ES2350291T3 - Método para aislar ácidos nucleicos que comprende el uso de multímeros de etilenglicol. - Google Patents

Abstract

Un método de aislar un ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de un multímero de etilenglicol que consiste en 2 a 20 monómeros de óxido de etileno por el cual el ácido nucleico soluble de dicha muestra se une a la superficie del soporte, y se separa de dicho soporte con ácido nucleico unido de la muestra.

Description

La presente invención se refiere al aislamiento del ácido nucleico, y en especial al aislamiento del ADN o ARN de las muestras.

El aislamiento del ADN o ARN es una etapa importante en muchos procedimientos bioquímicos y diagnósticos. Por ejemplo, en la separación de los 5 ácidos nucleicos de las muestras complejas en las que ellos se hallan a menudo, con frecuencia es necesario poder llevar a cabo antes otros estudios y procedimientos, por ejemplo, detección, clonación, secuenciación, amplificación, hibridación, síntesis de ADNc, estudio de la estructura y composición del ácido nucleico (por ejemplo, el patrón de metilación del ADN), etc.; la presencia de 10 grandes cantidades de material celular u otro contaminante, por ejemplo, proteínas o carbohidratos, en tales mezclas complejas a menudo impide muchas de las reacciones y técnicas usadas en biología molecular. Además, el ADN puede contaminar las preparaciones de ARN y viceversa. En consecuencia, se necesitan métodos para el aislamiento de los ácidos nucleicos de mezclas complejas tales 15 como células, tejidos, etc., no solo desde el punto de vista preparativo, sino también en los diversos métodos en uso actuales que se basan en la identificación del ADN o ARN por ejemplo, diagnóstico de infecciones microbianas, ciencia forense, tipificación de tejido y sangre, genotipificación, detección de variaciones genéticas, etc. La purificación del ADN o ARN de muestras más enriquecidas pero aún 20 contaminadas también es conveniente, por ejemplo, para purificar material nucleico preparado sintéticamente, por ejemplo, para purificar los productos de PCR de las sales contaminantes, cebadores en exceso y/o dNTP.

En particular en los campos de diagnóstico de ácido nucleico, estudios y genotipificación de la población, es importante obtener preparaciones de ácido 25 nucleico de alta calidad y puras para asegurar que las etapas posteriores de amplificación y/o detección se pueden llevar a cabo de modo confiable y preciso.

En las identificaciones del ARN es importante para un diagnóstico conclusivo tener la certeza de que la secuencia detectada deriva de una molécula de ARN y no de la contaminación del ADN genómico de la muestra. Por esta razón, 30 los métodos para la separación del ARN a partir del ADN son importantes. Asimismo, se requieren métodos de aislamiento de ARN rápidos ya que las moléculas de ARN usualmente son muy inestables y se degradan rápidamente con las ARnasas presentes en las células y fluidos corporales. La calidad del ARN es probablemente el factor más importante para determinar la calidad de los resultados 35 finales en los protocolos que utilizan ARNm, en especial para la síntesis de ADNc. Es importante evitar la contaminación del ADN de las preparaciones de ARN por numerosas razones. En primer lugar, el ADN aumenta la viscosidad lo que hace difícil la manipulación de la muestra y lleva a un escaso rendimiento de ARN y también a ARN de escasa calidad con la probabilidad de la contaminación del ADN. 5 Asimismo, la contaminación del ADN puede captar enzimas de ARNasa y hacer que aplicaciones posteriores tales como RT-PCR no tengan valor.

Una variedad de métodos son conocidos para el aislamiento de los ácidos nucleicos, pero en términos generales, estos se basan en una serie compleja de etapas de extracción y lavado y requieren tiempo y son laboriosos de realizar. 10 Además, a menudo está involucrado el uso de materiales tales como alcoholes y otros solventes orgánicos, caotropos y proteinasas, lo que es desventajoso ya que tales materiales tienden a interferir con muchas reacciones enzimáticas y otras aplicaciones de procesamiento posteriores.

En consecuencia, los métodos clásicos para el aislamiento de los ácidos 15 nucleicos de los materiales iniciales complejos tales como sangre o productos de sangre o tejidos involucra la lisis del material biológico por un detergente o caotropo, posiblemente en presencia de enzimas degradadoras de proteína, seguido por varias extracciones con solventes orgánicos por ejemplo, fenol y/o cloroformo, precipitación con etanol, centrifugaciones y diálisis de los ácidos 20 nucleicos. La purificación del ARN a partir del ADN puede involucrar una precipitación selectiva con LiCl o un aislamiento selectivo con tiocianato de guanidinio ácido combinado con extracciones con fenol y precipitación en etanol. No solo dichos métodos son engorrosos y laboriosos de realizar, sino que el número relativamente grande de etapas requeridas aumenta el riesgo de 25 degradación, pérdida de muestra o contaminación cruzada de las muestras donde varias muestras se procesan simultáneamente. En el caso del aislamiento del ARN, el riesgo de contaminación con ADN es relativamente alto.

En la purificación del ARN, comúnmente se desea aislar específicamente ARNm. La mayoría de las estrategias de purificación del ARNm involucran el 30 aislamiento del ARN total y el fraccionamiento del ARN aislado. La preparación de ARNm de alta calidad es una etapa importante en el análisis de la estructura del gen y la regulación del gen.

La mayor parte de los ARNm eucarióticos tienen una cola poli(A), normalmente de aproximadamente 50 a 300 nucleótidos de largo. Tal ARNm se 35 denomina como ARNm poliadenilado o poli(A)+. En la separación de este ARN poliadenilado a partir del ARN no adenilado que representa 95% o más de un ARN total de la célula, se aprovecha esta cola poli(A) y se realiza algún tipo de separación por afinidad dirigida a la cola poli(A). La tecnología convencional ha involucrado la purificación del ARN total como una primera etapa y la selección del 5 ARN de poli(A)+ por cromatografía de afinidad mediante el uso de oligo(dT)-celulosa como la segunda etapa. Esta estrategia, lleva tiempo y es relativamente laboriosa. Una estrategia alternativa para la purificación del ARNm es usar oligo(dT) ligado a los soportes sólidos tales como microplacas, látex, agarosa o perlas magnéticas. 10

Durante los últimos años se ha vuelto cada vez más popular emplear una estrategia asistida por perlas magnéticas para la selección de ARN poli(A)+ ya que se ha comprobado que tales perlas son favorables en las manipulaciones del ARNm. En muchos abordajes, el rendimiento y la calidad de los productos depende de qué rápido se pueda purificar el ARNm de las nucleasas y otros contaminantes. 15 Por el uso de la tecnología de separación de perlas magnéticas, se puede obtener ARN de poli(A)+ puro e intacto rápidamente a partir de las preparaciones de ARN totales o aun con mayor importancia, directamente de los lisados crudos de los tejidos sólidos, células o fluidos corporales. El procedimiento completo se puede llevar a cabo en un tubo de microcentrífuga sin extracciones en fenol o 20 precipitaciones con etanol.

Un abordaje común en la purificación del ADN, que se puede usar en conjunto con un abordaje en fase sólida es realizar la lisis del material biológico y la posterior hibridación a oligo dT en LiCl y buffer de LiDS/SDS, de este modo se evitan las etapas extra tales como extracción en fenol o digestión con proteinasa K. 25 El aislamiento del ARNm directo total lleva aproximadamente 15 minutos y debido a que el ARNm es estable durante más de 30 minutos en el buffer de lisis, esto garantiza la alta calidad del ARNm purificado. Sin embargo, una desventaja de este método es que el ARNm por unidad de peso del tejido es afectado por la cantidad de tejido usado y por encima de un umbral crítico de células lisadas, el rendimiento 30 del ARNm disminuye.

Otro abordaje común para la purificación de ARNm directa es, como se mencionó antes, usar isotiacianato de guanidinio (GTC) y sarcosilo. La mayoría de los investigadores prefiere un sistema de GTC-buffer debido a la capacidad de esta sal caotrópica de inhibir las ARNasas. Esto también se puede usar en combinación 35 con el abordaje de perlas magnéticas. Sin embargo, la viscosidad de los lisados celulares en 4 M de GTC es alta y las perlas no son atraídas efectivamente por el imán, lo que da como resultado un aumento del riesgo de la contaminación del ADN, tanto para las perlas como para otras fases sólidas, y menores rendimientos.

Más recientemente, se han propuesto otros métodos que se basan en el uso 5 de una fase sólida. El documento US-A-5.234.809, por ejemplo, describe un método donde los ácidos nucleicos se unen a una fase sólida en la forma de partículas de sílice, en presencia de un agente caotrópico tal como una sal de guanidinio, y de este modo se separan del resto de la muestra. El documento WO 91/12079 describe un método por el cual un ácido nucleico es atrapado en la superficie de 10 una fase sólida por precipitación. En términos generales, se usan alcoholes y sales como precipitantes.

Los documentos US 5.705.628 y US 5.898.071 describen métodos de aislar fragmentos de ácido nucleico mediante el uso de una combinación de polialquilenglicoles de peso molecular grande (por ejemplo, polietilenglicoles) a 15 concentraciones de 7 a 13% con sal en el intervalo de 0,5 a 5 M para obtener la unión a los grupos funcionales sobre un soporte sólido que actúa como un absorbente por bioafinidad para el ADN.

El documento US 570 7812 describe un PEG que tiene un peso molecular de 7.000 a 9.000 en un método de aislar ácidos nucleicos. Otros pesos moleculares 20 también están contemplados. Estos incluyen, por ejemplo, PEG-200, -500 y -1000.

Si bien tales métodos generalmente aceleran el proceso de separación del ácido nucleico, existen desventajas asociadas con el uso de alcoholes, caotropos, sales, moléculas de peso molecular alto y otros agentes similares.

Las moléculas de peso molecular alto aumentan la viscosidad del líquido lo 25 que reduce la eficiencia con la que se pueden realizar los protocolos de purificación. En el caso de la separación de las perlas magnéticas, tales moléculas grandes reducen la velocidad de aislamiento ya que ha aumentado el tiempo de contacto con el imán para separar las perlas. Además, la eliminación del sobrenadante de tales sistemas es más difícil en presencia de las moléculas de peso molecular alto. 30

Los caotropos se deben usar con alta molaridad lo que da origen a soluciones viscosas que pueden ser difíciles de trabajar, especialmente en el trabajo con ARN. Los procedimientos de amplificación tales como PCR, y otras reacciones basadas en enzimas, son muy sensibles a los efectos inhibidores o interferentes de otro modo de los alcoholes y otros agentes. Más aún, también se 35 sabe que el secado del pellet del ácido nucleico que es necesario luego de la precipitación con alcohol y los problemas en la disolución de los ácidos nucleicos, producen artefactos en los procedimientos basados en enzimas tales como PCR.

Debido a que tales procedimientos son en la actualidad un pilar de la biología molecular, se necesitan mejores métodos de aislamiento de ácido nucleico, 5 y en particular métodos que sean rápidos y sencillos de realizar, que permitan obtener buenos rendimientos sin pérdidas, y que evitan el uso de solventes y agentes caotrópicos o precipitación con alcohol o el uso de altos niveles de sal y/o compuestos de alto peso molecular con viscosidad alta. También se necesita un método que permita la diferenciación entre ARN y ADN y permita un aislamiento 10 separado de ambos tipos de ácido nucleico de la misma muestra. La presente invención intenta proporcionar tales métodos.

En particular, se ha hallado en la actualidad que el ácido nucleico se puede aislar de una muestra en una forma adecuada para la amplificación u otros procesos posteriores tales como secuenciación u otros análisis después de la 15 amplificación, por un procedimiento simple y fácil de realizar que involucra tratar la mezcla con detergente (si se requiere) y permitir que el ácido nucleico se una a un soporte sólido en presencia de niveles altos de una molécula que consiste en de 2 a 70 unidades de óxido de etileno (por ejemplo, tetraetilenglicol), después de lo cual el ácido nucleico se puede separar fácilmente de la muestra, por ejemplo, por la 20 eliminación del soporte. La unión al ácido nucleico es independiente de su secuencia.

En un aspecto, la presente invención proporciona de este modo un método de aislar el ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de una molécula que 25 consiste en de 2 a 20 unidades de óxido de etileno (preferentemente un oligoetilenglicol, especialmente preferible tetraetilenglicol (TETRA EG o TEG como se denomina en la presente memoria)), por el cual el ácido nucleico soluble en dicha muestra se une a la superficie del soporte, y se separa de dicho soporte con el ácido nucleico unido de la muestra. 30

Las moléculas para el uso de acuerdo con la invención son multímeros que consisten en de 2 a 70 unidades de óxido de etileno (es decir, -O-CH2-CH2), preferentemente en disposición lineal, es decir, con un peso molecular de aproximadamente de 100 a 3100. Tales moléculas se denominan en la presente memoria como multímeros de etilenglicol y tienen la fórmula general H-(CH2-CH2)n-35 OH, donde n es el número de unidades de óxido de etileno. Las moléculas preferidas tienen de 2 a 60, 50, 40, 30 o 20 monómeros. Las composiciones que contienen multímeros de etilenglicol, particularmente en el caso de los multímeros más grandes, por su verdadera naturaleza probablemente comprendan multímeros de longitud variada. El tamaño de los multímeros mencionados en la presente 5 memoria se refiere al número promedio de monómeros hallados en los multímeros de una composición. Una o más moléculas que tienen de 2 a 70 monómeros se pueden usar en una solución (es decir, se puede usar una mezcla de multímeros con una longitud promedio especificada junto con los multímeros con una segunda longitud promedio especificada). Las moléculas preferidas de acuerdo con la 10 invención son multímeros con 2 a 10 monómeros, denominados en la presente memoria como oligoetilenglicoles. Un oligoetilenglicol como se menciona en la presente memoria tiene 10 o menos (es decir, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2) unidades de óxido de etileno y un peso molecular de menos de 460. Con especial preferencia dicho etilenglicol tiene entre 2 y 6 (o entre 3 y 6) unidades de óxido de etileno, por 15 ejemplo, tetraetilenglicol.

El multímero de etilenglicol se usa en una concentración final de 10-90% en la mezcla final de la muestra y el soporte sólido. La concentración expresada para los multímeros de etilenglicol es p/v o v/v de acuerdo con si estas moléculas son sólidas o líquidas a temperatura ambiente. Para los oligoetilenglicoles, por ejemplo, 20 que son líquidos a temperatura ambiente, las concentraciones se expresan como v/v. Se usa preferentemente una concentración final mayor que 15, 20 o 30%, por ejemplo, 15-35, 20-40 o 30-75%, por ejemplo, 45-60%. El TEG como se menciona en la presente memoria tiene la fórmula HOCH2CH2(OCH2CH2)3OH y se puede obtener de Sigma-Aldrich Co., Fluka#86660 o 86662, o Aldrich #11,017-5. 25

TEG y otros oligoetilenglicoles usados de acuerdo con la invención se pueden generar por protocolos de síntesis apropiados. Por ejemplo, se pueden producir di, tri y tetraetilenglicoles y otros oligoetilenglicoles por la hidratación de óxido de etileno. Las moléculas más grandes se pueden generar por la polimerización del etilenglicol. 30

En un aspecto preferido la reacción de unión se realiza preferentemente en presencia de sal. La sal preferentemente está en niveles menores de 1 M (en su concentración final), por ejemplo, de 5, 10, 20 o 50 mM a menos de 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 M. Esto puede variar de acuerdo con la sal/catión particular que se usa. Por ejemplo se puede usar Mg2+ en el intervalo de 5-50 mM (concentración final, 35 preferentemente aproximadamente de 15 mM) y se puede usar Na+ en el intervalo de 0,5-1 M (concentración final). Otros iones que se pueden usar incluyen Ba2+, Ca2+, K+ y Li+, por ejemplo, como sales de cloruro.

Opcionalmente dicha muestra se puede poner en contacto con un detergente antes, simultáneamente o después del contacto de dicha muestra con el 5 multímero de etilenglicol. El uso de un detergente es particularmente deseable cuando muestras complejas y/o impuras se usan como material de partida. Con especial preferencia la muestra se pone en contacto con el multímero de etilenglicol, pero no se pone en contacto con uno o más de los siguientes (o ellos están presentes solo en niveles bajos): 10

- detergentes;

- caotropos; y

- alcoholes, tales como etanol.

Con especial preferencia, el multímero de etilenglicol se usa solo por ejemplo en una solución buffer simple (que opcionalmente también contiene sal 15 como se describió antes), por ejemplo, a 15-35%. Los detergentes, caotropos y/o alcoholes sin embargo pueden estar presentes en cantidades pequeñas o trazas. Cuando está presente, el detergente preferentemente está presente en un nivel como se describe de aquí en adelante en la presente memoria, por ejemplo, 0,2 a 30% (p/v). Sin embargo pueden estar presentes niveles bajos, por ejemplo, 20 menores de 1 o menores de 0,5 o 0,2% de detergente.

Preferentemente los caotropos están completamente ausentes.

Los niveles de alcohol preferentemente son menores de 30% (v/v), por ejemplo, menores de 20, 10, 5, 3, 2 o 1% (concentración final una vez que se añaden a la muestra y que incluye cualquier contribución hecha por el líquido 25 asociado con el soporte sólido una vez añadido). Cuando está presente, el alcohol puede estar presente, por ejemplo, a razón de 1 a 30%, por ejemplo, de 5 a 10 o 20%. Los niveles superiores de alcohol llevan a la captura de oligonucleótidos pequeños lo que es generalmente no deseable, particularmente en los métodos de la invención en los que las moléculas de ácido nucleico se separan de los 30 oligonucleótidos contaminantes por ejemplo, para permitir la separación de los productos amplificados de los cebadores.

En consecuencia la invención particularmente proporciona métodos que permiten la separación de las moléculas de ácido nucleico de más 100 pares de bases a partir de oligonucleótidos de longitudes más cortas, por ejemplo, menores 35 de 30 nucleótidos.

Con especial preferencia la presente invención proporciona un método de aislar un ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de 15-35% de un multímero de etilenglicol (preferentemente un oligoetilenglicol, con especial 5 preferencia tetraetilenglicol (TEG)), (y opcionalmente una concentración de sal menor de 1 M, por ejemplo, de 5 mM a 0,5 M (preferentemente 5-30 mM)) y una concentración de alcohol menor de 30% (preferentemente menor de 10%), por la cual el ácido nucleico soluble en dicha muestra se une a la superficie del soporte, y se separa de dicho soporte con el ácido nucleico unido de la muestra. 10

Preferentemente dicho método comprende adicionalmente la elución de dicho material de ácido nucleico del soporte sólido y opcionalmente la realización de procesos posteriores adicionales tales como secuenciación de dicho material eluido.

El ácido nucleico puede ser ADN, ARN o cualquier modificación natural o 15 sintética de este (por ejemplo, PNA), y sus combinaciones. Sin embargo, preferentemente el ácido nucleico será ADN, que puede ser genómico, o ADNc, y de cadena simple o doble o de cualquier otra forma, por ejemplo, lineal o circular. Con especial preferencia, dichas moléculas de ácido nucleico son productos de amplificación, por ejemplo, de PCR. En un aspecto preferido, se aíslan los 20 fragmentos de ADN no genómico, por ejemplo, que tienen un tamaño de 10 pares de bases a 250 kb, con especial preferencia se pueden aislar moléculas de 100 pb a 10 kb.

Los procedimientos de amplificación como se menciona en la presente memoria incluyen cualquiera de los procesos que aumentan los niveles de la 25 molécula de ácido nucleico o su secuencia complementaria por procesos in vitro e incluyen técnicas tales como LAR, 3SR y el sistema Q-beta-replicasa. Sin embargo, PCR y sus diversas modificaciones por ejemplo, el uso de cebadores anidados, generalmente será el método de elección (ver, por ejemplo, Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 para una revisión de las 30 tecnologías de amplificación del ácido nucleico).

Cuando se usa el método de la invención para aislar el ADN, se puede acoplar convenientemente con una etapa posterior para aislar el ARN de la misma muestra. El uso del método en tales separaciones de ARN de dos etapas se describirá con mayor detalle a continuación. 35

Las muestras pueden ser cualquier material que contiene ácido nucleico, que incluye por ejemplo alimentos y productos asociados, muestras clínicas y ambientales. La muestra puede ser una muestra biológica, que puede contener cualquier material viral o celular, que incluye células procarióticas o eucarióticas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y organelas. Tal material biológico 5 en consecuencia puede comprender todos los tipos de células animales de mamífero y no mamífero, células de plantas, algas que incluyen algas azul-verdosas, hongos, bacterias, protozoos, etc. Las muestras representativas en consecuencia incluyen sangre entera y productos derivados de sangre tales como plasma, suero y capa leucocitaria, orina, heces, líquido cefalorraquídeo o cualquier 10 otro de los fluidos corporales, tejidos, cultivos celulares, suspensiones celulares, etc.

Preferentemente sin embargo, la muestra es un material de partida relativamente puro tal como un producto de amplificación después de la realización de un proceso de amplificación, por ejemplo, un producto de PCR, o una 15 preparación semipura obtenida por otros procesos de recuperación de ácido nucleico. El método también se puede usar para purificar otro ADN no genómico tales como plásmidos, cósmicos y otros fragmentos de ADN. Estos pueden estar presentes convenientemente después de la separación mediante el uso de técnicas tales como la electroforesis y el material de ácido nucleico aislado después de tal 20 separación. En consecuencia, por ejemplo la muestra preferentemente está sustancialmente desprovista de componentes celulares tales como membranas y contiene solo material genético (o sus copias) derivadas de las células de las cuales se genera la muestra. Con especial preferencia la muestra está desprovista de ADN cromosómico, proteínas y membranas de las células de la que se derivó. 25

La muestra que contiene ácido nucleico, en términos generales, simplemente se puede poner en contacto con la solución que contiene el multímero de etilenglicol y una fase sólida que se puede añadir a la muestra antes, simultáneamente con o posteriormente al multímero de etilenglicol. (Preferentemente la relación de la muestra, por ejemplo, muestra de PCR: solución 30 que contiene el multímero de etilenglicol es aproximadamente 1:1). Si es necesario, esto puede ser precedido por una o más etapas separadas para alterar los componentes estructurales tales como paredes celulares o para obtener la lisis. Los procedimientos para obtener estos son bien conocidos en la técnica. En consecuencia, por ejemplo, algunas células por ejemplo, células sanguíneas, se 35 pueden lisar con el uso adicional del detergente. Otras células, por ejemplo células vegetales o fúngicas o tejidos animales sólidos también pueden requerir un tratamiento más vigoroso tal como, por ejemplo, la molienda en nitrógeno líquido, calentamiento en presencia de detergente, lisis alcalina en presencia de detergente. Para las muestras en la forma de secciones de parafina y como tales, la lisis (y 5 fusión de la parafina) se efectúa por calentamiento, por ejemplo mediante el uso de un horno de microondas (Banerjee, S.K. et al., 1995, Biotechniques 18: 769-773). Asimismo, ciertos tejidos más compactos pueden requerir el tratamiento enzimático, por ejemplo mediante el uso de proteinasa K para obtener suficiente liberación del ácido nucleico. Los diversos componentes se mezclan y simplemente se dejan 10 decantar durante un intervalo de tiempo adecuado para permitir que el ácido nucleico se una al soporte. De modo conveniente, si se usan otros agentes tales como enzimas por ejemplo, la proteinasa K, ellos se pueden incluir en el multímero de etilenglicol o detergente, si se usa el último. El soporte luego se elimina de la solución por cualquier medio conveniente, que dependerá del curso de la 15 naturaleza del soporte, e incluye todas las formas de retirar el soporte fuera del sobrenadante de la muestra o viceversa, por ejemplo centrifugación, decantación, pipeteo etc.

Las condiciones durante este proceso no son críticas, y se ha hallado conveniente, por ejemplo, mezclar simplemente la muestra con el multímero de 20 etilenglicol en presencia de una fase sólida, y dejar estacionar a temperatura ambiente, por ejemplo, 15-25°C, por ejemplo, aproximadamente de 20°C, durante 30 segundos a 20 minutos, por ejemplo, 2-10 minutes antes de la separación. Los tiempos de incubación más largos se pueden usar para maximizar el rendimiento de moléculas de ácido nucleico más largas. 25

Como se mencionó antes, el tiempo de reacción no es crítico y como mínimo suelen ser suficientes tan sólo 5 minutos. Sin embargo, si es conveniente, se pueden usar períodos más largos, por ejemplo, 0,5 a 3 horas, o incluso toda la noche. Se puede realizar el mezclado por cualquier medio conveniente, que incluye por ejemplo agitación simple por agitación o agitación en vórtex. Asimismo, si se 30 desea, se pueden usar temperaturas superiores o inferiores, pero no es necesario.

Cuando se usa, el detergente puede ser cualquier detergente, y una vasta selección es conocida y está descripta en la bibliografía.

En consecuencia, el detergente puede ser iónico, aniónico y catiónico, no iónico o zwitteriónico. El término "detergente iónico" como se usa en la presente 35 memoria incluye cualquier detergente que está en forma iónica parcial o total cuando se disuelve en agua. Los detergentes aniónicos han mostrado actuar particularmente bien y son preferidos. Los detergentes aniónicos adecuados incluyen por ejemplo docecil sulfato de sodio (SDS) u otras sales de alquilsulfato de metal alcalino o detergentes similares, sarcosilo, o combinaciones de ellos. 5

Convenientemente, el detergente se puede usar en una concentración de 0,2 a 30% (p/v), por ejemplo, 0,5 a 30%, preferentemente 0,5 a 15%, más preferentemente 1 a 10%. En cuanto a las concentraciones de los detergentes aniónicos de 1,0 a 5% por ejemplo, 0,5 a 5% han demostrado actuar bien.

Convenientemente, el detergente se puede incubar con la muestra a 10 temperatura ambiente o a temperaturas superiores, por ejemplo, 37°C, 50°C o 65°C para obtener la lisis. Asimismo, el tiempo de incubación puede variar de unos pocos minutos por ejemplo, 5 o 10 minutos a horas, por ejemplo, 20 a 40 minutos o 1 a 2 horas. Para la lisis enzimática, por ejemplo, mediante el uso de proteinasa K etc., se puede requerir un tratamiento más largo, por ejemplo, toda la noche. 15

El detergente puede ser aportado en solución acuosa simple, que puede ser alcalina o ácida, o más preferentemente en un buffer.

El multímero de etilenglicol y opcionalmente también el detergente si está presente se puede proporcionar en cualquier buffer adecuado, que incluye por ejemplo buffers Tris, Bicina, Tricina, y fosfato. Preferentemente, como se mencionó 20 antes, se puede incluir una fuente de cationes monovalentes, por ejemplo, una sal, para mejorar la captura del ácido nucleico, si bien esto puede ser no siempre necesario. Las sales adecuadas incluyen las sales de cloruro, por ejemplo, cloruro de magnesio, cloruro de sodio, cloruro de litio, etc. a concentraciones de 0,1 a 1 M, por ejemplo, 250 a 500 mM. También se pueden usar concentraciones menores, 25 por ejemplo, de menos de 200 mM, por ejemplo, de 5 a 50 mM de sal. Las anteriores concentraciones se refieren a la concentración final en la mezcla de la solución de muestra:perla:multímero de etilenglicol. Como se mencionó antes, también se pueden incluir otros componentes tales como enzimas.

Otros componentes opcionales en la composición que contiene el multímero 30 de etilenglicol incluyen agentes quelantes por ejemplo, EDTA, EGTA y otros ácidos poliaminocarboxílicos de modo conveniente a concentraciones de 1 a 50 mM etc., agentes reductores tales como ditiotreitol (DTT) o β-mercaptoetanol, a concentraciones de por ejemplo 1 a 10 mM.

Las composiciones de TEG preferidas por ejemplo, pueden comprender: 35

Tris-HCl 10 mM pH 7,5

EDTA 10 mM

TEG 40%

o:

Tris-HCl 10mM pH 7,5 5

TEG 50%

MgCl2 30 mM

o:

Tris-HCl 10mM pH 7,5

TEG 60% 10

MgCl2 30 mM

SDS 2%

o:

Tris-HCl 10mM pH 7,5

TEG 40% 15

MgCl2 30 mM

EtOH 20%

Estas soluciones son las soluciones patrón que se usan preferentemente en una relación de 1:1 con la muestra y en consecuencia las cantidades relativas de cada constituyente en la solución final se pueden reducir a la mitad. 20

Sin estar ligado a la teoría, se considera que el multímero de etilenglicol (y la sal cuando está presente) destruye los enlaces de hidrógeno entre el agua y las moléculas de ácido nucleico, lo que permite que este último se asocie con el soporte sólido y forme una estructura menos solvatada. Posteriormente se puede formar un puente de iones por un catión entre el soporte sólido cargado y la 25 molécula de ácido nucleico cargada.

El detergente, cuando está presente, funciona en el método para lisar el material que contiene ácido nucleico, por ejemplo, las células y los núcleos para liberar el ácido nucleico. También se considera que el detergente ayuda a alterar la unión de las proteínas, por ejemplo, proteínas de unión al ADN, al ácido nucleico y 30 para reducir el problema de los contaminantes en la muestra que se adhieren al soporte sólido si se emplean muestras impuras o altamente complejas.

El soporte sólido puede ser cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que se usan ampliamente o proponen para la inmovilización, separación etc. Estos pueden adoptar la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas 35 (por ejemplo, membranas de nylon), fibras, capilares, agujas o tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc., peines, puntas de pipeta, micromatrices, chips, o en efecto cualquier material de superficie sólido.

En forma conveniente el soporte puede estar hecho de vidrio, sílice, látex, plástico o un material polimérico. Los materiales preferidos presentan un área de 5 superficie alta para la unión del ácido nucleico. Tales soportes generalmente tendrán una superficie irregular y pueden por ejemplo ser porosos o particulados, por ejemplo, partículas, fibras, redes, aglomerados o tamices. En general se prefieren los materiales particulados, por ejemplo, perlas debido a su mayor capacidad de unión, en particular perlas poliméricas. 10

En forma conveniente, un soporte sólido particulado usado de acuerdo con la invención comprenderá perlas esféricas. El tamaño de las perlas no es crítico, pero ellas por ejemplo pueden ser del orden de diámetro de al menos 1 y preferentemente al menos 2 μm, y tienen un diámetro máximo de preferentemente no más de 10 y más preferentemente no más de 6 μm. Por ejemplo, se pueden 15 usar perlas con un diámetro de 1 μm, 2,8 μm o 4,5 μm.

Las partículas monodispersas, es decir las que son sustancialmente uniformes en cuanto a tamaño (por ejemplo, que tienen un diámetro estándar menor que 5%) tienen la ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de reacción muy uniforme. Las partículas monodispersas producidas por la técnica 20 descripta en US-A-4336173 son especialmente adecuadas.

Las perlas poliméricas no magnéticas adecuadas para uso en el método de la invención están disponibles en Dynal Biotech ASA (Oslo, Noruega) así como de Qiagen, Amersham Pharmacia Biotech, Serotec, Seradyne, Merck, Nippon Paint, Chemagen, Promega, Prolabo, Polysciences, Agowa y Bangs Laboratories. 25

Sin embargo, para ayudar a la manipulación y la separación, se prefieren las perlas magnéticas. El término "magnético" como se usa en la presente memoria significa que el soporte es capaz de tener un momento magnético impartido con este cuando se coloca en un campo magnético, y de este modo se puede desplazar bajo la acción de este campo. En otras palabras, un soporte que comprende 30 partículas magnéticas se puede eliminar fácilmente por agregación magnética, que proporciona una manera rápida, simple y eficiente de separar las partículas después de la etapa de unión del ácido nucleico, y es un método mucho menos riguroso que las técnicas tradicionales tales como centrifugación que generan fuerzas de cizallamiento que pueden degradar los ácidos nucleicos. 35

En consecuencia, mediante el uso del método de la invención, las partículas magnéticas con ácido nucleico unido se pueden extraer de una superficie adecuada por la aplicación de un campo magnético por ejemplo, con un imán permanente. Es usualmente suficiente aplicar un imán a la parte del recipiente que contiene la mezcla de muestra para agregar las partículas a la pared del recipiente y para 5 verter el resto de la muestra.

Se prefieren especialmente las partículas superparamagnéticas ya que se puede evitar la agregación magnética y el aglutinamiento de las partículas durante la reacción, de este modo se garantiza la extracción uniforme del ácido nucleico. Dichas partículas son descriptas por ejemplo por Sintef en EP-A-106873. Las 10 partículas magnéticas bien conocidas comercializadas por Dynal Biotech ASA (Oslo, Noruega) como DYNABEADS®, son particularmente adecuadas en la presente invención.

Los soportes sólidos que se pueden usar incluyen cualquier soporte sólido cuya superficie sea relativamente hidrófila y sea neutra o tenga una carga negativa 15 al pH en que se realiza el método. Los pH preferidos para la realización del método son de 4 a 9. Preferentemente tales soportes sólidos contienen grupos que pueden participar en la formación de complejos con el ácido nucleico. Los soportes sólidos apropiados incluyen los que están hechos de, o revestidos con, sílice, poliuretano, grupos epoxi y carbohidratos. 20

De acuerdo con la elección del soporte sólido, se puede usar sin la adición de grupos funcionales o se puede modificar para proporcionar tales grupos.

Las partículas revestidas funcionalizadas para usar en la presente invención se pueden preparar por la modificación de las perlas de acuerdo con las patentes US 4.336.173, 4.459.378 y 4.654.267. En consecuencia, las perlas u otros soportes 25 se pueden preparar con diferentes tipos de superficie funcionalizada.

Con especial preferencia los soporte sólidos, tales como perlas magnéticas, que no son hidrófilos y/o no portan un grupo adecuado para formar un complejo con el ácido nucleico, se pueden modificar para portar un grupo funcional libre al que se puede unir el ácido nucleico. Tal grupo funcional puede ser un grupo hidroxilo, 30 grupo epoxi, ácido carboxílico o ácido sulfónico. Las perlas preferidas incluyen perlas revestidas con sílice y perlas con superficies hidrófilas tales como las que portan acrilatos o epóxidos.

También es posible usar soportes sólidos que se han modificado para permitir la captura selectiva de las células deseadas, virus, etc. que contienen el 35 ácido nucleico, cuando el material de partida es una preparación relativamente impura. En consecuencia por ejemplo, se pueden usar soportes que portan anticuerpos u otras proteínas de unión, específicas para un tipo celular deseado. Esto puede introducir un grado de selectividad para el aislamiento del ácido nucleico, ya que solo se puede separar un ácido nucleico de una fuente blanco 5 deseada dentro de una mezcla compleja. En consecuencia por ejemplo, tal soporte se puede usar para separar y eliminar el tipo celular deseado, etc. de la muestra, después de lo cual, se añade detergente para obtener la lisis y la liberación del ácido nucleico y el multímero de etilenglicol se añade para obtener la unión al soporte. 10

La preparación de tales matrices de captura celular selectiva es bien conocida en la técnica y se describe en la bibliografía.

En consecuencia, en un aspecto preferido la invención proporciona un método de aislar el ácido nucleico de una muestra como se describió anteriormente en la presente memoria, en el que dicha muestra contiene células (que contienen el 15 ácido nucleico de interés) y dichas células se obtienen por separación inmunomagnética, por ejemplo, mediante el uso de un soporte sólido (por ejemplo, perlas) que porta los anticuerpos para los antígenos específicos para una célula blanco. El soporte sólido al que se unen las células puede ser igual o diferente al soporte sólido al que el ácido nucleico se une de acuerdo con la invención. 20 Preferentemente los soportes sólidos usados para separar las células son perlas y en consecuencia después de la separación inmunomagnética las células están presentes en un complejo célula: perla, antes del aislamiento del ácido nucleico. En este método, como en otros métodos de la invención, el método también puede comprender la etapa adicional de aislar el ARN de dicha muestra. 25

Asimismo, el soporte se puede proporcionar con los compañeros de unión para asistir en la captura selectiva de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, se pueden usar secuencias de ADN o ARN complementarias, o proteínas de unión al ADN, o proteínas virales de unión al ácido nucleico. La unión de tales proteínas al soporte sólido se puede obtener mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. 30

Si bien no necesario, puede ser conveniente introducir una o más etapas de lavado en el método de aislamiento de la invención, por ejemplo después de la separación del soporte de la muestra. Preferentemente el método que se describe en la presente memoria incluye al menos una etapa de lavado como se describe más adelante en la presente memoria. En el caso de las perlas magnéticas, esto se 35 puede realizar en forma conveniente antes de liberar el ADN de las perlas. Con especial preferencia, se realiza la primera etapa de lavado (y opcionalmente la posterior) después de la unión del material de ácido nucleico mediante el uso de soluciones con menos de 1 M de sal, preferentemente menos de 500 mM, por ejemplo, menores de 250, 100 o 50 mM de sal. En una realización, el buffer de 5 lavado puede ser el mismo que el buffer que contiene el multímero de etilenglicol, por ejemplo, una mezcla de TEG/sal. Con especial preferencia se usan soluciones de alcohol de entre 50 y 90% para el lavado, por ejemplo, 70% de etanol, sin ninguna sal.

Después de la etapa de separación, y cualquier etapa de lavado opcional 10 que se pueda desear, el soporte que porta el ácido nucleico se puede transferir, por ejemplo, resuspender o sumergir en cualquier medio adecuado por ejemplo, agua o buffer de baja concentración iónica. En forma conveniente, la eficiencia de elución se puede aumentar por la adición de agentes quelantes, por ejemplo, EDTA para eliminar el exceso de cationes, por ejemplo, Mg2+. De acuerdo con el soporte y la 15 naturaleza de cualquier proceso posterior deseado, puede ser deseable o no liberar el ácido nucleico del soporte.

En el caso de un soporte sólido particulado tal como perlas magnéticas o no magnéticas, en muchos casos este se puede usar directamente, por ejemplo en PCR u otras amplificaciones, o para la secuenciación sin eluir el ácido nucleico del 20 soporte. Asimismo, en muchos métodos de detección o identificación de ADN métodos, la elución no es necesaria ya que una gran mayoría de la extensión de las moléculas unidas estará disponible para la hibridación para los oligonucleótidos y para la amplificación.

Sin embargo, si se desea, la elución del ácido nucleico se puede obtener 25 fácilmente mediante el uso de medios conocidos, por ejemplo por el calentamiento, por ejemplo, a 65 °C durante 5 a 10 minutos, o simplemente a temperatura ambiente, por ejemplo, por ejemplo durante 1 a 10 minutos, por ejemplo, 2 o 10 minutos, en agua o un medio de concentración iónica baja (que no contiene un multímero de etilenglicol), por ejemplo, buffer tris-HCl 10-30 mM, pH 7,5. En forma 30 conveniente, la elución se puede realizar en un pequeño volumen para concentrar el ácido nucleico aislado.

Después de la elución el soporte se puede extraer del medio lo cual deja el ácido nucleico en solución.

Como se mencionó previamente, el método se usa en forma conveniente 35 para el aislamiento de los productos de amplificación.

El método de la invención elimina efectivamente los cebadores de los productos de amplificación deseados de modo que el nivel de contaminación es menor de 10%, por ejemplo, menor de 5 o 1%. Preferentemente se obtienen rendimientos de más de 85% para los fragmentos superiores a 1 kp y más de 40%, 5 por ejemplo, más de 60% para los fragmentos de 100 pb. Si se desea extraer un ARN del ADN, se puede obtener por la destrucción del ARN antes de la etapa de separación del ADN, por ejemplo por la adición de una ARNasa o un álcali tal como NaOH.

Alternativamente, como se mencionó antes, el método de la invención se 10 puede usar para separar ADN y ARN sucesivamente de la muestra. También se puede usar para extraer ADN de una muestra en un procedimiento de purificación de ARN.

En forma conveniente, la separación secuencial puede ocurrir mediante el uso de dos fases sólidas diferentes, por ejemplo soportes sólidos que pueden 15 diferenciar entre ADN y ARN. En consecuencia, tal método puede comprender llevar a cabo una primera etapa de separación para aislar ADN como se describió antes.

Un soporte sólido adicional se puede añadir posteriormente a la muestra para capturar el ARN restante en la muestra, sea por el uso de un soporte sólido 20 que puede unir el ARN o cualquier ácido nucleico restante, o un soporte sólido que captura las moléculas de ARN específicas (por ejemplo, al portar una sonda de ácido nucleico complementaria), o un subconjunto de moléculas de ARN por ejemplo, ARN poliadenilado. De esta manera es posible aislar rápidamente y separar ADN y ARN o subconjuntos de ambos de la misma muestra. Esto puede 25 ser útil, por ejemplo, por la medición del ADN aislado para estimar la cantidad de células usadas para la extracción del ARN, lo que dará una referencia entre las diferentes muestras.

Sin embargo, el procedimiento de aislamiento del ADN de la invención también se puede combinar fácilmente, como una etapa preliminar, con otros 30 procedimientos de purificación de ARN convencionales, por ejemplo el aislamiento de ADN con el multímero de etilenglicol de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo antes de una etapa de precipitación selectiva de ARN, por ejemplo mediante el uso de LiCl o antes de la separación del ARN con la utilización de GTC y sarcosilo. 35

En un procedimiento representativo, la muestra opcionalmente se lisa en presencia de detergente y el ADN se deja unir a un soporte sólido en presencia del multímero de etilenglicol, después de lo cual el ADN se puede separar fácilmente de la muestra por la extracción del soporte. Si se desea, el ADN también se puede manipular rápida y fácilmente para la amplificación u otros procesos posteriores, 5 tales como la secuenciación. El ARN posteriormente se puede aislar. Esto puede ser con un sistema basado en fase sólida como se describió anteriormente, que incluye una repetición del método de la invención, o por técnicas convencionales tales como extracciones, precipitaciones o cromatografía de afinidad.

Una realización particularmente ventajosa de la invención es usar el método 10 de aislamiento de la invención para extraer el ADN de una muestra antes del aislamiento de ARN, de modo que se reduzca la viscosidad de la muestra lisada y se favorece un aislamiento de moléculas de ARN que nuevamente reduce o evita la posibilidad de contaminación del ADN del ARN. Tal método tiene la ventaja de ser rápido de realizar. 15

La invención es ventajosamente susceptible a la automatización, en particular si las partículas y en especial, las partículas magnéticas se usan como el soporte. Las estaciones de trabajo de manipulación de líquidos automatizadas tales como Beckman Coulter Biomek®FX o Tecan Freedom EVO™ se pueden usar para este fin. 20

Los diversos reactantes y componentes requeridos para realizar el método de la invención pueden ser suministrados de modo conveniente en forma de kit. Tales kits representan un aspecto adicional de la invención.

En su forma más simple, este aspecto de la invención proporciona un kit para aislar un ácido nucleico de una muestra que comprende un soporte sólido y un 25 multímero de etilenglicol. Preferentemente dicho soporte sólido es una perla magnética que porta grupos ácido carboxílico como grupos funcionales libres en dicho soporte.

En un kit opcionalmente se incluyen buffer, detergentes, alcoholes, sales, agentes de lisis por ejemplo, proteinasas, agentes quelantes y agentes reductores. 30 El kit puede estar provisto con las instrucciones para uso del kit de acuerdo con la invención, por ejemplo, incluidas en un prospecto.

Para el aislamiento de ARN, los kits también pueden comprender medios para aislar el ARN por ejemplo, un segundo soporte sólido para aislar el ARN, por ejemplo un soporte provisto con sondas para la captura del ARN por ejemplo, oligo 35 dT o sondas de secuencia complementaria para el blanco deseado, o un caotropo o agente selectivo precipitante.

La invención se describirá a continuación con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes con referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra el rendimiento de los productos de PCR cuando se 5 usan varias concentraciones de TEG y MgCl2 (donde los valores indicados se refieren a las soluciones patrón y se deben reducir a la mitad para derivar la concentración final);

La Figura 2 muestra la eficiencia de la extracción del cebador mediante el uso de TEG para el aislamiento de ADN; 10

La Figura 3 muestra el efecto de la concentración de TEG en el protocolo de aislamiento de ADN, en el que los valores indicados se refieren a las concentraciones en las soluciones patrón, y el panel superior se refiere a una escalera de 100 bp y el panel inferior se refiere a los productos de PCR no purificados; 15

Las Figuras 4 y 5 muestran el efecto de la concentración de TEG y etanol en el procedimiento de aislamiento de ADN, donde los valores indicados se refieren a las concentraciones de las soluciones patrón; y

La Figura 6 muestra el efecto de las concentraciones de TEG, PEG y etanol alto sobre el procedimiento de aislamiento de ADN, donde los valores indicados se 20 refieren a las concentraciones de las soluciones patrón. Las calles se describen en el Ejemplo 6.

Ejemplo 1: Efecto del MgCl2 en el protocolo de aislamiento de ADN

El reactivo de PCR Clean-Up que contiene perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml) y los reactivos mostrados en la Figura 1 (20 µl) se añadieron al PCR no 25 purificado (20 µl). La mezcla se incubó durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron en etanol 70% (50 µl). Se añadió agua (20 µl), la muestra se mezcló e incubó durante 2 minutos. Las perlas se separaron por atracción magnética y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.

La cantidad de amplicón en el sobrenadante se midió con el ensayo de 30 detección de ADNds PicoGreen (Molecular Probes, Inc.). El rendimiento del producto de PCR se indica como el porcentaje de ADN detectado en el material de partida no purificado. (Se ha mostrado que los cebadores no interfieren con el reactivo de detección de PicoGreen).

Se observará en la Figura 1 que MgCl2 a una concentración de 10-30 mM 35 (que equivale a 5-15 mM de concentración final) produce un buen rendimiento de los productos de PCR.

Ejemplo 2: Eficiencia de la extracción del cebador en el protocolo de aislamiento de ADN

El reactivo de PCR Clean-Up que contiene perlas de MyOne-COOH (2 5 mg/ml), 50% de TEG y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5 (20 µl) se añadió al PCR no purificado enriquecido con 10 pmol de oligonucleótido de 20-mer marcado con fluoresceína (20 µl). La mezcla se incubó durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron en etanol 70% (50 µl). Se añadió agua (20 µl), la muestra se mezcló e incubó durante 2 minutos. Las perlas se 10 separaron por atracción magnética y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.

La cantidad de cebador fluorescente transferido en el sobrenadante se midió mediante el uso de una placa lectora VictorII (Perkin Elmer) a 485/515 nm.

Se observará a partir de la Figura 2 que el método de aislamiento fue efectivo para eliminar los cebadores contaminantes. 15

Ejemplo 3: Efecto de la concentración de TEG en el protocolo de aislamiento de ADN

El reactivo de PCR Clean-Up que contiene perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 40-60% de TEG y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5 (20 µl) se añadió a una solución de una escalera de 100 bp (20 µl) o PCR no purificado (20 20 µl). La mezcla se incubó durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron en etanol 70% (50 µl). Se añadió agua (20 µl), la muestra se mezcló e incubó durante 2 minutos. Las perlas se separaron por atracción magnética y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.

Se usó un PCR CleanUp que usa perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% 25 de PEG- 8000 y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5 como una referencia.

Se analizaron 10 µl del eluato por electroforesis en gel mediante el uso de agarosa 1,5 NuSieve y tinción con bromuro de etidio.

Se observará en la Figura 3 que TEG en una concentración final de 20-30% fue efectiva en el aislamiento del producto de PCR. 30

Ejemplo 4: Efecto de la concentración de TEG y etanol en el protocolo de aislamiento de ADN

El reactivo de PCR Clean-Up que contiene perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 40 - 50% de TEG, 0 - 20% de etanol y 30 mM de MgCl2 en 10 mM deTris pH 7,5 (20 µl) se añadió a una solución de una escalera de 100 pb (20 µl). La 35 mezcla se incubó durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron en etanol 70% (50 µl). Se añadió agua (20 µl), la muestra se mezcló e incubó durante 2 minutos. Las perlas se separaron por atracción magnética y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.

Se usó PCR CleanUp con perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% de PEG-5 8000 y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5 como referencia.

Se analizaron 10 µl del eluato por electroforesis en gel mediante el uso de agarosa 1,5 NuSieve y tinción con bromuro de etidio.

Es evidente a partir de la Figura 4 que el protocolo es efectivo a concentraciones de TEG de 20 o 25% (concentración final) y concentraciones de 10 etanol de 0,5 o 10% (concentración final).

Ejemplo 5: Efecto de la concentración de TEG y etanol en el protocolo de aislamiento de ADN

El reactivo de PCR Clean-Up que contiene perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 10-50% de TEG, 0-40% de etanol y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 15 7,5 (50 µl) se añadió a una solución de una escalera de 100 pb (50 µl). La mezcla se incubó durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron en etanol 70% (1000 µl). Se añadió agua (40 µl), la muestra se mezcló e incubó durante 2 minutos. Las perlas se separaron por atracción magnética y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. 20

Se utilizó PCR CleanUp con la utilización de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% de PEG-8000 y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5 como referencia.

Se analizaron 10 µl del eluato por electroforesis en gel mediante el uso de agarosa 1,5 NuSieve y tinción con bromuro de etidio. 25

La Figura 5 muestra que el aislamiento efectivo se obtiene con la utilización de 25% de TEG (concentración final) y que el aislamiento es efectivo sin etanol.

Ejemplo 6: Efecto de concentraciones altas de etanol y TEG en el protocolo de aislamiento de ADN

Los métodos se realizaron como se describió en los ejemplos previos. Las 30 calles mostradas en la Figura 6 son las siguientes:

1. PCR bruto enriquecido con 20 pmol de cebador.

2. Escalera de 100 pb "bruta".

3. Cebador "bruto".

4, 7, 10. PCR purificado enriquecido con 20 pmol de cebador mediante el 35 uso de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% de TEG, 67% de etanol y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5.

5, 8, 11. PCR purificado enriquecido con 20 pmol de cebador mediante el uso de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 50% de TEG y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5. 5

6, 9, 12. PCR purificado enriquecido con 20 pmol de cebador mediante el uso de perlas de MyOnCOOH (2 mg/ml), 25% de PEG 8000 y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris pH 7,5.

13. Escalera de 100 pb purificada mediante el uso de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% de TEG, 67% de etanol y 30 mM de MgCl2 en 10 mM de Tris 10 pH 7,5.

14. Escalera de 100 pb purificada mediante el uso de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 50% de TEG y 30 mM de MgCl 2 en 10 mM de Tris pH 7,5.

15. Escalera de 100 pb purificada mediante el uso de perlas de MyOne-COOH (2 mg/ml), 25% de PEG- 8000 y 30 mM de MgCl 2 en 10 mM de Tris pH 7,5. 15

Los resultados se muestran en la Figura 6 y muestran que el uso de altos niveles de etanol produce el desplazamiento/copurificación del cebador (ver calles 4, 7 y 10) y es en consecuencia no deseable.

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30

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Claims (30)

1. Reivindicaciones

   1. Un método de aislar un ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de un multímero de etilenglicol que consiste en 2 a 20 monómeros de óxido de etileno por el cual el ácido nucleico soluble de dicha muestra se une a la superficie del 5 soporte, y se separa de dicho soporte con ácido nucleico unido de la muestra.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dichos monómeros de óxido de etileno están en una disposición lineal.
3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que dicho multímero es un oligoetilenglicol con 10 o menos unidades de óxido de etileno, 10 preferentemente entre 2 y 6 unidades de óxido de etileno.
4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho multímero es tetraetilenglicol.
5. 5. A método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho multímero de etilenglicol se usa en una concentración final mayor que 15 15% de, preferiblemente 15 - 35%.
6. 6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicha etapa de unión de dicho ácido nucleico a dicho soporte sólido se realiza en presencia de sal a una concentración final de menos de 1 M, preferentemente de 5 mM de a 0,5 M. 20
7. 7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho método se realiza en presencia de alcohol a una concentración final menor de 30% de (v/v).
8. 8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicha muestra se pone contacto con un detergente antes, 25 simultáneamente o después del contacto de dicha muestra con el multímero de etilenglicol y dicho detergente está presente en una concentración final de 0,2 a 30% de (p/v)
9. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho detergente es un detergente aniónico, preferentemente un sal alquilsulfato de metal alcalino. 30
10. 10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho método se realiza en presencia de menos de 1% (p/v) de detergente, menos de 30% (v/v) de alcohol y en ausencia de caotropos.
11. 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho método se realiza en ausencia de uno o más de detergentes, caotropos y alcoholes. 35
12. 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el multímero de etilenglicol se usa solo en una solución buffer.
13. 13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la separación de las moléculas de ácido nucleico de más de 100 pares de bases de oligonucleótidos de menos de 30 nucleótidos. 5
14. 14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende adicionalmente la etapa de eluir el ácido nucleico del soporte sólido y opcionalmente realizar procesos posteriores adicionales, preferentemente la secuenciación, de dicho material eluido.
15. 15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 14, en el que dicho ácido nucleico es ADN, preferentemente fragmentos de ADN no genómico de 10 pares de bases a 250 kb.
16. 16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ADN está aislado y adicionalmente en una etapa más se aísla ARN de la misma muestra. 15
17. 17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que dicha muestra es sangre entera o un producto derivado de la sangre.
18. 18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que dicha muestra es una muestra obtenida después de un proceso de amplificación. 20
19. 19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que además comprende una o más etapas adicionales para alterar los componentes estructurales en la misma muestra o para lograr la lisis de las células en la muestra.
20. 20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 25 en el que dicho soporte sólido es particulado.
21. 21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el soporte sólido comprende perlas magnéticas.
22. 22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en el que la superficie de dicho soporte sólido es hidrófila. 30
23. 23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en el que dicho soporte sólido porta grupos hidroxilo, epoxi, ácido carboxílico o ácido sulfónico.
24. 24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 en el que después de la unión del ácido nucleico dicho soporte sólido se lava, 35 preferentemente con una solución que contiene menos de 250 mM de sal y alcohol de entre 50 y 90%.
25. 25. Un kit para aislar el ácido nucleico de una muestra de acuerdo con el método que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende un multímero de etilenglicol definido de acuerdo con una cualquiera de 5 las reivindicaciones 1 a 4 y un soporte sólido.
26. 26. Un kit de acuerdo con la reivindicación 25 en el que dicho soporte sólido es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
27. 27. Un kit de acuerdo con la reivindicación 25 o 26 que adicionalmente comprende un folleto con instrucciones para el uso del kit de acuerdo con el método 10 que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
28. 28. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 19 a 24 en el que dicha muestra contiene células y dichas células se obtienen por separación inmunomagnética.
29. 29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28 en el que dicho método 15 además comprende la etapa adicional de aislar el ARN de dicha muestra.
30. 30. Un método de acuerdo con la reivindicación 28 o 29 en el que dichas células están en un complejo de células:perla.