JP2005052142A - Ｒｎａ単離用の装置及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
核酸を単離するための装置及び方法が開示される。詳細には、細胞トータルＲＮＡの単離について検討されている。さらに、有害な汚染物質を導入せず且つ比較的時間を要さず、生物学的サンプル内のゲノミックＤＮＡを低減させる方法を提供する。
【解決手段】
一実施形態では、サンプル内のＲＮＡの完全性を維持しつつ、相当量のｇＤＮＡを除去する方法が開示される。この実施形態では、ガラスファイバー又はホウケイ酸ファイバーからなる少なくとも１つの層が充填されている予備濾過カラムが使用される。この実施形態では、組織／細胞溶解調製物が調製され、該調製物は予備濾過カラムに導入される。予備濾過カラム中をホモジェネートが通過する際、ｇＤＮＡを含む細胞汚染物質はカラム内に残り、一方、流出物には部分的にｔｃＲＮＡが含まれる。一態様では、サンプルに対してさらなる精製プロセス又は後段のプロセスを実施する前に、予備濾過カラムを使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、概して、核酸のような生体物質を単離するための装置と方法に関する。より詳細には、本発明は、生体物質から細胞トータルＲＮＡを単離することに関する。

ハイブリダイゼーションアレイなどの遺伝子発現技術、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、クローニング、制限分析、配列決定をはじめとする多くの分子生物学的技術では、高純度の完全なＲＮＡを投入する必要がある。ＲＮＡは、実験手順に干渉する可能性のある汚染物質を実質的に含まないものでなければならない。このような汚染物質としては、分子生物学で採用される、核酸もしくはタンパク質のハイブリダイゼーション、酵素触媒反応、及びその他の化学反応を阻害又は抑制する物質、目的の核酸又は他の生体物質の分解もしくは解重合を触媒する物質、分析されているサンプルに実際には存在していないのに、一定量のターゲット生体物質（例えば核酸）がサンプル内に存在すると示す、「バックグラウンド」を与える物質、が挙げられる。他の汚染物質としては、酵素、他の種類のタンパク質、多糖、ポリヌクレオチド、及び脂肪、又は低分子量酵素阻害剤、オリゴヌクレオチドなどの低分子量物質を挙げることができる。汚染物質はまた、対象とする物質を単離するために用いる化学物質又は他の物質からも系内に導入され得る。この種の汚染物質としては、微量金属、染料、有機溶媒が挙げられる。さらに典型的には、核酸は、組織、体液、培養物中の細胞、ターゲット核酸の増幅を行ったアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル又は溶液などの複雑系内に存在するため、核酸の単離は困難である。

従って、後段の分子生物学的技術で使用できる程度に高純度且つ完全なＲＮＡを調製するためには、多くの場合、ステップ数の多い大変なプロセスを必要とし、且つ従来の核酸単離プロセスには重大な欠点がある。このような欠点とは、フェノール（既知の発がん性物質）などの毒性のある化学物質、クロロホルム（非常に揮発性が高く毒性且つ可燃性である）などの揮発性の試薬などを使用する有機抽出ステップが含まれていること、並びに現在の方法は、オートメーション化又は高スループット化が困難なことである。さらに、有機溶媒抽出法を使用する場合には、規制対象であり、環境に配慮した方法で廃棄しなければならない有機性廃棄物が生じる。他の欠点は、所与の核酸材料を単離するために必要とされる抽出ステップの数が多く、時間を要すことである。従って、理想的な環境及び条件下であっても、ほとんどの従来の核酸単離方法は、時間を要し、危険で、しかも単離される核酸物質の収率が比較的低いといった問題を有していた。

上述のような従来の単離技術に取って代わるものとして、又は従来の単離技術を補足するものとして開発された市販の単離システムにおいては、多くの場合、核酸結合基材として珪酸ファイバー又はガラスファイバーからなるフィルタが使用されている。核酸は、ガラススラリーや珪藻土などのシリコン含有物質に結合することがよく知られている。これらの物質のいくつかが抱える問題点は、必要な珪酸材料が常に適切な形態で市販されているわけではないこと、また、多くの場合、オンサイトで調製しなければならないため、核酸単離手順に時間と手間を要すことである。

少なくとも数種の生体物質からトータルＲＮＡを単離するために使用し得る、シリカベースのシステム及び方法もまた、ここ数年の間に、既に開発されている。それら既知のシリカベースのＲＮＡ単離技術では、同一の基本的な一連のステップに基づいて、任意の所与の生体材料からターゲットＲＮＡが単離される。とはいえ、各手順で用いられる種々の溶液の濃度及び量は、使用するシリカベースの材料組成によって変更される。一般に、それら既知の全てのシリカベースＲＮＡ単離プロセスにおいて用いられる基本的な一連のステップには、溶解バッファー存在下で生体物質を分解するステップ、核酸（複数可）と「シリカベースの基質」との複合体を形成するステップ、得られた複合体から溶解バッファー混合液を除去し複合体を洗浄するステップ、複合体からターゲットの核酸を溶出させるステップが包含される。一般に、「シリカベース」という用語は、ＳｉＯ_２化合物、及びこれと同類の水和酸化物を記述するために用いられる。

近年、核酸をシリコンカーバイド粒子に結合するステップ、次いで核酸をシリコンカーバイドから溶出させるステップを含む、ＤＮＡ及びＲＮＡの精製方法も開発されている。ここで、シリコンカーバイドは、上記のような「シリカベース」ではなく、「シリカベース」として定義されるどの組成物にも含まれないことに注意されたい。

市販の種々のキットによって、種々の生体物質からＤＮＡ又はＲＮＡを単離する比較的迅速な手段がもたらされるが、特にＲＮＡを生体源から単離する場合には、シリカベースの核酸単離キットを使用することには限界のあることが知られている。特に少数の細胞からのサンプルを処理する場合、又は、哺乳類の膵臓組織、脾臓組織、肺組織など一部の困難な組織からＲＮＡを単離する場合などには、それら複雑な生体サンプル内のＲＮＡ純度は低く、完全なＲＮＡの回収は困難である。

ＲＮＡ単離における一般的な汚染物質は、ゲノミックＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。一部の市販のＲＮＡ単離キットは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ Ｉ）を用いて、選択的に汚染物質であるｇＤＮＡを酵素の働きにより除去するプロトコルを提供している。しかしながら、ＤＮａｓｅＩ処理を実施すると、商業生産されているＤＮａｓｅＩにはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）が混在している可能性があるため、ＲＮＡの収率が低下し、ＲＮＡの質が低下し得る。また、ＤＮａｓｅＩ処理を用いると、実験時間が長くなり、処理に必要な時間が延長される。さらに、ＤＮａｓｅＩ処理は、後段のプロセスと干渉しかねない金属イオンの添加を必要とする。

よって、実施手順全体に要する時間があまり長くなく、特殊な処理が必要となる危険な廃棄物を生成せず、タンパク質、脂質、ｇＤＮＡ、又は後段の処理もしくは解析を阻害、干渉する可能性のある任意の化学物質などの汚染物質を実質的に含まない単離ＲＮＡをもたらす、容易で、迅速で、安全な方法及び装置が必要とされている。さらに、非シリカベース材料を用いて核酸を捕捉及び単離する方法であって、現在の非シリカベースの方法よりも高いＲＮＡ収率をもたらす、容易で、迅速で、安全で、効果的な方法が必要とされている。

一実施形態では、サンプル内のＲＮＡの完全性を維持しつつ、相当量のｇＤＮＡを除去する方法が開示される。この実施形態では、ガラスファイバー又はホウケイ酸ファイバーからなる少なくとも１つの層が充填されている予備濾過カラムが使用される。この実施形態では、組織／細胞溶解調製物が調製され、該調製物は予備濾過カラムに導入される。予備濾過カラム中をホモジェネートが通過する際、ｇＤＮＡを含む細胞汚染物質はカラム内に残り、一方、流出物には部分的にｔｃＲＮＡが含まれる。一態様では、サンプルに対してさらなる精製プロセス又は後段のプロセスを実施する前に、予備濾過カラムを使用することができる。

他の実施形態では、複雑なサンプル基質から核酸を単離する方法が開示される。本発明の特定の実施形態では、核酸はＲＮＡである。この方法では、カオトロピック剤によりサンプル基質が破壊される。次いで、ｔｃＲＮＡ単離をはじめとする後段のプロセスを最適化するため、有機溶媒がサンプルに加えられる。次に、この調製物を、例えばシリコンカーバイドカラムなどの本発明のカラムに導入することができる。特定の実施形態では、カラムはシリコンカーバイドウィスカー（「ＳｉＣｗ」）カラムである。調製物がカラムを通過して流出した後に、その流出調製物を洗浄することによって、カラム内に残留することなく流出物中に混在している汚染物質を流出調製物から除去し得る。最終的に、所望の核酸製品をカラムから溶出させ単離することができる。

他の実施形態では、予備濾過カラムと、ＳｉＣｗ又は「シリカベース」カラムなどの単離カラムとを共に用いて、核酸を単離する。本実施形態では、組織／細胞溶解物を調製し、次いで予備濾過を実施する。この予備濾過ステップでは、予備濾過スピンカラムを使用する。予備濾過スピンカラムの例としては、限定はしないが、ガラスファイバーカラム又はホウケイ酸カラムが挙げられる。この実施形態の一態様では、ｇＤＮＡが予備濾過カラム基材中に残り、ＲＮＡが流出する。さらに、流出物中のＲＮＡをＤＮａｓｅを用いて処理し、予備濾過ステップで完全に除去されなかったＤＮＡを分解することができる。ＲＮＡ含有流出物を単離カラムにかけ、流出物からＲＮＡを精製する。次いで、ＲＮＡを少量溶出させることができる。

さらに別の実施形態では、本発明はシリコンカーバイドからなる装置に関する。特定の態様では、サンプル基質から核酸を単離するための核酸結合カラムとしてＳｉＣｗカラムを用いる。一態様ではＳｉＣｗがＲＮＡと結合する。

本発明によれば、核酸、特に細胞トータルＲＮＡ（ｔｃＲＮＡ）を単離する装置及び方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、有害な汚染物質を導入することなく、またサンプルに対して実施する手順全体に要する時間をそれほど延長させることなく、生体サンプル内のｇＤＮＡを低減させる、装置及び方法を提供することができる。

本発明は、核酸を単離するために使用される装置及び方法に関する。特に、本発明はｔｃＲＮＡの単離に関する。関連する方法では、本発明は、有害な汚染物質を導入することなく、また、サンプルに対して実施する手順全体に必要となる時間をそれほど延長させることなく、生体サンプル内のｇＤＮＡを低減させる、装置及び方法に関する。

本発明は、複雑なサンプル基質から核酸を単離する方法に関する。本発明の特定の態様では、核酸はＲＮＡである。別の態様では、ＲＮＡはｔｃＲＮＡである。本発明の生体サンプルには、限定はしないが、動物、植物、バクテリアなどの真核生物又は原核生物から得られる細胞及び組織が含まれる。一態様では、動物は哺乳類であってもよく、さらに別の態様では、哺乳類はヒトであってもよい。例えば、植物、イースト菌、真菌、ウィルスなど他のサンプルも考え得る。さらに、サンプルは、例えばポリメラーゼ連鎖反応又は酵素重合反応などの実験プロトコル由来の生成物、アガロースゲルなどの培地に存在する核酸などであってもよい。サンプル基質は、単一鎖又は二重鎖のＲＮＡ及びＤＮＡなど、単一鎖又は二重鎖の核酸を含んでいてもよい。また、変性された核酸も本発明の範囲に包含される。

本発明の予備濾過法及び装置では、ｇＤＮＡ汚染物質を除去するだけではなく、同時にサンプルをホモゲナイズ（均質化）する。ｇＤＮＡ除去とホモゲナイズとを同時に実施することは、通常は溶解とホモゲナイズとが、パワーホモゲナイズ処理などの単一ステップでは完了しないサンプルにとって、特に有利である。例えば、細胞培養物は、典型的には、当分野で既知の溶解溶液により、細胞培養容器又はチューブ内で溶解する。溶解した細胞培養液サンプルのホモゲナイズに失敗すると、サンプルの粘性が高まり、ＲＮＡの収率が低下又は変化し得る。従って、本発明の溶解とホモゲナイズとを同時に行う処理によって、他のホモゲナイズステップの必要性、並びにホモゲナイズステップの不実施に伴う問題、を回避することができる。

本発明の方法により、高度に精製された完全な細胞トータルＲＮＡ（ｔｃＲＮＡ）が得られる。精製されたｔｃＲＮＡとは、サンプル基質由来の汚染物質、並びにプロセス由来の汚染物質が本質的に完全に除去されたｔｃＲＮＡと定義される。これらの汚染物質には、カオトロピック塩、非カオトロピック塩、アルコール、ｇＤＮＡ、タンパク質、脂質、糖質、その他の細胞の残骸が含まれる。汚染物質の検出アッセイとしては、限定はしないが、電気泳動法、分光光度法、ＰＣＲ又は逆転写などの機能アッセイが挙げられる。

一般に、核酸単離の最初のステップは、当分野で周知の方法を用いてサンプルを破壊し、サンプル内に含まれる細胞を溶解させることである。本発明の一態様では、単離すべき核酸は、ｔｃＲＮＡである。高純度の完全なＲＮＡの例には、Ｐ．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＮ．Ｓａｃｃｉによる、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；１６２（１）：１５６−９（１９８７年４月）、及び、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉによる米国特許第４，８４３，１５５号において説明されている方法が含まれる。これらの内容は、参照することで、本明細書に取り入れることとする。その他の方法として、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３年）の第２章（ＤＮＡ）、第４章（ＲＮＡ）に説明されている方法を挙げることができる。参照することで、その内容の全てを本明細書に取り入れることとする。

種々の種類の生体材料からトータルＲＮＡを単離する溶解及び有機抽出法の例に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐ．７．３以下参照（１９８９）；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ」，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．９３以下参照（１９９６）；Ｃｈｉｒｇｗｉｎ Ｊ．Ｍ．らによる、１８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２９４（１９７９）参照。また、従来の技術及びシリカベースの技術に関しては、米国特許第６，２１８，５３１号を参照されたい。参照することで、これらの教示内容の全てを本明細書に取り入れることとする。

本発明では、１つ又は複数のカオトロピック塩を使用する。カオトロープには、例えば、グアニジンイソチオシアネート、アンモニウムイソチオシアネート、グアニジン塩酸塩を用いることができる。当業者であれば、他のカオトロープも本発明の範囲内で使用できることが理解されよう。典型的には、カオトロープの濃度は、約０．５Ｍ〜約５．０Ｍの範囲である。重ねて、これらの濃度は、当業者には既知の、サンプル基質などの要因に応じて変更することができる。カオトロピック剤は、例えば、タンパク質を変性させるために、又は、分子間の相互作用を抑制するために、又は、重要なことには、ヌクレアーゼ（存在すると、対象とする核酸を劣化させてしまう）の作用を抑制するために、用いられる。いくつかの方法を用いて、プロセス全体にわたる核酸の完全性をモニタリングすることができ、その最も一般的な方法は、電気泳動法やＲＴ−ＰＣＲアッセイである。

ホモジェネートは、当業者に周知の方法によりサンプル基質を破壊し、サンプル基質に含まれる細胞を溶解させることで形成される。当該ホモジェネートは、さらに処理することができる。

さらなる処理の例には、シリコンカーバイド粒子を用いて核酸を単離する方法に関して説明している、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄによる米国特許第６，１７７，２７８号及び第６，２９１，２４８号に記載の処理が含まれる。参照することで、これらの特許の記載内容の全てを本明細書に取り入れることとする。Ｈａｊ−Ａｈｍａｄが説明している、核酸単離法では、比較的低い比表面積（ｍ^２／ｇ）のシリコンカーバイド粒状物、即ち、無孔性の、不規則な形状を有する粒子が使用されている。

シリコンカーバイドの代替物として、ガラス粒子、ガラス粉末、シリカ粒子、ガラスマイクロファイバー、珪藻土、及びこれらの化合物の混合物、のようなシリカ材料を、カオトロピック塩水溶液と組み合わせて使用することで、核酸を単離する。

Ｈａｊ−Ａｈｍａｄが開示した方法とは対照的に、本発明の方法は、溶解調製物を予備濾過スピンカラムに導入し、精製ホモジェネートを得るステップを包含する。溶解溶液は、好ましくは、カオトロピック塩、及び／又はターゲット核酸の分解や収率低下を防止する添加物を含む。一態様では、予備濾過カラムは、ガラスファイバー又はホウケイ酸ファイバーカラムである。一態様では、本発明のファイバーには、結合剤は含まれない。結合剤を含まないファイバの例は、「純ホウケイ酸」である。別の態様では、使用するファイバーは結合剤を含んでいてもよい。結合剤を用いることで、固相の濾過剤の取り扱いが容易になる。結合剤はまた、複合材料の特性を変性させるために採用されたプロセスの結果存在することもある。このようなプロセス要素は、ターゲット核酸の最適収率及び純度にとの適合性に応じて選択しなければならない。このような結合剤の例として、限定はしないが、アクリル、アクリル様物質、又はプラスチック様物質が挙げられる。結合剤は、典型的には、ファイバーフィルタ重量の５％を占めるが、この割合は変更し得る。

本発明の他の態様では、有機溶媒が添加される。例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノールなどの低分子量アルコールを、容積で約５０％〜８０％添加する。当該有機溶媒によって、ターゲット核酸の純度が向上したり、及び／又は回収率が向上する。

予備濾過ステップでは、ｇＤＮＡ及び他の汚染物質がスピンカラム中に残留し、所望のＲＮＡは流出物中に含まれる。任意に、この流出物をＤＮａｓｅで処理することで、カラム内に残留することなく流出物中に混在しているＤＮＡが分解される。

本発明のファイバーフィルタ材は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径に相当する粒子保持能を有する。本発明のファイバー材の厚さは、約５０μｍ〜約２０００μｍの範囲とし得る。例えば、典型的なファイバーフィルタの厚さは、計約５００μｍである。ファイバーフィルタの比重は、典型的には、約７５ｇ／ｍ^２〜約３００ｇ／ｍ^２の範囲である。複数のファイバー層からなる実施形態もまた、本発明の範囲内である。

図１に、本発明の典型的なＳｉＣｗカラムの一例を示している。この図には、中にフリット２２が配置されているスピンカラム２０を示している。フリット２２上には、シリコンカーバイドウィスカー２４が配置されている。材料を固定するために、また、シリコンカーバイドウィスカー２４が過剰に膨潤するのを防ぐために、シリコンカーバイドウィスカーの土台に隣接して固定リング２６が配置されている。

当該シリコンカーバイドウィスカーは、核酸を単離するために、比較的高い比重を有する。表面窒素吸着法で測定した場合、本発明に用いているＳｉＣｗは、３．９ｍ^２／ｇであり、一方、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄの材料は０．４ｍ^２／ｇである。ウィスカー技術は、複雑なサンプルから、特にＲＮＡなどの核酸を単離することに関して効果的に機能する。本発明の方法と、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄにより開示された方法との重要な差異は、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄが開示したＲＮＡ単離プロセスでは、完全なＲＮＡは得られず、ｇＤＮＡを除去する方法も包含されていないことである。

上述のように、ＳｉＣｗスピンカラムにサンプルが導入されると、次いで、当該カラムを、遠心分離されることになる収集管内に配置するか、又は真空マニホールド上に乗せることができる。次いで、スピンカラムをマイクロ遠心分離機で遠心分離するか、又はマニホールドを真空にすることで、サンプル調製液がスピンカラム内のＳｉＣｗフィルタを通過し、そして収集チャンバに入る。このとき、予備濾過プロセスで除去されなかった殆どの核酸、即ちＲＮＡ及びｇＤＮＡは、ＳｉＣｗスピンカラム領域に残留する。実施例セクション中の表１及び表２を参照されたい。

任意に、サンプル調製物をスピンカラムに導入するステップの後段ステップとして、汚染物質を除去する洗浄処理と任意選択の酵素処理を実施することができる。例えば、このような処理は、ＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅＩ又はＩＩ）を用いて実施することができる。サンプル結合後のＤＮａｓｅ処理により、残りのｇＤＮＡ汚染物質を除去することができるが、このような処理が必要とされない場合もある。ＤＮａｓｅＩが最も一般的に使用されるＤＮａｓｅであるが、ＤＮａｓｅＩＩもまた使用できる。ＤＮａｓｅＩＩは、脾臓から単離される酵素であって、膵臓から単離されるＤＮａｓｅＩと比較すると、見掛けの分子量、最適ｐＨなどにおいて幾分異なる性質を有しており、異なる塩基を認識し切断するものと考えられる。しかしながら、どちらの酵素も、ＲＮａｓｅフリーにて市販されており、このことは、ＤＮａｓｅ消化後に完全なＲＮＡを得るために重要である。ＤＮａｓｅ処理を実施する場合は、ホモジェネートをカラムに通過させた後、カラムは、例えば少なくとも０．５Ｍの濃度のグアニジンイソチオシアネート、アンモニウムイソチオシアネート、グアニジン塩酸塩などのカオトロピック塩と、約５％〜約１０％のメタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低分子量アルコールを含む洗浄バッファー＃１により１回洗浄し、次いで、約６〜約９のｐＨに中和することができる。例えば、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ含有中和溶液（ｐＨ６〜９、塩化カルシウム及び塩化マグネシウム（又は硫酸塩、塩化マンガン）を含有している）を、サンプルが結合している基材に添加し、約２５℃〜約３７℃の温度で少なくとも５分間培養する。

この培養の後、洗浄バッファー＃１をカラム内のホモジェネートに添加する。次いで、カラムを遠心分離するか、及び／又はカラムを真空にする。

洗浄バッファー＃１により洗浄した後、２５ｍＭ、ｐＨ７のトリス塩化水素（米国テキサス州オースティン、アンビオン社）と、７０％エタノール（米国ミズーリ州セントルイス、シグマ社）とを含んで成る洗浄バッファー＃２により２回続けて洗浄することができる。典型的には、洗浄バッファー＃２は、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノールなどの低分子量アルコールを、約５０ｖｏｌ％〜８０ｖｏｌ％含んでいる。

上記のように、遠心分離及び／又は真空除去のいずれにおいても、洗浄溶液を除去することができる。遠心分離及び／又は真空手順により、カラム材料からアルコールの大部分が除去される。

ＤＮａｓｅ消化を実施しない場合は、サンプルを濾過カラムに通過させた後、洗浄バッファー＃１によりカラムを少なくとも１回洗浄し、次いで洗浄バッファー＃２を用いて洗浄する。洗浄後、カラムから対象物質を溶出させる。例えば、ＳｉＣｗカラムを使用する場合には、最後のステップは、単離され精製された核酸、例えばｔｃＲＮＡを、ＳｉＣｗカラムから溶出させることである。ＳｉＣｗカラムから溶出させるのに用いる溶液は、一般に低いイオン強度を有し、１００ｍＭ未満であり、ｐＨは約６．０〜約８．５である。このような溶液の２つの例として、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを挙げることができる。

さらに、２回目の単離を実施することができる。ＳｉＣｗ（又は他の結合）カラムからの全溶出液に、ＤＮａｓｅ消化を実施することができる。次いで、異なるカラムを用いて、洗浄ステップを含む精製を実施することができる。溶出後に、ＤＮａｓｅ消化を実施する場合は、全サンプルを用いて同じ収集管内で実施することができ、又はアリコートを除去することができる。典型的には、類似のバッファー条件下では、溶出後に実施されるＤＮａｓｅ反応では、より少ない量のＤＮａｓｅ酵素を使用する。溶出後のＤＮａｓｅ消化は、３７℃にて、溶出前に実施する１５分間のＤＮａｓｅ消化よりも短い時間実施することができる。ＥＤＴＡにより反応を終了させることができ、酵素を例えば６５℃の熱で不活性化したり、及び／又はフェノール／クロロホルム抽出などをはじめとする追加の精製手順を実施することができる。

図２は、本発明の予備濾過スピンカラム１０の典型的な実施形態を示している。本発明の特定の態様では、予備濾過カラムは、ファイバーフィルタ材１２からなる少なくとも１つの層（この図では複数の層が図示されている）と、ファイバーフィルタ材の第１の面に隣接して配置されている固定リング１４とを備える。固定リング１４は、ファイバーフィルタ材１２の層を固定し、サンプルを加えたときにファイバーフィルタ材１２が過剰に膨張するのを防止する。図２には、ファイバーフィルタ材１２の第２の面に隣接して配置されているフリット１６もまた描かれている。一態様では、フリット１６は、細孔径が約９０μｍ、厚さが１．５ｍｍのポリエチレンから構成される。フリット１６は、ファイバーフィルタ１２材が変形しないように機械的支持をもたらす機能を有する。

本発明の別の態様では、流出調製物を、例えば本発明のシリコンカーバイドウィスカーカラム（図１）をはじめとするシリコンカーバイドカラムなどの濾過カラムを用いて、さらに精製する。サンプルを本発明のファイバーフィルタを用いて予備濾過した後に、サンプルに対して任意の手順を実施することができる。次いで、ホモジェネートを導入したＳｉＣｗカラムを遠心分離ユニット内の収集管に入れるか、及び／又は真空マニホールド上に配置することができる。シリコンカーバイドウィスカーカラムをマイクロ遠心分離で遠心分離するか（１６０００×Ｇにて〜２分）、及び／又はマニホールドを真空にすることができ、流出物をＳｉＣｗフィルタを通過させて収集チャンバに入れる。目的のターゲット核酸はほとんどシリコンカーバイドウィスカーと結合しカラム内に残留する。特定の態様では、目的の核酸はＲＮＡである。より特定の態様では、ＲＮＡはｔｃＲＮＡである。

本発明の方法及び装置を利用するＲＮＡ単離用キットの、予めパッケージ化された構成要素又は個別に入手可能な構成要素も、本発明の範囲内である。典型的なキットとして、収集管と共にパックされたファイバー予備フィルタ、収集管と共にパックされたＳｉＣｗスピンカラム、又はプラスチック製品（実験者がスピンカラムをパックするのに用いられる）と共にパックされたＳｉＣｗスラリー、又は実験者がスラリー化させパックするための乾燥ＳｉＣｗ、洗浄バッファー＃１及び＃２を含む試薬、エタノールとβメトカプトエタノールなどのアルコール、溶出用収集管を挙げることができる。キットはまた、ＤＮａｓｅ及び／又はプロテイナーゼＫと共に準備又は組み立てることができ、キットを構成する構成要素は、別々に入手できるようにすることもできる。

構成要素の作製
（ａ）シリコンカーバイドウィスカーカラムの作製
サーメット社（米国ニューヨーク州バッファロー）のシリコンカーバイドウィスカーを、水溶液中でスラリー化させた。スピンカラム装置（オロケム社、米国イリノイ州ウェストモント）を真空マニホールド上に乗せ、細孔径が約７μｍのポリエチレンフリット（ポレックス社、米国ジョージア州フェアバーン）をスピンカラム内に配置した。次いで、ＳｉＣｗスラリーをスピンカラム内の前記フリット上に配置し、真空にした。カラムを真空でわずかに乾燥させた。プラスチック固定リングをシリコンカーバイドウィスカー層上に配置し、スピンカラムを固定した。

（ｂ） ファイバーフィルタカラムの作製
この特定の例では、ファイバーフィルタ材としてＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｆ Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｆｉｌｔｅｒ（ｃａｔ番号１８２５−９１５）をフィッシャーサイエンティフィック社（米国ジョージア州アトランタ）から購入した。（購入した大きなシート又はディスク状の）多数の層を、９／３２”ハンドパンチ（マックマスターカー社、米国イリノイ州シカゴ）を用いてパンチし、本発明の予備フィルタを形成し、それを、９０μｍのポリエチレンフリット（ポレックス社、米国ジョージア州フェアバーン）を備えるスピンカラム（オロケム社、米国イリノイ州ウェストモント）内に配置した（その場合、ファイバーフィルタ材は、ポリエチレンフリット上に配置した）。フィルタ材上にしっかりと固定した固定リングを用いてファイバー材をカラムに固定し、ファイバー（オロケム社、イリノイ州ウェストモント）が過剰に膨らむのを防いだ。例として図２を参照されたい。

（ｃ） 試薬の調製
以下の溶液を調製し、又は市販されているものを入手し、後述する実施例に記載される方法において使用した。調製した試薬は全て、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ内で調製し、溶解溶液、ＤＮａｓｅＩ及びプロテイナーゼＫ以外は、室温で保存した。βメルカプトエタノールを含む溶解溶液は４℃で保存し、ＤＮａｓｅＩ及びプロテイナーゼＫは−２０℃で保存した。

溶解バッファー／溶液ストック
４Ｍ グアニジンチオシアネート（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）
２５ｍＭ トリス、ｐＨ７（アンビオン社、米国テキサス州オースティン）
実際の溶液の調製では、βメルカプトエタノールを加えて１４３ｍＭの濃度にした。

洗浄バッファー＃１
１Ｍ グアニジンチオシアネート（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）
２５ｍＭ トリス、ｐＨ７（アンビオン社、米国テキサス州オースティン）
１０％ エタノール（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）

洗浄バッファー＃２
２５ｍＭ トリス、ｐＨ７（アンビオン社、米国テキサス州オースティン）
７０％ エタノール（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）

ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）試薬
ＲＬＴ、ＲＷ１、ＲＰＥバッファーは、製造業者の指示に従って調製した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、部品番号７４１０４、米国カリフォルニア州バレンシア）。

ＤＮａｓｅ Ｉ
ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩは、フェルメンタス社（米国メリーランド州ハノーバー）から入手した。
プロテイナーゼＫは、フェルメンタス社（米国メリーランド州ハノーバー）から入手した。
ＤＮａｓｅ消化バッファー１０Ｘ
１Ｍ トリス、ｐＨ８（アンビオン社、米国テキサス州オースティン）
１００ｍＭ ＭｇＳＯ_４（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）
１００ｍＭ ＣａＣｌ_２（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）
１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）

溶出バッファー
溶出バッファーの３つの例は、ｐＨ６〜９の、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、並びにヌクレアーゼフリー水である。

マウス組織からのＲＮＡの単離
次に、マウスの種々の組織及び細胞からＲＮＡを単離する実験に関して説明する。ＲＮＡは、ＳｉＣｗカラム（図１）を用いて単離した。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（アジレントテクノロジーズ社、カリフォルニア州パロアルト、部品番号Ｇ２９３８Ｂ）において、ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ（アジレントテクノロジーズ社、部品番号５０６５−４４７６）を用いて、分析した。図３及び表１に、多数のアッセイから得られた結果を示している。即ち、図３に示している全てのアッセイが同一のチップ上で実施されたわけではない。図３記載の記号を説明すると、Ｌはアンビオン社ＲＮＡ６０００ Ｌａｄｄｅｒ（部品番号７１５２）のＬａｄｄｅｒであり、レーン１〜２はＳｉＣｗカラムにより単離した脳のＲＮＡ、レーン３〜４はＳｉＣｗカラムにより単離した肝臓のＲＮＡ、レーン５〜６はＳｉＣｗカラムにより単離した腎臓のＲＮＡ、レーン７〜８はＳｉＣｗカラムにより単離した膵臓のＲＮＡ、レーン９〜１０はＳｉＣｗにより単離した脾臓のＲＮＡである。表１には、ＲＮＡ収率をまとめている。

採取直後に液体窒素で急速冷凍したマウスの臓器は、ペルフリーズバイオロジカル社（米国アーカンソー州ロジャーズ）から入手した。あるいはまた、マウスの臓器は、採取後すぐに用いることもできるし、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（アンビオン社、米国テキサス州オースティン）溶液中で保存することもできる。

サンプルの重さを量り、約４〜約８のｐＨを有する過剰な溶解溶液（出願者の方法、典型的には２０倍過剰）中で、ＯＭＮＩ ＴＨ組織ホモジナイザ（オムニ社、米国バージニア州ワレントン）を用いて１５０００ｒｐｍにて３０秒間パワーホモゲナイズを実施した。

細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ 米国バージニア州２０１０８マナサス）から入手し、提供された指示に従って成長させた（表１を参照）。細胞をトリプシン処理（ｔｒｉｐｓｉｎｉｚｅ）し、培養容器から分離し、再び懸濁させ、血球計算器を用いてカウントした。懸濁液を１０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られたペレットを溶解溶液内に再び懸濁させ、最終的な濃度を８．３×１０^６細胞／ｍＬにして、１分にわたって強力に渦動混合した。あるいはまた、細胞を細胞培養容器内に溶解させることもできる。

組織又は細胞のホモジェネート（典型的には３００μＬ〜６００μＬ）を、スピンカラム内のガラスファイバー予備フィルタに加え、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄマイクロ遠心分離機（ブリンクマン社、米国ニューヨーク州ウェストベリー）内で１６０００×ｇにて３分間遠心分離した。

各組織ホモジェネートに、等量の７０％エタノールを加え混合した。シリコンカーバイドウィスカー（ＳｉＣｗ）１５ｍｇを含むスピンカラムを、キャップのない２ｍＬの収集管内に配置し、エタノール含有ホモジェネートを当該スピンカラムに加えた。スピンカラムを１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間スピンさせた。フロースルー（カラムに吸着しなかった物質）を収集管からデカントし、スピンカラムを収集管に戻した。

スピンカラムを５００μＬの洗浄バッファー＃１で洗浄し、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離した。遠心分離後、スピンカラムに対してＤＮａｓｅ消化を実施することができる。ＤＮａｓｅ消化を実施しない場合は、さらに洗浄バッファー＃２を、それぞれの回で５００μＬ及び２５０μＬ加えて、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間２回遠心分離する。次いで、スピンカラムを１６０００×ｇにて２分間遠心分離し、最後の少量の洗浄バッファー＃２を除去した。スピンカラムを２ｍＬの収集管から取り出して、１．５ｍＬのヌクレアーゼフリーマイクロ遠心分離管内に配置した。

ヌクレアーゼフリー水５０μＬでＲＮＡを２回溶出させ、それぞれ、１５秒間及び２分間遠心分離した。次いで、ＲＮＡを−７０℃で保存することができる。

２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を、アジレントテクノロジーズ社の８４５３ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて測定し、溶出したＲＮＡの存在を確認した。

本実験で得たＲＮＡを、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ（アジレントテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、製造業者の指示に従って、アッセイを実施した。ソフトウェアにより生成された画像を図３に示している。

表１及び図３から見てとれるように、本発明による方法及び装置を用いて精製したＲＮＡは、高い収率、純度、完全性を有する。

表１：ＳｉＣｗカラムを用いた場合のＲＮＡ収率（実施例２及び３参照）

以下の実験では、種々の種類のガラスファイバーフィルタ材を用いて、ＲＮＡ単離を実施した。以下、それを並べて示す。

予備濾過装置及びそれに関連する方法に関しては、種々の種類の１６層からなるガラスファイバーフィルタを構成した。Ｗｈａｔｍａｎ Ｔｙｐｅｓ ＧＦ／Ｆ（カタログ番号１８２５〜９１５）及びＧＦ／Ｄ（部品番号１８２３−１５０）は、フィッシャーサイエンティフィック社（米国ジョージア州アトランタ）から入手した。Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｙｐｅｓ Ａ／Ｂ（部品番号６６２１１）及びＴｙｐｅｓ Ａ／Ｄ（部品番号６６２２７）は、ＶＷＲ社（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）から入手した。ＤＮａｓｅ消化を実施するサンプルに関しては、後に概説するオンカラムＤＮａｓｅ消化法を用いた。

以下のサンプルの精製は、製造業者の指示に従ってＱＩＡＧＥＮ（登録商標）シリカベースの方法によって、又は、本発明のシリコンカーバイドウィスカー法と装置を用いて実施した。さらに、オンカラムＤＮａｓｅ消化法を用いた。得られたＲＮＡは、アジレントテクノロジーズ社のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（アジレントテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州パロアルト、部品番号Ｇ２９３８Ｂ）を用いて、同社のＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ（部品番号５０６５−４４７６）により、製造業者の指示に従って、アッセイした。図３は、ソフトウェアにより生成された電気泳動アッセイの結果を示している。

採取後すぐに液体窒素で急速冷凍したマウスの脾臓を、ペルフリーズバイオロジカル社（米国アーカンソー州ロジャーズ）から入手した。脾臓には大量のｇＤＮＡが存在するため、脾臓組織は、ＲＮＡを単離するのがもっとも困難な組織の１つである。そのため、本明細書で示す実施例では、脾臓組織を採用した。予備濾過後、シリコンカーバイドウィスカー（ＳｉＣｗ）及び／又はシリカベース（ＱＩＡＧＥＮ）単離法を用いて、脾臓ＲＮＡを単離した。

サンプルの重さを量り、約４〜約８のｐＨを有する過剰の溶解バッファー（上記のもの）又はキアゲン社のＲＬＴ（典型的には２０倍過剰）中で、ＯＭＮＩ ＴＨ組織ホモジナイザ（オムニ社、米国バージニア州ワレントン）を用いて、３０秒間１５０００ｒｐｍにてパワーホモジナイズした。

組織ホモジェネート（典型的には約３００μＬ〜６００μＬ）は、１６０００×ｇにて３分間遠心分離することにより前処理して、ＱＩＡＧＥＮカラムに使用した。又は、本発明のガラスファイバー予備フィルタに加え、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｄマイクロ遠心分離機（ブリンクマン社、米国ニューヨーク州ウェストベリー）を用いて１６０００×ｇにて３分間遠心分離することにより前処理して、ＳｉＣｗカラムに使用した。

各組織ホモジェネートに、等量の７０％エタノールを加え混合した。次いで、エタノール含有ホモジェネートを、キアゲン社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州バレンシア、部品番号７４１０４）からのミニスピンカラムか、又は本明細書で説明したＳｉＣｗに加えた。

次いで、スピンカラムを１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離した。各々から得られた流出物を収集し、２ｍＬの収集管からデカントし、スピンカラムを収集管の中に戻した。

次いで、スピンカラムを７００μＬのＲＷ１（キアゲン社 ＲＮｅａｓｙカラム）又は７００μＬの洗浄バッファー＃１で洗浄し、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離した。ＳｉＣｗスピンカラムを使用したサンプルに関しては、ＳｉＣｗスピンカラム内容物に対して、以下に説明するように、ＤＮａｓｅ消化を実施するか、又は洗浄バッファー＃２による洗浄を実施した。

ＤＮａｓｅ消化を実施しないカラムに関しては、上記のように、５００μＬ（一回目）及び２５０μＬ（２回目）のＲＰＥ（キアゲン社 ＲＮｅａｓｙカラムバッファー）又は洗浄バッファー＃２を加えて、カラムを、上記のように２回遠心分離した（少なくとも１０秒間、１６０００×ｇ）。２回目の遠心分離を１６０００×ｇにて２分間へと延長し、最終的に微量のＲＰＥ又は洗浄バッファー＃２を除去した。各カラムを、２ｍＬの収集管から取り出し、１．５ｍＬのヌクレアーゼフリーマイクロ遠心分離管内に配置した。５０μＬのヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏを用いて、ＲＮＡを２回溶出させた。次いで、ＲＮＡを−７０℃で保存した。

上記のように、例えば、洗浄バッファー＃２を加える前に、サンプルを任意にＤＮａｓｅ処理することができる。ＤＮａｓｅ処理を実施するカラムに関しては、ＤＮａｓｅＩを、最終的には１００μＬの容積になるように、１ＸＤＮａｓｅバッファー中で０．５μｇ／μＬの濃度にまで希釈し、ＳｉＣｗのカラムに加えた。（本明細書に記載する本発明の方法においては、ＤＮａｓｅバッファーとして、例えば１００ｍＭ程度の低濃度の塩を使用しているが、殆どの従来の方法では高濃度の塩を必要とすることに注意されたい。例えば、オンカラム消化用の一部の市販のＤＮａｓｅバッファーには、１Ｍもの塩化ナトリウムが使用されている）。ＤＮａｓｅは、高濃度のイオンに非常に敏感であるため、本発明の方法では、イオン強度を強めたり、結合を保持したりする塩を使用しない（上記実施例１において列挙されている試薬を参照されたい）。例えば、本実施例では、１０ｍＭの塩化カルシウムしか使用しない。次いで、２５℃にて１５分間カラムを培養した。洗浄バッファー＃１を５００μＬ加え、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離して消化を終了させた。次いで、洗浄バッファー＃２で洗浄し、最終的に微量の洗浄バッファー＃２を除去した後に、上記のように溶出を実施した。ＱＩＡＧＥＮ法を利用するサンプルに関しては、ＤＮａｓｅ消化は実施しなかった。

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、５’ヌクレアーゼアッセイ又は「リアルタイム」ＰＣＲアッセイ実施して、ゲノミックＤＮＡの汚染物質を定量化した。この種のアッセイでは、各ＰＣＲサイクルで蓄積されるＰＣＲ生成物の量がモニタリングされる。これは、ＰＣＲ生成物を検出するための、非常に高感度で再現性の高いアッセイである。

マウス脾臓から単離したｔｃＲＮＡ（〜２０ｎｇ）を、マウスに特異的なプライマとプローブを含有する反応混合物（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿００８０８４）グリセラアルデヒド−３−フォスフェート デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ）に加えた。全てのサンプルを、５００ｎＭの両プライマ、２００ｎＭの蛍光プローブ、及び１Ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（部品番号４３０４４４３７）から構成される反応混合物内で、当分野で周知の条件下で実施した。マウスのゲノミックＤＮＡ（プロメガ社、米国ワイオミング州マディソン）を倍々希釈して、標準曲線を作った。全てのサンプル、標準サンプル、非鋳型対照サンプルに関して、２回実施した。

マウスのＧＡＰＤＨアッセイにより、エクソン内で７８塩基対のフラグメントが増幅された。ＧＡＰＤＨアッセイのプライマとプローブは、プライマ発現ソフトウェアパッケージ（アプライドバイオシステム社、米国カリフォルニア州フォスターシティ、部品番号４３２９４４２）において使用されるように設計されている。プライマは脱塩され、また、プローブ（５’が６−ＦＡＭにより、３’がＢＨＱ−１により標識化されている）は、陰イオン交換、それに次ぐ逆位相ＨＰＬＣ（バイオサーチテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州ナバト）により、精製された。

両アッセイに関するアッセイサイクリングパラメータ（ａｓｓａｙ ｃｙｃｌｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）は、製造業者によって設定されたデフォルト条件（即ち、５０℃にて２分間、９５℃にて１０分間、次いで９５℃にて１５秒間と６０℃にて１分間を４０サイクル）であった。単離されたｔｃＲＡＮ中のｇＤＮＡの定量は、マウスのｇＤＮＡ標準曲線から計算し実施した。

表２は、遠心分離、予備濾過、ＤＮａｓｅ消化、ＱＩＡＧＥＮ法、本発明のＳｉＣｗ法などを種々に組み合わせて、予備濾過及び／又はオンカラムＤＮａｓｅ消化を施した際の、ｇＤＮＡの低減を示す、定量的ＰＣＲアッセイの結果である。表２は、図３に示す脾臓ｔｃＲＮＡ実験に関するＲＮＡ収率及びｇＤＮＡ汚染を示すものである。ｇＤＮＡ汚染が高いサンプルについては収率を示していない。ｇＤＮＡの量は、上記実施例で説明したリアルタイムＰＣＲアッセイにより決定した。

図４は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙで検出されたｇＤＮＡ汚染物質濃度を示している。ｇＤＮＡ濃度は、レーン１〜３、１０〜１２、１６〜１８、１９〜２１では高レベルであるが、例えばレーン４〜６では低レベルである。図４の凡例は、以下の通りである。Ｌは、Ａｍｂｉｏｎ ＲＮＡ６０００ Ｌａｄｄｅｒ（部品番号７１５２）のラダー、レーン１〜３は、精製した（遠心分離した）ホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン４〜６は、ＧＦ／Ｆで予備濾過したホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン７〜９は、ＧＦ／Ｆで予備濾過したホモジェネートをオンカラムＤＮａｓｅ消化処理しＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン１０〜１２は、ＧＦ／Ｄで予備濾過したホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン１３〜１５は、Ａ／Ｂで予備濾過したホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン１６〜１８は、Ａ／Ｄで予備濾過したホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン１９〜２１は、精製した（遠心分離）ホモジェネートをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎで単離した脾臓ＲＮＡ、レーン２２〜２４は、ＧＦ／Ｆで予備濾過しＲＮｅａｓｙｃｏｌｕｍｎで単離した脾臓ＲＮＡである。

このアッセイによって、特定の種類のファイバーとフィルタだけが、総ｇＤＮＡ汚染物を効果的に除去できることが実証された。例えば、レーン４、５及び６からわかるように、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｆフィルタ材を使用することが効果的であった。この場合、最終的な溶出サンプルには、ｇＤＮＡ汚染物質はほとんど含まれておらず、ＤＮａｓｅ消化は実施しなかった。同様に、本発明のガラスファイバーフィルタを使用した予備濾過法によってＱＩＡＧＥＮ法を補足したレーン２２〜２４では、ＱＩＡＧＥＮ法を使用した他の全サンプル／レーンと比較して、存在するｇＤＮＡ汚染物がはるかに少なかった。

対照的に、レーン１０〜１２及び１６〜１８では、かなり多くのｇＤＮＡが存在した。レーン１０〜１２では、約３μｍの粒子を保持する能力を有するフィルタ材を使用し、また、レーン１６〜１８では、約１μｍの粒子を保持する能力を有するフィルタ材を使用したが、一方、レーン４〜６及び２２〜２４で使用したフィルタ材は約０．７μｍの粒子を保持する能力を有するものであった。従って、フィルタの種類、組成、性能を最適化する必要がある。

表２及び図４を参照すると、ＤＮａｓｅ消化を実施しないレーン１〜３、１０〜１２、１６〜１８、１９〜２１では、ＲＮＡ定量化が本質的に無意味になるほど多くのｇＤＮＡ汚染物質の存在することが観察された。しかしながら、レーン４〜６及び２２〜２４の結果から、本発明の予備濾過法及び装置は、本質的に無視できる量のｇＤＮＡ汚染に帰着することが確認された。実際、予備濾過では、ＤＮａｓｅ処理を実施しなくても、ＤＮａｓｅ処理後に残存するｇＤＮＡとほとんど同程度のｇＤＮＡしか残さずに、ＤＮａｓｅ処理とほぼ同じＲＮＡ収率が得られる。本発明の予備濾過法と装置を使用したレーン４〜６のＲＮＡ収率及びｇＤＮＡ量と、従来のＤＮａｓｅ処理と予備濾過法を組み合わせて実施したレーン７〜９のＲＮＡ収率及びｇＤＮＡ量を比較されたい。予備濾過とＤＮａｓｅ消化を組み合わせると、除去されるｇＤＮＡはやや多くなるが、本発明の方法及び装置だけで、全てのｇＤＮＡを実質的に除去することができ、実験者は、特定の用途において望まれる場合には、ＤＮａｓｅ処理を回避することができる。

ＱＩＡＧＥＮ法に関しては、これらの方法で使用するＤＮａｓｅ消化はプロメガ社によって説明されており、そのプロトコルはＱＩＡＧＥＮキットに採用されている。しかしながら、ＤＮａｓｅ消化の使用は、常に、最終用途に依存する。例えば、ＱＩＡＧＥＮキットを使用しても、ノーザンハイブリダイゼーションではＤＮａｓｅ消化はおそらく不必要であろう。従って、ＤＮａｓｅ消化を使用するかしないか、また必要であるかないかは、ＲＮＡを単離する最終用途に依存する。

本発明の方法及び装置によって、ＲＮＡを単離する元のサンプルから効果的にｇＤＮＡを除去し、ＤＮａｓｅ消化を不必要にし（しかし必要な場合はＤＮａｓｅ消化と両立できる）、特にシリカベースのキットである市販のＲＮＡ単離キット（例えばキアゲン社のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ）と共に機能し、それらの効果を高めることが確認された。

表２：図３に示す単離ｔｃＲＮＡに関する、ＲＮＡ収率及びｇＤＮＡ汚染量

マウス肝臓ホモジェネート
マウス肝臓ホモジェネートを上記のように調合し、ＲＮＡ単離に用いた。実施例２で示した、濾過したホモジェネートに７０％エタノールを加える手順の代わりに、等量のＲＮａｓｅフリー水、７０％イソプロパノール又はメタノールを加えた。この混合液をＳｉＣｗスピンカラムに加え、次いで、上記のようなＲＮＡ単離を実施した。

２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ８４５３ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定し、溶出したＲＮＡの存在を確認した。

この結果を表３に示している。

表３：ＲＮＡ収率

植物組織からのＲＮＡ単離
シロイヌナズナの葉の重さを量り、ＯＭＮＩ ＴＨ組織ホモジナイザ（オムニ社、米国バージニア州ワレントン）を用いて、過剰の溶解バッファー内で１５０００ｒｐｍにて３０秒間パワーホモジナイズした。採取後に葉の組織を冷凍し、上記のようにホモジナイズすることもできる。

組織ホモジェネート（典型的には約３００μＬ〜６００μＬ）を、１６０００×ｇにて２分間遠心分離することにより前処理した。又は、本発明のガラスファイバー予備フィルタに加え、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｄマイクロ遠心分離機（ブリンクマン社、米国ニューヨーク州ウェストベリー）を用いて、１６０００×ｇにて２分間遠心分離することにより前処理した。

各組織ホモジェネートに、等量の７０％エタノール（結合促進剤の一例）を加え混合した。次いで、スピンカラムを１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離した。各サンプルからの流出物を収集し、それぞれ２ｍＬの収集管からデカントし、スピンカラムを収集管に戻した。

次いで、５００μＬの洗浄バッファー＃１を用いてスピンカラムを洗浄し、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間遠心分離した。次いで、上記のように各カラムに、１回目は５００μＬ、２回目は２５０μＬの洗浄バッファー＃２を加えて、１６０００×ｇにて少なくとも１０秒間２回遠心分離した。２回目の遠心分離を１６０００×ｇにて２分間に延長して、最終的に微量の洗浄バッファー＃２を除去した。次いで、各カラムを２ｍＬの収集管から取り出し、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離管内に配置した。次いで、５０μｌのヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏを用いて、ＲＮＡを２回溶出させた。次いで、ＲＮＡを−２０℃又は−７０℃で保存した。

植物組織のＲＮＡ単離の結果を図５に示す。得られたＲＮＡについて、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（アジレントテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州パロアルト、部品番号Ｇ２９３８Ｂ）において同社のＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ（部品番号５０６５−４４７６）を用いて、製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。図５は、コンピュータで生成した、電気泳動アッセイ結果のプリントアウトである。図５の凡例は、以下の通りである。Ｌは、Ａｍｂｉｏｎ ＲＮＡ６０００ Ｌａｄｄｅｒ（部品番号７１５２）のラダー、レーン１〜３は、ＧＦ／Ｆで予備濾過したホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離したシロイヌナズナのＲＮＡ、レーン４〜６は、精製した（遠心分離した）ホモジェネートをＳｉＣｗカラムで単離したシロイヌナズナのＲＮＡである。

図４及び表２に示す動物組織と同様に、レーン１〜３に示す結果から、本発明の予備濾過方法と装置を使用することで、植物組織サンプルからもほとんどのｇＤＮＡを除去し得ることが理解されよう。実際、予備濾過後に存在するｇＤＮＡ濃度は、高感度アッセイを使用しても検出できなかった。

ゲノミックＤＮＡ汚染物質は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）において、５’ヌクレアーゼアッセイ、又は「リアルタイム」ＰＣＲアッセイにより定量化した。この種のアッセイでは、ＰＣＲサイクル毎に蓄積するＰＣＲ生成物の量がモニタリングされる。これはＰＣＲ生成物を検出するための、非常に高感度で再現性の高いアッセイである。

シロイヌナズナの葉から単離したｔｃＲＮＡ（２００ｎｇ）を、１８ＳリボソームＲＮＡに対して特異的なプライマ及びプローブを含む反応混合物に添加した。製造業者の基準によれば、全サンプルを、５００ｎＭの両プライマ、２００ｎＭの蛍光プローブ、１Ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（部品番号４３０４４４３７）から構成される反応混合液内で実施した。シロイヌナズナの葉から精製したゲノミックＤＮＡを倍々希釈して標準曲線を作った。全サンプル、標準サンプル、非鋳型対照サンプルについて２回実施した。

このアッセイによって、エクソン内で１８７塩基対のフラグメントが増幅される。プライマ及びプローブは、プライマ発現ソフトウェアパッケージ（アプライドバイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ、部品番号４３２９４４２）を使用して設計した。プライマは脱塩され、また、プローブ（５’が６−ＦＡＭにより、３’がＢＨＱ−１により標識化されている）は、陰イオン交換、及びそれに次ぐ逆位相ＨＰＬＣ（バイオサーチテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州ナバト）により精製した。両アッセイのアッセイサイクリングパラメータは、製造業者が設定したデフォルト条件であった。即ち、５０℃にて２分間、９５℃にて１０分間、次いで９５℃にて１５秒間から６０℃にて１分間を４０サイクル実施した。

単離したｔｃＲＮＡ中のｇＤＮＡの定量は、シロイヌナズナｇＤＮＡ標準曲線から計算して実施した。この結果を表４に示す。図５及び表４に示す結果によって、本発明のガラスファイバー予備濾過法と装置が、植物組織においても使用できる汎用性を有することを示している。

表４：図５に示す単離ＲＮＡに関する、ＲＮＡ収率及びｇＤＮＡ汚染量

他の組織の単離
上記の単離精製法に加え、皮膚、心臓及び筋肉のような、結合組織及び構造タンパク質の多い組織からのＲＮＡの単離もまた、プロテイナーゼＫ処理により容易になる。この場合、まず始めに、そのような組織を上記のようにホモジナイズし、等量の水をサンプルに加える。次いで、プロテイナーゼＫを加えて、最終的な濃度を１ユニット／１００μＬにし、混合し、５５℃にて１０分間培養することができる。次いで、本発明の予備フィルタカラムを用いてホモジェネートを遠心分離することができる（さらなる処理を実施してもしなくてもよい）。この場合、上記のＤＮａｓｅ処理を実施してもよいし実施しなくてもよい。

また、固相抽出（ＳＰＥ）カラム及び真空ポンプと共に使用するよう設計されている真空マニホールドを用いて、多くのサンプルからのＲＮＡ調製を容易にすることができる。サンプルは上記のようにホモジナイズし、精製し、エタノールなどの低分子量アルコールと混合する。本発明のＳｉＣｗカラムを使用する場合には、ＳｉＣｗスピンカラムを真空マニホールドに乗せ、コックを閉じた位置にする。次いで、エタノールを含むホモジェネートをカラムに加え、コックを開いてホモジェネートを流すことができる。次いで、コックを閉じて、洗浄バッファー＃１を５００μＬ加え、再びコックを開く。先述のように、５００μＬ及び２５０μＬの洗浄バッファー＃２を用いて、このプロセスを繰り返す。次いで、コックを２分間開いたままにしてスピンカラムを乾燥させ、次にスピンカラムを１．５ｍＬマイクロ遠心分離管内に配置して、先述の最終溶出を実施する。

特定の実施形態を参照して本発明を具体的に例示し、説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細について種々の変更が可能であることが理解されよう。

本発明のＳｉＣｗカラムの概略図 本発明の予備フィルタカラムの概略図 本発明の種々のガラスファイバーフィルタを用いて種々の哺乳類の組織及び細胞培養物からＲＮＡを単離した結果 本発明の種々のガラスファイバーフィルタを用いて種々の哺乳類の組織及び細胞培養物から単離されたＲＮＡ中のｇＤＮＡ汚染物質濃度 本発明の種々のガラスファイバーフィルタを用いて植物細胞からＲＮＡを単離した結果

符号の説明

１０ 予備濾過スピンカラム
１２ ファイバーフィルタ材
１４、２６ 固定リング
１６、２２ フリット
２０ スピンカラム
２４ シリコンカーバイドウィスカー

Claims (23)

1. ゲノミックＤＮＡを実質的に含まないサンプルを調製する方法であって、
   （ａ）生体サンプルから組織／細胞溶解物を形成するステップと、
   （ｂ）ガラスファイバー又はホウケイ酸ファイバーからなる少なくとも１つの層を有するフィルタ材１２を備える予備濾過カラム１０に、前記溶解物を接触させるステップと、
   （ｃ）前記予備濾過カラム１０から前記ゲノミックＤＮＡを実質的に含まない流出物を収集するステップと、
   を包含する方法。
2. 前記溶解物が、カオトロピック剤を含む溶解バッファーを用いて形成される、請求項１に記載の方法。
3. 前記生体サンプルが、動物及び植物の組織及び／又は細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記動物組織及び／又は細胞が、血液、尿、毛髪、皮膚、筋肉、骨、体液、臓器抽出物などからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記フィルタ材１２が、約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の粒子を保持する能力を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記フィルタ材１２が、約５０μｍ〜約２０００μｍの範囲の厚さを有する、請求項１に記載の方法。
7. 前記フィルタ材１２が、約７５ｇ／ｍ^２〜約３００ｇ／ｍ^２の範囲の比重を有する、請求項１に記載の方法。
8. サンプル基質から核酸を単離する方法であって、
   （ａ）溶解バッファーを用いて前記サンプル基質に含まれる組織及び細胞を破壊して、サンプル調合物を形成するステップと、
   （ｂ）前記（ａ）のサンプル調合液を、シリコンカーバイドカラムに接触させるステップと、
   （ｃ）前記シリコンカーバイドカラムから核酸を溶出させるステップと、
   を包含する方法。
9. 前記ステップ（ａ）が、ＤＮＡ消化を含む、請求項８に記載の方法。
10. サンプル基質から核酸を単離する方法であって、
    （ａ）溶解バッファーを用いてサンプル基質から組織／細胞溶解物を形成するステップと、
    （ｂ）ガラスファイバー又はホウケイ酸ファイバーからなる少なくとも１つの層を有するフィルタ材１２を備える予備濾過カラム１０に、前記溶解物を接触させるステップと、
    （ｃ）前記カラムから前記ゲノミックＤＮＡを実質的に含まない流出物を収集するステップと、
    （ｄ）前記（ｃ）の前記流出物を、シリコンカーバイドカラムに接触させるステップと、
    （ｅ）前記シリコンカーバイドカラムから核酸を溶出させるステップと、
    を包含する方法。
11. 前記核酸が、ＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ステップ（ｃ）が、ＤＮＡ消化を含む、請求項１０に記載の方法。
13. １つ又は複数のカオトロピック剤が前記溶解バッファーにおいて使用されている、請求項２、８又は１０の何れか一項に記載の方法。
14. 前記カオトロピック剤が、グアニジンイソチオシアネート、アンモニウムイソチオシアネート、グアニジン塩酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記カオトロピック剤の濃度が、約０．５Ｍ〜約５．０Ｍの範囲である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ステップ（ａ）に、１つ又は複数の有機溶媒結合促進剤が含まれる、請求項８又は１０の何れか一項に記載の方法。
17. 前記有機溶媒結合促進剤が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアルコールである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記シリコンカーバイドカラムが、シリコンカーバイドウィスカーカラム２０であり、該シリコンカーバイドウィスカーカラムがフリット２２を有しており、シリコンカーバイドウィスカー２４が前記フリット２２に隣接している、請求項８又は１０の何れか一項に記載の方法。
19. 前記溶解バッファーが、βメルカプトエタノールを含む、請求項２、８又は１０の何れか一項に記載の方法。
20. 前記溶解バッファーが、約４〜約８の範囲のｐＨを有する、請求項２、８又は１０の何れか一項に記載の方法。
21. 前記溶出ステップが、ヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏ、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウムからなる群から選択される溶出バッファーを用いて実施される、請求項８又は１０の何れか一項に記載の方法。
22. 前記溶出バッファーが、約６〜約９の範囲のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記溶出ステップから得られた溶出液に、ＤＮＡ消化に適する条件でデオキシリボヌクレアーゼを加えるステップをさらに包含する、請求項８又は１０の何れか一項に記載の方法。

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