、結合用混合物においてカットオフ値Bを決定する結合条件Bをもたらし、カットオフ値Bは、カットオフ値Aよりも低く、得られる溶出液Bから、カットオフ値Bを上回るがカットオフ値Aは下回るサイズを有する標的DNA分子を主に含む画分がもたらされる。
キット
(a)少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、8~10の範囲内に入るpH値を有する、結合用緩衝液、
(b)無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
(c)任意選択で、少なくとも1種の洗浄用溶液、および
(d)任意選択で、少なくとも1種の溶出用溶液
を含むキットが提供される。
i)Mg2+を二価カチオン、好ましくはMgCl2として含む、
ii)ポリエチレングリコールを、好ましくは、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含む、
iii)アルカリ金属塩、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、より好ましくは、塩化ナトリウムを、0.5M~2.75M、好ましくは、0.75M~2.5Mの範囲内に入る濃度で含む、
iv)少なくとも1種の緩衝剤を、100~550mMの範囲内に入る濃度で含む、および
v)8.5~9.5または8.6~9.2の範囲内に入るpHを有する。
(実施例1)
(実施例2)
(実施例3)
(実施例4)
- 磁気シリカ粒子(MagAttract Gビーズ、QIAGEN)を洗浄緩衝液(ビーズ5μl+洗浄緩衝液10μl、ボルテックスすることにより混合したもの)中でプレインキュベートした。洗浄緩衝液は、PEGを含有しない以外は結合用緩衝液と同じ組成を有するものであった。磁気シリカ粒子を、磁石の力を借りて分離し、洗浄緩衝液を除去した。
- 洗浄した磁気シリカ粒子(5μl)を結合用緩衝液63μlおよびDNA含有試料(1μg)90μlと接触させた。それにより、およそ9%のPEGを含む第1の結合用混合物がもたらされる(1部分のDNA試料に対して0.7部分の結合用緩衝液)。磁気シリカ粒子は、結合用混合物中の構成成分の濃度の算出において考慮に入れない。第1の結合用混合物をボルテックスすることにより混合し、上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を磁気粒子に結合させるために、第1の結合用混合物を振とうしながら10分間インキュベートした。
- DNA分子が結合した磁気粒子を、試料を磁気ラック上に置くことによって磁気により分離した。それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するより大きなDNA分子が第1の結合用混合物から除去された。残りの試料をさらに処理した。
- 磁気シリカ粒子(上記の通り洗浄したもの)5μlを、別の体積の結合用緩衝液(25.5μl)および残りの試料140mlと接触させた。それにより、およそ11%のPEGを含む第2の結合用混合物がもたらされた。この場合でもまた、結合用混合物中の構成成分の濃度の算出において磁気シリカ粒子は考慮に入れない。第2の結合用混合物をボルテックスすることにより混合し、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子を磁気粒子に結合させるために、第2の結合用混合物を振とうしながら10分間インキュベートした。
- 標的DNA分子が結合した磁気粒子を、試料を磁気ラック上に置くことによって磁気により分離した。上清を取り出し、廃棄した。
- 標的DNA分子が結合した磁気シリカ粒子を80%エタノール500μlで洗浄し、RT、振とう下で5分間インキュベートし、磁気ラック上で1分間の磁気分離を行った。上清を取り出し、廃棄した。洗浄ステップを2回実施した。
- 洗浄した、標的DNA分子が結合した磁気シリカビーズを5分間風乾した。
- 第1の溶出ステップを、緩衝液TE(QIAGEN)17μlを添加し、RT、振とう下で5分間インキュベートすることによって実施した。懸濁液を分離のために磁気ラック上に置き、得られた溶出液15μlを取り出した。
- 第2の溶出ステップを、緩衝液EB(QIAGEN)50μlを使用し、RT、振とう下で5分間インキュベートして実施した。懸濁液を分離のために磁気ラック上に置き、得られた溶出液を取り出した。本実施例では、全ての結合したDNAの回収を確実にするために第2の溶出ステップを実施した。
(実施例5)
実験計画:
プロトコール詳細:
*結合用混合物中のサイズ選択用緩衝液の百分率
使用するサイズ選択用緩衝液:
1)CAPSO(N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸)
2)AMPD(2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール)
3)CHES(N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)
4)TAPS(N-[Tris(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸)
結果1-CAPSO/CHES(新しく調製したもの)を用いたサイズ選択用緩衝液:
結果2~4-CAPSO、AMPD、CHESまたはTAPSを用いたサイズ選択用緩衝液(6カ月間の保管):
結果2-CAPSOを用いたサイズ選択用緩衝液(6カ月間の保管):
結果3-AMPDを用いたサイズ選択用緩衝液(6カ月間の保管):
結果4-CHESを用いたサイズ選択用緩衝液(6カ月間の保管):
結果5-TAPSを用いたサイズ選択用緩衝液(6カ月間の保管):
結論:
- CAPSO、pH9.2
- AMPD、pH9.1
- CHES、pH9.2
- TAPS、pH9.3
を用いたサイズ選択用緩衝液バリアントにより、
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
DNA含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を単離するための、ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーに基づくサイズ選択的DNA単離方法であって、
(a)前記DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む方法。
(項目2)
DNA含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的DNA分子を単離するためであって、
(a)前記DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、および少なくとも1種の二価カチオンを含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記第1の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、前記標的DNA分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
(c)前記残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8~10の範囲内に入るpHを有し、前記第2の結合用混合物中の前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度が前記第1の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)前記結合した標的DNA分子を前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(a)において、結合用緩衝液を前記DNA含有試料に添加して前記結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、前記少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、8~10の範囲内に入るpHを有する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
ステップ(c)において、結合用緩衝液を前記残りの試料に添加して前記第2の結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、前記少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、8~10の範囲内に入るpHを有し、任意選択で、ステップ(a)におけるものと同じ結合用緩衝液が使用される、項目2または3に記載の方法。
(項目5)
前記結合用混合物および/または前記結合用緩衝液が、少なくとも1種の塩をさらに含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
以下の特性:
a)前記塩が、非カオトロピック塩であること、
b)前記塩が、一価の塩であること、
c)前記塩が、アルカリ金属塩、好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物であること、
d)前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムおよび塩化セシウムから選択され、より好ましくは、前記塩が塩化ナトリウムであること、ならびに/または
e)前記塩が、前記結合用混合物中に、≧250mM、≧350mM、≧500mM、≧600mM、≧650mM、≧700mM、≧750mMおよび≧800mMから選択される濃度、ならびに/または、250mM~2M、350mM~1.75M、500mM~1.5M、600mM~1.3Mおよび650mM~1.25Mから選択される範囲の濃度で存在すること
の1つまたは複数を有する、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記二価カチオンが、以下の特性:
a)前記二価カチオンが、Mg 2+ 、Fe 2+ 、Ca 2+ 、Mn 2+ 、Zn 2+ およびNi 2+ から選択され、好ましくは、Mg 2+ であること、
b)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記塩が、任意選択で、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩、好ましくは、ハロゲン化物であること、
c)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、塩化マグネシウムである溶解塩の形態で存在すること、
d)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、好ましくは溶解塩の形態で、3mM~75mM、4mM~50mM、5mM~40mM、5.5mM~35mM、6mM~30mM、6.5mM~25mM、7mM~20mMおよび7.5mM~15mMから選択される範囲の濃度で存在すること、ならびに/または
e)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記結合用混合物が、アルカリ金属塩、好ましくは、塩化ナトリウムをさらに含有すること
の1つまたは複数を有する、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
以下の特性:
a)前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーが、ポリエチレングリコールであること、
b)前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーが、好ましくはポリエチレングリコールであり、2000~40000、2500~30000、3000~25000、3500~20000、4000~16000、4500~12000および5000~10000から選択される範囲の分子量を有すること、
c)前記カットオフ値が、前記結合用混合物中の前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度によって調整されること、ならびに/または
d)前記結合用混合物が、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールを少なくとも7.5%の濃度で含み、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマー濃度が6%~20%、7%~17%、7.5%~15%、8%~13%および8.5%~12.5%から選択される範囲内に入ることが好ましいこと
の1つまたは複数を有する、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記結合用混合物が、8.25~9.75、8.5~9.5または8.6~9.2から選択される範囲内に入るpH値を有し、ならびに/または、前記結合用混合物が、少なくとも1種の緩衝剤を、好ましくは25mM~600mM、50mM~500mM、60mM~450mM、70mM~400mM、80mM~350mM、90mM~300mMおよび100mM~275mMから選択される濃度で含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記結合条件が、前記DNA含有試料および/または残りの試料と接触させる前記結合用緩衝液によって排他的に確立される、項目3から9までまたは項目4から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記結合用緩衝液が、以下の特性:
a)8.25~9.75、8.5~9.5または8.6~9.2から選択される範囲内に入るpH値を有すること、
b)緩衝剤を、25mM~1M、50mM~750mM、75mM~700mM、100mM~650mM、125mM~600mM、150mM~550mM、175mM~525mMおよび200mM~500mMから選択される濃度で含むこと、
c)塩、好ましくはアルカリ金属塩を、0.5M~4M、0.7M~3.5M、1M~3M、1.2M~2.75Mおよび1.3M~2.5Mから選択される濃度で含むこと、
d)前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーが、好ましくはポリエチレングリコールであり、7%~45%、10%~40%、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含むこと、ならびに/または
e)以下の特徴:
i)Mg 2+ を二価カチオン、好ましくはMgCl 2 として含むこと、
ii)ポリエチレングリコールを、好ましくは、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含むこと、
iii)アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを、0.5M~2.75M、好ましくは、0.75M~2.5Mの範囲内に入る濃度で含むこと、
iv)前記少なくとも1種の緩衝剤を、100~550mMの範囲内に入る濃度で含むこと、
v)8.5~9.5または8.6~9.2の範囲内に入るpHを有することを有すること
の1つまたは複数を有する、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
(a)前記DNA含有試料、7.5%~15%、好ましくは、8%~13%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および7mM~40mM、好ましくは8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl 2 を含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)前記結合したDNA分子を、前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
(a)前記DNA含有試料、8.5%~9.5%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および、7mM~40mM、好ましくは8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl 2 を含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)前記結合したDNA分子を、前記標的DNA分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
(c)前記残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、前記第2の結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度が前記第1の結合用混合物と比較して上昇しており、10%~12%の範囲内に入り、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)前記結合した標的DNA分子を前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、項目2から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
アダプターがライゲートしたDNA分子を標的DNA分子としてアダプターライゲーション試料であるDNA含有試料から単離するため、およびアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去するための、項目1から13のいずれか一項に記載の方法であって、アダプターがライゲートしたDNA分子を、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、前記アダプターがライゲートしたDNA分子のサイズがより大きいことに基づいて分離する、方法。
(項目15)
所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子のDNA含有試料からのサイズ選択的単離のためのキットであって、
(a)少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、8~10の範囲内に入るpH値を有する、結合用緩衝液、
(b)無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
(c)任意選択で、少なくとも1種の洗浄用溶液、および
(d)任意選択で、少なくとも1種の溶出用溶液
を含むキット。
(項目16)
前記結合用緩衝液が、項目11に記載の特性のうちの1つまたは複数を有する、項目15に記載のキット。
Claims (15)
- DNA含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子を単離するための、ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーに基づくサイズ選択的DNA単離方法であって、
(a)前記DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであって、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)である、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種のアルカリ金属塩、および少なくとも1種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む方法。 - DNA含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的DNA分子を単離するためであって、
(a)前記DNA含有試料、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであって、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)である、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種のアルカリ金属塩、および少なくとも1種の二価カチオンを含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記第1の結合用混合物が、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)結合したDNA分子を、前記標的DNA分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
(c)前記残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有し、前記第2の結合用混合物中の前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度が前記第1の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)前記結合した標的DNA分子を前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む、請求項1に記載の方法。 - ステップ(a)において、結合用緩衝液を前記DNA含有試料に添加して前記結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであって、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーが前記PEGである、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種のアルカリ金属塩、前記少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有する、請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(c)において、結合用緩衝液を前記残りの試料に添加して前記第2の結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであって、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーが前記PEGである、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種のアルカリ金属塩、前記少なくとも1種の二価カチオンであって、前記二価カチオンがアルカリ土類金属である、二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、8.5~9.5の範囲内に入るpHを有し、任意選択で、ステップ(a)におけるものと同じ結合用緩衝液が使用される、請求項2または3に記載の方法。
- 以下の特性:
a)前記アルカリ金属塩が、アルカリ金属ハロゲン化物であること、
b)前記アルカリ金属塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムおよび塩化セシウムから選択され、より好ましくは、前記塩が塩化ナトリウムであること、ならびに/または
c)前記アルカリ金属塩が、前記結合用混合物中に、≧250mM、≧350mM、≧500mM、≧600mM、≧650mM、≧700mM、≧750mMおよび≧800mMから選択される濃度、ならびに/または、250mM~2M、350mM~1.75M、500mM~1.5M、600mM~1.3Mおよび650mM~1.25Mから選択される範囲の濃度で存在すること
の1つまたは複数を有する、請求項1から4に記載の方法。 - 前記二価カチオンが、以下の特性:
a)前記二価カチオンが、Mg2+およびCa2+から選択され、好ましくは、Mg2+であること、
b)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記塩が、任意選択で、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩、好ましくは、ハロゲン化物であること、
c)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、塩化マグネシウムである溶解塩の形態で存在すること、
d)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、好ましくは溶解塩の形態で、3mM~75mM、4mM~50mM、5mM~40mM、5.5mM~35mM、6mM~30mM、6.5mM~25mM、7mM~20mMおよび7.5mM~15mMから選択される範囲の濃度で存在すること、ならびに/または
e)前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記結合用混合物が、アルカリ金属塩、好ましくは、塩化ナトリウムをさらに含有すること
の1つまたは複数を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - 以下の特性:
a)前記ポリエチレングリコールが、2000~40000、2500~30000、3000~25000、3500~20000、4000~16000、4500~12000および5000~10000から選択される範囲の分子量を有すること、
b)前記カットオフ値が、前記結合用混合物中の前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーの濃度によって調整されること、ならびに/または
c)前記結合用混合物が、前記ポリエチレングリコールを少なくとも7.5%の濃度で含み、前記ポリエチレングリコール濃度が6%~20%、7%~17%、7.5%~15%、8%~13%および8.5%~12.5%から選択される範囲内に入ることが好ましいこと
の1つまたは複数を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記結合用混合物が、8.6~9.5または8.6~9.2から選択される範囲内に入るpH値を有し、ならびに/または、前記結合用混合物が、少なくとも1種の緩衝剤を、好ましくは25mM~600mM、50mM~500mM、60mM~450mM、70mM~400mM、80mM~350mM、90mM~300mMおよび100mM~275mMから選択される濃度で含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合条件が、前記DNA含有試料および/または残りの試料と接触させる前記結合用緩衝液によって排他的に確立される、請求項3から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合用緩衝液が、以下の特性:
a)8.5~9.5または8.6~9.2から選択される範囲内に入るpH値を有すること、
b)緩衝剤を、25mM~1M、50mM~750mM、75mM~700mM、100mM~650mM、125mM~600mM、150mM~550mM、175mM~525mMおよび200mM~500mMから選択される濃度で含むこと、
c)アルカリ金属塩を、0.5M~4M、0.7M~3.5M、1M~3M、1.2M~2.75Mおよび1.3M~2.5Mから選択される濃度で含むこと、
d)前記ポリエチレングリコールを、7%~45%、10%~40%、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含むこと、ならびに/または
e)以下の特徴:
i)Mg2+を二価カチオン、好ましくはMgCl2として含むこと、
ii)ポリエチレングリコールを、好ましくは、12.5%~35%、15%~30%、17.5%~27.5%および20%~25%から選択される濃度で含むこと、
iii)アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを、0.5M~2.75M、好ましくは、0.75M~2.5Mの範囲内に入る濃度で含むこと、
iv)前記少なくとも1種の緩衝剤を、100~550mMの範囲内に入る濃度で含むこと、
v)8.5~9.5または8.6~9.2の範囲内に入るpHを有することを有することの1つまたは複数を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記DNA含有試料、7.5%~15%、好ましくは、8%~13%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および7mM~40mM、好ましくは8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl2を含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)前記結合したDNA分子を、前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合したDNA分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記DNA含有試料、8.5%~9.5%の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および、7mM~40mM、好ましくは8mM~20mMの範囲内に入る濃度のMgCl2を含む第1の結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、8.5~9.25の範囲内に入るpHを有し、沈殿DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するDNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的DNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(b)前記結合したDNA分子を、前記標的DNA分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
(c)前記残りの試料を含む第2の結合用混合物を調製するステップであって、前記第2の結合用混合物が、8.6~9.25の範囲内に入るpHを有し、前記第2の結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度が前記第1の結合用混合物と比較して上昇しており、10%~12%の範囲内に入り、沈殿した標的DNA分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、標的DNA分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するDNA分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
(d)前記結合した標的DNA分子を前記残りの試料から分離するステップ、
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を洗浄するステップ、ならびに
- 任意選択で、前記結合した標的DNA分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、請求項2から11のいずれか一項に記載の方法。 - アダプターがライゲートしたDNA分子を標的DNA分子としてアダプターライゲーション試料であるDNA含有試料から単離するため、およびアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法であって、アダプターがライゲートしたDNA分子を、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、前記アダプターがライゲートしたDNA分子のサイズがより大きいことに基づいて分離する、方法。
- 所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的DNA分子のDNA含有試料からのサイズ選択的単離のためのキットであって、
(a)少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであって、前記ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)である、少なくとも1種のポリ(アルキレンオキシド)ポリマー、少なくとも1種のアルカリ金属塩、少なくとも1種の二価カチオンおよび少なくとも1種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、8.5~9.5の範囲内に入るpH値を有する、結合用緩衝液、
(b)無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
(c)任意選択で、少なくとも1種の洗浄用溶液、および
(d)任意選択で、少なくとも1種の溶出用溶液
を含むキット。 - 前記結合用緩衝液が、請求項10に記載の特性のうちの1つまたは複数を有する、請求項14に記載のキット。
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NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
DE4321904B4 (de) * | 1993-07-01 | 2013-05-16 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen |
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DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
DE69636553T2 (de) | 1995-07-07 | 2007-05-31 | Toyo Boseki K.K. | Nukleinsäuren bindender magnetischer Träger und Verfahren für die Nukleinsäureisolierung unter dessen Verwendung |
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AU6021798A (en) | 1997-01-21 | 1998-08-07 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Silica adsorbent on magnetic substrate |
WO1999058664A1 (en) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids |
DE19943374A1 (de) * | 1999-09-10 | 2001-03-29 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase |
US7183002B2 (en) | 2000-03-24 | 2007-02-27 | Qiagen, Gmbh | Porous ferro- or ferrimagnetic glass particles for isolating molecules |
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GB0522310D0 (en) * | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
CN102084001B (zh) * | 2008-03-28 | 2015-03-18 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于核酸测序的组合物和方法 |
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Chinese J. Analytical Chemistry, 2006年,Vol.34, No.7,p.923-926 |
Microbial & Comparative Genomics, 1998年,Vol.3, No.4,p.237-241 |
Nucleic Acids Research, 1975年,Vol.2, No.3,p.383-389 |
Nucleic Acids Research, 1991年,Vol.19, No.6,p.1346 |
Nucleic Acids Research, 2009年,Vol.37, No.18,e122 (p.1-9) |
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