JP2001522238A - 胃腸管の疾患の検出に有用な試薬および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 CS198と称される、連続的または部分的に重複したcDNA配列のセット、およびそれにコードされGI管組織から転写されるポリペプチドを記載する。これらの配列は、個体におけるGI管癌などのGI管の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。また、GI管の疾患、腫瘍または転移の治療に有用な分子である、CS198コード化ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体、および組織特異的CS198ポリペプチドの作用を妨げるアゴニストまたは阻害剤を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 胃腸管の疾患の検出に有用な試薬および方法 発明の背景 本発明は、全般に、胃腸管器官の疾患の検出に関する。特に、本発明は、ポリ ヌクレオチド配列、それによりコードされているポリペプチド配列などの試薬、 およびこれらの配列を利用する方法に関する。これらは、癌などのGI管の疾患ま たは状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療また は素因の判定に有用である。 GI管の器官は、食道、胃、小腸、大腸、直腸および膵臓を含む。米国で1996年 の間に推定された約225,900件のGI管癌の新たな症例のうち、131,200件が結腸直 腸癌によるものであろう。さらに、GI管癌は約127,070件の関連死の原因であろ う（American Cancer Societyの統計）。その高い発生率に加えて、GI管癌は著 しく致死的となる可能性があり、例えば、膵臓癌患者の97％以上が該疾患で死亡 する(H.J.Waneboら，Cancer 78:580-91(1996))。 一般に、侵入前段階のGI管癌の初期検出は、疾患関連死亡率 を劇的に減少させる。しかしながら、この段階では、ごく僅かのGI管癌しか検出 されない。例えば、癌に進行する前に摘出可能な前癌性ポリープに関するスクリ ーニングによりこの段階で検出されるのは、結腸直腸癌の37％にすぎない。結腸 直腸癌のスクリーニングに使用する主な方法は、便潜血試験（FOBT）およびフレ キシブルS状結腸鏡検査である（A.M．Cohenら，Cancer:Principles and Practic e of Oncology ，第４版，pp．929-977，Philadelphia，PA:J/B．Lippincott Co ．(1993)）。FOBTは非侵襲性であり、簡便であり、安価であるが、その感度は低 く、例えば、ある研究では、結腸直腸癌の検出感度は僅か26％であった（D.A.Ah lquistら，JAMA 269:1262-1267(1993)）。さらに、フレキシブルS状結腸鏡検査 は、初期癌および前駆体ポリープの検出に関して高感度であるが、それは侵襲性 であり、高価であり、日常的なスクリーニングに使用するには余りにも高度な技 術が要求される（D.F．Ransohoffら，JAMA 269:1278-1281(1993)）。また、膵臓 癌の僅か8％および胃癌の18％が前侵入段階で検出されるにすぎない（American Cancer Societyの統計）。したがって、癌などのGI管疾患の検出のための改良さ れたスクリーニング方法が必要とされている。 GI管癌に関する決定的な診断を確定するために現在使用されている標準的な方 法には、バリウム検査、内視鏡検査、生検およびコンピュータ断層撮影（CT）が 含まれる。これらの方法は侵襲的であり高価である。さらに、これらの方法はい ずれも、技術的な理由により又は結果の主観的な解釈により又は該方法の感度の 不足により、誤った診断につながる可能性がある(M.F．Brennanら，Cancer:Prin ciples and Practice of Oncology ，第４版，pp．849-882，Philadelphia，PA:J .B．Lippincott Co．(1993))。 ある特定のGI管癌の診断が確認された後、該疾患の解剖学的な度合を決定する ために病期分類が行なわれる。病期分類は、生検および／または手術で得た組織 に関して病理学者によって行なわれる。正確な病期分類は、患者の成り行きを予 測し最適療法の設計のための基準を得るために決定的に重要である。不正確な病 期分類は、不十分な治療判断につながる可能性があり、結腸直腸癌における主要 な臨床的問題となっている。したがって、GI管癌を病期分類するための、より高 感度の診断方法が必要とされている。 罹患器官の外科的切除は、GI管癌と診断された大多数の患者に対する典型的な 療法であるが、放射線療法および／または化 学療法を受ける患者もいる。療法に対する該患者の応答を評価し、持続性または 再発性疾患および遠隔転移を検出するために、これらのすべての患者をモニター する必要がある。CEAおよびCA19-9を含む種々のマーカーをアッセイすることが 可能であり、放射線医学的方法および結腸内視術と共に該アッセイ結果を用いて 患者の進行をモニターすることができる（E.L．Jacobs，Curr ．Probl．Cancer 1 5(6):299-350(1991)）。しかしながら、これらのモニター技術は、これらの患者 の進行をモニターするための正確かつ有効な手段を提供するに至っていない。 侵襲性が可能な限り小さい方法により得られる血液、血漿、血清などの試験サ ンプル中の種々の疾患マーカーの出現に基づくアッセイは、癌などの疾患の診断 、治療プロトコールの選択、および選択した療法の成否のモニターの際に医師を 助ける低コストで正確な情報を与えるであろう。そのようなマーカーは、いくつ かの範疇に分類されている。第１の範疇は、疾患において上昇するマーカーを含 む。具体例には、精巣癌およびトロボブラスト疾患において上昇するヒト絨毛性 ゴナドトロピン（hCG）、肝細胞癌（HCC）において上昇するαフェトプロテイン （AFP）が含まれる（E.L．Jacobs(前掲)）。第２の範疇は、 疾患において定性的に変化するmRNAまたはタンパク質マーカーを含む。具体例に は、膀胱癌におけるCD44のmRNAスプライス変異体、ならびに肺癌および結腸直腸 癌におけるp53タンパク質中の突然変異が含まれる（Y．MatsumuraらJournal of Pathology ，175(補遺):108A(1995);W.P．Bennett，Cancer Detection and Preve ntion 19(6):503-511(1995)）。第３の範疇は、特異的な組織、器官または器官 系においては正常に発現されるが不適当な身体画分中に出現するタンパク質マー カーを含む。例えば、前立腺特異的抗原（PSA）は、精液中に高レベルで分泌さ れる正常なタンパク質である。PSAは、正常な前立腺を有する男性の血液中には 非常に低レベルでしか存在しないが、良性前立腺肥大（BPH）、前立腺の腺癌な どの前立腺疾患を有する患者の血中では著しく上昇する。PSAは、血中に高レベ ルで存在すれば、前立腺疾患の有力な指標となる（P.H．LangeらUrology 33(6補 遺):13(1989)）。同様に、癌胎児性抗原（CEA）は、結腸疾患を有さない者の血 中に低レベルで存在する結腸の正常な内側裏打ち成分である（E.L．Jacobs(前掲 )）。しかしながら、CEA濃度は、炎症性腸疾患、結腸の腺癌などの結腸疾患と診 断された多数の患者の血液、血漿または血清中で著しく 上昇し、結腸直腸疾患の指標として用いられる。 不適当な身体画分中の疾患マーカーを検出する更に他の具体例がある。転移癌 の場合には、血液、骨髄またはリンパ節が、原発性腫瘍に由来する細胞であって 該原発性腫瘍に典型的なmRNAまたはタンパク質マーカーを発現しうる細胞を含有 している可能性がある。例えば、CEAおよびPSAは、それぞれ転移性結腸直腸癌お よび前立腺癌を有する患者のリンパ節または骨髄中に免疫組織学的に見いだされ ている（B.R．Davidsonら，Cancer 65:967-970(1990);J.L．Mansiら，J ．Urol. ，139:545-548(1988)）。また、RT-PCRは、結腸および前立腺癌を有する患者に おいて遠隔部位でCEAおよびPSA mRNAを検出しており、これは転移細胞の存在を 示唆するものである（M．Gerhardら，J ．Clin．Oncol．12:725-729(1994);A.E． Katzら，Urology 43:765-775(1994)）。正常な遺伝子産物の不適当な出現が疾患 の指標となりうる他の画分には、全血、尿、唾液および糞便が含まれるが、これ らに限定されるものではない。現在のところ、膵臓、胃および食道癌の初期検出 のために一般に許容されているマーカーは存在しない。さらに、結腸直腸癌を検 出するための改良されたマーカーが必要とされている。 したがって、GI管に関連した疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニタ ー、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のための特異的な方法および 試薬を提供したり、またはこれらの状態の、可能な素因を示すことは有益であろ う。そのような方法は、GI管の疾患および状態（例えば、癌）において過剰発現 される遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイすることを含むであろう。 また、そのような方法は、GI管の疾患または状態に関連した遺伝子変化の産物に 関して試験サンプルをアッセイすることを含むであろう。さらに、そのような方 法は、身体の種々の組織および画分中の分布がGI管関連疾患または状態（例えば 、癌）により変化している遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイするこ とを含むであろう。有用な試薬には、生検された組織、血液または他の試験サン プルから抽出したmRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、PCRまたはハ イブリダイゼーションアッセイなどの診断方法において使用しうるポリヌクレオ チドまたはその断片；そのようなmRNAの翻訳産物であるポリペプチドまたはタン パク質；またはこれらのタンパク質に対する抗体が含まれる。このように、GI管 の疾患または状態に対する薬物治療または遺伝子治療は、 これらの同定された遺伝子配列またはそれらの発現されたタンパク質に基づくこ とが可能であり、いずれかの特定の療法の効力をモニターすることが可能である 。さらに、初期段階のGI管疾患（例えば、癌）を検出する能力を有する代替的な 非外科的診断方法が利用可能になれば、有益であろう。発明の概要 本発明は、試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドを検出する方法であ って、該試験サンプルを、少なくとも１つのCS198特異的ポリヌクレオチドと接 触させ、該試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドの存在を検出すること を含んでなる方法を提供する。CS198特異的ポリヌクレオチドは、配列番号1、配 列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号 8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14 、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20 、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26 、配列番号27(「配列番号１〜27」、およびそれらの断片または相補体よりなる 群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有する。 また、該方法を行なう前に、CS198特異的ポリヌクレオチドを固相に結合させる ことが可能である。 本発明はまた、試験サンプル中のCS198 mRNAを検出する方法であって、少なく とも１つのプライマーで逆転写（RT）を行なってcDNAを得、得られたcDNAを、CS 198オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとし て使用して増幅して、CS198アンプリコンを得、試験サンプル中のCS198 mRNAの 存在の指標として該CS198アンプリコンの存在を検出することを含んでなり、該C S198オリゴヌクレオチドが、配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よ りなる群から選ばれる配列に対して少なくとも50％の同一性を有することを特徴 とする方法を提供する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応により行なうことができ る。また、該方法を行なう前、増幅の前または検出の前に、該試験サンプルを固 相と反応させてもよい。この反応は、直接的または間接的な反応であってもよい 。さらに、該検出工程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使 用を含む。この検出可能な標識は、固相に結合させることが可能である。 本発明はさらに、標的CS198ポリヌクレオチドを含有する疑 いのある試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドの検出方法であって、（a ）該試験サンプルを、センスプライマーとしての少なくとも１つのCS198オリゴ ヌクレオチドおよびアンチセンスプライマーとしての少なくとも１つのCS198オ リゴヌクレオチドと接触させ、増幅して第１段階反応産物を得、（b）該第１段 階反応産物を少なくとも１つの他のCS198オリゴヌクレオチドと接触させて、第 ２段階反応産物を得（ただし、前記の、他のCS198オリゴヌクレオチドは、工程 （a）で使用するCS198オリゴヌクレオチドの3'側に位置し、該第１段階反応産物 に相補的である)、（c）該試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドの存在 の指標として該第２段階反応産物を検出することを含んでなる方法を提供する。 該方法において試薬として選択するCS198オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜27 およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくと も50％の同一性を有する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応により行なうことがで きる。また、該方法を行なう前、または増幅の前、または検出の前に、直接的ま たは間接的に該試験サンプルを固相と反応させることが可能である。また、該検 出工程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使 用を含む。さらに、この検出可能な標識は、固相に結合させることが可能である 。また、試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドを検出するのに有用な試 験キットであって、配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群 から選ばれる少なくとも１つのCS198特異的ポリヌクレオチドを含有する容器を 含んでなる試験キットを提供する。これらの試験キットはさらに、試験サンプル （例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器 を含む。そのような手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび 吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便 サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または 不可逆的吸着を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集 材料を処理することが可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるた めに、該採集材料を保存剤、安定化剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材 料に保存剤、安定化剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。 本発明はまた、CS198遺伝子に由来する精製されたポリヌクレオチドまたはそ の断片を提供する。該精製ポリヌクレオチド は、CS198遺伝子またはその相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする能力を 有する。該ポリヌクレオチドは、（a）配列番号7〜13およびそれらの相補体、（ b）配列番号15〜26およびそれらの相補体、ならびに（c）配列番号7〜26の断片 よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有 する。さらに、該精製ポリヌクレオチドは、組換えおよび／または合成技術によ り製造することができる。該精製組換えポリヌクレオチドは、組換えベクター中 に含有されていることが可能である。本発明はさらに、該組換えベクターでトラ ンスフェクトされた宿主細胞を含む。 本発明はさらに、CS198に由来するオープンリーディングフレームを含む核酸 配列を含んでなる組換え発現系を提供する。該核酸配列は、配列番号1〜27およ びそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも50 ％の同一性を有する。該核酸配列は、所望の宿主に和合性の制御配列に作動的に 結合している。また、この組換え発現系でトランスフェクトされた細胞を提供す る。 本発明はまた、CS198にコードされるポリペプチドを提供する。該ポリペプチ ドは、組換え技術により製造し、精製形態で 提供することが可能であり、または合成技術により製造することか可能である。 該ポリペプチドは、（a）配列番号43〜47、および（b）配列番号42〜47の断片よ りなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有するア ミノ酸配列を含む。 また、少なくとも１つのCS198エピトープに特異的に結合する抗体を提供する 。該抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが可能で ある。該エピトープは、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ば れるアミノ酸配列に由来する。試験サンプル中のCS198抗原または抗CS198抗体の 存在を判定するためのアッセイキットも含まれる。１つの実施態様では、該アッ セイキットは、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミ ノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有する少なくとも１つのCS198ポリ ペプチドを含有する容器を含む。さらに、該試験キットは、試験サンプル（例え ば、血液、尿、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含む 。そのような手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙 または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または 糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性ま たは不可逆的吸着を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの 採集材料を処理してもよい。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、 これらの採集材料を保存剤、安定化剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材 料に保存剤、安定化剤または抗微生物剤を含有させてもよい。また、該ポリペプ チドを固相に結合させることが可能である。 試験サンプル中のCS198抗原または抗CS198抗体の存在を判定するためのもう１ つのアッセイキットは、CS198抗原に特異的に結合する抗体を含有する容器を含 んでなり、該CS198抗原は、少なくとも１つのCS198コード化エピトープを含む。 該CS198抗原は、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるCS1 98コード化抗原の配列に対して少なくとも60％の配列類似性を有する。さらに、 該試験キットは、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採集す るのに有用な手段を有する容器を含む。そのような手段には、血液を採集し安定 化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するための スワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採 集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着 を避けるために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理し てもよい。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、これらの採集材料 を保存剤、安定化剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定 化剤または抗微生物剤を含有させてもよい。また、該抗体を固相に結合させるこ とが可能である。 CS198のエピトープの少なくとも１つを含有するポリペプチドの製造法であっ て、発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートすること を含んでなる製造法を提供する。このベクターは、配列番号42〜47およびそれら の断片よりなる群から選ばれるCS198アミノ酸配列に対して少なくとも50％の同 一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配 列を含む。 また、CS198抗原を含有する疑いのある試験サンプル中のCS198抗原を検出する 方法を提供する。該方法は、CS198抗原のエピトープの少なくとも１つに特異的 に結合する抗体またはその断片と該試験サンプルとを、抗体／抗原複合体の形成 に十分な時間および条件下で接触させ、該抗体を含有するそのような 複合体の存在を、該試験サンプル中のCS198抗原の存在の指標として検出するこ とを含む。該抗体は、固相に結合させることが可能であり、モノクローナル抗体 またはポリクローナル抗体であることが可能である。さらに、該抗体は、配列番 号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれる少なくとも１つのCS198抗 原に特異的に結合する。 これらの抗体を含有する疑いのある試験サンプル中のCS198抗原に特異的に結 合する抗体を検出する、もう１つの方法を提供する。該方法は、CS198ポリヌク レオチドにコードされるアミノ酸またはその断片に対して少なくとも50％の同一 性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのCS198エピトープを含有するポ リペプチドと該試験サンプルとを接触させることを含む。接触は、抗原／抗体複 合体の形成が可能となるのに十分な時間および条件下で行なう。該方法はさらに 、該ポリペプチドを含有する複合体を検出することを含む。該ポリペプチドは、 固相に結合させることが可能である。さらに、該ポリペプチドは、配列番号42〜 47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも 50％の同一性を有する組換えタンパク質または合成ペプチドであってもよい。 本発明は、CS198抗原のエピトープの少なくとも１つ又はその断片をコードす るCS198核酸配列でトランスフェクトされた細胞を提供する。該核酸配列は、配 列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる。 また、CS198抗原に対する抗体の製造法であって、少なくとも１つのCS198エピ トープを含む単離された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を個体に投与する ことを含んでなる製造法を提供する。該免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を引 き起こすのに十分な量で個体に投与する。この単離された免疫原性ポリペプチド は、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を 含む。 CS198抗原に特異的に結合する抗体のもう１つの製造法であって、配列番号42 〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に由来する少なく とも１つのCS198エピトープをコードする核酸配列を含むプラスミドを哺乳動物 に投与することを含んでなる製造法を開示する。該プラスミドが該個体内の細胞 により取込まれ、免疫応答を産生するのに十分なレベルで発現される量で、該プ ラスミドを投与する。 また、（a）配列番号7〜13およびそれらの相補体、（b）配 列番号15〜26およびそれらの相補体、ならびに（c）配列番号７〜26の断片より なる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有する 少なくとも約10〜12ヌクレオチドのCS198ポリヌクレオチドを含んでなる組成物 を提供する。該CS198ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのCS198エピトープを 有するアミノ酸配列をコードする。本発明が提供するもう１つの組成物は、約8 〜10アミノ酸のCS198エピトープの少なくとも１つを有するポリペプチドを含む 。該ポリペプチドは、（a）配列番号43〜47、および（b）配列番号42〜47の断片 よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有する アミノ酸配列を含む。また、配列番号47に対して少なくとも50％の同一性を有す るCS198ポリペプチドをコードする遺伝子またはその断片、および配列番号26に 対して少なくとも50％の同一性を有するDNAを含んでなる遺伝子またはその断片 を提供する。図面の簡単な説明 図1A〜1Gは、ゲノムクローンg2804590（配列番号1〜6）に由来するエキソン配 列、クローン2682428（配列番号7）、2682469（配列番号8）、3359342（配列番 号9）、1736231（配列番号10）、 1734520（配列番号11）、2596108（配列番号12）、3388863（配列番号13）、g23 22685（配列番号14）、3988413（配列番号15）、3615515（配列番号16）、20553 71（配列番号17）、1431231（配列番号18）、3253860（配列番号19）、1753756 （配列番号20）、1887713（配列番号21）、1803052（配列番号22）、889029（配 列番号23）、2620906（配列番号24）、1754901（配列番号25）；クローン205537 1の完全長配列（クローン2055371IH（配列番号26）と称される）；およびそれら に由来するコンセンサス（Consensus）配列（配列番号27）のヌクレオチドアラ インメントを示す。 図２は、ゲノムクローンg2804590（配列番号1〜6）に由来するエキソン配列お よび重複クローン2682428（配列番号7）、2682469（配列番号8）、3359342（配 列番号9）、1736231（配列番号10）、1734520（配列番号11）、2596108（配列番 号12）、3388863（配列番号13）、g2322685（配列番号14）、3988413（配列番号 15）、3615515（配列番号16）、2055371（配列番号17）、1431231（配列番号18 ）、3253860（配列番号19）、1753756（配列番号20）、1887713（配列番号21） 、1803052（配列番号22）、889029（配列番号23）、2620906（配列番号24）、17 54901 （配列番号25）、および2055371IH（配列番号26）のヌクレオチドアラインメン トからのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号27）の形成を表すコンティグ 地図を示す。 図３は、種々の組織からのRNAの臭化エチジウム染色アガロースゲルのスキャ ン、およびRNAの対応ノーザンブロット（CS198放射能標識プローブを使用するも の）である。 図４および図５は、CS198特異的プライムドPCR増幅産物の染色アガロースゲル のスキャンである。 図６は、CS198合成ペプチドに対する抗血清を使用するヒト組織抽出物のパネ ルのウエスタンブロットのスキャンである。矢印は、45kDのタンパク質に結合す る抗体を表すバンドを示す。発明の詳細な説明 本発明は、配列番号47に対して少なくとも約50％の同一性を有するCS198ポリ ペプチドをコードする遺伝子またはその断片を提供する。本発明はさらに、配列 番号に対して少なくとも約50％の同一性を有するDNAを含んでなるCS198遺伝子ま たはその断片を含む。 本発明はまた、CS198と称される胃腸管（GI管）組織遺伝子の産物に関して試 験サンプルをアッセイするための方法であっ て、該試験サンプル中のmRNAからcDNAを調製し、GI管組織遺伝子CS198の存在の 指標として該cDNAを検出することを含んでなる方法を提供する。該方法は、CS19 8に由来する、該遺伝子またはその断片に対応する１以上のmRNA部分を増幅する 増幅工程を含む。また、CS198の翻訳産物に関してアッセイするための方法を提 供する。本発明で提供する方法によりアッセイしうる試験サンプルには、組織、 細胞、体液および分泌物が含まれる。本発明はまた、これらの方法を実施するの に有用なオリゴヌクレオチドプライマー、ポリペプチドなどの試薬を提供する。 本明細書で開示する核酸配列の一部は、RNAの逆転写のための、またはcDNAの 増幅のためのプライマーとして、あるいは試験サンプル中の或るmRNA配列の存在 を判定するためのプローブとして有用である。また、診断用イムノアッセイにお ける基準または試薬として、医薬スクリーニングアッセイの標的として、および ／または、種々の療法のための成分または標的部位として有用なそれによりコー ドされているポリペプチド配列の製造を可能にする核酸配列を開示する。これら のポリペプチド配列内に含有される少なくとも１つのエピトープに対するモノク ローナル抗体およびポリクローナル抗体は、CS198に関連し た疾患または状態（特にGI管癌）の治療剤の運搬剤として有用であり、また、該 疾患または状態に関する診断試験およびスクリーニングに有用である。関心のあ る遺伝子の他の部分の配列の単離は、これらの核酸配列に由来するプローブまた はPCRプライマーを用いて行なうことができる。これは、確認すべき関心のある ｍRNAまたはcDNAの追加的なプローブおよび対応するコード化ポリペプチド配列 を可能にする。これらの追加的な分子は、本明細書に開示するCS198により特徴 づけられるGI管の疾患および状態（例えば、GI管癌）の検出、診断、病期分類、 モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。 アミノ酸配列の「類似性」を判定するための技術は、当該技術分野でよく知ら れている。一般に、「類似性」は、アミノ酸が、同一であるか、または類似した 化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有するところ の、適当な位置における２以上のポリペプチドの厳密なアミノ酸対アミノ酸の比 較を意味する。したがって、いわゆる「類似性の割合（％）」は、比較されるポ リペプチド配列の間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性 を判定するための 技術も、当該技術分野でよく知られており、その遺伝子に関するmRNAのヌクレオ チド配列を決定し（通常は、cDNA中間体を介して）、それにコードされるアミノ 酸配列を決定し、これともう１つのアミノ酸配列とを比較することを含む。一般 に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞ れ、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致を意味 する。２以上のポリヌクレオチド配列は、「同一性（％）」を決定することによ り比較することができる。同様に、２以上のアミノ酸配列は、それらの「同一性 の割合（％）」を決定することにより比較することができる。Wisconsin Sequen ce Analysis Package，Version ８（Genetics ComputerGroup，Madison，WIから 入手可能）において入手可能なプログラム、例えばGAPプログラムは、２つのポ リヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性 との両方を計算する能力を有する。配列間の同一性または類似性を計算するため の他のプログラムが、当該技術分野で公知である。 本明細書に記載の組成物および方法は、GI管組織の疾患または状態の指標とし ての或るマーカーの同定を可能にし、それか ら得られる情報は、CS198に関連した疾患および状態（特にGI管癌）の検出、診 断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定の助け となるであろう。試験方法には、例えば、本発明で提供する配列を利用し核酸増 幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼチェイン反応(LCR)およ びハイブリダイゼーションを利用しうるプローブアッセイが含まれる。また、本 発明で提供するヌクレオチド配列は、免疫原性エピトープを見出すことが可能な オープンリーディングフレームを含有する。このエピトープは、CS198に関連し た病態または状態に特有であると考えられている。また、ポリヌクレオチドまた はこのCS198遺伝子によりコードされているポリペプチドおよびタンパク質は、 マーカーとして有用であると考えられている。このマーカーは、GI管癌などの疾 患において上昇するか、GI管癌などの疾患において変化しているか、または正常 なタンパク質として存在するが不適当な身体画分中に出現する。該エピトープの 特有性は、（i）CS198遺伝子にコードされているタンパク質およびポリペプチド に対する抗体に対するその免疫反応性および特異性、および（ii）他の任意の組 織マーカーに対するその非反応性により測定することができ る。免疫反応の測定方法は、よく知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ （RIA）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ELISA）、赤血球凝集反応（HA）、蛍 光偏光イムノアッセイ（FPIA）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）などを含むが 、これらに限定されるものではない。適当な方法のいくつかの例は、本明細書に 記載されている。 特に示さない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとする。 示されている配列に「由来」する又は「特異的」なポリヌクレオチドは、示さ れているヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、一致した又は相補的で ある）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、 より好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくと も約15〜20ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する 。該配列は、当該技術分野で公知の技術で判定した場合に、ある特定のポリヌク レオチド配列に特有の配列と相補的または同一であろう。示されている配列の特 有性を判定する方法として、例えば、データバンク中の配列の比較を用いること ができる。配列が由来する領域には、特異 的エピトープをコードする領域、ならびに非翻訳および／または非転写領域が含 まれるが、これらに限定されるものではない。該由来ポリヌクレオチドは、必ず しも、研究中の関心のあるヌクレオチド配列に物理的に由来するとは限らず、該 ポリヌクレオチドが由来する領域中の塩基配列から得られる情報に基づく化学合 成、複製、逆転写または転写を含む（これらに限定されるものではない）任意の 方法で生成させることができる。このように、これは、元のポリヌクレオチドの センスまたはアンチセンス配向であってよい。さらに、示されている配列の領域 に対応する領域の組合せを、意図する用途に適合するように、当該技術分野で公 知の方法で修飾することができる。 特定されているポリヌクレオチドの「断片」は、示されているヌクレオチド配 列の領域に対応する（すなわち、一致した又は相補的である）少なくとも約６ヌ クレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくと も約10〜12ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約15〜20ヌクレオチド の連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。 「プライマー」なる語は、標的ヌクレオチド配列に相補的で あり該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるのに使用する特定のオリゴ ヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラー ゼまたは逆転写酵素により触媒されるヌクレオチドの重合の開始点として働く。 「プローブ」なる語は、相補的配列を含有するサンプル中に存在する特定のポ リヌクレオチドを同定するために使用しうる一定の核酸セグメント（またはヌク レオチド類似体セグメント、例えば、後記で定義するPNA）を意味する。 「コード（されている）」は、ポリペプチド配列が核酸配列にコードされてい ることを意味する（該ポリペプチドまたはその一部は、該核酸配列にコードされ ているポリペプチドからの少なくとも3〜5アミノ酸、より好ましくは少なくとも 8〜10アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも15〜20アミノ酸のアミノ酸配列 を含有する）。また、該配列にコードされているポリペプチドにより免疫学的に 同定可能なポリペプチド配列が含まれる。したがって、「ポリペプチド」、「タ ンパク質」または「アミノ酸」配列は、CS198アミノ酸配列に対して少なくとも 約50％の同一性、好ましくは約60％の同一性、より好ましくは約75〜85％の同一 性、最も好ましくは約90〜95％以上の同一性 を有する。さらに、CS198「ポリペプチド」、「タンパク質」または「アミノ酸 」配列は、CS198のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して少なくとも約60％ の類似性、好ましくは少なくとも約75％の類似性、より好ましくは約85％の類似 性、最も好ましくは約95％以上の類似性を有することが可能である。このアミノ 酸配列は、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46およ びそれらの断片よりなる群から選ぶことが可能である。 本明細書では互換的に用いることがある「組換えポリペプチド」、「組換えタ ンパク質」または「組換え技術により製造されたポリペプチド」なる語は、本来 的に又は操作により、天然において伴われているポリペプチドの全部または一部 が伴われていないポリペプチド、および／または、天然で結合しているポリペプ チド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを意味する。組換え又はコ ード化ポリペプチドまたはタンパク質は、必ずしも、示されている核酸配列から 翻訳されるわけではない。また、それは、化学合成または組換え発現系の発現を 含む任意の方法で得ることができよう。 本発明で用いる「合成ペプチド」なる語は、当業者によく知 られている方法で化学的に合成することが可能な、任意の長さのアミノ酸の重合 形態を意味する。これらの合成ペプチドは、種々の用途において有用である。 本発明で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、リボヌクレオチドまたはデオ キシリボヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。こ の用語は、該分子の一次構造のみをさす。したがって、該用語は、二本鎖および 一本鎖のDNAならびに二本鎖および一本鎖のRNAを含む。また、それは、該ポリヌ クレオチドのメチル化体またはキャップ形成体などの修飾体、および非修飾形態 を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」およ び「オリゴ」は、本明細書中では互換的に用いる。 「cDNAに対応する配列」は、該配列が、示されているDNA中の配列と同一また は相補的であるポリヌクレオチド配列を含有することを意味する。cDNAに対する 同一性または相補性の程度（または割合（％））は、約50％以上、好ましくは少 なくとも約70％以上、より好ましくは少なくとも約90％以上となろう。特定され ているcDNAに対応する配列は、少なくとも約50ヌクレオチド長、好ましくは少な くとも約60ヌクレオチド長、より 好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長となろう。関心のある遺伝子または遺 伝子断片と該cDNAとの間の対応度は、当該技術分野で公知の方法により決定する ことができ、例えば、配列決定された物質と、記載されているcDNAとの直接比較 、またはハイブリダイゼーション、および一本鎖ヌクレアーゼによる消化、およ びそれに続く、該消化断片のサイズの測定を含む。 「精製（された）ポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチドが天然において 伴われているタンパク質を実質的に含まない（例えば、その約50％以上、好まし くは約70％以上、より好ましくは約90％以上を含有しない）関心のあるポリヌク レオチドまたはその断片を意味する。関心のあるポリヌクレオチドを精製するた めの技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ポリヌクレオチドを含 有する細胞をカオトロピック試薬で破壊すること、およびイオン交換クロマトグ ラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に応じた沈降によるポ リヌクレオチドおよびタンパク質の分離を含む。 「精製（された）ポリペプチド」または「精製（された）タンパク質」は、関 心のあるポリペプチドが天然において伴われている細胞成分を実質的に含まない （例えば、その約50％以上、 好ましくは約70％以上、より好ましくは約90％以上を含有しない）関心のあるポ リペプチドまたはその断片を意味する。関心のあるポリペプチドを精製するため の方法は、当該技術分野で公知である。 「単離（された）」なる語は、該物質が、その元の環境（例えば、それが天然 に生じるものである場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。 例えば、生きた動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプ チドは、単離されていないが、天然系中の共存物質の一部または全部から分離さ れている同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは、単離されてい る。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部となることが可能であり、お よび／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部 となることが可能であり、それらもまた、該ベクターまたは組成物がその天然環 境の一部でないため単離されている。 「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中では互換的に用い、共 有結合および／または非共有結合で結合したアミノ酸の分子鎖の少なくとも１つ を示す。これらの用語は、特定の長さの該産物を意味するものではない。したが って、ポ リペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる 。これらの用語は、該ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチ ル化、リン酸化などを含む。また、タンパク質断片、類似体、突然変異または変 異タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意義に含まれる。 特定されているポリペプチドの「断片」は、その特定されているポリペプチド に由来する少なくとも約3〜5アミノ酸、より好ましくは少なくとも約8〜10アミ ノ酸、より一層好ましくは少なくとも約15〜20アミノ酸を含むアミノ酸配列を意 味する。 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」お よび単細胞体として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他のそのよう な用語は、組換えベクターまたは他の導入DNAのレシピエントとして使用しうる 又は使用されている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代 （original progeny）を含む。 本発明で用いる「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位 として挙動するプラスミド、染色体、ウイルスなどの任意の遺伝要素を意味する 。 「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合し ているレプリコンであり、例えば該結合セグメントの複製および／または発現を 引き起こす。 「制御配列」なる語は、それが結合しているコード配列の発現を引き起こすた めに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿 主生物によって異なる。原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモ ーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含み、真核生物では、その ような制御配列は、一般に、プロモーター、ターミネーター、および場合によっ てはエンハンサーを含む。したがって、「制御配列」なる語は、発現するために 存在することを要する全成分を最低限含むと意図され、また、存在すれば有利で ある追加的な成分（例えば、リーダー配列）を含んでいてもよい。 「作動的に結合」は、記載されている成分が、それらの意図される様態で機能 しうる関係で存在している状況を意味する。したがって、例えば、コード配列に 「作動的に結合」している「制御配列」は、該制御配列に適合しうる条件下で該 コード配列の発現が達成されるように連結されている。 「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、ポリペプチドをコード するポリヌクレオチド配列の領域を意味する。 この領域は、コード配列の一部または全コード配列に相当する。 「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合に、mRNAに転写 されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。該コード配列の境 界は、5'末端の翻訳開始コドンと、3'末端の翻訳停止コドンとにより定められる 。コード配列には、mRNA、cDNAおよび組換えポリヌクレオチド配列を含めること が可能であるが、これらに限定されるものではない。 「免疫学的に同定可能」なる語は、示されているポリペプチド中に存在しそれ に特有なエピトープおよびポリペプチドの存在を意味する。免疫学的同一性は、 抗体結合および／または結合における競合により判定することができる。これら の技術は、当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。また、エピトー プの特有性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関するGenBank などの公知データバンクのコンピューター検索により、また、他の公知タンパク 質とのアミノ酸配列の比較により判定することができる。 本発明で用いる「エピトープ」は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原決定 基を意味する。エピトープは、該エピトープに特有の空間コンホメーションにお いて３個のアミノ酸を含む ことが可能である、と考えられる。一般に、エピトープは、少なくとも５個のそ のようなアミノ酸よりなり、通常、それは、少なくとも8〜10個のアミノ酸より なる。空間コンホメーションを調べる方法は、当該技術分野で公知であり、例え ば、X線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。 「コンホメーションエピトープ」は、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の 特異的な配置を含むエピトープであり、そのようなアミノ酸は、連続的または不 連続的な順序で同一ポリペプチド上に存在するか又は異なるポリペプチド上に存 在する。 ポリペプチド内に含有される特異的エピトープの抗体認識により該ポリペプチ ドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドは抗体に対して「免疫反応性」である 。免疫反応性は、抗体結合により、より詳しくは抗体結合の速度論により、およ び／または、該抗体に対するエピトープを含有する公知ポリペプチドを競合体と して用いる結合における競合により測定することができる。ポリペプチドが抗体 に対して免疫反応性であるか否かを判定する方法は、当該技術分野で公知である 。 本発明で用いる「関心のあるエピトープを含有する免疫原性ポリペプチド」は 、関心のある天然に生じるポリペプチドまた はその断片、および他の手段（例えば、化学合成、または組換え生物中での該ポ リペプチドの発現）で製造されたポリペプチドを意味する。 「トランスフェクション」なる語は、原核性または真核性宿主細胞内に外因性 ポリヌクレオチドを導入することを意味し、その導入に用いる方法には無関係で ある。「トランスフェクション」なる語は、ポリヌクレオチドの安定な導入およ び一過性の導入の両方を意味し、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形 質導入およびｆ接合を含む。外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入され たら、非組込みレプリコン（例えば、プラスミド）として維持されることが可能 であり、あるいは宿主ゲノム内に組込まれることが可能である。 「処置」は、予防および／または治療を意味する。 本発明で用いる「個体」なる語は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意 味し、家畜、競技用動物、霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されるもの ではない。この用語は、特にヒトを意味する。 本発明で用いる「センス鎖」または「プラス鎖」(または「＋」)なる語は、 該ポリペプチドをコードする配列を含有する核酸を 意味する。「アンチセンス鎖」または「マイナス鎖」（または「−」）は、「プ ラス」鎖の配列に相補的な配列を含有する核酸を意味する。 「試験サンプル」なる語は、被検体（例えば、関心のある抗体または関心のあ る抗原）の起源である個体の身体の成分を意味する。これらの成分は当該技術分 野でよく知られている。試験サンプルは、典型的には、標的配列を含有する疑い のあるものである。試験サンプルは、当該技術分野でよく知られた方法により、 例えば、個体から試料を得、必要に応じて、それが含有するいずれかの細胞を破 壊して標的核酸を遊離させることにより調製することができる。これらの試験サ ンプルには、本明細書に記載の本発明の方法により試験することができる生物学 的サンプルが含まれ、ヒトおよび動物の体液、例えば、全血、血清、血漿、脳脊 髄液、痰、気管支洗液、気管支吸引液、尿、リンパ液、および気道、腸管および 尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など；生物学的流体 、例えば、細胞培養上清；固定しうる組織試料；および固定しうる細胞試料が含 まれる。 「精製（された）産物」は、該産物が通常伴っている細胞構 成成分から、また、関心のあるサンプル中に存在しうる他の型の細胞から単離さ れている産物の調製物を意味する。 「PNA」は、標的の存在を判定するための本明細書に記載のアッセイなどの方 法で使用しうる「ペプチド核酸類似体」を意味する。「MA」は、標的の存在を判 定するための本明細書に記載のアッセイなどの方法で使用しうるモルホリノ類似 体を意味する。例えば、米国特許第5,378,841号を参照されたい。PNAは、RNA標 的またはDNAに指向しうる中性に荷電している部分である。例えば本発明のDNAプ ローブの代わりにアッセイで使用するPNAプローブは、DNAプローブを使用した場 合には達成できない利点をもたらす。これらの利点には、製造可能性、大規模標 識、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する不感受性、およびDNAまたはRNA を用いる方法において存在する酵素分解に対する抵抗性が含まれる。これらのPN Aは、フルオレセイン、放射性ヌクレオチド、化学発光性化合物などのシグナル 生成化合物で標識（「付加」）することができる。したがって、DNAまたはRNAの 代わりに、PNAまたは他の核酸類似体、例えばMAを、アッセイ方法において使用 することができる。本明細書には、DNAプローブを使用するアッセイが記載され ているが、RNA またはDNAの代わりにPNAまたはMAを使用し、必要に応じて、アッセイ試薬におけ る適当な変更を加えることは、当業者の技量の範囲内に含まれる。 本発明で用いる「被検体」は、試験サンプル中に存在する可能性がある検出す べき物質である。該被検体は、天然に生じる特異的結合メンバー（例えば、抗体 ）に対する物質、または特異的結合メンバーを与えうる任意の物質であることが 可能である。したがって、被検体は、アッセイにおいて１以上の特異的結合メン バーに結合しうる物質である。また、「被検体」は、任意の抗原物質、ハプテン 、抗体およびそれらの組合せを含む。天然に生じる特異的結合パートナー（ペア ）を用いて（例えば、ビタミンB12を測定するために特異的結合ペアのメンバー として内因子タンパク質を使用して、あるいは葉酸を測定するために葉酸結合タ ンパク質を使用して、あるいは炭水化物を測定するために特異的結合ペアのメン バーとしてレクチンを使用して）、該被検体を特異的結合ペアのメンバーとして 検出することができる。該被検体には、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、 ヌクレオチド標的などを含めることができる。 「GI管の疾患」、「GI管疾患」および「GI管の状態」は、 本発明では、食道、胃、小腸、大腸、直腸および膵臓の任意の疾患または状態、 例えば、バレット食道、胃潰瘍、胃炎、平滑筋腫、ポリープ、クローン病、潰瘍 性大腸炎、膵炎、癌など（これらに限定されるものではない）を示すために互換 的に使用する。 本発明で用いる「GI管癌」は、腺癌、粘液性腺癌、カルチノイド腫瘍、扁平上 皮癌、リンパ腫および肉腫を含む（これらに限定されるものではない）胃腸管の 任意の悪性疾患を意味する。 「発現しているタグ配列」または「EST」は、組織から抽出されたmRNAの逆転 写およびそれに続くベクター内への挿入により作製されたcDNA挿入断片の部分配 列を意味する。 「転写産物イメージ」は、ライブラリー中のESTの量的分布を示す表または一 覧を意味し、該ライブラリーが由来する組織内で活性な遺伝子を表す。 本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。本発明で用い る「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアのメンバーである。すなわち、２ つの異なる分子のうちの一方か、化学的または物理的に、もう一方の分子に特異 的に結合する。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体 特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとして、ビオチンおよびアビジン 、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容 体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含めることができる。 さらに、特異的結合ペアには、元の特異的結合メンバーの類似体（例えば、被検 体類似体）であるメンバーを含めることができる。免疫反応性特異的結合メンバ ーには、組換えDNA分子により形成されたものを含む、抗原、抗原断片、抗体お よび抗体断片（モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複 合体）が含まれる。 本発明で用いる「ハプテン」なる語は、抗体に結合する能力を有するが、担体 タンパク質に結合しない限り抗体形成を惹起する能力を有さない部分抗原または 非タンパク質結合メンバーを意味する。 本発明で用いる「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイにおいては該被検体に 特異的な、あるいは競合アッセイにおいては指示試薬に特異的な、あるいは間接 アッセイにおいては補助的特異的結合メンバー（それ自体は、該被検体に特異的 である）に特異的な未標識の特異的結合メンバーを意味する。該アッセ イの実施前または該アッセイの実施中に、該捕捉試薬を固相材料に直接的または 間接的に結合させて、試験サンプルから固定化複合体を分離できるようにするこ とが可能である。 「指示試薬」は、特異的結合メンバーに共役（「付加」）している、外的手段 により検出可能な測定可能なシグナルを生成する能力を有し該シグナルを生成す る「シグナル生成化合物」（「標識」）を含む。該指示試薬は、特異的結合ペア の抗体メンバーであることに加えて、ハプテン−抗ハプテン系（例えば、ビオチ ンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補 的ヌクレオチド配列、エフェクターまたは受容体分子、酵素補因子および酵素、 酵素阻害剤または酵素など）を含む任意の特異的結合ペアのメンバーとなること も可能である。免疫反応性の特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにお ける関心のあるポリペプチド、または競合アッセイにおける捕捉試薬、または間 接アッセイにおける補助的特異的結合メンバーのいずれかに結合する能力を有す る抗体、抗原または抗体／抗原複合体でありうる。プローブおよびプローブアッ セイを説明する場合に、「レポーター分子」なる語を用いることがある。レポー ター分子は、特異的結合ペアの特異的 結合メンバーに共役した前記のシグナル生成化合物（例えば、カルバゾールまた はアダマンタン）を含む。 意図される種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、発色性物質、触媒（ 例えば、酵素）、発光性化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、 化学発光性化合物（例えば、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニ ウムおよびルミノール）、放射性要素および直接可視標識が含まれる。酵素には 、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β -ガラタトシダーゼなどが含まれる。個々の標識の選択は、決定的に重要ではな いが、それ自体で又は１以上の追加的物質と共にシグナルを生成する能力を有す るものでなければならない。 「固相」（「固体支持体」）は、当業者に公知であり、反応トレーのウェルの 壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性または非磁性ビーズ、ニトロセルロース 小片、膜、微粒子（例えば、ラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物の）赤 血球および 可能な、ピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドで固定された赤血球）な どを含む。「固相」は決定的に重要なもので はなく、当業者であれば選択することができよう。例えば、ラテックス粒子、微 粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェル の壁、ガラスまたはシリコ はすべて、適当な具体例である。ペプチドを固相上に固定化するための適当な方 法には、イオン、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。本発明で用いる「 固相」は、不溶性であるか又は後続の反応で不溶性にすることができる任意の材 料を意味する。固相は、捕捉試薬を誘引し固定化するその固有能力に関して選択 することができる。あるいは、固相は、捕捉試薬を誘引し固定化する能力を有す る追加的な受容体を保有することが可能である。追加的な受容体には、捕捉試薬 自体とは反対に荷電した、あるいは捕捉試薬に共役した荷電物質とは反対に荷電 した荷電物質を含めることが可能である。あるいはまた、該受容体分子は、特異 的結合反応により捕捉試薬を固定化する能力を有し固相上に固定化（付加）され ている任意の特異的結合メンバーであることが可能である。該受容体分子は、ア ッセイの実施前またはアッセイの実施中に捕捉試薬が固相材料に間接的に結合す るのを可能にする。したがって、固相は、プラスチッ ク、誘導プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン 表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（ま たは他の動物の）赤血球、 ある。 検出抗体の接近を許容するのに十分な多孔性と、抗原を結合させる適当な表面 親和性とを有する、適当な任意の多孔性材料を、固相が含むことも可能であると 期待され、そのような場合も本発明の範囲内に含まれる。多孔性構造が一般に好 ましいが、水和化状態のゲル構造を有する材料も使用できる。そのような有用な 固体支持体には、ニトロセルロースおよびナイロンが含まれるが、これらに限定 されるものではない。本明細書に記載のそのような多孔性固体支持体は、好まし くは、約0.01〜0.5mm、好ましくは約0.1mmの厚さのシートの形態であると意図さ れる。該孔径は、広範囲の値を取ることが可能であり、好ましくは約0.025〜15 ミクロン、特に好ましくは約0.15〜15ミクロンである。そのような支持体の表面 は、該支持体に対する抗原または抗体の共有結合を引き起こす化学的方法により 活性化することができる。しかしながら、一般には、十分には理解されていな い疎水性力による多孔性材料上での吸着により、抗原または抗体の不可逆的結合 を得る。他の適当な固体支持体は、当該技術分野で公知である。 試薬 本発明は、関心のあるGI管組織に由来しCS198と称されるポリヌクレオチド配 列、それにコードされるポリペプチド、これらのポリペプチドに特異的な抗体な どの試薬を提供する。本発明はまた、開示されているポリヌクレオチドおよびこ れらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列に由来するオリゴヌクレオチド断片 などの試薬を提供する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を 使用して、GI管癌などのGI管の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニタ ー、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定につながる情報を得ることが できる。本明細書に開示の配列は、遺伝子転写活性の特異的プロフィールを得る ために又はアッセイで使用しうる特有のポリヌクレオチドである。そのようなア ッセイは、欧州特許第0373203B1号および国際公開WO 95/11995に開示されている 。 選択したCS198由来ポリヌクレオチドを、正常な又は変化した遺伝子発現の検 出のために本明細書に記載の方法で使用する ことができる。そのような方法では、CS198ポリヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド、それらの断片もしくは誘導体、またはそれらに相補的な核酸配列を使 用することができよう。 本明細書に開示のポリヌクレオチド、それらに相補的な配列、またはそれらの いずれかの断片を、GI管組織の疾患または状態に関連した遺伝子、核酸、cDNAま たはmRNAの検出、増幅または定量のためのアッセイで使用することができる。ま た、それらを使用して、CS198ポリペプチドのコード領域の全部または一部を同 定することができる。さらに、それらは、アッセイ用のキットの形態で個々の容 器内に提供したり、あるいは個々の組成物として提供することができる。アッセ イ用のキットで提供する場合には、緩衝液、結合体などの他の適当な試薬を含有 させることができよう。 該ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAの形態でありうる。DNA、cDNA、ゲノムD NA、核酸類似体および合成DNAの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に 含まれる。該DNAは、二本鎖または一本鎖でありえて、一本鎖である場合には、 コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖でありうる。該ポリペプ チドをコードするコード配列は、本発明で提供する コード配列と同一でありえて、遺伝暗号の重複または縮重の結果、本発明で提供 するDNAと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列でありうる。 このポリヌクレオチドは、該ポリペプチドのコード配列のみを含んでいたり、 あるいは該ポリペプチドのコード配列と追加的なコード配列（例えば、リーダー または分泌配列またはプロタンパク質配列）とを含んでいたり、あるいは該ポリ ペプチドのコード配列（および所望により追加的なコード配列）と非コード配列 （例えば、該ポリペプチドのコード配列の5'および／または3'側の非コード配列 ）とを含んでいよう。 また、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換または付加などの修飾を含有 する変異ポリヌクレオチドと、該変異ポリヌクレオチド配列から生じる任意のポ リヌクレオチド修飾体を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明で提 供するコード配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を有してい てもよい。 さらに、該ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞におけるポリペプチドの発 現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチ ドの輸送を制御するための 分泌配列として機能するリーダー配列）に、同じリーディングフレームで融合さ せることができる。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり 、それは、該ポリペプチドを形成するために宿主細胞により切断されるリーダー 配列を有していてもよい。また、該ポリヌクレオチドは、該タンパク質と追加的 な5'アミノ酸残基とを含むプロタンパク質をコードしていてもよい。プロ配列を 有するタンパク質は、プロタンパク質であり、場合によっては、該タンパク質の 不活性形態であってもよい。プロ配列が切断されると、活性タンパク質が残され る。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしたり、あ るいはプロ配列を有するタンパク質をコードしたり、あるいはプレ配列（リーダ ー配列）とプロ配列とを有するタンパク質をコードしてもよい。 また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にす るマーカー配列とインフレームで融合したコード配列を有していてもよい。該マ ーカー配列は、細菌宿主の場合には、該マーカーと融合したポリペプチドの精製 をもたらすための、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであ ることが可能であり、あるいは例えば、哺乳動物宿主 （例えば、COS-7細胞系）を使用する場合には、該マーカー配列は赤血球凝集素 （HA）タグであることが可能である。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タン パク質に由来するエピトープに対応する。例えば、I．Wilsonら，Cell 37:767(1 984)を参照されたい。 ポリヌクレオチドと本発明で提供する配列との間で少なくとも50％、好ましく は少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％の同一性があれば、該ポリヌ クレオチドは該配列にハイブリダイズすると期待される。 本発明はまた、精製されたCS198ポリペプチドを使用して産生された抗体であ って、該ポリペプチドの少なくとも一部が、本発明が提供するポリヌクレオチド から選ばれるCS198ポリヌクレオチドにコードされることを特徴とする抗体を提 供する。これらの抗体は、試験サンプル中のCS198抗原の検出のために本発明で 提供する方法で使用することができる。試験サンプル中のCS198抗原の存在は、G I管の疾患または状態の存在の指標となる。該抗体はまた、治療目的に使用する ことが可能であり、例えば、変化した又は異常な発現に関連した状態におけるCS 198ポリペプチドの活性の中和において使用することができる。 本発明はさらに、本発明で提供する推定アミノ酸配列を有するCS198ポリペプ チド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の精製ポリペプチドまたは 合成ポリペプチドでありうる。CS198ポリペプチドの断片、誘導体または類似体 は、該アミノ酸残基の１以上が同類アミノ酸残基または非同類アミノ酸残基（好 ましくは、同類アミノ酸残基）で置換されているものでありうる。そのような置 換アミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされていてもコードされていなくても よい。あるいはそれは、アミノ酸残基の１以上が置換基を含みうる。あるいはそ れは、該ポリペプチドが別の化合物（例えば、該ポリペプチドの半減期を増加さ せる化合物、例えばポリエチレングリコール）に融合しているものでありうる。 あるいはそれは、追加的なアミノ酸（例えば、リーダーもしくは分泌配列、また は該ポリペプチドの精製のために使用する配列、またはプロタンパク質配列）が 該ポリペプチドに融合しているものでありうる。そのような断片、誘導体および 類似体は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ オチドは、好ましくは、単離（好ましくは精製）された形態で提供 される。 したがって、本発明のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドのアミノ酸 配列と同じであるか又は１以上のアミノ酸の置換による小さな変異により異なる アミノ酸配列を有することが可能である。該変異は、典型的には、約1〜5アミノ 酸の範囲の「同類変化」であることが可能であり、この場合、該置換アミノ酸は 、類似した構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンからイソロイシ ンへの置換またはトレオニンからセリンへの置換）。これに対して、変異には、 非同類変化(例えば、グリシンからトリプトファンへの置換)を含めることができ る。また、類似した小さな変異には、アミノ酸の欠失または挿入またはそれらの 両方を含めることができる。生物学的または免疫学的活性の変化を引き起こさず に置換し、挿入し又は欠失させるアミノ酸の種類および個数を決定する際の指針 は、当該技術分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えばDNASTA Rソフトウェア（DNASTAR Inc.，Madison WI）を用いて得ることができる。 本発明のポリヌクレオチド配列に従い構築したプローブを、種々のタイプの分 析を行なうための種々のアッセイ方法で使用 することができる。例えば、そのようなプローブは、染色体分析を行なうために 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）技術で使用することが可能であり 、また、染色体の広がりから認められるか又はPCR産生および／または対立遺伝 子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、対立遺伝子特異的増幅を用いて若しくは 直接シークエンス法により検出可能な欠失または転座などの染色体中の癌特異的 構造変化を同定するために使用することができる。また、プローブは、放射性同 位体、直接的または間接的に検出可能なハプテン、または蛍光性分子で標識する ことができ、組織試料または細胞中のポリヌクレオチドを含む遺伝子のmRNA発現 を評価するためのin situハイブリダイゼーション研究で使用することができる 。 また、本発明は、本発明で提供するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製 造に関する教示を提供する。 プローブアッセイ 試験サンプル中の核酸の検出のためのアッセイで使用しうるプローブを得るた めに、本発明で提供する配列を使用することができる。該プローブは、関心のあ るポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、または関心のあるポリヌクレ オチドの 非保存ヌクレオチド領域から設計することができる。アッセイの最適化のための そのようなプローブの設計は、当業者の技量の範囲内である。一般には、最大の 特異性を望む場合には、非保存領域またはユニーク領域から核酸プローブを得、 例えば多遺伝子ファミリーの異なるメンバーに密接に関連しているヌクレオチド 領域またはマウスおよびヒトなどの関連種におけるヌクレオチド領域に関してア ッセイする場合には、保存領域から核酸プローブを得る。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、核酸中またはその混合物中に含有されてい る所望の核酸配列（標的）を増幅するための技術である。PCRでは、一対のプラ イマーを過剰に使用して、標的核酸の相補鎖とハイブリダイズさせる。標的核酸 を鋳型として使用して、該プライマーのそれぞれをポリメラーゼにより伸長させ る。該伸長産物は、元の標的鎖から解離した後、それ自体が標的配列となる。つ いで新たなプライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより伸長させ、こ のサイクルを繰返して、標的配列分子の数を幾何級数的に増加させる。PCRは、 米国特許第4,683,195号および第4,683,202号に開示されている。 リガーゼチェイン反応（LCR）は、核酸の増幅のためのもう１ つの方法である。LCRでは、２個の一次（第１および第２）プローブと２個の二 次（第３および第４）プローブとを含むプローブペアを使用し、それらはすべて 、標的に対して過剰モルで使用する。第１プローブを標的鎖の第１セグメントに ハイブリダイズさせ、第２プローブを標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズ させる。該一次プローブが5'リン酸−3'ヒドロキシルの関係で互いに隣接するよ う、また、リガーゼがそれらの２個のプローブを融合産物に共有的に融合または 連結させることが可能となるよう、第１セグメントと第２セグメントとは隣接し ている。さらに、第３（二次）プローブは第１プローブの一部にハイブリダイズ することが可能であり、第４（二次）プローブは、同様の隣接様態で第２プロー ブの一部にハイブリダイズすることが可能である。勿論、該標的が最初に二本鎖 である場合は、二次プローブは、最初の標的の相補体にもハイブリダイズするこ とになる。一次プローブのライゲーションした鎖が標的鎖から分離すると、それ は第３および第４プローブにハイブリダイズすることになり、それらはライゲー ションされて相補的な二次連結産物を形成しうる。該ライゲーション産物が標的 またはその相補体のいずれかと機能的に等価であると認識される ことが重要である。ハイブリダイゼーションとライゲーションとの反復サイクル により、標的配列の増幅が達成される。この技術は、1989年６月16日付け公開の K.BackmanのEP-A-320 308および1991年７月31日付け公開のK.BackmanらのEP-A-4 39 182に更に詳しく記載されている。 mRNAの増幅の場合には、mRNAをcDNAに逆転写し、ついでポリメラーゼ連鎖反応 を行なうこと（RT-PCR）、あるいは米国特許第5,322,770号に記載されていると おり、両工程で単一の酵素を使用すること、あるいはR.L.Marshallら,PCR Metho ds and Applications 4:80-84(1994)に記載のとおり、mRNAをcDNAに逆転写し、 ついで不斉ギャップリガーゼチェイン反応を行なうこと（RT-AGLCR）が、本発明 の範囲内に含まれる。 本発明で使用しうる他の公知増幅方法には、J.C Guatelliら，PNAS USA 87:18 74-1878（1990）およびJ Compton，Nature 350(No 6313):91-92(1991)に記載の いわゆる「NASBA」または「3SR」技術、欧州特許出願公開(EPA)第4544610号に記 載のQ-β増幅、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(G.T.Walkerら ，Clin ．Chem．42:9-13[1996]および欧州特許出願第684315号に記載)、および国 際公開WO 93/22461に記載の標的媒介増 幅（target mediated amplification）が含まれるが、これらに限定されるもの ではない。 CS198の検出は、当該技術分野で現在よく知られている検出方法および将来現 れうる検出方法を含む適当な任意の検出方法を用いて行なうことができる。例え ば、Caskeyらの米国特許第5,582,989号、Gelfandらの米国特許第5,210,015号を 参照されたい。そのような検出方法には、例えば、標的増幅方法およびシグナル 増幅技術が含まれる。現在公知の検出方法には、例えば、PCR、LCR、NASBA、SDA 、RCRおよびTMAと称される核酸増幅技術が含まれるであろう。例えば、Caskeyら ，米国特許第5,582,989号およびGelfandら，米国特許第5,210,015号を参照され たい。また、Snitmanら，米国特許第5,273,882号などに開示されているシグナル 増幅を用いて、検出を行なうことができる。標的またはシグナルの増幅が現在好 ましいが、増幅を必要としない超高感度の検出方法を本発明で使用することが可 能であると考えられ、本発明の範囲内に含まれる。 種々の不均一または均一な検出様式を用いて、増幅型または非増幅型の両方の 検出を（組合せて）行なうことができる。不均一検出様式の具体例は、Snitman ら，米国特許第5,273,882 号、Albarellaら，EP-84114441.9、Urdeaら，米国特許第5,124,246号、Ullmanら ，米国特許第5,185,243号およびKouriskyら，米国特許第4,581,333号に開示され ている。均一検出様式の具体例は、Caskeyら，米国特許第5,582,989号、Gelfand ら，米国特許第5,210,015号に開示されている。また、ハイブリダイゼーション アッセイにおける複数のプローブの使用(その使用により、CS198シグナルの感度 および増幅が改善される)が意図され、本発明の範囲内に含まれる。例えば、Cas keyら，米国特許第5,582,989号およびGelfandら，米国特許第5,210,015号を参照 されたい。 １つの実施態様では、本発明は、一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含有す る疑いのある試験サンプルを、アンプリコン配列の内部領域にハイブリダイズし うる検出プローブと増幅プライマーとを含む増幅反応試薬と接触させる工程を含 む。本発明で提供する方法に従い使用するプローブおよびプライマーは、捕捉標 識および検出標識で標識し、この場合、プローブは１つのタイプの標識で標識し 、プライマーは別のタイプの標識で標識する。さらに、プライマーおよびプロー ブは、該プローブ配列が、該プライマー配列より低い融解温度を有するように選 択 する。増幅試薬、検出試薬および試験サンプルは、標的配列の存在下で該標的配 列のコピー（アンプリコン）を産生させる増幅条件下に配置する。通常の場合、 プライマーは標的配列とその相補的鎖とを増幅するように与えられるため、該ア ンプリコンは二本鎖である。ついで該二本鎖アンプリコンを熱変性させて、一本 鎖アンプリコンメンバーを得る。該一本鎖アンプリコンメンバーが形成したら、 該プローブと一本鎖アンプリコンメンバーとの複合体の形成が可能となるように 該混合物を冷却する。 該一本鎖アンプリコン配列およびプローブ配列を冷却するにつれて、該プロー ブ配列は該一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合する。該プローブ配列が 、一般に、該プライマー配列より短くなるように選択され、したがって該プライ マーより低い融解温度を有すると仮定すると、この知見は反直感的なものである 。したがって、該プライマーにより産生されるアンプリコンの融解温度も、該プ ローブより高い融解温度を有するはずである。したがって、該混合物が冷却する につれて、二本鎖アンプリコンの再形成が予想されるであろう。しかしながら、 前記のとおり、それはこの場合には当てはまらない。該プロー ブは、該一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合することが判明している。 さらに、このようなプローブ／一本鎖アンプリコン結合の優先性は、該プライマ ー配列を該プローブに対して過剰に加えた場合にも存在する。 該プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーのハイブリッドが形成した後、それ らを検出する。該プライマーおよびプローブ上に存在する検出標識および捕捉標 識を使用して該ハイブリッドを検出するには、標準的な不均一アッセイ様式が適 している。該ハイブリッドを、該捕捉標識により固相試薬に結合させ、該検出標 識により検出することが可能である。該検出標識が直接的に検出可能な場合には 、検出可能なシグナルを該標識に生成させ、必要に応じて該シグナルを検出する ことにより、該固相上のハイブリッドの存在を検出することができる。該標識が 直接的に検出されない場合には、直接的に検出可能な標識に結合した結合メンバ ーを一般に含む結合体と該捕捉ハイブリッドとを接触させることが可能である。 該結合体が該複合体に結合するようになり、該複合体上の結合体の存在を、その 直接的に検出可能な標識で検出することができる。このようにして、固相試薬上 のハイブリッドの存在を判定することができる。ハイブ リダイズしていないアンプリコンまたはプローブおよび未結合結合体を洗い落と すために洗浄工程を実施しうる、と当業者に認識されるであろう。 標的配列は一本鎖として記載されているが、標的配列が実際には二本鎖であり 、増幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションの前に、該標的配列がその相 補体から分離されるにすぎない場合も含むと意図される。この方法においてPCR を用いる場合には、通常は、標的配列の末端が既知である。好ましい方法におい てLCRまたはその変法を用いる場合には、通常は、全標的配列が既知である。典 型的には、標的配列は、RNA、DNAなどの核酸配列である。 本発明で提供する方法は、熱サイクル反応混合物を含む良く知られた増幅反応 において、特にPCRおよびギャップLCR（GLCR）において用いることができる。増 幅反応では、典型的には、標的核酸配列（該標的配列は、通常、より一層大きな 核酸配列の小さな領域である）のコピーを反復的に産生させるためにプライマー を使用する。プライマー自体は、標的配列の領域に相補的な核酸配列である。増 幅条件下では、これらのプライマーは、標的配列の相補的領域にハイブリダイズ または結合 する。標的配列のコピーは、典型的には、該ハイブリダイゼーションプライマー にヌクレオチドを加え及び／又は隣接プローブ対をライゲーションするためにポ リメラーゼまたはリガーゼ活性を有する酵素を別々に又は組合せて用いるプライ マー伸長および／またはライゲーションの過程により生じる。単量体または予め 生成したオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに加えるヌクレオチドもま た、標的配列に相補的である。プライマーまたはプローブが、十分に伸長し及び ／又はライゲーションしたら、例えば、相補的核酸鎖が解離する温度である「融 解温度」まで該反応混合物を加熱することにより、それらを標的配列から分離す る。このようにして、標的配列に相補的な配列が形成する。 ついでいずれかの二本鎖配列を分離して、プライマーまたはプローブがそれら の各々の標的にハイブリダイズするのを可能にし、ハイブリダイズしたプライマ ーまたはプローブを伸長および／またはライゲーションさせ、再分離することに より、標的配列数を更に増幅するために、新たな増幅サイクルを行なうことがで きる。増幅サイクルにより産生される相補的配列は、標的配列数を更に増幅する ためにプライマーを伸長させるため 又は２個のプローブのギャップを埋めるための鋳型として働くことが可能である 。典型的には、反応混合物を20〜100サイクルに付す。より典型的には、反応混 合物を25〜50サイクルに付す。サイクル数の決定は、当業者において可能である 。このようにして、多コピーの標的配列およびその相補的配列を得る。したがっ て、プライマーが増幅条件下に存在する場合には、該プライマーが標的配列の増 幅を開始させる。 一般には、PCRにおいては、標的鎖の一部とその相補体とに相補的な２個のプ ライマーを使用する。LCRでは、一般に、４個のプローブ（そのうちの２個は標 的配列に相補的であり、残りの２個は、同様に、標的の相補体に相補的である） を使用する。前記のプライマーセットおよび酵素に加えて、核酸増幅反応混合物 は、よく知られている他の試薬を含むことも可能であり、それらには、酵素補因 子（例えば、マンガン）、マグネシウム塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ チド（NAD）、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）（例えば、デオキ シアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸お よびデオキシチミン三リン酸）が含まれるが、これらに限定されるものではない 。 増幅プライマーは標的配列の増幅を開始させるが、検出（またはハイブリダイ ゼーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは、一般に、核酸配列 または非荷電核酸類似体、例えば、国際公開WO 92/20702に開示されているペプ チド核酸、米国特許第5,185,444号、第5,034,506号および第5,142,047号に記載 されているモルホリノ類似体などである。該プローブが担持する標識のタイプに 応じて、増幅反応により生じるアンプリコンの捕捉または検出に、該プローブを 使用する。該プローブは標的配列の増幅に関与せず、したがって、追加的なdNTP を該プローブに加えることができない点で該プローブを「伸長不可能」なものと する必要があろう。通常、類似体自体はもともと伸長不可能である。核酸プロー ブは、該プローブの3'末端を修飾してヒドロキシル基がもはや伸長に関与できな くなるようにすることにより、伸長不可能にすることが可能である。例えば、該 プローブの3'末端を捕捉または検出標識で官能基化して、ヒドロキシル基を消費 させるか又は保護する。あるいは、3'ヒドロキシル基を単に切断し、置換し又は 修飾することが可能である。1993年４月19日付け出願の米国特許出願第07/049,0 61号には、プローブを伸長不可能にするのに使用 しうる修飾が記載されている。 プローブに対するプライマーの比は、重要ではない。したがって、プローブま たはプライマーのいずれかを過剰に反応混合物に加えて、一方の濃度を他方の濃 度より大きくすることが可能である。あるいは、プライマーおよびプローブを同 等の濃度で使用することができる。しかしながら、好ましくは、プローブに対し て過剰のプライマーを反応混合物に加える。したがって、プライマー対プローブ の比は、例えば5：1であり、20：1が好ましい。 プライマーおよびプローブの長さは様々となることが可能であるが、プローブ 配列がプライマー配列より低い融解温度を有するように、プローブ配列を選択す る。したがって、プライマー配列は、一般に、プローブ配列より長い。典型的に は、プライマー配列は、20〜50ヌクレオチド長の範囲であり、より典型的には、 20〜30ヌクレオチド長の範囲である。典型的なプローブは、10〜25ヌクレオチド 長の範囲である。 プライマーおよびプローブを合成するための種々の方法が、当該技術分野でよ く知られている。同様に、プライマーまたはプローブに標識を結合させるための 方法も、当該技術分野でよ く知られている。例えば、通常のヌクレオチドホスホルアミジット化学と、Appl ied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)、DuPont（Wilmington，DE）または、M illigen（Bedford MA）から入手可能な装置とを用いて、所望の核酸プライマー またはプローブを合成するのが、常套手段である。本発明のプライマー、プロー ブなどのオリゴヌクレオチドを標識するための多数の方法が、既に記載されてい る。Enzo Biochemical（New York，NY）およびClontech（Palo Alto，CA）は共 に、プローブ標識技術を記載し、商業化している。例えば、3'-Amin-ON CPG^TM(C lontech，Palo Alto，CA)を使用して、第一級アミンを3'オリゴ末端に （Clontech）を使用して、第一級アミンを5'オリゴ末端に結合させることができ る。通常の活性化および結合の化学的方法を用いて、該アミンを種々のハプテン と反応させることができる。また、1990年12月11日付け出願の同時係属米国特許 出願第625,566号および1990年12月20日付け出願の第630,908号は、それぞれ5'お よび3'末端でプローブを標識するための方法を教示している。1992年６月25日付 け公開の国際公開WO92/10505および1992年７月９日付け公開のWO92/11388は、そ れぞれ5' および3'末端でプローブを標識するための方法を教示している。オリゴヌクレオ チドを標識するための１つの公知方法では、標識-ホスホルアミジット試薬を調 製し使用して、該標識をオリゴヌクレオチドに、その合成中に付加する。例えば 、N.T Thuongら，Tet ．Letters 29(46):5905-5908(1988)またはJ.S．Cohenら， 米国特許出願第07/246,688号（NTIS ORDER No．PAT-APPL-7-246,688）(1989)を 参照されたい。好ましくは、プローブは、その3'および5'末端で標識する。 捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合させる。該捕捉標識は、固相試 薬の特異的結合メンバーと結合ペアを形成する特異的結合メンバーであることが 可能である。プライマーまたはプローブ自体が捕捉標識として機能しうると理解 されるであろう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、 それは、プライマーまたはプローブの相補的部分に結合して該プライマーまたは プローブを固相に固定化するように選択することができる。プローブ自体が結合 メンバーとして機能する場合には、該プローブは、一本鎖アンプリコンメンバー に相補的でない配列または「テイル」を含有する、と当業者には認識されるであ ろう。プライマー自体が捕捉標識として機能 する場合には、該プライマーの少なくとも一部は、固相上の核酸に自由にハイブ リダイズすることができるであろう。なぜなら、該プローブは、プライマー配列 に対して完全には相補的とならないように選ばれるからである。 一般に、不均一系イムノアッセイを行なうために一般的に用いる技術を用いて 、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体を検出することができる。好ま しくは、この実施態様では、 Park，IL)装置で用いるプロトコールに従い、検出を行なう。 試験サンプルを一対のプライマーと接触させ、増幅を行ない、ハイブリダイゼ ーションプローブを加え、検出を行なう典型的なPCRアッセイにおいて、本明細 書に開示するプライマーおよびプローブは有用である。 本発明が提供するもう１つの方法は、試験サンプルを複数のポリヌクレオチド （少なくとも１つのポリヌクレオチドは、本明細書に記載のCS198分子である） と接触させ、該試験サンプルを複数のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、 ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含む。ハイブリダイゼーション 複合体を同定し、定量して、GI管組織の疾患（例えば、 GI管癌）を示すプロフィールを集める。さらに、発現されたRNA配列を、逆転写 と、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの当該技術分野でよく知られている方法 によるDNAの増幅とにより検出することができる。 薬物のスクリーニングおよび遺伝子治療 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなどのア ンチセンスCS198由来分子を、GI管組織の疾患または状態（特に、GI管癌）に関 連したポリヌクレオチドの異常な発現に関連した状態を有する患者内に導入する ための、遺伝子治療方法の用途を含む。アンチセンスRNAおよびDNA断片ならびに リボザイムを含むこれらの分子は、CS198-mRNAの翻訳を抑制するように設計し、 CS198ポリヌクレオチドの変化された又は異常な発現に関連した状態の治療にお いて治療的に使用することができる。 あるいは、前記のオリゴヌクレオチドを、当該技術分野で公知の方法で細胞に 送達して、該アンチセンスRNAまたはDNAをインビボで発現させて、前記のとおり にCS198ポリペプチドの産生を抑制することができよう。したがって、CS198ポリ ヌクレオチドに対するアンチセンス構築物は、CS198転写産物の作 用を逆転させ、GI管組織の病態（例えば、GI管癌）の治療に使用することができ る。また、これらのアンチセンス構築物は、腫瘍転移を治療するために使用する ことができよう。 本発明はまた、CS198ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの化合 物を同定するために、CS198ポリペプチドまたはその任意の断片に対する特異的 結合に関して複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方 法は、少なくとも１つの化合物を準備し、結合を許容するのに十分な時間、適当 な条件下でCS198ポリペプチドと各化合物とを一緒にし、各化合物に対する該CS1 98ポリペプチド結合を検出する工程を含む。 そのような試験で使用するポリペプチドまたはペプチド断片は、溶液中で遊離 していることも、固相に固定されていることも、細胞表面上に担持されているこ とも、あるいは細胞内に局在していることも可能である。１つのスクリーニング 方法では、該ポリペプチドまたはペプチド断片を発現しうる組換え核酸で安定に トランスフェクトされた真核性または原核性宿主細胞を使用する。そのようなト ランスフェクト化細胞に対して競合結合アッセイにおいて、薬物、化合物または 他の任意の物質をス クリーニングすることができる。例えば、ポリペプチドと被検体との複合体の形 成は、生存細胞または固定細胞のいずれかにおいて測定することができる。 したがって、本発明は、CS198に関連した疾患を治療するために使用しうる薬 物、化合物または他の任意の物質に関してスクリーニングする方法を提供する。 これらの方法は、該物質をポリペプチドまたはその断片と接触させ、該物質と該 ポリペプチドとの複合体の存在に関して、または該ポリペプチドと該細胞との複 合体の存在に関してアッセイすることを含む。競合的結合アッセイにおいては、 典型的には、該ポリペプチドを標識する。適当なインキュベーションの後、遊離 （または未複合体化）ポリペプチドまたはその断片を、結合形態で存在するポリ ペプチドまたはその断片から分離し、遊離または未複合体化標識の量を、その個 々の物質が該ポリペプチドに結合する又はポリペプチド／細胞複合体を妨害する 能力の尺度として用いる。 本発明はまた、ポリペプチドに結合する能力を有する中和抗体を、該ポリペプ チドまたはその断片に対する結合に関して試験剤と特異的に競合させる競合的ス クリーニングアッセイの用途を含む。このようにして、本発明で提供するCS198 ポリペプ チドと１以上の抗原決定基を共有する、試験サンプル中のいずれかのポリペプチ ドの存在を検出するために、該抗体を使用することができる。 もう１つのスクリーニング方法は、本明細書に開示するCS198の少なくとも１ つのポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物に関する高処理量の スクリーニングをもたらす。簡単に説明すると、多数の異なる小さなペプチド試 験化合物を、固相（例えば、プラスチックピンまたは他の何らかの表面）の固相 上で合成する。該ペプチド試験化合物を、ポリペプチドと反応させ、洗浄する。 そのように固相に結合しているポリペプチドを、当該技術分野でよく知られてい る方法で検出する。また、本明細書に記載のスクリーニング方法で使用するため に、精製ポリペプチドをプレート上に直接コーティングすることができる。さら に、非中和抗体を使用して、該ポリペプチドを捕捉し、それを固相上に固定化す ることができる。例えば、1984年９月13日付け公開のEP 84/03564を参照された い。 合理的な薬物設計の目標は、関心のある生物学的に活性なポリペプチドの又は 小分子の構造類似体（それらが相互作用するアゴニスト、アンタゴニストまたは 阻害剤を含む）を得ること である。また、そのような構造類似体を使用して、該ポリペプチドのより活性な 又は安定な形態である又はポリペプチドの機能をインビボで増強または阻害する 薬物を設計することができる（J．Hodgson，Bio/Technology 9:19-21(1991)）。 例えば、１つのアプローチでは、ポリペプチドまたはポリペプチド−阻害剤複 合体の三次元構造を、X線結晶解析、コンピューターモデリングまたは最も一般 的にはそれらの２つのアプローチの組合せにより決定する。該ポリペプチドのの 構造を解明し、その活性部位を決定するためには、該ポリペプチドの形状および 電荷の両方を確認しなければならない。該ポリペプチドの構造に関する有用な情 報が、同種タンパク質の構造に基づくモデリングにより得られることは、それほ ど多くない。どちらの場合も、関連した構造情報を用いて、類似したポリペプチ ド様分子を設計したり、あるいは効率的な阻害剤を同定する。 合理的な薬物設計の有用な具体例には、S．Braxtonら，Biochemistry 31:7796 -7801(1992)に示されているとおり、改善された活性または安定性を有する分子 、またはS.B.P．Athaudaら，J ．Biochem．(Tokyo)113(6):742-746(1993)に示さ れているとおり、天然ペプチドの阻害剤、アゴニストまた はアンタゴニストとして作用する分子を含めることができる。 また、前記のアッセイにより選択された標的特異的抗体を単離し、ついでその 結晶構造を決定することが可能である。原則として、このアプローチは、後続の 薬物設計の基礎となりうるファーマコフォア（pharmacophore）を与える。さら に、機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「抗id」） を産生させることにより、タンパク質の結晶解析を全く行なわないで済ませるこ とが可能である。抗idの結合部位は、鏡像の鏡像として、もとの受容体の類似体 となる。したがって、抗idを使用して、化学的または生物学的に得られたペプチ ドのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。ついで、単離された ペプチドは、ファーマコフォア（すなわち、原型（prototype）医薬）として機 能することが可能である。 X線結晶解析などの分析的研究を行なうのに十分な量の本発明の組換えポリペ プチドを入手可能とすることができる。さらに、本発明で提供する核酸配列から 導き出すことができる該ポリペプチドのアミノ酸配列の知見は、X線結晶解析の 代わりに又はそれに加えてコンピューターモデリング技術を用いる者に指針を与 えるであろう。 さらに、CS198ポリペプチドに特異的な抗体(例えば、抗CS198抗体)を使用して 、該ポリペプチドに対する結合により該ポリペプチドの生物学的作用を阻害する ことができる。このようにして、該抗体を、例えば、GI管癌およびその転移を含 むGI管組織疾患を治療するための療法において使用することができる。 さらに、そのような抗体は、試験サンプル中のCS198ポリペプチドの存在また は不存在を検出することができ、したがってGI管組織の疾患または状態（特に、 GI管癌）の診断のための診断マーカーとして有用である。また、そのような抗体 は、GI管組織の病態（例えば、GI管癌）に関する診断マーカーとして機能しうる 。 本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニストおよび阻害剤に関する 。該アンタゴニストおよび阻害剤は、該ポリペプチドの機能を阻害または除去す るものである。したがって、例えば、アンタゴニストは、本発明のポリペプチド に結合し、その機能を阻害または除去しうる。該アンタゴニストは、例えば、CS 198ポリペプチドに結合することによりCS198ポリペプチドの活性を除去するポリ ペプチドに対する抗体であることが可能であろう。場合によっては、該アンタゴ ニストは、オリゴヌクレオチドであることが可能である。小分子阻害剤には、例 えば、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定される ものではない。 該アンタゴニストおよび阻害剤は、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、 水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含む（これらに限定され るものではない）医薬上許容される担体と共に組成物として使用することができ る。CS198ポリペプチド阻害剤の投与は、好ましくは、全身投与である。本発明 はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害する抗体を提供する。 アンチセンス技術を用いて、三重らせんの形成またはアンチセンスDNAもしく はRNAにより遺伝子発現を減少させることができ、それらの方法は共に、DNAまた はRNAに対するポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明のポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分を用いて、10〜40塩 基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチ ドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であることにより転写およびCS198 ポリペプチドの産生を妨げるように設計する。三重らせんに関しては、例えば、 Leeら，Nuc ．Acids Res，6:3073(1979);Cooneyら，Science 241:456(1988)およびDervanら，Science 251:1360(1991)を参照されたい。該ア ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、mRN A分子からCS198ポリペプチドへの翻訳を遮断する。アンチセンスに関しては、例 えば、Okano，J．Neurochem，56:560(1991)および“Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression”，CRC Press，Boca Raton，Fla．( 1988)を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド切断 に対して該分子を抵抗性にする人工的ヌクレオチド間結合を含有するように修飾 されている場合に、より大きな効力で作用する。そのような人工的ヌクレオチド 間結合には、メチルホスホナート、ホスホロチオラートおよびホスホロアミダー トヌクレオチド間結合が含まれるが、これらに限定されるものではない。 組換え技術 本発明は、本発明のCS198ポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞および発現 ベクター、およびそれがコードするポリペプチドの製造法を提供する。そのよう な製造法は、CS198ポリヌクレオチドの発現に適した条件化で該宿主細胞を培養 し、該細 胞培養からCS198ポリペプチドを回収することを含む。 本発明はまた、本発明のCS198ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベ クターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペ プチドの製造を提供する。 宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターであることが可能な本 発明のベクターで遺伝的に操作する（トランスフェクト、形質導入または形質転 換する）。該ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であ ることが可能である。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化しトランス フェクト化細胞を選択し又はCS198遺伝子を増幅するために必要に応じて改変さ れた通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発 現のために選択された宿主細胞で既に用いられているものであり、当業者には明 らかなものである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によるポリペプチドの製造に使用す ることができる。したがって、ポリペプチドを発現させるためのいずれか１つの 種々の発現ビヒクル(特に、ベクターまたはプラスミド)中に該ポリヌクレオチド 配列を含めることが可能である。そのようなベクターには、染色体、非 染色体および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージD NA、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクタ ー、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび 仮性狂犬病ウイルス）が含まれる。しかしながら、宿主内で増殖可能かつ生存可 能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することも可能であ る。 適当なDNA配列を、種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一 般には、該DNA配列を、当該技術分野で公知の方法により、適当な制限エンドヌ クレアーゼ部位内に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の技量 の範囲内であると考えられる。該発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令 する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動的に結合させる。そのようなプ ロモータの代表例には、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌（E．coli）lacま たはtrp、ファージλP subLプロモーター、および原核性もしくは真核性細胞ま たはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロ モーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターはまた 、翻訳の開始のためのリボ ソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。該ベクターはまた、配列 の増幅のための適当な配列を含むことが可能である。さらに、該発現ベクターは 、好ましくは、トランスフェクト化宿主細胞の選択のための表現型形質を与える 遺伝子（例えば、真核細胞培養におけるジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマ イシン耐性、または大腸菌（E.coli）におけるテトラサイクリンまたはアンピシ リン耐性）を含有する。 前記の適当なDNA配列と適当なプロモーターまたは制御配列とを含有するベク ターを使用して、適当な宿主にトランスフェクトして、該宿主が該タンパク質を 発現できるようにすることが可能である。適当な宿主の代表例としては、細菌細 胞、例えば大腸菌(E.coli)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhim urium)；ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）；真菌細胞、例え ば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエおよびSf9；動物細胞、例えばCHO、 COSまたはBowes黒色腫；植物細胞などが挙げられる。適当な宿主の選択は、本明 細書の教示に基づけば当業者の技量の範囲内に含まれると考えられる。 より詳しくは、本発明はまた、前記で広く記載されている配 列の１以上を含んでなる組換え構築物を含む。該構築物は、本発明の配列が順配 向または逆配向で挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス ベクター）を含む。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、該配 列に作動的に結合した調節配列（例えば、プロモーターなど）を含む。多数の適 当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能であ る。以下のベクターを例示する：細菌性：pINCY（Incyte Pharmaceuticals Inc. ，Palo Alto，CA）、pSPORT1(Life Technologies,Gaithersburg,MD)、pQE70、pQ E60、pQE-9（Qiagen）pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pN H8a、pNH16a、pNH18a,．pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、p DR540、pRIT5（Pharmacia）；真核性：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（St ratagene）pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）。しかしながら、宿主内で複 製可能で生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用する ことが可能である。 プラスミドpINCYは、一般には、それがポリリンカー（マルチクローニング部 位）中に２つの修飾を有することを除きプラスミドpSPORT1（Life Technologies ，Gaithersburg，MDから入 手可能）と同一である。これらの修飾は、（１）それがHindIII制限部位を欠き 、（２）そのEcoRI制限部位が、異なる位置に存在することである。pSPORT1をHi ndIIIとEcoRIとの両方で切断し、該ポリリンカーの切り出された断片を合成DNA 断片（配列番号28および配列番号29）で置換することにより、pINCYをpSPORT1か ら作製する。この置換は、当業者に公知の任意の方法で行なうことができる。例 えば、それらの２つのヌクレオチド配列（配列番号28および配列番号29）は、5' 末端リン酸を有するように合成的に生成させ、共に混合し、ついで、HindIIIとE coRIとで切断されたpSPORT1プラスミド中に、付着末端のライゲーションを行な うための標準的な条件下でライゲーションする。ついで適当な宿主細胞（例えば 、大腸菌（E.coli）DH5μ細胞）を、そのライゲーションされたDNAでトランスフ ェクトし、アンピシリン耐性に関して組換えクローンを選択する。ついで個々の クローンからプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析またはDNA配列決定に付して 、挿入配列が適切な配向で存在することを確認する。当業者に公知の他のクロー ニング方法を用いることも可能である。 プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフ ェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望 の任意の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターとして、pKK2 32-8およびpCM7が挙げられる。挙げられる個々の細菌性プロモーターには、lacI 、lacZ、T3、SP6、T7、gpt、λP sub R、P sub L、およびtrpが含まれる。真核 性プロモーターには、サイトメガロウイルス（CMV）最初期、単純ヘルペスウイ ルス（HSV）チミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR 、およびマウスメタロチオイネンＩが含まれる。適当なベクターおよびプロモー ターの選択は、当業者の技量の範囲内に十分に含まれるものである。 もう１つの実施態様では、本発明は、前記構築物を含有する宿主細胞を提供す る。該宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下 等動物細胞であることが可能であり、あるいは該宿主細胞は、細菌細胞などの原 核細胞であることが可能である。該宿主細胞内への該構築物の導入は、リン酸カ ルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクショ ンまたはエレクトロポレーション（L．Davisら，"Basic Methods in Molecular Biology"，第２版， Appleton and Lang，Paramount Publishing，East Norwalk，CT(1994)）により 行なうことができる。 宿主細胞内の構築物は、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生さ せるために常法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、 通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 組換えタンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細 菌または他の細胞内で発現させることができる。また、本発明のDNA構築物に由 来するRNAを使用してそのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を 使用することができる。原核性または真核性宿主と共に使用するための適当なク ローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laborato ry Manual ，第２版(Cold Spring Harbor，NY.，1989)に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、該ベク ター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。エンハンサーは、 プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約10〜300bpのシス作用性要 素である。具体例には、複製起点の後期側上SV40エンハンサー（bp100〜 270）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期 側上ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。 一般には、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞のトランスフェクショ ンを可能にする選択マーカー（例えば、大腸菌（E.coli）のアンピシリン耐性遺 伝子およびエス・セレビシエ（S．cerevisiae）TRP1遺伝子）、および下流の構 造配列の転写を指令するための、高度に発現される遺伝子に由来するプロモータ ーを含むであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ3-ホスホグリセリン酸 キナーゼ（PGK）、α因子、酸ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質など の解糖酵素をコードするオペロンに由来することが可能である。該異種構造配列 を、翻訳開始配列および終結配列、および好ましくは、ペリプラズム腔または細 胞外培地中への翻訳タンパク質の分泌を指令しうるリーダー配列と、適当な段階 で合体させる。所望により、該異種配列は、所望の特性（例えば、発現された組 換え産物の安定化または簡便な精製）を付与するN末端同定ペプチドを含む融合 タンパク質をコードすることが可能である。 細菌において使用するための有用な発現ベクターは、作動可 能な読取りを機能的プロモーターと一致させて適当な翻訳開始および終結シグナ ルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築 する。該ベクターは、該ベクターの維持を保証し、所望により該宿主内での増幅 をもたらすための、１以上の形質選択マーカーと複製起点とを含むであろう。ト ランスフェクションのための適当な原核性宿主には、大腸菌（E.coli）、バシラ ス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmone lla typhimurium）、およびシュードモナス（Paeudomonas）属、ストレプトマイ セス（Streptomyces）属およびスタヒロコッカス（Staphylococcus）属内の種々 の種が含まれるが、その他の原核性宿主を通常の選択物として使用することも可 能である。 細菌において使用するための有用な発現ベクターは、選択マーカーと細菌性複 製起点（よく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝要素を含 むプラスミドに由来するもの）とを含む。他のベクターには、PKK223-3（Pharma cia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden）およびGEM1（Promega Biotec,Madison, WI）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのpBR322「バック ボーン」切片を、適当なプロモーター および発現させる構造配列と合体させる。 適当な宿主にトランスフェクトし、該宿主を適当な細胞密度まで増殖させた後 、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導） により抑制解除し、細胞を更に一定期間培養する。細胞は、典型的には、遠心分 離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更 なる精製のために保存する。タンパク質の発現において使用した微生物細胞は、 凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む簡便な 任意の方法で破壊することができる。そのような方法は、当業者によく知られて いる。 組換えタンパク質を発現させるためには、種々の哺乳動物細胞培養系を使用す ることができる。哺乳動物発現系には、例えば、Gluzman，Cell 23:175(1981)に 記載のサル腎線維芽細胞のCOS-7系、および和合性ベクターを発現する能力を有 する他の細胞系（例えば、C127、HEK-293、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系）が 含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエン ハンサーならびに必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプ ライス供与およ び受容部位、転写終結配列および5'フランキング非転写配列を含むであろう。SV 40ウイルスゲノムに由来するDNA配列（例えば、SV40起点、初期プロモーター、 エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）を使用して、必要な非転 写遺伝要素を得ることが可能である。代表的で有用なベクターには、pRc/CMVお よびpcDNA 3（Invitrogen，San Diego，CAから入手可能）が含まれる。 アフィニテイークロマトグラフィー、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、陰 イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグ ラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーなどの公知方法により、CS198ポリ ペプチドを組換え細胞培養物から回収し、精製する。精製中に存在するカルシウ ムイオンを低濃度（約0.1〜5mM）にするのが好ましい（Priceら,J.Biol.Chem.24 4:917(1969)）。該ポリペプチドの立体配置を完全なものにする際に、必要に応 じて、タンパク質のリフォールディング工程を行なうことが可能である。最後に 、最終精製工程として高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行なうことができ る。 このように、本発明のポリペプチドは、高発現細胞系から発現された天然に精 製された産物、または化学方法により又は原核性もしくは真核性宿主から（例え ば、培養における細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞により）組換 え技術で得られた産物でありうる。組換え製造法で使用する宿主に応じて、本発 明のポリペプチドを哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され 、あるいは非グリコシル化されよう。また、本発明のポリペプチドには、開始メ チオニンアミノ酸残基を含むこともあろう。 出発プラスミドは、入手可能なプラスミドから、公開されている公知方法に従 い構築することができる。さらに、記載されているものと同等のプラスミドが、 当該技術分野において公知であり、当業者には明らかであろう。 以下は、cDNAクローンの単離および分析のための一般的な方法である。本明細 書に開示する特定の実施態様においては、mRNAをGI管組織から単離し、cDNAライ ブラリーの作製のために使用した。GI管組織を、患者から外科的切除により得、 それが病理学者により腫瘍または非腫瘍組織に分類された。 該GI管組織ライブラリーのランダム単離物からのcDNA挿入 断片を、部分的に配列決定し、実施例に記載のとおりに詳細に分析した。それは 、配列番号7〜25として配列表に開示されている。また、ゲノムクローンg280459 0（配列番号1〜6）に由来するエキソンの配列、クローン2055371の完全長配列（ クローン2055371IH（配列番号26）と称される）を、実施例に記載のとおりに分 析し、配列表に開示する。これらの挿入断片のコンセンサス配列は、配列番号27 として記載されている。これらのポリヌクレオチドは、ある特定の遺伝子に関す る関連調節配列を有する又は有さない全オープンリーディングフレームを含有し ているかもしれない、あるいはそれらは、関心のある遺伝子の一部のみをコード しているかもしれない。これは、遺伝子の多くが数百塩基長、時には数千塩基長 であり、ベクターの制約、第１鎖の不完全な逆転写または第２鎖の不完全な複製 のため、現在の技術では、その全体をクローニングすることができないというこ とに起因する。追加的なヌクレオチド配列を含有する連続的な二次クローンは、 当業者に公知の種々の方法を用いて得ることができる。 DNA配列決定の方法は、当該技術分野でよく知られている。通常の酵素法では 、関心のあるDNA鋳型にアニーリングしたオ リゴヌクレオチドプライマーからDNA鎖を伸長するために、DNAポリメラーゼ、Kl enow断片、Sequenase（US Biochemical Corp,Cleveland,OH）またはTaqポリメラ ーゼを使用する。一本鎖および二本鎖の両方の鋳型を使用するための方法が、開 発されている。チェインターミネーション反応生成物を、尿素／ポリアクリルア ミドゲル上で電気泳動し、オートラジオグラフィー(放射性ヌクレオチド標識前 駆体の場合)または蛍光（蛍光標識前駆体の場合）により検出することができる 。蛍光検出方法を用いる機械化された反応調製、配列決定および分析における最 近の改良は、Applied Biosystems 377 DNA Sequencers（Applied Biosystem，Fo ster City，CA）などの装置を使用して１日当たりに測定しうる配列数の拡大を 可能にした。 ヌクレオチド配列のリーディングフレームは、いくつかのタイプの分析で確認 することができる。第１に、コード配列内に含有されているリーディングフレー ムは、開始コドンATGおよび停止コドンTGA、TAAまたはTAGの存在に関して分析す ることができる。典型的には、１つのリーディングフレームが、cDNAの大きな部 分にわたって続き、他のリーディングフレームは、多数の停止コドンを含有する 傾向にある。そのような場合には、 リーディングフレームの決定は直接的である。それより困難な他の場合には、さ らなる分析が必要となる。 各推定コドントリプレットにおける個々のヌクレオチド塩基の出現頻度を分析 するためのアルゴリズムが作製されている。例えば、J.W．Fickett，Nuc Acids Res 10:5303(1982)を参照されたい。特定の生物（細菌、植物および動物）に関 するコードDNAは、あるトリプレット周期性内で或るヌクレオチドを含有する傾 向にある（例えば、第３コドン位にピリミジンの優先性が有意に認められる）。 これらの優先性は、所定のDNA伸長のコード可能性（coding potential）（およ びフレーム）を判定するために使用しうる広く利用可能なソフトウェアに取込ま れている。アルゴリズム由来の情報を開始／停止コドンの情報と一緒に使用して 、適切なフレームを高い確実性で決定することができる。そしてこれは、正確な リーディングフレーム内の配列を適当な発現ベクター中にクローニングするのを 容易に可能にする。 本明細書に開示する核酸配列は、十分に確立されている組換えDNA技術により 、関心のある他の種々のポリヌクレオチド配列およびベクターに結合させること が可能である。J Sambrook ら，前掲を参照されたい。関心のあるベクターには、プラスミド、コスミド、フ ァージ誘導体、ファジミドなどのクローニングベクターならびに配列決定、複製 および発現ベクターなどが含まれる。一般に、そのようなベクターは、少なくと も１つの生物において機能的な複製起点、簡便な制限エンドヌクレアーゼ消化部 位、および個々の宿主細胞に適した選択マーカーを含有する。該ベクターは、当 業者に公知の種々の手段により、所望のDNA、RNAまたはポリペプチドを産生する 適当な宿主細胞内に導入することができる。 時には、配列決定またはランダム逆転写の誤りのために、適当なオープンリー ディングフレームまたは調節要素の存在が隠されてしまう。そのような場合には 、ポリペプチドの発現を試み、標準的なペプチドマッピングおよび配列決定技術 によりアミノ酸配列を決定することにより、正確なリーディングフレームを決定 することが可能である。F.M．Ausubelら，Current Protocols in Molecular Bio logy ，John Wiley & Sons，New York，NY(1989)を参照されたい。さらに、ある 与えられたヌクレオチド配列の実際のリーディングフレームは、合計３個の潜在 的リーディングフレームを含有するベクターで宿主細胞をトランス フェクトすることより決定することができる。正確なリーディングフレームのヌ クレオチド配列を有する細胞だけが、予想される長さのペプチドを産生すること になる。 本発明で提供するヌクレオチド配列は、現在の最高水準の自動化された方法で 製造されており、それ自体が、未同定のヌクレオチドを含有している可能性があ る。このことは、本発明を実施することを望む当業者に問題を提議することには ならないであろう。J Sambrookら（前掲）またはその定期的最新版に記載されて いる標準的な組換え技術を用いるいくつかの方法を用いて、欠けている配列情報 を完全なものにすることができる。本明細書に記載の完全長配列を得るために用 いるのと同じ技術を、ヌクレオチド配列を得るために用いることができる。 cDNAを適当な発現ベクター中にサブクローニングし、このベクターを適当な発 現宿主中にトランスフェクトすることにより、ある特定のcDNAの発現を行なうこ とができる。GI管組織のcDNAライブラリーの作製に使用するクローニングベクタ ーは、ある特定のcDNAのmRNAの転写に使用することができ、β-ガラクトシダー ゼに関するプロモーター、アミノ末端のmetおよびそれに続くβ-ガラクトシダー ゼの７アミノ酸残基を含有する。人工 的なプライミングおよび転写に有用な操作されたバクテリオファージプロモータ ーの直後に、これらの８残基ならびにクローニング用の多数のユニーク制限部位 （例えば、EcoRI）が存在する。該ベクターは、大腸菌（E．coli)の適当な宿主 株内にトランスフェクトすることができる。 単離された細菌株を標準的な方法によりイソプロピルチオガラクトシド（IPTG ）で誘導することにより、β-ガラクトシダーゼの最初の７残基、リンカーの約1 5残基、および該cDNA内にコードされるペプチドを含有する融合タンパク質が得 られるであろう。cDNAクローンの挿入断片は、実質的にランダムな方法で作製さ れるため、含まれるcDNAが適切な翻訳のための正確なフレームで存在する機会は 、３回のうちの１回である。該cDNAが適切なリーディングフレームにない場合は 、インビトロ突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIもしくはヤエナリヌクレア ーゼでの消化またはオリゴヌクレオチドリンカーの取込みなどの良く知られた方 法による適当な数の塩基の欠失または挿入により、正確なフレームを得ることが できる。 該cDNAは、特定の宿主内でのタンパク質の発現に有用であることか知られてい る他のベクターに対して往復（シャトル）さ せることができる。クローニング部位と標的DNAの両端の伸長にハイブリダイズ するのに十分なDNAセグメントとを含有するオリゴヌクレオチドプライマーは、 標準的な方法で化学的に合成することができる。ついでこれらのプライマーを使 用して、PCRにより所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた 新たな遺伝子セグメントは、標準的な条件下、適当な制限酵素て消化し、ゲル電 気泳動により単離することができる。あるいは、該cDNAを適当な制限酵素で消化 し、欠けている遺伝子セグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで 埋めることにより、同様の遺伝子セグメントを得ることができる。複数の遺伝子 に由来するコード配列のセグメントを一緒にライゲーションし、適当なベクター 中にクローニングして、組換え配列の発現を最適化することができる。 そのようなキメラ分子のための適当な発現宿主には、チャイニーズハムスター 卵巣（CHO）、ヒト胎児腎（HEK）293細胞などの哺乳動物細胞、Sf9細胞などの昆 虫細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母 細胞および大腸菌（E.coli）などの細菌が含まれるが、これらに限定されるもの ではない。これらの各細胞系に関して、有用な発現ベ クターは、細菌内での増殖を可能する複製起点と、細菌内での選択を可能にする 選択マーカー（例えば、β-ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子）とを含むことも 可能である。さらに、該ベクターは、トランスフェクトされた真核性宿主細胞に おける選択を可能にするもう１つの選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホ トランスフェラーゼ遺伝子）を含むことが可能である。真核性発現宿主において 使用するためのベクターでは、関心のある配列がポリAを欠く場合には、3'ポリ Ａテイルの付加が必要となるかもしれない。 さらに、該ベクターは、遺伝子発現を増強するプロモーターまたはエンハンサ ーを含有することが可能である。そのようなプロモーターは、宿主特異的であり 、CHO細胞の場合にはMMTV、SV40またはメタロチオニンプロモーター、細菌宿主 の場合にはtrp、lacまたはT7プロモーター、あるいは酵母の場合にはα因子、ア ルコールオキシダーゼまたはPGHプロモーターを含むが、これらに限定されるも のではない。転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハン サー）を有する又は有さないアデノウイルスベクターを使用して、哺乳動物細胞 系におけるタンパク質の発現を駆動することができる。組換え細 胞の均一培養が得られたら、多量の組換え産生タンパク質を、ならし培地から回 収し、当該技術分野でよく知られているクロマトグラフィー法で分析することが できる。多量の分泌タンパク質のもう１つの製造法は、哺乳動物胚のトランスフ ェクション、およびトランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジなどが産生する乳か ら該組換えタンパク質を回収することを含む。ポリペプチド、および密接に関連 している分子は、タンパク質の精製を容易にするような方法で組換え的に発現さ せることができる。１つのアプローチは、ヒトポリペプチド上に天然には存在し ない１以上の追加的ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現を含む 。精製を容易にするそのようなドメインには、固定化された金属上での精製を可 能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン-トリプトファンドメイ ン）、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイ ン、およびFLAGS伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp，Seattle，WA）で 使用されるドメインが含まれるか、これらに限定されるものではない。切断可能 なリンカー配列、例えばXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen，SanDiego ，CAから入手可能）を該ポリペプチド配列と該精製ドメインとの間 に含有させることは、該ポリペプチドの回収に有用かもしれない。 イムノアッセイ CS198ポリペプチド（その断片、誘導体および類似体を含む）またはそのよう なポリペプチドを発現する細胞は、GI管組織に対する抗体の検出のための種々の アッセイ（そのうちの多数が本明細書に記載されている）で使用することができ る。また、それらを免疫原として使用して、抗体を産生させることができる。こ れらの抗体は、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、 一本鎖およびヒト化抗体およびFab断片、またはFab発現ライブラリーの産物であ ることが可能である。そのような抗体および断片の産生のためには、当該技術分 野で公知の種々の方法を用いることができる。 例えば、本発明の配列を含むポリペプチドに対して産生される抗体は、該ポリ ペプチドを動物に直接注入することにより、あるいは該ポリペプチドを動物（例 えば、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒト）に投与することにより得ることができ る。マウス、ウサギまたはヤギが好ましい。該ポリペプチドは、配列番号42〜47 およびそれらの断片よりなる群から選ばれる。ついで、 そのようにして得た抗体が、該ポリペプチド自体に結合することとなる。このよ うに、該ポリペプチドの断片だけをコードする配列でも、天然ポリペプチドに結 合する抗体を産生させるために使用することができる。ついで、そのような抗体 を使用して、そのポリペプチドを含有する疑いのある組織などの試験サンプルか ら該ポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の製造には、連 続継代細胞培養により産生される抗体を与える任意の技術を用いることができる 。具体例には、KohlerおよびMilstein，Nature 256:495-497(1975)に記載のハイ ブリドーマ技術、トリオーマ技術、Kozborら，Immun.Today 4:72(1983)に記載の ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびColeら，Monoclonal Antibodies and Can cer Therapy ，Alan R．Liss，Inc，New York，NY，pp．77-96(1985)に記載のヒ トモノクローナル抗体を産生させるためのEBV-ハイブリドーマ技術が含まれる。 一本鎖抗体の産生のための記載されている技術を、本発明の免疫原性ポリペプチ ド産物に対する一本鎖抗体を産生させるために適用することができる。例えば、 米国特許第4,946,778号を参照されたい。 本発明の抗体は、「サンドイッチ」イムノアッセイおよびプ ローブアッセイを含む種々のアッセイ様式において使用することができる。例え ば、本発明の抗体またはその断片は、試験サンプル中のCS198抗原の存在を判定 するための種々のアッセイ系で使用することができる。例えば、第１のアッセイ 様式では、固相上にコーティングされている、ポリクローナルもしくはモノクロ ーナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の組合せを、試験サンプルと接 触させて、第１混合物を形成させる。この第１混合物を、抗原／抗体複合体の形 成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、シグナル生成化合 物が結合しているモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片、 またはこれらの抗体の組合せを含む指示試薬を、該抗原／抗体複合体と接触させ て、第２混合物を形成させる。ついで、この第２混合物を、抗体／抗原／抗体複 合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。シグナル生成化合 物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、固相上に捕捉され 試験サンプル中に含まれうるCS198抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存 在するCS198抗原の量は、生成したシグナルに比例する。 もう１つのアッセイ様式では、（1）CS198抗原に特異的に結 合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくはその断片、または固休 支持体に結合したそのような抗体の組合せ、（2）試験サンプル、および（3）シ グナル生成化合物が結合している、異なるCS198抗原に特異的に結合するモノク ローナル抗体、ポリクローナル抗体もしくはその断片（またはこれらの抗体の組 合せ）含む指示試薬を接触させることにより、混合物を得る。この混合物を、抗 体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。 該シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより 、試験サンプル中に存在し固相上に捕捉されたCS198抗原の存在を判定する。試 験サンプル中に存在するCS198抗原の量は、生成したシグナルに比例する。 もう１つのアッセイ様式では、本発明の少なくとも２つのモノクローナル抗体 の一方または組合せを、CS198抗原に対する抗体の検出のための競合プローブと して使用することができる。例えば、CS198ポリペプチド（例えば、本明細書に 開示の組換え抗原）を、単独で又は組合せて、固相上にコーティングする。つい で、CS198抗原に対する抗体を含有する疑いのある試験サンプルを、シグナル生 成化合物と本発明の少なくとも１つのモ ノクローナル抗体とを含む指示試薬と共に、固相に結合している試験サンプルお よび指示試薬または固相に結合している指示試薬のいずれかの抗原／抗体複合体 の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。固相に対するモノクロ ーナル抗体の結合の減少を定量的に測定することができる。 さらにもう１つの検出方法では、本発明のモノクローナルまたはポリクローナ ル抗体のそれぞれを、免疫組織化学的分析による組織切片中または細胞中のCS19 8抗原の検出において使用することができる。これらの抗体を直接的に標識（例 えば、フルオレセイン、金コロイド、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ア ルカリホスファターゼなどでの標識）したり又は二次標識化抗種抗体を使用して 標識（本明細書に例示する種々の標識）して、疾患の組織病理を追跡する細胞化 学的分析も、本発明の範囲内に含まれる。 さらに、これらのモノクローナル抗体を、CNBr活性化セファロースに類似した マトリックスに結合させて、細胞培養または生物学的組織からの特異的CS198ポ リペプチドのアフィニティー精製（例えば、組換え及び天然CS198タンパク質の 精製）に使用することができる。 また、本発明のモノクローナル抗体は、治療用途または他の同様の用途のため のキメラ抗体の産生に使用することができる。 モノクローナル抗体またはその断片は、CS198抗原の検出のために個々に提供 することができる。また、本発明で提供するモノクローナル抗体（およびその断 片）の組合せを、他のCS198領域に特異的に結合する抗体（各抗体は、異なる結 合特異性を有する）と共に、本発明の少なくとも１つのCS198抗体の混合物また は「カクテル」中の成分として一緒に使用することができる。したがって、この カクテルは、本明細書に開示のCS198ポリペプチドに対する本発明のモノクロー ナル抗体と、CS198抗原または他の関連タンパク質の他の抗原決定基に特異的な 他のモノクローナル抗体とを含むことが可能である。 アッセイ様式で使用しうるポリクローナル抗体またはその断片は、CS198ポリ ペプチドまたは該アッセイで追加的に使用する他のCS198ポリペプチドに特異的 に結合すべきである。好ましく使用されるポリクロナール抗体は、CS198ポリペ プチドに結合する、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジポリクローナル抗体などの 哺乳動物に由来するものである。最も好ましくは、該ポリクローナル抗体は、ウ サギに由来するものである。該アッ セイで使用するポリクローナル抗体は、単独で又はポリクローナル抗体のカクテ ルとして使用することができる。該アッセイ様式で使用するカクテルは、CS198 ポリペプチドに対する異なる結合親和性を有するモノクローナル抗体またはポリ クローナル抗体を含むため、それらは、GI管癌などのGI管の疾患または状態の検 出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定 に有用である。 組換え抗原の使用により、あるいはCS198のアミノ酸配列を含む合成ペプチド または精製ペプチドの使用により、アッセイにおいてCS198抗原の検出が可能と なることが意図され、それが本発明の範囲内に含まれる。そのようなポリペプチ ドのアミノ酸配列は、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれ る。また、CS198の異なるエピトープを定める異なる合成、組換えまたは精製ペ プチドを、GI管癌などのGI管の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニタ ー、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定のためのアッセイにおいて併 用することも、本発明の範囲内に含まれる。この場合、これらのペプチドすべて を固相上にコーティングしたり、あるいはそれぞれ分離したペプチドを、分離し た固相（例えば、 微粒子）上にコーティングし、ついで、後にアッセイにおいて使用しうるペプチ ド混合物を形成するように合体させることが可能である。さらに、GI管癌などの GI管の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もし くは治療または素因の判定のために、異なる抗原からのエピトープを定める複数 のペプチドを使用することができると期待される。ついで、固相上にコーティン グされた又は検出可能な標識で標識されたペプチドを、一定量の抗体に関して、 患者のサンプル中に存在する（存在する場合）ペプチドと競合させる。該抗体に 対する該合成、組換えまたは精製ペプチドの結合の減少は、患者のサンプル中の CS198抗原の存在の指標となる。CS198抗原の存在は、患者におけるGI管組織の疾 患、特にGI管癌の存在を示す。アッセイ様式の変形は、当業者に公知であり、本 明細書において後に検討する。 もう１つのアッセイ様式では、以下のとおり、抗CS198抗体および／またはCS1 98抗原の存在を同時に検出することができる。試験サンプルを、同時に、第１被 検体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、固相に結合した第１被検体に特異的な第１結合 メンバーを含む）および第２被検体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、第２ 固相に結合した第２被検体に対する第１結合メンバーを含む）と接触させて、混 合物を得る。この混合物を、捕捉試薬／第１被検体および捕捉試薬／第２被検体 複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、これら のいわゆる複合体を、シグナル生成化合物で標識された第１被検体に特異的な結 合ペアのメンバーと、シグナル生成化合物で標識された第２被検体に特異的な結 合ペアのメンバーとを含む指示試薬に接触させる。この第２混合物を、捕捉試薬 ／第１被検体／指示試薬複合体および捕捉試薬／第２被検体／指示試薬複合体の 形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。いずれかの又は両方の固 相上で形成した複合体に関して生成したシグナルを、試験サンプル中の１以上の 被検体の存在の指標として検出することにより、１以上の被検体の存在を判定す る。このアッセイ様式では、本明細書に開示する発現系に由来する組換え抗原、 および本明細書に開示の発現系に由来するタンパク質から産生したモノクローナ ル抗体を使用することができる。例えば、このアッセイでは、CS198抗原を第１ 被検体とすることが可能である。そのようなアッセイ系は、EP公開第0473065号 に、より詳しく記載されている。 さらにもう１つのアッセイ様式では、本明細書に開示するポリペプチドを使用 して、試験サンプル中のCS198抗原に対する抗体の存在を検出することができる 。例えば、試験サンプルを、少なくとも１つのポリペプチド（例えば、組換えタ ンパク質または合成ペプチド）が結合している固相と共にインキュベートする。 該ポリペプチドは、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれる 。これらを、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で反応させる。 インキュベーション後、該抗原／抗休複合体を検出する。選択するアッセイ系に 応じて、検出を容易にするために、指示試薬を使用することができる。もう１つ のアッセイ様式では、試験サンプルを、本明細書に記載のとおりに産生させた組 換えタンパク質が結合している固相と接触させ、また、指示試薬で好ましくは標 識されている、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗 体と接触させる。抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュ ベーションした後、固相を遊離相から分離し、該標識をCS198抗原に対する抗体 の存在の指標として該固相中または該遊離相中で検出する。本明細書に開示する 組換え抗原を使用する他のアッセイ様式が期待される。これらは、 第１起源からの少なくとも１つの抗原が結合している固相と試験サンプルとを接 触させ、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で該固相と試験サン プルとをインキュベートし、ついで該固相を標識抗原（該抗原は、第１起源とは 異なる第２起源に由来する）と接触させることを含む。例えば、大腸菌(E.coli) などの第１起源に由来する組換えタンパク質を、固相上の捕捉抗原として使用し 、そのように調製された固相に試験サンプルを加え、必要に応じて標準的なイン キュベーションおよび洗浄工程の後、異なる起源（すなわち、非大腸菌(E．coli )）に由来する組換えタンパク質を、後に検出する指示試薬の一部として使用す る。同様に、固相上の組換え抗原と合成ペプチド（指示相中）との組合せも可能 である。第１起源から産生した又はそれに由来するCS198に特異的な捕捉抗原と しての抗原と、異なる第２起源からのCS198に特異的な抗原とを使用する任意の アッセイ様式が期待される。このように、組換え抗原の種々の組合せ、および合 成ペプチド、精製タンパク質などの使用が、本発明の範囲内に含まれる。このア ッセイおよび他のアッセイは、米国特許第5,254,458号に記載されている。 また、種々の他の固相を使用する他の実施態様も意図され、 本発明の範囲内に含まれる。例えば、速い液相免疫化学的反応を行なうために、 負に荷電した重合体との固定化可能反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法 （EP公開第0326100号およびEP公開第0406473号に記載されている）を本発明で使 用することができる。固定化可能な免疫複合体は、その負に荷電したポリ-アニ オン／免疫複合体と、予め処理されている正に荷電した多孔性マトリックスとの 間のイオン相互作用により、該反応混合物の残部から分離され、既に記載されて いる種々のシグナル生成系（例えば、EPO公開第0273,115号に記載の化学発光シ グナルの測定において記載されているもの）を用いて検出される。 また、固相が微粒子（磁性または非磁性）を含む微粒子技術を用いる系（例え ば、自動化系および半自動化系）での使用に、本発明の方法を適合させることが 可能である。そのような系には、例えば、公開されているEPO出願EP 0425 633お よびEP0424634にそれぞれ記載されている系が含まれる。 イムノアッセイにおける走査型プローブ顕微鏡検査法（scanning probe micro scopy）（SPM）の使用も、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合させること が可能な技術として 挙げられる。走査型プローブ顕微鏡検査法、特に原子間力顕微鏡検査法において は、捕捉相、例えば、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つを固相に付 着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面上に存在しうる抗原／抗 体複合体を検出する。通常、多数のイムノアッセイ系においては、抗原／抗体複 合体を検出するために標識を使用しなければならないが、走査型トンネル顕微鏡 検査法を使用すると、そのような標識が不要になる。特異的結合反応をモニター するためのSPMの使用は、多数の方法で実施することが可能である。１つの実施 態様では、特異的結合パートナーのメンバーの１つ（本発明のモノクローナル抗 体である被検体特異的物質）を、走査に適した表面に結合させる。該被検体特異 的物質の結合は、当業者に公知の方法に従って行なう、プラスチックまたは金属 表面の固相を含む試験片に対する吸着によるものであってもよい。あるいは、誘 導体化プラスチック、金属、シリコン（ケイ素）またはガラスの固相を含む試験 片に対する特異的結合パートナー（被検体特異的物質）の共有結合を用いてもよ い。共有結合方法は、当業者に公知であり、特異的結合パートナーを試験片に不 可逆的に結合させるための種々の手段を含む。該試験片がシ リコンまたはガラスである場合には、特異的結合パートナーを結合させる前に、 該表面を活性化する必要がある。また、特異的結合パートナーを試験片の表面上 に化学的方法で固定化するために、混成電極相互作用を用いることができる。好 ましい結合方法は、共有的手段によるものである。特異的結合メンバーの結合の 後、非特異的結合を最小限に抑えるために、該表面を血清、タンパク質または他 のブロッキング剤などの物質で更に処理することができる。また、アッセイ目的 に対する適合性を確認するために、該表面を、製造部位または使用点において走 査することができる。走査過程は、試験片の特異的結合特性を変えないと考えら れる。 本発明は、主として固相の使用に関して開示されているが、本発明の抗体、タ ンパク質、ペプチドなどの試薬は、非固相アッセイ系においても使用可能である と期待される。これらのアッセイ系は、当業者に公知であり、本発明の範囲内に 含まれるとみなされる。 アッセイに使用する試薬は、バイアル、ボトルなどの１以上の容器を有する試 験キットの形態で提供できると期待される。その各容器は、該アッセイで使用す るプローブ、プライマー、 モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のカクテル、またはポリペプチ ド（例えば、組換え的、合成的に製造または精製されたもの）などの別個の試薬 を含有する。該ポリペプチドは、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群 から選ばれる。当業者に公知の他の成分（例えば、緩衝液、対照など）を、その ような試験キットに含めることが可能である。また、利用可能な体液（例えば、 血液、尿、唾液および糞便）を含む試験サンプルを採集するための手段を有する 試験キットを提供することが期待される。採集に有用なそのような手段（「採集 材料」）には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布 、唾液を採集し安定化するためのスワブ、尿または糞便サンプルを採集し安定化 するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるた めに、所望により、採集材料、紙、布、スワブ、カップなどを処理することが可 能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、該採集材料を保存 剤、安定化剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定化剤ま たは抗微生物剤を含有させることが可能である。手術または針生検により得た試 験試料の採集、安定化および保存のために設計された試験キッ トも有用である。すべてのキットは、別個に提供されることが可能な２つの成分 （その一方の成分は、試料の採集および運搬のためのものであり、もう一方は、 試料の分析のためのものである）に構成することができると期待される。例えば 、採集成分は、公開市場の消費者に提供することが可能であり、一方、分析用成 分は、被検体の存在、不存在または量の測定のために研究者などに提供すること が可能である。さらに、試験試料の採集、安定化および保存のためのキットは、 熟練していない者による使用を意図して構成することが可能であり、家庭で使用 された後、該試験サンプルの分析のために研究室に運搬されることを意図して、 公開市場において入手可能とすることができる。 大腸菌（E．coli）（クローン2055371）は、American Type Culture Collecti on（A.T.C.C.）、12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852に6/25/9 7に寄託された。該寄託は、ブダペスト条約の条項に基づくものであり、寄託の 日から30年間または寄託に関する最終請求後５年間または該米国特許の存続期間 のうち最も遅い時まで保管されることとなる。該寄託および本明細書に記載の他 の任意の寄託物質は、便宜上与え られているにすぎず、本明細書の教示を考慮して本発明を実施することは必ずし も要求されない。それらの全寄託物質におけるcDNA配列を、参考として本明細書 に組入れるものとする。クローン2055371には、A.T.C.C.受託第98462号が付与さ れている。 つぎに、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は例示にすぎす、 本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 実施例１:胃腸管組織ライブラリーCS198遺伝子特異的クローンの特定 A．発現されたタグ配列（EST）または転写イメージにおける、ライブラリーの 比較 cDNAクローン挿入断片の部分配列、いわゆる「発現されたタグ配列」（EST） を、GI管腫瘍組織、GI管非腫瘍組織および多数の他の組織（腫瘍および非腫瘍の 両方）から作製したcDNAライブラリーから導き出し、遺伝子転写イメージとして データベース（Incyte Pharmaceuticals，Palo Alto，CAから入手可能なLIFESEQ^TM データベース）に入力した。国際公開WO 95/20681を参照されたい（転写イメ ージは、ある与えられた組織ライブ ラリーにおける代表遺伝子のそれぞれに関するEST数の一覧である。相互配列重 複の領域を共有するESTは、クラスターに分類される。クラスターには、代表的5 'ESTからのクローン番号が割り当てられる。しばしば、関心のあるクラスターを 、そのコンセンサス配列と、自動化クラスタリングの基準を満足しなかった他の ESTの配列との比較により伸長させることが可能である。入手可能な全クラスタ ーおよび単−ESTのアラインメントは、コンセンサス配列が導かれるコンティグ を表す）。ついで該転写イメージを評価して、主としてGI管組織ライブラリーを 代表するEST配列を同定した。ついで、これらの標的クローンを、標的ライブラ リー中のそれらの存在量（出現頻度）と、バックグラウンドライブラリーにおけ るそれらの不存在とに基づきランク付けした。低いバックグラウンド出現頻度を 有する、より高い存在量のクローンには、より高い研究優先度を与えた。CS198 のコンセンサス配列に対応するESTは、GI管組織ライブラリーの32.3％（59例中1 9例）で見出された。コンセンサス配列27またはその断片に対応するESTは、該デ ータベースのその他の非GI管ライブラリーの4.7％（573例中27例）で見出された 。したがって、コンセンサス配列またはその断片は、GI管 においては非GI管組織の場合の６倍以上多く見出された。重複クローン2682428 （配列番号7）、2682469（配列番号8）、3359342（配列番号9）、1736231（配列 番号10）、1734520（配列番号11）、2596108（配列番号12）、3388863（配列番 号13）、g2322685（配列番号14）、3988413（配列番号15）、3615515（配列番号 16）、2055371（配列番号17）、1431231（配列番号18）、3253860（配列番号19 ）、1753756（配列番号20）、1887713（配列番号21）、1803052（配列番号22） 、889029（配列番号23）、2620906（配列番号24）および1754901（配列番号25） を、更なる研究のために同定した。これらは、ゲノムクローンg2804590に由来す るエキソン配列（配列番号1〜6）およびクローン2055371IHの完全長配列（配列 番号26）と共に本明細書に記載するコンセンサス配列（配列番号27）を導き出す もとになった、該コンティグを形成するのに必要な最小数のクローンを代表した 。 B ．コンセンサス配列の作製 重複クローン2682428（配列番号7）、2682469（配列番号8）、3359342（配列 番号9）、1736231（配列番号10）、1734520（配列番号11）、2596108（配列番号 12）、3388863（配列番号13）、g2322685（配列番号14）、3988413（配列番号15 ）、3615515 （配列番号16）、2055371（配列番号17）、1431231（配列番号18）、3253860（ 配列番号19）、1753756（配列番号20）、1887713（配列番号21）、1803052（配 列番号22）、889029（配列番号23）、2620906（配列番号24）、1754901（配列番 号25）、2055371IH（配列番号26）のヌクレオチド配列、およびゲノムクローンg 2804590に由来するエキソン配列（配列番号1〜6）を、Sequencher^TMプログラム （Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MIから入手可能）に入力して、ヌクレ オチドアライメント（コンティグ地図）を得、ついでそれらのコンセンサス配列 （配列番号27）を得た。図1A〜1Gは、これらのクローンおよびエキソン配列のヌ クレオチド配列アラインメント、および得られたそれらのヌクレオチドコンセン サス配列（配列番号27）を示す。図２は、CS198遺伝子の重複領域を形成する重 複クローン2682428（配列番号7）、2682469（配列番号8）、3359342（配列番号9 ）、1736231（配列番号10）、1734520（配列番号11）、2596108（配列番号12） 、3388863（配列番号13）、g2322685（配列番号14）、3988413（配列番号15）、 3615515（配列番号16）、2055371（配列番号17）、1431231（配列番号18）、325 3860（配列番号19）、1753756（配列番号20）、1887713（配列番号 21)、1803052（配列番号22）、889029（配列番号23）、2620906（配列番号24） 、1754901（配列番号25）、2055371IH（配列番号26）、およびゲノムクローンg2 804590に由来するエキソン配列（配列番号1〜6）を示すコンティグ地図と、得ら れたこれらのクローンのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号27）とを図示 的に表す。該コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号27）の163位に、可能なG /T多型が認められた。LIFESEQ^TMデータベースにおいて163位で認められたTに対 するGの比率は、3：1であった。該コンセンサス配列の作製の後、配列番号27上 で３フレーム翻訳を行なった。第２フォワードフレームは、679残基のアミノ酸 配列をコードするオープンリーディングフレームを有することが判明し、これを 配列番号42として示す。この分子のC末端部分を表す215残基のアミノ酸配列を、 配列番号47として示す。配列番号42に示す679残基のポリペプチド配列は、GenBa nkに1998年1月23日に受託第AC004030号で寄託されている「未知機能の仮想的ヒ トタンパク質」の概念上の翻訳に対して実質的な配列同一性を有する。また、配 列番号42のポリペプチド配列を、当業者に公知のソフトウェアおよび技術を用い て、公開されている配列と比較した。熱帯熱マラリ ア原虫（Plasmodium falciparum）のグルタミン酸に富む前駆体に類似したタン パク質のポリペプチド配列は、配列番号42のCS198ポリペプチドの配列と部分的 に相同であることが判明した。この部分的に相同なタンパク質の配列は、GenBan kに受託第D87440号で寄託されている。 実施例２：CS198 EST特異的クローンの配列決定 CS198遺伝子コンティグのクローン2055371のDNA配列を、公知方法に従い、色 素ターミネーターを使用するジデオキシターミネーション配列決定法で決定した （配列番号26）[F Sangerら，PNAS U.S.A ．74:5463(1977)]。この完全長配列を 、本発明では、クローン2055371IH（配列番号26）と称することにする。 pINCYベクター（Incycte Pharmaceuticals，Inc.，Palo，CAから入手可能）は 、該挿入断片の3'および5'ライゲーション結合部に直接隣接した普遍的プライミ ング部位を含有するため、普遍的プライマー(配列番号30および配列番号31、New England Biolabs，Beverly，MAおよびApplied Biosystems Inc，FosterCity，C Aから入手可能)を使用して該挿入断片の約300塩基を両方向に配列決定した。該 配列決定反応を、ポリアクリルアミ ド変性ゲル上で行ない、Applied Biosystems 377 Sequencer（Applied Biosyste ms，Foster City，CAから入手可能）により、該配列を決定した。追加的な配列 決定プライマー（配列番号32〜39）を、該コンセンサス配列（配列番号27）の配 列情報から設計した。ついで、これらのプライマーを使用して、既に記載されて いるとおりに、各DNA鎖からのクローン化挿入断片のその他のDNA配列を決定した 。 実施例３：核酸 A ．組織からのRNAの抽出 GI管組織および非GI管組織から全RNAを単離した。当該技術分野で公知でありK atoら（J ．Virol．61:21-2191，(1987)）に記載されている塩化リチウム／尿素 法、Ultraspec^TM(Biotecx Laboratories，Inc.,Houston Texas)およびTRIzol^TM( Gibco-BRLGrand Island，NY)を含む（これらに限定されるものではない）種々の 方法を用いた。 簡単に説明すると、該組織を氷上の無菌円錐管中に配置し、10〜15容量の3M L iCl、6M尿素、5mM EDTA、0.1M β-メルカプトエタノール、50mM Tris-HCl(pH7.5 )を加えた。該組織を、氷 Westbury，NY）で30〜50秒間ホモジナイズした。該溶液を15mlプラスチック遠心 管に移し、−20℃で一晩放置した。該管を9,000×g、0〜4℃で90分間遠心し、該 上清を直ちにデカントした。10mlの3M LiClを加え、該管を５秒間ボルテックス した。該管を11,000×g、0〜4℃で45分間遠心した。デカント、LiClへの再懸濁 および遠心分離を繰返し、最終ペレットを風乾し、2mlの1mM EDTA、0.5% SDS、1 0mM Tris(pH7.5)に懸濁した。20μlのプロテイナーゼK（20mg/ml）を加え、時々 混合しながら該溶液を37℃で30分間インキュベートした。10分の１容量（0.22〜 025ml）の3M NaClを加え、該溶液をボルテックスした後、2mlのフェノール／ク ロロホルム／イソアミルアルコール（PCI）を含有する別の管に移した。該管を1 〜3秒間ボルテックスし、3,000×g)10℃で20分間遠心した。PCI抽出を繰返し、 ついでクロロホルム／アミルアルコール（CI）での同様の抽出を２回行なった。 最終水溶液を、6mlの無水エタノールを含有する予め冷却した15mlコレックスガ ラス管に移し、該管をパラフィンで覆い、−20℃で一晩放置した。該管を10,000 ×g、0〜4℃で30分間遠心し、該エタノール上清を直ちにデカントした。該RNAペ レットを10mlの75％氷冷エタノールで４回洗浄し、最終 ペレットを室温で15分間風乾した。該RNAを0.5mlの10mM TE(pH7.6，1mM EDTA)に 懸濁し、その濃度を分光光度的に測定した。RNAサンプルを等分割し、エタノー ル沈殿物として−70℃で保存した。 該RNAの量を、アガロースゲル電気泳動（実施例5、ノーザンブロット分析を参 照されたい）および0.5μg/mlの臭化エチジウムでの１時間の染色により測定し た。無傷rRNAを含有しないRNAサンプルを、該研究から除外した。 あるいは、RT-PCR分析では、1mlのUltraspec RNA試薬を、2.0mlポリプロピレ ンミクロ遠心管120mgの微粉砕組織に加え、 Westbury，NY）で50秒間ホモジナイズし、氷上に５分間放置した。ついで0.2ml のクロロホルムを各サンプルに加え、ついで15秒間ボルテックスした。該サンプ ルを氷上に更に５分間放置し、ついで12,000×g、4℃で15分間遠心した。該上層 を集め、RNアーゼを含まない別の2.0mlミクロ遠心管に移した。等容量のイソプ ロパノールを各サンプルに加え、該溶液を氷上に10分間放置した。該サンプルを 12,000×g、4℃で10分間遠心し、該上清を捨てた。残ったペレットを冷75％エタ ノールで２回洗浄 し、ホルテックスにより再懸濁し、再懸濁した該物質をついで、7,500×g、4℃ で５分間遠心分離によりペレット化した。最後に、該RNAペレットをスピードバ ック（Speedvac）（Savant，Farmingdale，NY）中で５分間乾燥し、RNアーゼを 含まない水中で再構成した。 B ．血液単核細胞からのRNA抽出 単核細胞を、以下のとおりFicoll-Hypaqueを使用する遠心分離により、患者か らの血液サンプルから単離する。10ml容量の全血を、等容量のRPMI培地（Gibco- BRL，Grand Island，NY）と混合する。ついでこの混合物の下に10mlのFicoll-Hy paque（Pharmacia，Piscataway，NJ）を配置し、200×gで30分間遠心する。該単 核細胞を含有するバフィーコートを取り出し、Dulbecco PBS（Gibco-BRL，Grand Island，NY）で50mlまで希釈し、該混合物を200×gで10分間遠心した。２回の 洗浄の後、得られたペレットをDulbecco PBSに再懸濁して、1mlの最終容量とす る。 Katoら（J ．Virology 61:2182-2191(1987)）に記載のとおりに、単離した単核 細胞からRNAを調製する。簡単に説明すると、該ペレット化単核細胞を1mlの最終 容量にし、ついで250μLの PBSに再懸濁し、2.5mlの3M LiCl、6M尿素、5mM EDTA、0.1M 2-メルカプトエタノ ール、50mM Tris-HCl(pH7.5)と混合する。得られた混合物をホモジナイズし、− 20℃で一晩インキュベートする。該ホモジネートを、Beckman J2-21Mローター中 、8,000RPM、0〜4℃で90分間速心する。該ペレットを、ボルテックスすることに より10mlの3M LiClに再懸濁し、ついでBeckman J2-21Mローター遠心機中、10,00 0RPM、0〜4℃で45分間遠心する。ついで該再懸濁工程およびペレット化工程を繰 返す。該ペレットを、ボルテックスしながら2mlの1mM EDTA、0.5%SDS、10mM Tri s(pH7.5)および400μgプロテイナーゼKに再懸濁し、ついでそれを、振とうしな がら37℃で30分間インキュベートする。ついで10分の１の容量の3M NaClを加え 、該混合物をボルテックスする。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ ール（PCI）での２サイクルの抽出、およびそれに続くクロロホルム／イソアミ ルアルコール（CI）での１回の抽出により、タンパク質を除去する。6mlの無水 エタノールを加え、ついで−20℃で一晩インキュベートすることにより、RNAを 沈殿させる。該沈殿RNAを遠心により集めた後、該ペレットを75％エタノールで ４回洗浄する。ついで該ペレット化RNAを1mM EDTA、10mM Tris-HCl(pH7.5)を含有する溶液に溶解する。 非GI管組織を陰性対照として使用する。さらにポリアデニル化RNAの単離のた めのオリゴdTセルローススピンカラム（Pharmacia，Uppsala，SwedenからのRedi Col^TM）などの商業的に入手可能なキットを使用して、該mRNAを全RNAから精製す ることができる。全RNAまたはmRNAは、リボヌタレアーゼ保護アッセイにおける 分析のために溶解緩衝液（5Mグアニジンチオシアナート、0.1m EDTA、pH7.0）中 に溶解することができる。 C．ポリソームからのRNA抽出 組織を、4℃、食塩水中で細かく刻み、6mM 2-メルカプトエタノールを含有す るTK₁₅₀M（150mMKCl、5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl、pH7.5）溶液中、2.5容量の0. 8Mショ糖と混合する。該組織を、Teflon-ガラスPotterホモジナイザー中、100〜 200rpm、５往復で、ついでDounceホモジナイザー中、６往復でホモジナイズする （B．Mechler，Methods in Enzymology 152:241-248（1987）に記載のとおり） 。ついで該ホモジネートを、12,000×g、4℃で15分間遠心して、核を沈降させる 。2mlの該上清を、TK₁₅₀M中の2.5Mショ糖6mlと混合し、この混合物を38mlポリア ロマー管内のTK₁₅₀M中の4mlの2.5Mショ糖の上に重層することにより、 該ポリソームを単離する。追加的な２つのTK₁₅₀M溶液を、該抽出画分の上に順次 重層する(13mlの2.05Mショ糖の第１層およびそれに続く6mlの1.3Mショ糖の第２ 層)。該勾配を90,000×g、4℃で５時間速心することにより、該ポリソームを単 離する。ついで該画分をシリコーン化パスツールピペットで1.3Mショ糖／2.05M ショ糖界面から取り、等量のTE(10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM EDTA)中に希釈する 。等容量の90℃のSDS緩衝液（1%SDS、200mM NaCl、20mM Tris-HCIl、pH7.4）を 加え、該溶液を沸騰水浴中で２分間インキュベートする。つぎにタンパク質をプ ロテイナーゼK（50mg/ml）で37℃で15分間消化する。等容量のフェノール／クロ ロホルムで３回抽出し、ついで0.1容量の2M酢酸ナトリウム(pH5.2)および２容量 の100％エタノールで−20℃で一晩沈殿させることにより、該mRNAを精製する。 その沈殿したRNAを、12,000×g、4℃で10分間の遠心分離により回収する。該RNA を乾燥し、TE（pH7.4）または蒸留水に再懸濁する。ついで該再葱濁化RNAをスロ ットブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで使用して 、CS198mRNAの存在を確認することができる（実施例６を参照されたい）。 核酸およびタンパク質の量は、用いる製造方法に左右される。 標的分子の単離効率を最大にするためには、各サンプルは、異なる調製技術を必 要とするかもしれない。これらの調製技術は、当業者の技量の範囲内に含まれる 。 実施例４：リボヌクレアーゼ保護アッセイ A ．標識化相補的RNA（cRNA）ハイブリダイゼーションプローブおよび未標識セ ンス鎖の合成 標識されたアンチセンスおよび未標識のセンスリボプローブを、5'RNAポリメ ラーゼプロモーター（例えば、SP6またはT7）を含有するCS198遺伝子cDNA配列か ら転写する。該配列は、適当なCS198 cDNA挿入断片を含有するベクターに由来す るか又は5'RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むPCRプライマーを使用する該 挿入断片のPCR産物に由来することが可能である。例えば、対向するSP6およびT7 ポリメラーゼプロモーターに隣接する、CS198遺伝子cDNA配列を含有する記載さ れているプラスミド、クローン2055371またはもう１つの比較しうるクローンを 、Qiagen Plasmid Purificationキット(Qiagen，Chatsworth，CA)を使用して精 製する。ついで10μgの該プラスミドDNAを、20UのDdeI制限酵素で37℃で１時間 で切断することにより線状化する。その線状化プラスミドDNAを、QIAprepキット (Qiagen， Transcription System（Promega Corporation，Madison，WI）を該供給業者の指 示書の記載のとおりに使用し6.3μM（α³²P）UTP（Amersham Life Sciences，In c．Arlington Heights，IL）または100〜500μMビオチン化UTPを標識として取込 ませることによりアンチセンス転写産物を適当なプロモーターから合成するため に、該プラスミドDNAを使用する。該センス鎖を得るために、10μgの該精製プラ スミドDNAを、制限酵素XbaIおよびNotIで切断し、前記のとおりに適当なSP6また はT7プロモーターから転写する。センスおよびアンチセンスの両方の鎖を、スピ ンカラムクロマトグラフィーにより単離する。未標識センス鎖を、260nmのUV吸 収により定量する。 B ．標的に対する標識プローブのハイブリダイゼーション 凍結した組織を、液体窒素下で粉砕して粉末にし、100〜500mgを1mlの溶解緩 衝液（Direct Protect^TM Lysate RNase Protectionキット（Ambion，Inc.，Aust in，TX）の一成分として入手可能）に溶解する。さらに組織ホモジナイザーを使 用して溶解を行なうことができる。また、陽性対照として使用するために、マウ ス肝ライセート中の既知量のセンス鎖の希釈系列 を作製する。最後に、45μlの可溶化組織または希釈化センス鎖を、（1）1×100⁵ cpmの放射能標識プローブ、または（2）5μlの溶解緩衝液中の250pgの非同位体 標識プローブのいずれかと直接混合する。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩 進行させる。T．Kaabacheら，Anal ．Biochem．232:225-230(1995)を参照された い。 C ．RNアーゼ消化 Direct Protect^TMプロトコールに従い、RNアーゼAおよびRNアーゼT1の溶液を3 7℃で30分間使用し、ついでサルコシルナトリウムの存在下でプロテイナーゼK消 化によりRNアーゼを除去することにより、プローブにハイブリダイズしていない RNAを該反応から除去する。ついで、消化されないように保護されたハイブリダ イズした断片を、等容量のイソプロパノールの添加により沈殿させ、−70℃で１ 時間放置する。該沈殿物を、12,000×gで20分間の遠心分離により集める。 D ．断片の分析 該沈殿物を、変性ゲルローディング色素(80%ホルムアミド、10mM EDTA(pH8.0) 、1mg/mlキシレンシアノール、1mg/mlブロモフェノールブルー）に溶解し、熱変 性させ、6％ポリアクリル アミドTBE、8M尿素変性ゲル中で電気泳動する。STORM^TM貯蔵蛍りん光体（storag e phosphor）オートラジオグラフィー系（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA ）を使用して、該ゲルをイメージングし、分析する。試験サンプルから得たピー ク面積を陽性対照センス鎖の既知希釈物からのものと比較することにより、フェ ムトグラム（fg）単位で示される保護断片バンドの定量を行なう(B節、前掲を参 照されたい)。結果を、CS198 RNA/細胞の分子数でイメージ評価得点として表す 。非同位体標識を使用する場合には、ハイブリッドを、ブロッティングにより該 ゲルからメンブレン（ナイロンまたはニトロセルロース）にトランスファーし、 ついでストレプトアビジンアルカリホスファターゼ共役体および化学発光または 化学蛍光試薬を使用する検出系を用いて分析する。 配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列 を含む産物の検出は、CS198mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患ま たは状態の診断を示唆する。 実施例５：ノーザンブロット法 アガロースゲル電気泳動および核酸ハイブリダイゼーション によりRNAの複合体集団中の特定のサイズのRNA種を同定するために、ノーザンブ ロット法を用いた。簡単に説明すると、40mMモルヒリノプロパンスルホン酸（MO PS）(pH7.0)、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、2.2Mホルムアルデヒド、50% v/v ホルムアミドを含有する15μlの溶液中で、5〜10μgの全RNA（実施例３、核酸の 調製を参照されたい）を65℃で15分間インキュベートした。該変性RNAを2μlの ローディング緩衝液（50%グリセロール、1mM EDTA、0.4%ブロモフェノールブル ー、0.4%キシレンシアノール）と混合し、40mM MOPS(pH7.0)、10mM酢酸ナトリウ ム、1mM EDTAおよび2.2Mホルムアルデヒドを含有する変性1.0％アガロースゲル 中にローディングした。該ゲルを60Vで1.5時間電気泳動し、RNアーゼを含まない 水中の0.5μg/mlの臭化エチジウムで１時間染色し、RNアーゼを含まない水中で3 0〜45分間リンスした。下向性アルカリキャピラリートランスファー法（downwar d alkaline capillary transfer method）（Chomczynski，Anal ．Biochem．201: 134-139，1992）を用いて、RNAを該ゲルからナイロンメンブレン（Brightstar-P lus，Ambion，Inc.，Austin，TX）に1.5時間トランスファーした。該フィルター を1×SSCでリンスし、Stratalinker(Stratagene， Inc.，La Jolla，CA)を自動架橋（autocrosslinking）モードで使用してRNAを該 フィルターに架橋し、15分間乾燥した。ついで該メンブレンを、予め加熱した20 mlのプレハイブリダイゼーション溶液（5×SSC、50%ホルムアミド、5×デンハル ト液、100μg/ml変性サケ精子DNA）を含有するハイブリダイゼーション管に入れ 、42℃のハイブリダイゼーションオーブン中で少なくとも３時間インキュベート した。該ブロットをプレハイブリダイズさせながら、製造業者の指示書(Gibco-B RL，Grand Island，NY)に従いCS198挿入断片を使用して³²P標識ランダムプライ ムドプローブを作製した。該プローブの半分を10分間煮沸し、氷上で急冷し、該 ハイブリダイゼーション管に加えた。ハイブリダイゼーションを42℃で少なくと も12時間行なった。該ハイブリダイゼーション溶液を捨て、該フィルターを、30 mlの3×SSC、0.1%SDS中、42℃で15分間洗浄(２回)し、ついで30mlの0.3×SSC、0 .1%SDS中、60℃でそれぞれ15分間洗浄（２回）した。該フィルターをサランラッ プ（Saran Wrap）で包み、Kodak XAR-Omatフィルムに8〜120時間さらし、該フィ ルムを現像し分析した。 GI管および非GI管組織を含有するノーザンブロットに対するCS198のハイブリ ダイゼーションの分析の結果を、図３に示 す。この図は、臭化エチジウムで染色されたRNAゲルおよびCS198ノーザンブロッ トを示している。RNAサイズ基準の位置（Kb単位）を、各パネルの左側に示す。 図３は、該CS198プローブが、結陽試料における約3.0KbのRNAを検出し（レーン3 ）、前立腺試料における同一サイズのバンドを、より弱く検出し(レーン10)、腎 臓試料における約5Kbの産物を弱く検出した（レーン4）ことを示している。残り の９個の非GI管RNAサンプルのいずれにおいても、ハイブリダイゼーションは認 められなかった。 配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列 を含む産物の検出は、CS198mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患ま たは状態の診断を示唆する。 実施例６：ドットブロット／スロットブロット ドットおよびスロットブロットアッセイは、複雑な核酸混合物中の特異的核酸 配列の存在を評価するための迅速な方法である。そのようなアッセイを行なうた めに、50μgまでのRNAを50μlの50％ホルムアミド、7％ホルムアルデヒド、1×S SC中で混合し、60℃で15分間インキュベートし、ついで氷上で冷却す る。ついで100μlの20×SSCを該RNA混合物に加え、調製されたニトロセルロース またはナイロンメンブレンを有するマニホールド装置上に真空下でローディング する。該メンブレンを水、20×SSCに１時間漬け、20×SSCで予め湿らせたWhatma n#3濾紙の２枚のシート上に配置し、スロットブロットまたはドットブロット真 空マニホールド装置中にローディングする。該スロットブロットを、前記実施例 ４に記載のとおりに調製され標識されたプローブで分析する。配列番号1〜27お よびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列に対応するmRNAの検 出は、CS198の存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患または状態の診断を示 唆する。 実施例５および６に記載（ただし、ここでは、特に詳細に記載されているわけ ではない）の方法で使用しうる他の方法および緩衝液は、当該技術分野で公知で あり、J．Sambrookら（前掲）に記載されている。 配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列 を含む産物の検出は、CS198 mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患ま たは状態の診断を示唆する。実施例７：In Situハイブリダイゼーション この方法は、検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して細胞 中の特異的標的核酸配列を直接検出するのに有用である。 細胞RNAの保持を最大にするためのパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ ドなどの架槁固定剤を用いて、組織を調製する。L．Angererら，Methods in Cel l Biol ． 35:37-71（1991）を参照されたい。簡単に説明すると、該組織を、50mM リン酸ナトリウム（pH7.5）中の５容量以上の１％グルタルアルデヒド中に4℃で 30分間放置する。該溶液を、新鮮なグルタルアルデヒド溶液（1%グルタルアルデ ヒド、50mMリン酸ナトリウム中（pH7.5））と交換して、さらに30分間固定する 。該固定溶液は、約0.375％NaClの浸透圧モル濃度を有するべきである。該組織 を等張NaCl中で１回洗浄して、該リン酸を除去する。 ついで該固定化組織を、以下のとおり、パラフィン中に包埋する。50％（２回 ）、70％（２回）、85％、90％、ついで100％（２回）の一連の増加するエタノ ール濃度により、それぞれ15分間、該組織を脱水する。つぎに、該組織をキシレ ン（２回交換）に、室温でそれぞれ20分間漬ける。ついで該組織を、キシ レンおよびパラフィンの１：１混合物（２回交換）に60℃でそれぞれ20分間、つ いでパラフィン（３回の最終交換）にそれぞれ15分間漬ける。 つぎに、該組織を、標準的なミクロトームを使用して5μmの切片に切断し、3- アミノプロピルトリエトキシシランなどの組織接着剤で予め処理されたスライド 上に配置する。 キシレンに10分間２回漬けることにより、該組織からパラフィンを除去し、99 ％（２回）、95%、85%、70%、50%、30%の一連の減少するエタノール濃度中、つ いで蒸留水（２回）中で再び脱水する。該切片を、0.2M HClで10分間、前処理し 、37℃で15分間、2μg/mlプロテイナーゼKで透過性を上昇させる。 CS198遺伝子プラスミドから転写された標識Riboprobe(実施例４を参照された い)を、その調製された組織切片にハイブリダイズさせ、3×標準食塩水抽出物お よび50％ホルムアミド中、56℃で一晩インキュベートする。2×標準クエン酸食 塩水および50％ホルムアミド中で洗浄し、ついで100μg/ml RNアーゼAで37℃で3 0分間消化することにより、過剰なプローブを除去する。蛍光プローブを、顕微 鏡下での紫外（UV）光による照明により可視化する。細胞質中の蛍光は、CS198 mRNAを示している。別 法として、該切片をオートラジオグラフィーで可視化することができる。 配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列 を含む産物の検出は、CS198 mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患ま たは状態の診断を示唆する。 実施例８：逆転写PCR A ．一工程RT-PCRアッセイ 当該技術分野で公知の方法を用いる逆転写PCRにより前記標的配列を検出する ために、標的特異的プライマーを設計する。一工程RT-PCRは、RTおよびPCRの両 方を単一反応混合物中で行なう逐次的方法である。該方法は、50mM(N,N-ビス[2- ヒドロキシエチル]グリシン）（pH8.15）、81.7mM KOAc、33.33mM KOH、0.01mg/ mlウシ血清アルブミン、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、0.02mg/ml NaN₃、8% w/ vグリセロール、150μMの各dNTP、0.25μMの各プライマー、5U rTthポリメラー ゼ、3.25mM Mn(OAc)₂および5μlの標的RNA（実施例３を参照されたい）を含有す る200μlの反応混合物中で行なう。RNAおよび該rTthポリメラーゼ酵素は、Mn(OA c)₂の存在下では不安定であるため、該Mn(OAc)₂ は、標的の添加の直前に加えるべきである。当業者であれば、cDNA合成およびサ ーマルサイクリングのための最適条件を容易に決定することが可能である。該反 応を、Perkin-Elmer ThermalCycler480中でインキュベートする。当業者であれ ば、cDNA合成およびサーマルサイクリングのための最適条件を容易に決定するこ とが可能である。有用であると考えられる条件には、60℃〜70℃で15〜45分間の cDNA合成、および94℃で１分間、55〜70℃で１分間、72℃で２分間の30〜45サイ クルの増幅か含まれる。また、一工程RT-PCRは、Taqポリメラーゼと逆転写酵素( 例えば、MMLVまたはAMV RT酵素)とを使用する二重酵素法を用いて行なうことが できる。 B ．伝統的なRT-PCR 伝統的な二工程RT-PCを、K.Q．Huら，Virology 181:721-726(1991)に記載のと おりに行なった。簡単に説明すると、1.0μgの抽出されたｍRNA（実施例３を参 照されたい）を、1×PCR II緩衝液（Perkin-Elmer）、5mM MgCl₂、1mM dNTP、20 U RNasin、2.5μMランダムヘキサマーおよび50U MMLV（モロニーマウス白血病ウ イルス）逆転写酵素（RT）を含有する20μlの反応混合物中で逆転写した。逆転 写は、PE-480サーマルサイクラー中、 42℃で30分間行ない、ついで95℃で５分間インキュベートして、該RTを不活性化 した。PCRは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、200μM dNTP、0 .4μMの各センスおよびアンチセンスプライマー（それぞれ配列番号40および配 列番号41）および2.5UのTaqポリメラーゼを含有する50μlの最終PCR反応容量中 、2μlの該cDNA反応液を使用して行なった。該反応を、MJ Research Model PTC- 200中で以下のとおりにインキュベートした：94℃で２分間の変性、ついで35サ イクルの増幅（94℃で45秒間、59℃で45秒間、72℃で２分間）、最終伸長（72℃ で５分間）および4℃での浸漬。 C ．PCR断片の分析 正しい産物を、臭化エチジウム染色（0.5μg/ml）によるゲル Eugene，OR）で染色するサイズの決定により確認した。該ゲル た後、Molecular Dynamics Stormイメージング系を用いて、それを可視化した。 図４においては、レーン１は、100bpの分子量マーカーのセットを示す。レーン ２は、胎盤DNA陰性対照である。その他のレーンは以下のとおりである：（レー ン3）正 常結腸、（レーン4）結腸癌、（レーン5〜6）乳癌、（レーン7）良性前立腺肥大 、（レーン8）前立腺癌、（レーン9）良性前立腺肥大、（レーン10〜11）正常肺 、および（レーン12）肺癌。結腸試料（レーン3〜4）だけでなく、前立腺癌試料 （レーン8）、正常肺試料（レーン10）および肺癌試料（レーン12）においても 、予想される496bpのRT-PCRアンプリコンが検出された。胎盤DNA対照においては 、該バンドは検出されなかった。 図５において、レーン１は、100bpの分子量マーカーのセットを示す。レーン ２は、胎盤DNA陰性対照を示す。残りのレーンは以下のとおりである：（レーン3 および6）正常結腸、および（レーン４、５および７）結腸癌。全５個の組織試 料（レーン3〜7）においては、予想される496bpのRT-PCRアンプリコンが検出さ れたが、胎盤DNA対照（レーン2）においては検出されなかった。 配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列 を含む産物の検出は、CS198 mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI管組織の疾患ま たは状態の診断を示唆する。実施例９：OH-PCR A ．プローブの選択および標識 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションPCRにより前記標的配列を検出す るために、標的特異的プライマーおよびプローブを設計する。1992年６月25日付 け公開の国際公開WO 92/10505および1992年７月９日付け公開のWO 92/11388は、 それぞれ5'末端および3'末端でオリゴヌクレオチドを標識するための方法を開示 している。オリゴヌクレオチドを標識するための１つの公知方法によれば、標識 −ホスホルアミジット試薬を調製し、それを使用して、該標識を該オリゴヌクレ オチドに、その合成中に付加する。例えば、N.T．Thuongら，Tet.Letters 29(46 ):5905-5908(1988)またはJ.S．Cohenら，公開されている米国特許出願第07/246, 688号（NTIS ORDER No.PAT-APPL-7-246,688）(1989)を参照されたい。好ましく は、プローブを、その3'末端で標識して、PCRへの関与および望ましくない伸長 産物の形成を妨げる。一工程OH-PCRでは、該プローブは、該プライマーのT_Mより 少なくとも15℃低いT_Mを有するべきである。当該技術分野でよく知られている標 準的なホスホルアミジット化学および／または合成後標識法を用いて、該プ ライマーおよびプローブを、検出可能な標識を有する又は有さない特異的結合メ ンバーとして使用する。 B ．一工程オリゴハイブリダイゼーションPCR 50mM（N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]グリシン）(pH8.15)、81.7mM KOAc、33. 33mM KOH、0.01mg/mlウシ血清アルブミン、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、0.02 mg/ml NaN₃、8% w/vグリセロール、150μMの各dNTP、0.25μMの各プライマー、3 .75nMのプローブ、5U rTthポリメラーゼ、3.25mM Mn(OAc)₂および標的の血液等 価体5μl(実施例３を参照されたい)を含有する200μlの反応中で、OH-PCRを行な う。RNAおよび該rTthポリメラーゼ酵素は、Mn(OAc)₂の存在下では不安定である ため、該Mn(OAc)₂は、標的の流加の直前に加えるべきである。該反応を、Perkin -Elmer Thermal Cycler480中でインキュベートする。当業者であれば、cDNA合成 およびサーマルサイクリングのための最適条件を容易に決定することが可能であ る。有用であると考えられる条件には、cDNA合成（60℃、30分間）、30〜45サイ クルの増幅（94℃で40秒間、55〜70℃で60秒間）、オリゴーハイブリダイゼーシ ョン（97℃で５分間、15℃で５分間、15での浸漬）が含まれる。正しい反応産物 は、該PCR産物の鎖の少 なくとも１つと、内部でハイブリダイズしたプローブとを含有する。 C ．OH-PCR産物の分析 Park，ILから入手可能）上で検出する。簡単に説明すると、抗体で標識された微 粒子により、該PCR産物鎖上または該ハイブリダイゼーションプローブ上の捕捉 可能部位で、正しい反応産物を捕捉させ、該プローブ上または該PCR鎖上の検出 可能部位に対する検出可能な抗体共役体の結合により複合体を検出する。該内部 プローブにハイブリダイズしたPCR鎖を含有する複合体だけが、検出可能である 。したがって、この複合体の検出は、CS198mRNAの存在を示し、GI管癌などのGI 管の疾患または状態の診断を示唆する。 増幅された又は増幅されていないCS198由来核酸配列の存在を検出するために 当業者が使用および／または修飾しうる多数の他の検出様式が存在し、それらに は、リガーゼチェイン反応（LCR，Abbott Laboratories，Abbott Park，IL）；Q βレプリカーゼ（Gene-Trak^TM，Naperville，Illinois）、ブランチトチェイン （branched chain）反応（Chiron，Emeryville，CA）お よび鎖置換(strand displacement)アッセイ(Becton Dickinson,Research Triang le Park，NC)が含まれるが、これらに限定されるものではない。 実施例10：合成ペプチドの製造 CS198ポリペプチドコンセンサス配列の推定アミノ酸配列に基づき、合成ペプ チドを設計し、製造した（実施例１を参照されたい）。特に、配列番号43、配列 番号44、配列番号45および配列番号46のペプチドを含む、配列番号42に由来する 多数のCS198ペプチドを製造した。すべてのペプチドは、FMOC化学、標準的なサ イクルおよびin situ HBTU活性化を用いてSymphony Peptide Synthesizer（Rain in Instrument Co，Emeryville CAから入手可能）上で合成した。切断および脱 保護の条件は以下のとおりであった：2.5mlの容量の切断試薬（77.5% v/vトリフ ルオロ酢酸、15% v/vエタンジチオール、2.5% v/v水、5% v/vチオアニソール、1 〜2% w/vフェノール）を該樹脂に加え、室温で2〜4時間攪拌した。ついで該濾液 を除去し、該ペプチドを冷ジエチルエーテルで該切断試薬から沈殿させた。つい で各ペプチドを濾過し、水／アセトニトリル／0.1％TFA勾配を用いる逆相分取HP LCで精製し、凍結乾燥した。該産物を質量分析により 確認した。 ついで該精製ペプチドを使用して、動物を免疫した（実施例14を参照されたい ）。 実施例11a：プラスミド577を使用する、細胞系内でのタンパク質の発現 A ．CS198発現プラスミドの構築 1995年６月７日付け出願の米国出願第08/478,073号に記載のプラスミド577は 、永久細胞系内での分泌抗原の発現用に構築されている。このプラスミドは、以 下のDNAセグメントを含有する：（a）細菌性β-ラクタマーゼとDNA複製起点とを 含有するpBR322の2.3kbの断片、（b）HSV-1チミジンキナーゼプロモーターおよ びポリA付加シグナルの制御下でネオマイシン耐性遺伝子の発現を指令する1.8Kb のカセット、（c）SV-40(シミアンウイルス40）プロモーターおよびポリA付加シ グナルの制御下でのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現を指令する1.9Kbの カセット、（d）SV40 T-Agプロモーターおよび転写エンハンサー、B型肝炎ウイ ルス表面抗原（HbsAg）エンハンサーIおよびそれに続くポリA付加シグナルを与 える単純ヘルペスウイルス１（HSV-1）ゲノムの断片の制御下で、修飾C型肝炎ウ イルス（HCV）E2タンパク質に融合したウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列 の発現を指令する3.5Kbのカセット、（e）このプラスミド内で機能しないSV40ゲ ノム後期領域の、残りの0.7Kb断片。該ベクターの全セグメントを、分子生物学 の当業者に公知の標準的な方法で合体させた。 選択可能なCS198タンパク質の発現のためのプラスミドは、プラスミド577中の C型肝炎ウイルスE2タンパク質コード配列を、配列番号1〜27およびそれらの断片 または相補体よりなる群から選ばれるCS198ポリヌクレオチド配列で以下のとお りに置換することにより構築する。XbaIでのプラスミド577の消化により、C型肝 炎ウイルスE2遺伝子断片が遊離する。得られたプラスミドバックボーンは、発現 されたタンパク質を該細胞の分泌経路に導くウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル 配列の下流へのCS198 cDNA挿入断片の挿入を可能にする。該CS198 cDNA断片は、 標準的な方法を用いるPCRにより得る。該センスPCRプライマー配列内にコードさ れているのは、XbaI部位であり、その直後には、シグナルプロテアーゼのプロセ シング、効率的な分泌および培養流体内の最終産物の安定性を向上させるアミノ 酸配列Ser-Asn-Glu-Leu（「SNEL」）をコードする12ヌクレオ チドの配列が続く。該プライマーは、この12ヌクレオチドの配列の直後に、CS19 8遺伝子のアミノ酸をコードする鋳型配列に相補的なヌクレオチドを含有する。 該アンチセンスプライマーは、以下の８アミノ酸をコードする配列を、停止コド ンの直前に取込む：Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（配列番号48）。この配 列内に、CS198タンパク質産物の分析および精製を容易にするための認識部位が 取込まれる。抗FLAGM2(Eastman Kodak，Co.，New Haven，CT)と称される商業的 に入手可能なモノクローナル抗体に認識される認識部位（「FLAG」と称される） ならびに他の適合配列およびその対応抗体を使用することが可能で 業者の指示に従い使用して、PCRを行なう。PCRプライマーは、0.5μMの最終濃度 で使用する。PCRは、CS198プラスミド鋳型上、100μlの反応液中、35サイクル（ 94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で90秒間）、ついで72℃で10分間の伸長サイ クルで行なう。 B ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞へのトラ ンスフェクション 前記プラスミドをCHO/dhfr細胞（DXB-111,Uriacioら,PNAS 77:4451-4466(1980)）中にトランスフェクトする。これらの細胞は、A.T.C.C.， 12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852から受託第CRL 9096号として入手 可能である。トランスフェクションは、P.L．Felgnerら，PNAS 84:7413-7414(19 87)に記載のカチオニックリポソーム媒介法を用いて行なう。特に、CHO/dhfr細 胞を、10％ウシ胎仔血清、L-グルタミン（1mM）で補足されたHam F-12培地内で 培養し、フラスコ内に5〜8×10⁵細胞/フラスコの密度で新たに播く。トランスフ ェクションのために、60〜80％のコンフルエンシーになるまで該細胞を増殖させ る。20マイクログラム（20μg）のプラスミドDNAを1.5mlのOpti-MEM I培地に加 え、100μlのLipofectin Reagent（Gibco-BRL;Grand Island，NY）を、Opti-MEM I培地のもう１つの1.5ml部分に加える。それらの２つの溶液を混合し、室温で2 0分間インキュベートする。該培地を該細胞から除いた後、該細胞を5mlのOpti-M EM I培地で３回リンスする。ついで該Opti-MEM I-Lipofectin-プラスミドDNA溶 液を該細胞上に重層する。該細胞を37℃で３時間インキュベートし、ついで該Op ti-MEM I-Lipofectin-プラスミドDNA溶液を、選択前に更に24時間、培地と交換 する。C ．選択および増幅 トランスフェクションの１日後に、細胞を1：3継代し、dhfr/G418選択培地（ 以下、「F-12マイナス培地G」と称する）と共にインキュベートする。選択培地 は、L-グルタミンを含有しヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含有しな いHamF-12（JRH Biosciences，Lenexa，Kansas）ならびに300μg/mlのG418（Gib co-BRL;Grand Island，NY）である。培地の容量対表面積比を、5ml/25cm²に維持 する。約２週間後、F-12マイナス培地G内での継代および連続的維持が可能とな るようにDHFR/G418細胞を増殖させる。 トランスフェクトしたCS198 cDNA配列のそれぞれの増幅は、メトトレキセート によるDHFR⁺、G418⁺細胞の逐次的選択により行なう［R．Schimke，Cell 37:705- 713(1984)の総説］。耐性コロニーが出現するまで、150nMメトトレキセート(MTX )(Sigma，St．Louis，MO)を含有するF-12マイナス培地Gと共に細胞を約２週間イ ンキュベートする。さらに、遺伝子増幅は、5μM MTX適合細胞150nMによるの選 択により行なう。 D ．抗原の産生 5μM MTXが補足されたF-12マイナス培地Gを、ちょうどコ ンフルエントの単層上に5％CO₂中37℃で12〜24時間重層する。該増殖培地を除き 、該細胞をDulbeccoリン酸緩衝食塩水（PBS）（カルシウムおよびマグネシウム ）(Gibco-BRL，Gland Island，NY）で３回リンスして、存在しうる残りの培地／ 血清を除く。ついで細胞を、VAS特注（custom）培地（HEPESと共にL-グルタミン を含有しフェノールレッドを含有しないVAS特注製剤、JRH Bioscience;Lenexa K Sから入手可能、製品番号52-08678P）と共に、5％CO₂中37℃で１時間インキュベ ートする。ついで細胞を、5ml/Tフラスコで製造するためにVASで覆う。７日間の インキュベーションの後、培地を除去し、維持し、ついで収穫2、3および４と共 に精製するまで凍結する。３回の７日間の収穫のために、該単層をVASで覆う。 E ．GI管組織遺伝子CS198抗原の発現の分析 CS198タンパク質構築物を発現する細胞からのVAS上清のアリコートを、標準的 な方法および当該技術分野で公知の試薬（Laemmli不連続discontiuous gels）を 用いるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、または質量分 析により分析する。F ．精製 ヒドラジン結合でアガロースに共有結合している抗FLAG M2モノクローナル抗 体を含むアフィニティーマトリックス（Eastman Kodak Co.，New Haven，CT）を 使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、FLAG配列を含有する CS198タンパク質の精製を行なう。アフィニティー精製の前に、ローラーボトル からのプール化VAS培地収穫物中のタンパク質を、Sephadex G-25（Pharmacia Bi otech Inc.，Uppsala，Sweden）カラムを使用して50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl緩衝液中に交換する。この緩衝液中のタンパク質を、抗FLAG M2抗体アフィ ニティーカラムに適用する。該カラムを50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl緩衝 液で洗浄することにより、未結合タンパク質を溶出する。50mM Tris-HCl(pH7.5) 、150mM NaCl中の過剰のFLAGペプチドを使用して、結合タンパク質を溶出する。 その過剰のFLAGペプチドは、ゲル電気泳動またはHPLCにより該精製CS198タンパ ク質から除去することができる。 この実施例ではプラスミド577を使用しているが、それに匹敵する他の発現系 （例えば、CMV）を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で使 用することが可能であること が当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に含まれる。 ついで、CS198遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化挿入断片を、 （ｉ）例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよび／またはタンパ ク質融合可能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる真 核発現ベクター、または（ii）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびCMP -KDOシンターゼ（CKS）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列の 発現のためのもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする。 SODの融合配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、1 986年10月１日付け公開のEPO 0196056に記載されており、CKSの融合配列を含有 するものは、1989年９月13日付け公開のEPO公開第0331961号に記載されている。 このようにして精製したタンパク質は、動物の免疫研究、固相イムノアッセイな どを含む種々の技術において使用することができる。 実施例11b：pcDNA3.1/Myc-Hisを使用する、細胞系でのタンパク質の発現 A ．CS198発現プラスミドの構築 プラスミドpcDNA3.1/Myc-His（Cat.#V855-20，Invitrogen， Carlsbad.CA）は、これまでに、ほとんどの哺乳動物細胞系による分泌抗原の発 現用に構築されている。発現されるタンパク質挿入断片は、myc-hisペプチドタ グと融合している。該myc-hisタグは、配列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-A sp-Leu-Asn-Met-His-Thr-Glu-His-His-His-His-His-His（配列番号49）を有する 21残基のアミノ酸配列であり、抗mycもしくは抗hisアフィニティーカラムまたは 金属タンパク質結合カラムのいずれかを使用する発現融合タンパク質の精製に有 用なmycエピトープおよびポリヒスチジン配列を含む。 分泌可能なCS198タンパク質の発現用のプラスミドは、配列番号1〜27およびそ れらの断片または相補体よりなる群から選ばれるCS198ポリヌクレオチド配列を 挿入することにより構築する。CS198発現プラスミドを構築する前に、まず該CS1 98 cDNA する。 該CS198 cDNA断片は、標準的な方法を用いるPCRにより作製する。例えば、Str atagene，La Jolla，CAから得られる う。PCRプライマーは、0.5μMの最終濃度で使用する。5Uのpfu ポリメラーゼ（Stratagene）を使用するPCRを、CS198プラスミド鋳型（実施例２ を参照されたい）上、50μlの反応液中、30サイクル（94℃で１分間、65℃で1.5 分間、72℃で３分間）およびそれに続く72℃で８分間の伸長サイクルで行なう。 該センスPCRプライマー配列は、該CS198遺伝子挿入断片の直ぐ上流のpINCYベク ターに相補的であるか又は5'EcoRI制限部位、隣接下流タンパク質翻訳コンセン サスイニシエーターおよび3'核酸配列（これは、CS198 cDNA挿入断片の5'最末端 と同じセンスである）を取込むヌクレオチドを含む。該アンチセンスプライマー は、5'NotI制限配列と、最も3'側のインフレーム停止コドンの直ぐ上流のCS198 cDNA挿入断片の3'末端に相補的な配列とを取込む。得られた平滑末端化PCR産物 の５マイクロリッ Carlsbad，CA)中に連結して、該ベクターの致死ccdB遺伝子を遮断する。One Sho t^TM形質転換キット（Invitrogen，Carlsbad，CA）を供給業者の指示に従い使用 して、得られた連結ベクターをTOP10大腸菌（E．coli）（Invitrogen，Carlsbad ，CA）中にトランスフェクトする。該トランスフェクト化細胞を、LB-Kan（50μ g/mlカナマイシン）選択プレート上、37℃で増殖させる。 遮断されたccdB遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞だけが、トランスフェ クション後に増殖することになる（Grant，S.G.N.，PNAS USA 87:4645-4649(199 0)）。トランスフェクトされたコロニーを拾い、3mlのLB-Kanブロス中、37℃で 増殖さ 造業者の指示に従い使用して、プラスミドDNAを単離する。該DNAをEcoRIおよびN otI制限酵素で消化して、CS198挿入断片 臭化エチジウム/TEゲル上で電気泳動し、UV照明により可視化し、QIAquick^TM（Q iagen Inc，Santa Clarita，CA）法を供給業者の指示に従い使用して切り出し精 製する。 pcDNA3.1/Myc-HisプラスミドDNAを、該プラスミドDNAのポリリンカー領域中に 存在するEcoRIまたはSnaBIおよびNotIでの消化により線状化する。得られたプラ スミドDNAバックボーンは、哺乳類細胞中での該タンパク質の発現を指令するCMV プロモーターの下流への前記CS198精製cDNA断片の挿入を可能にする。連結プラ スミドを、DH5アルファ^TM細胞（GibcoBRLGaithersburg，MD）中に、供給業者の 指示に従いトランスフェクトする。簡単に説明すると、CS198挿入断片を含有す る10ng のpcDNA3.1/Myc-Hisを、50μlのコンピテントDH5アルファ細胞に加え、該含有物 を穏やかに混合する。該混合物を氷上で30分間インキュベートし、37℃で20秒間 、それに熱ショックを与え、それを氷上に更に２分間放置する。0.95mlのLB培地 を加えたら、225rpmで振とうしながら該混合物を37℃で１時間インキュベートす る。ついで該トランスフェクト化細胞を100mmLB/Amp（50μg/mlアンピシリン） プレート上にプレーティングし、37℃で増殖させる。コロニーを拾い、3mlのLB/ アンピシリ ミドDNAを精製する。該挿入断片の存在は、制限酵素消化、ゲル分析などの（こ れらに限定されるものではない）当業者に公知の技術を用いて確認する（例えば 、J．Sambrookら，前掲を参照されたい）。 B ．ヒト胎児腎293細胞のトランスフェクション 前記のCS198発現プラスミドを、QIAfilter^TMMaxiキット（Qiagen，Chatsworth ，CA）を使用してDH5α細胞から精製し、ついでHEK293細胞(F.L．Grahamら，J ． Gen．Vir ．36:59-72(1977))中にトランスフェクトする。これらの細胞は、A.T.C .C.,12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852から、受託番号 CRL 1573として入手可能である。P．Hawley-Nelsonら，Focus 15:73(1993)に記 載のカチオニックリポフェクタミン媒介法を用いて、トランスフェクションを行 なう。特に、HEK293細胞を、10％ウシ胎仔血清（FBS）、L-グルタミン（2mM）が 補足された10ml DMEM培地内で培養し、100mm培養プレート内に9×10⁶細胞/プレ ートの密度で新たに播く。トランスフェクションのために、70〜80％のコンフル エンシーになるまで該細胞を37℃で増殖させる。８マイクログラム（8μg）のプ ラスミドDNAを1.5mlの 〜96μlのLipofectamine^TMReagent(Gibco-BRL;Grand Island, それらの２つの溶液を混合し、室温で15〜30分間インキュベートする。該培地を 該細胞から除いた後、該細胞を10mlの無血清 Lipofectamine-プラスミドDNA溶液を、6.4mlの無血清DMEM中に希釈し、該細胞上 に重層する。該細胞を3℃で５時間インキュベートし、ついで20％FBSを含有する 追加的な8mlのDMEMを加える。18〜24時間後、その古い培地を吸引し、該細胞に 、10％FBSを含有する5mlの新鮮なDMEMを重層する。トランスフェク ションの72時間後に、上清および細胞抽出物を、CS198遺伝子活性に関して分析 する。 C ．GI管組織遺伝子CS198抗原の発現の分析 前記培養上清を、低温チューブ（cryotube）に移し、氷上で保存する。HEK293 細胞を、10mlの冷Dulbecco PBSで２回洗浄し1.5mlのCAT溶解緩衝液(Boehringer Mannhein，Indianapolis，IN)を加えて溶解することにより収穫し、ついで室温 で30分間インキュベートする。ライセートを1.7mlポリプロピレンミクロ遠心管 に移し、1000×gで10分間遠心する。該上清を新たな低温チューブに移し、氷上 で保存する。細胞上清のアリコートと、該CS198タンパク質構築物を発現する細 胞のライセートとを、CS198組換えタンパク質の存在に関して分析する。当該技 術分野で公知の標準的な方法および試薬を用いるSDSポリアクリルアミドゲル電 気泳動（SDS-PAGE）により、該アリコートを分析することができる（J．Sambroo kら，前掲を参照されたい）。ついで該ゲルをニトロセルロース、ナイロンなど の固形培地上にブロッティングし、該CS198タンパク質のバンドを、抗mycエピト ープもしくは抗ヒスチジンモノクローナル抗体（Invitrogen Carlsbad，CA）ま たはCS198ポリクローナル血清 を使用するウエスタンブロット法により可視化することができる（実施例14を参 照されたい）。別法として、該発現CS198組換えタンパク質を、質量分析により 分析することができる（実施例12を参照されたい）。 D ．精製 ポリヒスチジン残基に特異的に結合するニッケル充填アガロ ー系（Invitrogen Carlsbad，CA）を使用して、myc-his配列を含有するCS198組 換えタンパク質の精製を行なう。前記のとおりに調製した、10×100mmプレート からの上清を、プールし、該ニッケル充填カラムに通した。該カラムを50mM Tri s-HCl(pH7.5)/150mM NaCl緩衝液で洗浄することにより、非結合タンパク質を溶 出すると、myc-his融合タンパク質だけが残る。ついで、過剰のイミダゾールも しくはヒスチジンまたは低pH緩衝液を使用して、結合CS198組換えタンパク質を 該カラムから溶出する。別法として、ヒドラジンまたは他の結合によりアガロー ス樹脂に結合した抗mycまたは抗ヒスチジンモノクローナル抗体よりなるアフィ ニティーカラムにmyc-his配列にて結合させ、それぞれ過剰のmycペプチドまたは ヒスチジンで溶出する ことにより、該組換えタンパク質を精製することも可能である。 ついで該精製組換えタンパク質を、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化セファ ロースカラム（Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）などの固相に供給業者の 指示に従い共有的に架橋することができる。ついで、共有結合したCS198組換え タンパク質を含有するこれらのカラムを使用して、ウサギまたはマウス血清から 抗CS198抗体を精製することができる（実施例13および14を参照されたい）。 E ．CS198発現タンパク質によるマイクロタイタープレートのコーティング 前記100mmプレートからの上清を、適当な容量のPBS中に希釈する。得られた混 合物の100μlを、Reaci-Bind^TM金属キレートマイクロタイタープレート（Pierce ，Rockford，IL）の各ウェル中に配置し、振とうしながら室温でインキュベート し、つ 回洗浄する。ついで、その調製されたマイクロタイタープレートを使用して、CS 198抗体の存在に関してポリクローナル抗血清をスクリーニングすることができ る（実施例17を参照されたい）。 この実施例ではpcDNA3.1/Myc-Hisを使用しているが、それに匹敵する他の発現 系（例えば、CMV）を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で 使用することが可能であることが当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に 含まれる。該CS198遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化挿入断片を 、（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよび／またはタン パク質融合可能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる 真核発現ベクター、または（ii）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびC MP-KDOシンターゼ（CKS）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列 の発現のためのもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする 。SODの融合配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは 、1986年10月１日付け公開の欧州特許出願EP 0 196 056に記載されており、CKS の融合配列を含有するベクターは、1989年９月13日付け公開の欧州特許出願EPO 331 961号に記載されている。該精製タンパク質は、動物の免疫研究、固相イム ノアッセイなどを含む種々の技術において使用することができる。実施例12：GI管組織タンパク質の化学的分析 A ．MSによるトリプシンペプチド断片の分析 GI管癌などのGI管疾患を有する患者からの血清、GI管疾患を有さない患者から の血清、GI管癌などのGI管疾患を有する患者からのGI管組織または細胞の抽出物 、GI管疾患を有さない患者からのGI管組織または細胞の抽出物、および患者の他 の非疾患または疾患器官からの組織または細胞の抽出物を、標準的な方法を用い てポリアクリルアミドゲル上で移動させ、クーマシーブルーで染色する。該未知 ポリペプチドを含有する疑いのあるゲルの切片を切り出し、ゲル内還元、アセト アミド化およびトリプシン消化に付す(P．Jenoら，Anal ．Bio．224:451-455(199 5)およびJ．Rosenfeldら，Anal ．Bio．203:173(1992))。該ゲル切片を100mM NH₄ HCO₃およびアセトニトリルで洗浄する。収縮したゲル片を、消化緩衝液（50mM N H₄HCO₃、5mM CaCl₂および12.5μg/mlトリプシン）中、4℃で45分間膨潤させる。 該上清を吸引し、トリプシンを含有しない5〜10μlの消化緩衝液と置換し、37℃ で一晩インキュベートする。ペプチドを、5％ギ酸およびアセトニトリルの３回 の交換により抽出し、蒸発乾固させる。該ペプチドを、延伸したガスクロマトグ ラフィー毛管の 先端に捕捉された約0.1μlのPOROS R2吸着剤（Perseptive Biosystems，Framing ham，Massachusetts）に、それらを10μlの5％ギ酸に溶解しそれを該毛管に通す ことにより吸着させる。吸着したペプチドを水洗し、60％エタノール中の5％ギ 酸で溶出する。ナノエレクトロスプレー質量分析による分析のために、該溶出液 をAPI III質量分析計(Perkin-Elmer Sciex，Thornhill，Ontario，Canada)の噴 霧毛管中に直接通過させる（M．Wilmら，Int ．J．Mass Spectrom．Ion Process 136:167-180(1994)およびM．Wilmら，Anal ．Chem．66:1-8(1994)）。該トリプシ ンペプチドの質量を、第１四極子から得た質量スペクトルから測定する。さらに 、予想されるペプチドに対応する質量をMS/MSモードで分析して、該ペプチドの アミノ酸配列を得ることができる。 B ．LC/MSによるペプチド断片の分析 増殖性疾患組織中で見出されたmRNA配列から推定されるポリペプチドの存在を 、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法(LC/MS/MS)で確認することがで きる(D．Hessら，METHODS.A Companion to Methods in Enzymology 6:227-238(1 994))。該患者からの血清試料または腫瘍抽出物をSDSで変性させ、ジチオトレイ トール（1.5mg/ml）で90℃で30分間還元し、つい でヨードアセトアミド（4mg/ml）で25℃で15分間アルキル化する。アクリルアミ ド電気泳動の後、該ポリペプチドをカチオンメンブレン上にエレクトロブロット し、クーマシーブルーで染色する。染色後、該メンブレンを洗浄し、該未知ポリ ペプチドを含有すると考えられる切片を切断し、小片に切断する。該メンブレン を500μlミクロ遠心管中に配置し、10〜20μlのタンパク質分解消化緩衝液（0.1 M NaCl、10%、2mM CaCl₂および5μg/mlトリプシンを含有する100mM Tris-HCl、p H8.2）(Sigma，St．L0UiS，MO)に漬ける。37℃で15時間後、3μlの飽和尿素およ び1μlの100μg/mlトリプシンを加え、さらに37℃で5時間インキュベートする。 該消化混合物を3μlの10％トリフルオロ酢酸で酸性化し、遠心して、上清をメン ブレンから分離する。該上清をミクロホア逆相HPLCカラム上に直接注入し、0.05 ％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出する。該溶出液を、物 質の容量を調節するために必要に応じて流動スプリッターに通した後、エレクト ロスプレー質量分析計に送り込む。実施例12第A節に記載の方法に従い、データ を分析する。実施例13：遺伝子免疫プロトコール A ．インビボでの抗原の発現 遺伝子免疫（gene immunization）は、適当な発現ベクターの接種後に抗原を インビボで直接発現させることにより、タンパク質の精製工程を不要にする。ま た、この方法による抗原の産生は、正しいタンパク質フォールディングおよびグ リコシル化を可能にしうる。なぜなら、該タンパク質は、哺乳動物組織内で産生 されるからである。該方法では、CMVプロモーターを含有するプラスミド内への 該遺伝子配列の挿入、該プラスミドの増殖および精製、ならびに動物の筋肉組織 内への該プラスミドDNAの注入を行なう。好ましい動物には、マウスおよびウサ ギが含まれる。例えば、H．Davisら，Human Molecular Genetics 2:1847-1851(1 993)を参照されたい。１回または２回のブースター免疫の後、該動物から採血し 、腹水液を集めたり、あるいはハイブリドーマの産生のために該動物の脾臓を採 集することができる。 B ．プラスミドの調製および精製 実施例11に記載の方法に従い、適当な5'制限部位を含有する適当なPCRプライ マーを使用してCS198 cDNA含有ベクターか らCS198 cDNA配列を作製する。該PCR産物を、適当な制限酵素で切断し、CMVプロ モーター（例えば、pRc/CMVまたはpcDNA3ベクター（Invitrogen，San Diego，CA から入手））を含有するベクター中に挿入する。ついでこのプラスミドを適当な 細菌株中で増殖させ、CsCl勾配またはQiagenプラスミドDNA精製カラムを用いて 該細胞ライセートから精製する。これらのすべての技術は、分子生物学の当業者 に良く知られているものである。 C ．免疫プロトコール 麻酔した動物を、PBSまたは他のDNA取込み増強剤（Cardiotoxin、25％ショ糖 ）中に希釈された0.1〜100μgの該精製プラスミドで筋肉内にて免疫する。例え ば、H．Davisら，Human Gene Therapy 4:733-740(1993)およびP．W．Wolffら，B iotechniques 11:474-485(1991)を参照されたい。１回または２回のブースター 注射を、１ヵ月間隔で行なう。D ．抗血清の試験および使用 動物から採血し、得られた血消を、当該技術分野で公知の技術（例えば、ウエ スタンブロット法またはEIA技術）により公知遺伝子配列（実施例16を参照され たい）から合成されたペプ チドを使用して抗体に関して試験する。ついで、この方法により産生した抗血清 を使用して、患者の組織もしくは細胞抽出物中または患者の血清中の抗原の存在 をELISAまたはウエスタンブロット法（例えば、実施例15〜18に記載のもの）で 検出することができる。 実施例14：CS198に対する抗体の製造 A ．ポリクローナル抗血清の産生 CS198に対する抗血清は、CS198コンセンサスヌクレオチド配列の推定アミノ酸 配列（配列番号42）に由来する配列を有するペプチドをウサギに注射することに より製造した。これらのペプチド（配列番号43、配列番号44、配列番号45および 配列番号46）の合成は、実施例10に記載されている。免疫原として使用したペプ チドは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などの担体には共役させな かった（すなわち、それらは非共役体であった）。 動物の免疫化 ポリクローナル抗血清を産生させるために、雌の白色New Zealandウサギ（体 重2kg以上）を使用した。非共役ペプチド（配列番号43、配列番号44、配列番号4 5および配列番号46） １個当たり１匹の動物を免疫した。初回免疫の１週間前に、非免疫採血前サンプ ルとして使用する血液サンプル（5〜10ml）を該動物から得た。 非共役ペプチド（配列番号43、配列番号44、配列番号45および配列番号46）を 使用し、0.5mlの該ペプチドを、0.5mlの完全フロイントアジュバント（CFA）（D ifco，Detroit，MI）を含有するPBS（pH7.2）中、2mg/mlの濃度で乳化すること により、該一次免疫原を調製した。該免疫原を、動物のいくつかの部位に皮下、 腹腔内および筋肉内投与経路で注射した。初回免疫の４週間後、ブースター免疫 を投与した。該ブースター免疫投与に使用した免疫原は、一次免疫原に使用した のと同じ非共役ペプチド0.5mlを乳化することにより調製した（ただし、この場 合には、0.5mlの不完全フロイントアジュバント（IFA）（Difco，Detroit，MI） で該ペプチドを1mg/mlに希釈した）。この場合もまた、該ブースター用量を、い くつかの部位に皮下、腹腔内および筋肉内のタイプの注射により投与した。該ブ ースター免疫の２週間後に該動物から採血し（5ml）、後記のとおり、該ペプチ ドに対する免疫反応性に関して各血清を試験した。適当な力価が得られるまで、 該ブースターおよび採血のスケジュール を４週間隔で繰返した。後記実施例17に記載のとおり、マイクロタイターEIAに おいて非共役ペプチドを使用することにより、抗血清の力価または濃度を測定し た。1：500以上の抗体力価を、更なる使用および研究のための適当な力価とみな した。表１．ウサギ抗CS198ペプチド抗血清の力価（13週目に採血） ペプチド免疫原 力 価 配列番号43 ＞62,500 配列番号44 58,000 配列番号45 7,200 配列番号46 10,500 B ．モノクローナル抗体の産生 1．免疫プロトコール KLH(後記のとおりに調製)などの担体と共役している又は非共役体である（す なわち、KLHなどの担体と共役していない）ことが可能なペプチドを使用して、 マウスを免疫する。ただし、マウスにおけるモノクローナル抗体の産生のための 非共役または共役ペプチドの量は、ウサギにおいてポリクローナル抗血清を産生 させるのに使用した量の10分の１である。したがって、該一次免疫原は、0.1ml のCFAエマルション中の100μgの非共 役または共役ペプチドよりなり、一方、ブースター免疫に使用する免疫原は、0. 1mlのIFA中の50μgの非共役または共役ペプチドよりなる。標準的な技術を用い て、モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを調製し、スクリーニングする 。モノクローナル抗体産生に用いた方法は、KohlerおよびMilstein，Nature 256 :494(1975)に詳細に記載されており総説としてJ.G.R．Hurrel編，Monoclonal Hy bridoma Antibodies:Techniques and Applications ，CRCPress，Inc，BocaRaton ，FL(1982)に記載されている当該技術分野で公知の手順に従った。Kohlerおよび Milsteinの方法に基づくモノクローナル抗体産生のためのもう１つの方法は、L. T．Mimmsら，Virology 176:604-619(1990)の方法である。 免疫方式（マウス１匹当たり）は、追加的ブースター免疫を伴う一次免疫より なる。一次免疫に使用する一次免疫原は、50μlのCFA中に予め乳化されている50 μlのPBS（pH7.2）中の100μgの非共役または共役ペプチドよりなる。一次免疫 の約２週間および４週間後に行なうブースター免疫は、50μlのIFAで乳化されて いる50μlのPBS（pH7.2）中の50μgの非共役または共役ペプチドよりなる。合計 100μlのこの免疫原を各マウ スの腹腔内および皮下に接種する。三次免疫の４週間後に、実施例17に記載のマ イクロタイタープレート酵素イムノアッセイ（EIA）により、免疫応答に関して 個々のマウスをスクリーニングする。三次免疫の約15週間後に、PBS（pH7.2）中 の50μgの非共役または共役ペプチドをマウスの静脈内、脾臓内または腹腔内に 接種する。 この静脈内ブースト（追加抗原刺激）の３日後に、脾細胞を、ポリエチレング リコール（PEG）法により例えばSp2/0-Ag14骨髄腫細胞（Milstein Laboratories ，England）と融合させる。該融合体を、10％ウシ胎仔血消（FCS）と1％ヒポキ サンチン、アミノプテリンおよびチミジン（HAT）とを含有するIscove'sModifie d Dulbecco's Medium（IMDM）中で培養する。実施例17のプロトコールに従いマ イクロタイタープレートEIAにより、バルク培養をスクリーニングする。免疫原 として使用したペプチドには反応性であり他のペプチド（すなわち、免疫原とし て使用していないCS198のペプチド）には無反応性であるクローンを、最終増殖 のために選択する。このようにして選択したクローンを増殖させ、等分割し、10 ％FCSおよび10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するIMDM中で凍結させる 。 2．ペプチドの共役化 マレイミド活性化KLH（Pierce Chemical Company，Rockford， 応性マレイミド基を含有する。該活性化KLHを、約7.7mg/mlの濃度でリン酸緩衝 食塩水（PBS、pH8.4）に溶解する。該ペプチドは、ペプチド配列中に存在するシ ステインを介して共役させるか、または付加点を付与するために該合成ペプチド に予め付加されたシステインに共役させる。該ペプチドをDMSO（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）に溶解し、該KLHに結合している反応性マレイミド１ モル当たりペプチド約1.5モルのモル比で該活性化KLHと反応させる。ペプチドの 共役化のための方法は、後記で説明する。そのような方法における量、時間およ び条件を種々変化させてペプチド共役を最適化することが可能であることは、当 業者に公知である。 後記の共役反応は、約0.77μモルの反応性マレイミド基を含有する3mgのKLHペ プチド共役体（「共役ペプチド」）の入手に基づく。ペプチド共役のこの量は、 通常、ウサギにおいてポリクローナル抗血清を産生させるための１回の初回注射 および 4回の追加抗原刺激注射に適している。簡単に説明すると、ペプチドをDMSOに、D MSO 100μl当たり1.16μモルの濃度で溶解する。100μlの該DMSO溶液を、前記の とおりに調製した活性化KLH溶液380μlに加え、20μlのPBS(pH8.4)を加えて容量 を500μlにする。該反応を、攪拌しながら室温で一晩インキュベートする。該反 応混合物中の未反応チオールの量を測定することにより、反応の度合を判定する 。チオールの出発濃度と最終濃度との差が、該活性化KLHに組合わされたペプチ ドの濃度と考えられる。残存チオールの量を、Ellman試薬（5,5'-ジチオビス（2 -ニトロ安息香酸）、Pierce Chemical Company，Rockford，IL）を使用して測定 する。35mgのシステインHCl（Pierce Chemical Company，Rockford，IL）を10ml のPBS（pH7.2）に溶解し、該ストック溶液を所望の濃度まで希釈することにより 、システイン標準物を0、0.1、0.5、2、5および20mM Technologies，Chantilly，VA）の各ウェル内に200μlのPBS（pH8.4）を配置す ることにより、チオール濃度の光度的測定を行なう。つぎに、10μlの標準物ま たは反応混合物を各ウェルに加える。最後に、PBS（pH8.4）中1mg/mlの濃度のEl lman試 薬20μlを各ウェルに加える。該ウェルを室温で10分間インキュベートし、全ウ ェルの吸光度をマイクロプレートリーダー(例えば、BioRad Model 3550，BioRad ，Richmond，CA)で415nmにて読取る。該標準物の吸光度を用いて標準曲線を作成 し、該反応混合物のチオール濃度を該標準曲線から求める。遊離チオールの濃度 の減少は、成功した共役反応を示す。未反応ペプチドは、PBS（pH7.2）に対して 室温で６時間透析することにより除去される。該共役体は、直ちに使用する場合 には2〜8℃で保存し、そうでない場合には−20℃以下で保存する。 3．モノクローナル抗体を含有する腹水液の製造 前記のとおりに調製した凍結ハイブリドーマ細胞を融解し、増殖培養内に配置 する。生存可能なハイブリドーマ細胞を、Pristane処理マウスの腹腔内に接種す る。腹水液を該マウスから取り出し、プールし、0.2μフィルターで濾過し、該 精製に必要なカラムに付す。 4．腹水液からのモノクローナル抗体の精製 簡単に説明すると、プロテインAの容量を測定するために免疫グロブリンクラ スG（IgG）を分析するよう、濾過し、融解した腹水液を等容量のプロテインAセ ファロース結合緩衝液 （1.5Mグリシン、3.0M NaCl、pH8.9）と混合し、0.2μフィルターで再濾過する 。プロテインAカラムの容量を、腹水液中に存在するIgGの量から求める。ついで 該溶出液を、2〜8℃で一晩、PBS(pH7.2)に対して透析する。透析されたモノクロ ーナル抗体を滅菌濾過し、アリコートに分注する。該精製モノクローナル抗体の 免疫反応性は、免疫原として使用するペプチドにそれが特異的に結合する能力を 実施例17のEIAマイクロタイタープレーとアッセイ法で測定することにより確認 する。該精製モノクローナル抗体の特異性は、それが無関係なペプチド（例えば 、免疫原として使用していないCS198のペプチド）に結合しないことを判定する ことにより確認する。このようにして調製し特徴づけた精製抗CS198モノクロー ナルは、短期保存には2〜8℃、長期保存には−80℃で放置する。 5．モノクローナル抗体の更なる特徴づけ 前記のとおりに製造したモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブタイプ は、商業的に入手可能なキット（Amersham．Inc.，Arlington Heights，ILから 入手可能）を用いて決定することができる。また、安定性試験は、該モノクロー ナル抗体のアリコートを2〜8℃で連続保存し、ある期間の経過全体にわ たって光学密度（OD）をアッセイすることにより、該モノクローナル抗体上で行 なうことができる。 C ．免疫原としての組換えタンパク質の使用 本明細書に記載のとおりに製造した組換えタンパク質を、当業者に公知の試薬 および技術に付随的変更を加えて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の 製造における免疫原として使用することは、本発明の範囲内に含まれる。 実施例15：CS198ペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製 前記実施例13および／または14に記載のとおりに得た免疫血清を、実施例10に 記載のとおりに調製した固定化合成ペプチドまたは実施例11に記載のとおりに調 製した組換えタンパク質を使用してアフィニティー精製する。希釈された該粗製 抗血清をプロテインAカラム（Affi-Gel protein A，Bio-Rad，Hercules，CA）に 通過させることにより、該抗血清のIgG画分を得る。緩衝液（該製造業者により 供給された結合緩衝液）での溶出により、免疫グロブリン以外の実質的にすべて のタンパク質が除去される。0.1M緩衝化グリシン（pH3）での溶出により、アル ブミンおよび他の血清タンパク質を実質的に含まない 免疫グロブリン調製物が得られる。 特異的抗原結合性抗体のより高い画分を有する調製物を得るために、免疫アフ ィニティークロマトグラフィーを行なう。該抗血清を産生させるために使用した ペプチドを、クロマトグラフィー樹脂上に固定化し、そのエピトープに対する特 異的抗体を該樹脂に吸着させる。非結合成分を洗い落とした後、該特異的抗体を 0.1Mグリシン緩衝液（pH2.3）で溶出する。抗体画分を1.0M Tris緩衝液（pH8.0 ）で直ちに中和して、免疫反応性を維持する。選択するクロマトグラフィー樹脂 は、該ペプチド中に存在する反応性基に左右される。該ペプチドがアミノ基を有 する場合には、Affi-Gel 10またはAffi-Gel 15（Bio-Rad，Hercules，CA）など の樹脂を使用する。該ペプチド上のカルボキシ基を介して結合させたい場合には 、Affe-Gel 102(Bio-Rad，Hercules，CA)を使用することかできる。該ペプチド が遊離スルフヒドリル基を有する場合には、Affi-Gel 501（Bio-Rad，Hercules ，CA）などの有機水銀樹脂を使用することができる。 別法として、脾臓を採取し、当該技術分野で公知の通常の前記方法に従いモノ クローナル抗体を製造するためのハイブリドーマの製造に使用することができる 。実施例16：組織サンプルのウエスタンブロット法 0.1M Tris-HCl(pH7.5)、15％(w/v)グリセロール、0.2mM EDTA、1.0mM 1,4-ジ チオトレイトール、10μg/mlロイペプチンおよび1.0mMフェニルメチルスルホニ ルフルオリド（S.R．Kainら，Biotechniques，17:982(1994)）中で組織サンプル をホモジナイズすることにより、タンパク質抽出物を調製した。ホモジナイズし た後、該ホモジネートを4℃で５分間遠心して、上清を残渣から分離した。タン パク質の定量では、3〜10μlの上清を1.5mlのビシンコニン酸(bicinchoninic ac id)試薬(Sigma，St．Louis，MO)に加え、562nmで得られた吸光度を測定した。 SDS-PAGEでは、サンプルを、Tricine Buffer(Novex，San Diego，CA)で所望の タンパク質濃度に調節し、等容量の2×Tricineサンプル緩衝液（Novex，San Die go，CA）と混合し、サーマルサイクラー中100℃で５分間加熱した。ついでサン プルを、Novex10〜20％Precast Tricineゲルに適用して、電気泳動した。電気泳 動後、サンプルを該ゲルからNovex Tris-グリシントランスファー緩衝液中のニ トロセルロースメンブレンにトランスファーした。ついでメンブレンを、Wester n Lights PlusまたはWestern Lights（Tropix，Bedford，MA）化学発光検出試薬 で提 供される試薬および方法を用いて特異的抗ペプチド抗体でプローブした。展開し たメンブレンをHyperfilm ECL（Amersham，Arlington Heights，IL）にさらすこ とにより、化学発光バンドを可視化した。 図６は、配列番号44のCS198合成ペプチドに対する抗血清(実施例14を参照され たい)を使用して組織抽出物のパネル上で行なったウエスタンブロットの結果を 示す。図６の各レーンは、以下の異なる組織タンパク質抽出物を表す：（1）内 皮癌、（2）乳癌、（3）正常肺、（4）良性前立腺肥大、（5）卵巣癌、（6）正 常膀胱、（7）膀胱癌、（8〜10）正常結腸、（11〜13）結腸癌、および（14）マ ーカー。すべてのサンプルにおいて約45kDのバンドが認められるが、該バンドは 、正常組織抽出物よりも癌性組織抽出物において強力である（レーン1、2、5、7 、11、12および13を参照されたい）。 該ニトロセルロースフィルターにさらす前に該一次抗体（抗ペプチドポリクロ ーナル抗血清）を種々の濃度のペプチド免疫原と共に4℃で一晩プレインキュベ ートする以外は前記と同様の方法で、競合実験を行なった。該ウエスタンの展開 を、前記のとおりに継続した。約45kDのバンドへの抗体結合は、2.6μM の濃度のCS198合成ペプチド（配列番号44）で抑制された。 また、フィルム上の該ウエスタンの可視化の後、発色性基質5-ブロモ-4-クロ ロ-3-インドリルホスファート（BCIP）の添加および展開により該バンドをメン ブレン上で直接可視化した。該溶液は、0.016％BCIP、100mM NaCl、5mM MgCl₂お よび100mM Tris-HCl（pH9.5）を含有していた。該バンドが所望の強度で展開さ れるまで、該フィルターを該溶液中室温でインキュベートした。染色前分子量基 準（Novex，San Diego，CA）およびビオチン化分子量基準（Tropix，Bedford，M A）の移動度に基づいて、分子量の測定を行なった。実施例17：EIAマイクロタイタープレートアッセイ 実施例13または実施例14に記載のとおりに好ましくはウサギまたはマウスから 得た抗血清の免疫反応性を、以下のとおり、マイクロタイタープレートEIAによ り測定した。簡単に説明すると、実施例10に記載のとおりに調製した合成ペプチ ド、配列番号43、配列番号44、配列番号45および配列番号46を、炭酸緩衝液（50 mM，pH9.6）に溶解して、2μg/mlの最終濃度とした。つぎに、100μlの該ペプチ ドまたはタンパク質溶液を、 Chantilly，VA）の各ウェル中に配置した。該プレートを室温で一晩インキュベ ートし、ついで脱イオン水で４回洗浄した。125 （Pierce Chemical Company，Rockford，IL））を各ウェルに加え、ついで直ち に該溶液を捨てることにより、該ウェルをブロッキングした。このブロッキング 手順を３回行なった。既に記載されているとおりに調製した免疫ウサギまたはマ ウスから得 レンエーテル，Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）およびの0.05％アジ 化ナトリウム（1：100、1：500、1：2500、1：12,500および1：62,500の希釈度 ）を含有するPBS中のタンパ 該コート化マイクロタイタープレートの各ウェル内に配置した。ついで該ウェル を室温で３時間インキュベートした。各ウェル ナトリウムとを含有するリン酸緩衝食塩水中の３％ ファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マウスIgG抗血清（Southern Biote ch，Birmingham，AB）を、各ウェルに加え た。該ウェルを室温で２時間インキュベートした。つぎに、各ウェルを脱イオン 水で４回洗浄した。ついで100μlのパラニトロフェニルホスファート基質（Kirk egaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD）を各ウェルに加えた。該 ウェルを室温で30分間インキュベートした。各ウェルにおいて、405nmにおける 吸光度を読取った。該試験ウェル中の405nmでの吸光度が、非免疫血清（陰性対 照）から得られる吸光度に比べて増加することに基づいて、陽性反応を同定した 。陽性反応は、検出可能な抗CS198抗体の存在を示した。該抗ペプチド抗血清の 力価を、既に記載されている抗血清の希釈度から計算し、算出希釈度と定義した （ここでは、A_405nm=0.5 ODとした） 実施例18：固相粒子のコーティング A ．CS198抗原に特異的に結合する抗体による微粒子のコーティング CS198タンパク質に特異的に結合するアフィニティー精製された抗体（実施例1 5を参照されたい）を、約0.1〜20μmの範囲内の半径を有するポリスチレン、カ ルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリラートの微粒子または同様の粒子 上にコーティングする。微粒子は、受動的または能動的のいずれかで コーティングすることが可能である。１つのコーティング方法は、EDAC（1-(3- ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（Aldrich Chemical C o.，Milwaukee，WI））で活性化されたカルボキシル化ラテックス微粒子を、CS1 98タンパク質に特異的に結合する抗体で、以下のとおりにコーティングすること を含む。簡単に説明すると、最終的に0.375％の樹脂固体懸濁液で洗浄されたカ ルボキシル化ラテックス微粒子(Bangs Laboratories，Carmel，INまたはSerodyn ，Indianapolis，INから入手可能)を、適当な容器内で、50mM MES緩衝液（pH4.0 ）と150mg/lのアフィニティー精製抗CS198抗体（実施例14を参照されたい）とを 含有する溶液中で15分間混合する。EDAC結合剤を、5.5μg/mlの最終濃度になる まで該混合物に加え、室温で2.5時間混合する。 ついで0.2μm Microgon Filtrationモジュールを使用するタンジェンシャルフ ロー（tangentialflow）濾過により、該微粒 で洗浄する。洗浄した微粒子は、希薄な界面活性剤および無関係なタンパク質（ ブロッキング剤）を通常は含有する適当な緩衝液中に、必要になるまで保存する 。B ．1/4インチのビーズのコーティング また、CS198抗原に特異的に結合する抗体を、当該技術分野で公知の常法（Sni tmanら，米国特許第5,273,882号）により1/4インチのポリスチレンビーズの表面 上にコーティングし、競合結合またはEIAサンドイッチアッセイにおいて使用す ることができる まず、ポリスチレンビーズを、10mM NaHCO₃緩衝液（pH8.0）中で約15秒間超音 波処理に付すことにより清浄化する。ついで、すべての細粒が除去されるまで、 該ビーズを脱イオン水で洗浄する。ついでビーズを、10mM炭酸緩衝液（pH8.0〜9 .5）中の抗体溶液に漬ける。該抗体溶液は、高親和性モノクローナル抗体の場合 には1μg/mlと同程度に、あるいはアフィニティー精製されていないポリクロー ナル抗体の場合には約500μg/mlの濃度と同程度に希薄であってよい。ビーズを 、室温で少なくとも12時間コーティングし、脱イオン水で洗浄する。ビーズは、 風乾するか、または湿ったまま保存（PBS，pH7.4中）することができる。また、 それらは、タンパク質安定化剤（例えば、ショ糖）、または非特異的結合ブロッ カー（例えば、無関係なタン るタンパク質ブロッキング剤でオーバーコーティングすることができる。 実施例19：微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA） 微粒子などの固相を使用する標準的な抗原競合EIAまたは抗体サンドイッチEIA （MEIA）を行なうことにより、患者の試験 Analyzer（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL）などの自動分析装置上で行 なうことができる。 A ．抗体サンドイッチEIA 簡単に説明すると、抗原／抗体複合体を形成させるために、CS198抗原を含有 する疑いのあるサンプルを、抗CS198抗体でコーティングされた微粒子(実施例17 に記載のとおりに調製したもの)の存在下でインキュベートする。ついで該微粒 子を洗浄し、シグナル生成化合物（すなわち、アルカリホスファターゼ、ホース ラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素）に結合した抗体を含む指示試薬を該 抗原／抗体複合体または該微粒子に加え、インキュベートする。該微粒子を洗浄 し、シグナル生成化合物と反応して測定可能なシグナルを生成する基質（例えば 、それぞれ4-メチルウンベリフェリルホスファート（MUP） またはOPD/ペルオキシド）を加えることにより該結合抗体／抗原／抗体複合体を 検出する。陰性対照から生じたシグナルと比べて上昇した試験サンプル中のシグ ナルにより、CS198抗原の存在が検出される。試験サンプル中のCS198抗原の存在 は、GI管癌などのGI管の疾患または状態の診断を示す。 B ．競合結合アッセイ 該競合結合アッセイでは、抗ペプチド抗体でコーティングされた微粒子と標識 ペプチドとを接触させた場合に測定可能シグナルを生成するペプチドまたはタン パク質を使用する。このア IL）上で行なうことができる。該標識ペプチドを、CS198抗原を含有する疑いの ある試験サンプルの存在下、CS198抗体でコーティングされた微粒子(実施例17に 記載のとおりに調製したもの)に加え、標識CS198ペプチド（または標識タンパク 質）／結合抗体複合体および／または患者のCS198抗原／結合抗体複合体の形成 に十分な時間および条件下でインキュベートする。試験サンプル中のCS198抗原 は、該微粒子上の結合部位に関して標識CS198ペプチド（またはCS198タンパク質 ）と競合する。該アッセイにおいて、試験サンプル中のCS198抗原は、標識ペ プチドまたは抗体でコーティングされた微粒子の結合を低下させる。なぜなら、 試験サンプル中の抗原と、該CS198ペプチドまたはCS198タンパク質とが、抗体結 合部位に関して競合するからである。低下したシグナル（対照と比べた場合）は 、試験サンプル中のCS198抗原の存在を示す。CS198抗原の存在は、GI管癌などの GI管の疾患または状態の診断を示唆する。 本発明で提供し前記で検討したCS198ポリヌクレオチドおよびそれにコードさ れるタンパク質は、GI管組織の疾患、特にGI管癌のマーカーとして有用である。 血液、血漿、血清などの試験サンプルにおけるこのマーカーの出現に基づく試験 は、安価かつ非侵襲的に診断情報を提供して、癌の診断を行なう医師を助け、療 法プロトコールを選択したり又は選択した療法の達成度をモニターするのを助け る。このマーカーは、血液、尿、糞便などの容易に利用可能な体液中に、免疫学 的方法により検出可能な疾患組織由来の抗原として出現しうる。このマーカーは 、病態において上昇したり、病態において変化したり、あるいは不適当な身体画 分中に出現するGI管の正常タンパク質であることが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (72)発明者 コルピツツ，トレーシー・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク、ノース・サークル・ドライ ブ・34365 (72)発明者 フリードマン，ポーラ・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60015、デー アフイールド、カムノー・コート・462 (72)発明者 ゴードン，ジユリアン アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、イースト・シエリダン・ロー ド・307 (72)発明者 グラナドス，エドワード・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、モンゴメリー・レイン・19 (72)発明者 ハイドン，マーク アメリカ合衆国、イリノイ・60041、イン グルサイド、ノース・セダーウツド・レイ ン・25059 (72)発明者 ホツジス，ステイーブン・シイ アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツ フアロ・グローブ、ストーンゲート・ロー ド・169 (72)発明者 クラス，マイケル・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、マルベリイ・ドライブ・1606 (72)発明者 クラトクビル，ジヨン・デイー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、フイフス・アベニユー・7101 (72)発明者 ロバーツ−ラツプ，リサ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ウエストフイールド・ドライブ・ 2090 (72)発明者 ラツセル，ジヨン・シイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノーシヤ、シクステイー・フオース・コ ート・8275 (72)発明者 ストロープ，ステイーブン・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、ウイルシヤー・ドライブ・ 945

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）該試験サンプルを、少なくとも１つのCS198特異的ポリヌクレオチドま たはその相補体と接触させること、および （b）該試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドの存在を検出することを含 んでなり、 該CS198特異的ポリヌクレオチドが、配列番号1〜27およびそれらの断片または相 補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性 を有するものである、試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオチドの存在を検 出する方法。 ２．工程（a）を行なう前に、該標的CS198ポリヌクレオチドを固相に結合させる 、請求項１に記載の方法。 ３．（a）少なくとも１つのプライマーで逆転写を行なってcDNAを得ること、 （b）工程（a）から得たcDNAを、CS198オリゴヌクレオチドをセンスプライマー およびアンチセンスプライマーとして使用して増幅して、CS198アンプリコンを 得ること、および （c）該試験サンプル中の該CS198アンプリコンの存在を検出す ることを含んでなり、 工程（a）および（b）で使用するCS198オリゴヌクレオチドが、配列番号1〜27お よびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対し て少なくとも50％の同一性を有するものである、試験サンプル中のCS198のmRNA を検出する方法。 ４．工程（a）、（b）または（c）の１つを行なう前に、該試験サンプルを固相 と反応させる、請求項３に記載の方法。 ５．該検出工程が、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識を使用する ことを含む、請求項３に記載の方法。 ６．標的CS198ポリヌクレオチドを含有する疑いのある試験サンプル中の標的CS1 98ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （a）該試験サンプルを、センスプライマーとしての少なくとも１つのCS198オリ ゴヌクレオチドおよびアンチセンスプライマーとしての少なくとも１つのCS198 オリゴヌクレオチドと接触させ、増幅させて第１段階反応産物を得ること、 （b）該第１段階反応産物を少なくとも１つの他のCS198オリゴヌクレオチドと接 触させて、第２段階反応産物を得ること（た だし、前記他のCS198オリゴヌクレオチドは、工程（a）で使用するCS198オリゴ ヌクレオチドの3'側に位置し、該第１段階反応産物に相補的である）、および （c）該標的CS198ポリヌクレオチドの存在の指標として該第２段階反応産物を検 出することを含んでなり、 工程（a）および（b）において使用するCS198オリゴヌクレオチドが、配列番号1 〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド に対して少なくとも50％の同一性を有するものである、上記方法。 ７．工程（a）、（b）または（c）の１つを行なう前に、該試験サンプルを固相 と反応させる、請求項６に記載の方法。 ８．該検出工程が、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識を使用する ことを含む、請求項６に記載の方法。 ９．前記の検出可能な標識を固相に反応させる、請求項８に記載の方法。 10．配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配 列に対して少なくとも50％の同一性を有する少なくとも１つのCS198ポリヌクレ オチドを含有する容器を含んでなる、試験サンプル中の標的CS198ポリヌクレオ チドを検 出するのに有用な試験キット。 11．CS198遺伝子の核酸に選択的にハイブリダイズする能力を有し、 （a）配列番号7〜13およびそれらの相補体、（b）配列番号15〜26およびそれら の相補体、ならびに（c）配列番号7〜26の断片よりなる群から選ばれるポリヌク レオチドに対して少なくとも50％の同一性を有する、CS198遺伝子に由来する精 製されたポリヌクレオチドまたはその断片。 12．該ポリヌクレオチドが組換え技術により製造される、請求項11に記載の精製 されたポリヌクレオチド。 13．該ポリヌクレオチドが合成技術により製造される、請求項11に記載の精製さ れたポリヌクレオチド。 14．該ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのCS198エピトープをコードする配 列を含む、請求項11に記載の精製されたポリヌクレオチド。 15．所望の宿主に和合性の制御配列に作動的に結合しているCS198由来のオープ ンリーディングフレームを含む核酸配列を含んでなる組換え発現系であって、該 核酸配列が、配列番号1〜27およびそれらの断片または相補体よりなる群から選 ばれる ポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有するものである、上記組 換え発現系。 16．請求項15に記載の組換え発現系でトランスフェクトされた細胞。 17．（a）配列番号43〜47、および（b）配列番号42〜47の断片よりなる群から選 ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCS198ポリペプチ ド。 18．該ポリペプチドが組換え技術により製造される、請求項17に記載のポリペプ チド。 19．該ポリペプチドが合成技術により製造される、請求項17に記載のポリペプチ ド。 20．少なくとも１つのCS198エピトープに特異的に結合する抗体であって、該CS1 98エピトープが、配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるア ミノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列に由来するも のである、上記抗体。 21．配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に 対して少なくとも50％の同一性を有するCS198ポリペプチドを含有する容器を含 んでなる、試験サンプ ル中のCS198抗原または抗CS198抗体の存在を判定するためのアッセイキット。 22．該ポリペプチドが固相に結合している、請求項21に記載のアッセイキット。 23．少なくとも１つのCS198エピトープを含むCS198抗原に特異的に結合する抗体 を含有する容器を含んでなる、試験サンプル中のCS198抗原の存在を判定するた めのアッセイキット。 24．該抗体が固相に結合している、請求項23に記載のキット。 25．配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に 対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトされた 宿主細胞をインキュベートすることを含んでなる、少なくとも１つのCS198エピ トープを含むポリペプチドの製造法。 26． （a）配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるCS198抗原のエ ピトープの少なくとも１つに特異的に結合する抗体またはその断片と該試験サン プルとを、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させること 、および （b）該複合体を検出することを含んでなる、CS198抗原を含有する疑いのある試 験サンプル中のCS198抗原を検出する方法。 27．該抗体が固相に結合している、請求項26に記載の方法。 28． （a）配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列 に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列またはその断片に由来す る少なくとも１つのCS198エピトープを含有するCS198ポリペプチドと該試験サン プルとを、抗原／抗体複合体の形成が可能となるのに十分な時間および条件下で 接触させること、および （b）該複合体を検出することを含んでなる、CS198抗原に特異的な抗体を含有す る疑いのある試験サンプル中の該抗体の存在を検出する方法。 29．該CS198ポリペプチドが固相に結合している、請求項28に記載の方法。 30．少なくとも１つのCS198エピトープをコードする核酸配列でトランスフェク トされた細胞であって、該核酸配列が、配列番号1〜27およびそれらの断片また は相補体よりなる群から選ばれるものである、上記細胞。 31．免疫応答を惹起するのに十分な量の単離された免疫原性ポリペプチドまたは その断片を個体に投与することを含んでなる、CS198抗原に特異的に結合する抗 体の製造法であって、該免疫原性ポリペプチドが、 少なくとも１つのCS198エピトープを含み、および 配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し て少なくとも50％の同一性を有するものである、上記製造法。 32．配列番号42〜47およびそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を 有するポリペプチドに由来する少なくとも１つのCS198エピトープをコードする 配列を含むプラスミドを個体に投与することを含んでなる、CS198抗原に特異的 に結合する抗体の製造法。 33．（a）配列番号7〜13およびそれらの相補体、（b）配列番号15〜26およびそ れらの相補体、ならびに（c）配列番号7〜26の断片よりなる群から選ばれるポリ ヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有する、CS198ポリヌクレオチ ドまたはその断片を含んでなる組成物。 34．少なくとも１つのCS198エピトープを含有するポリペプチ ドを含んでなる組成物であって、該ポリペプチドが、（a）配列番号43〜47、お よび（b）配列番号42〜47の断片よりなる群から選ばれる配列に対して少なくと も50％の同一性を有するものである、上記組成物。 35．該サンプルの採集に有用な手段を有する容器をさらに含み、該手段が、ラン セット、吸収紙、布、スワブおよびカップよりなる群から選ばれる、請求項10に 記載の試験キット。 36．該サンプルの採集に有用な手段を有する容器をさらに含み、該手段が、ラン セット、吸収紙、布、スワブおよびカップよりなる群から選ばれる、請求項21に 記載のアッセイキット。 37．該サンプルの採集に有用な手段を有する容器をさらに含み、該手段が、ラン セット、吸収紙、布、スワブおよびカップよりなる群から選ばれる、請求項23に 記載の試験キット。 38．配列番号47に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含むCS 198タンパク質をコードする遺伝子またはその断片。 39．配列番号26に対して少なくとも50％の同一性を有するDNAを含んでなる遺伝 子またはその断片。