CN109425647A - 一种蛋白质复合物交联信息深度覆盖的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于化学交联质谱解析蛋白‑蛋白相互作用,实现蛋白质复合物交联信息深度覆盖的分析方法,该方法通过在样品预处理过程中使用与胰蛋白酶不同的一种或多种限制性内切酶分别与胰蛋白酶进行联合酶切的方式,实现多种酶解产物对蛋白质复合物交联信息的深度覆盖。该方法能有效地用于解析单一蛋白质复合物,将交联蛋白酶解成适合质谱解析的肽段长度,得到更全面、丰富的蛋白质相互作用信息。在蛋白质复合物结构解析领域有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质复合物交联信息深度覆盖的分析方法,可实现单一蛋白质复合物通过化学交联反应相互作用信息的全面鉴定,具有鉴定信息全面、准确性高的优点,并且该方法可以广泛应用于化学交联质谱解析蛋白-蛋白相互作用的研究中,为蛋白质结构的精准解析提供具有重要意义的蛋白质相互作用位点信息。
背景技术
蛋白质作为生物体生命活动的主要执行者,通过与其它蛋白质相互作用形成复合体,精密、有序地调控各项生命过程。对蛋白质复合体进行分析,绘制蛋白质构象折叠变化及蛋白质之间相互作用网络,对于理解生物系统、揭示疾病发生发展机制、筛选疾病相关的生物标志物以及寻找药物的靶标具有重大意义。因此,蛋白质复合体的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。
一些传统研究蛋白质相互作用和蛋白质结构的方法已成功地应用于蛋白质复合体的解析,如酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白质结晶结合X射线衍射以及核磁共振等技术(Smits,A.H.;Vermeulen,M.Trends Biotechnol.2016,34,825-834.Carneiro,D.G.;Clarke,T.;Davies,C.C.;Bailey,D.Methods 2016,95,46-54.)。但这些方法也存在各自的局限性:酵母双杂交技术可以鉴定直接的相互作用,但不能反映体内相互作用的情况,假阳性率较高;免疫共沉淀技术虽能鉴定体内相互作用的蛋白质,但不能区分直接和间接的相互作用,并且对于瞬时、微弱的相互作用,比如信号转导过程中的松散变化的蛋白质复合物,很难获得有效信息;蛋白质结晶结合X射线衍射和核磁共振技术能够提供高精度的结构信息,但对蛋白质样品本身有比较严苛的要求,如蛋白质的绝对量、纯度、浓度、分子大小和可结晶性等都必须达到一定的标准且成本高。并且,这些方法均无法提供蛋白质相互作用的界面信息,并且分析通量较低。
新技术和新方法的发展一直是推动蛋白质研究的关键和强大动力。近年发展起来的化学交联结合质谱技术,是通过化学交联剂与氨基酸残基反应,将动态变化的蛋白质相互作用以共价键的形式固定,可以获得蛋白质在低分辨率水平上的结构信息以及蛋白质相互作用信息的鉴定(Tran,B.Q.;Goodlett,D.R.;Goo,Y.A.Biochim.Biophys.Acta 2016,1864,123-129.)。这一方法具有分析速度快、通量高、成本低、对蛋白质各方面性状要求低等优势。但是,由于该技术普遍采用Bottom-up的方式将交联蛋白酶解成肽段进行质谱鉴定,交联蛋白相比非交联蛋白体积大,这将导致严重的漏切,同时酶切得到的产物中,具有相互作用信息的交联肽段丰度低,且体积大,不利于质谱的鉴定。此外,通常发生交联反应的氨基酸为赖氨酸,最常用的特异性最高的胰蛋白酶的酶切位点为赖氨酸和精氨酸,赖氨酸在发生交联反应后将不会被胰蛋白酶酶切,这也将导致大量的漏切。在对交联肽段混合物进行LC-MSn(液相色谱-质谱联用技术)分析时,绝大部分信号来自于非交联肽段,而交联肽段的谱图数目少且信号差。普通肽段的二级谱图只涉及一条肽段并且碎裂只发生一次,而交联肽段的谱图不仅涉及两条肽段并且碎裂形式多变,可能发生在任意一条肽上,也可能发生在交联剂上,其二级谱图的碎片离子比起常规谱图在种类和数目上都更多。因此,尽量降低漏切,将交联蛋白酶解成适宜质谱鉴定的长度的肽段,提高交联肽段在样品中的纯度和丰度,并增加其在质谱分析和数据解析中的识别度,是实现基于化学交联结合质谱技术的蛋白质复合物组成和位点精准解析的关键。
通常,采用LysC与Trypsin联合酶切的方式降低蛋白样品酶解过程中漏切的发生,而针对于交联的蛋白质复合物,此专利我们采用一种或二种及以上具有相同或不同酶切位点的限制性内切酶与胰蛋白酶进行联合酶切的方式,对交联蛋白进行酶切,得到的酶解产物经过质谱解析,实现了对蛋白质复合物相互作用信息的深度覆盖。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于发展一种用于化学交联质谱解析深度覆盖蛋白质复合物相互作用信息的方法,通过该方法能有效提高蛋白质相互作用位点信息的鉴定效果,实现蛋白质复合物组成和相互作用位点信息的精准解析。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种用于蛋白质复合物交联信息深度覆盖的分析方法,在化学交联质谱解析蛋白-蛋白相互作用样品预处理过程中,通过使用一种或多种限制性内切酶与胰蛋白酶进行联合酶切的方式,增加酶切位点之间的互补性,降低漏切,将复杂的交联蛋白样品,酶解成适合质谱鉴定的肽段长度,提高质谱对交联肽段的鉴定效果,得到更为丰富和全面的交联信息。
(1)将待鉴定的蛋白质复合物通过与化学交联剂发生化学交联反应,生成交联蛋白。将交联蛋白通过变性、还原、烷基化处理后,通过一种或二种及以上限制性内切酶与胰蛋白酶进行联合酶切的方式进行酶解,将得到的酶解产物进行质谱鉴定和数据处理。
(2)其中所用的限制性内切酶包括丝氨酸蛋白酶Trypsin、丝氨酸蛋白酶LysC、丝氨酸蛋白酶ArgC、金属蛋白酶AspN、丝氨酸蛋白酶GluC、丝氨酸蛋白酶LysN中的一种或二种以上。
(3)酶解反应的条件为:蛋白质复合物与蛋白酶的摩尔比可从1000:1到10:1;酶解反应温度为20℃到40℃;酶解溶液的pH范围7.0到8.0;酶解反应时间为0.5小时到48小时。
(4)联合酶切的方式为:采用一次加入二种或以上限制性内切酶的方式进行酶解或采用先后向样品中加入二种或以上限制性内切酶的方式或通过在超滤膜上进行酶解,将前一步的酶解产物通过离心的方式分离,再对膜上的样品进行下一次的酶解。
(5)分别对上述酶解产物进行质谱鉴定和数据检索,从而得到通过该实验策略鉴定到的蛋白质复合物相互作用信息。
(6)该方法能有效地用于解析单一蛋白质复合物,将交联蛋白酶解成适合质谱解析的肽段长度,得到更全面、丰富的蛋白质相互作用信息。在蛋白质复合物结构解析领域有着广阔的应用前景。
本发明具有如下优点:
1.分析速度快,通量高,对蛋白质复合物的性状要求低。
2.联合酶切,降低漏切,得到合适长度的酶解肽段,有利于质谱的鉴定。
3.深度覆盖蛋白质相互作用位点信息。通过具有不同酶切位点的限制性内切酶的联合使用,得到不同的酶解产物,实现对蛋白质相互作用信息的全面鉴定。
附图说明
图1为使用Trypsin与Trypsin联合酶切的鉴定结果;
图2为使用AspN与Trypsin联合酶切的鉴定结果。
图3为使用Trypsin与Trypsin联合酶切的鉴定结果;
图4为使用不同的联合酶切策略,鉴定到的蛋白质相互作用位点信息汇总结果。
图5为以Trypsin与Trypsin联合酶切鉴定到的相互作用位点信息和其他限制性内切酶与Trypsin联合酶切鉴定到的相比于Trypsin与Trypsin联合酶切得到的补充位点信息作为总体,每种联合酶切策略鉴定到的相互作用位点信息占总体鉴定结果的比例图。
具体实施方式
实施例1
对蛋白Tryptophanase(色氨酸酶)进行相互作用信息鉴定
(1)化学交联反应:将经纯化的蛋白Tryptophanase溶解于50mM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸),pH 7.5,150mM NaCl(氯化钠)溶液中,蛋白浓度为10mg/mL;加入溶解于DMF(二甲基甲酰胺)的化学交联剂DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)至交联剂与蛋白混合后,交联剂的终浓度为1mM;室温反应1小时。
(2)加入终浓度为50mM的NH4HCO3碳酸氢铵溶液,室温下终止交联反应20min。
(3)冻干,将交联蛋白重溶于8M尿素,5mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液中,交联蛋白浓度为1mg/mL,56℃反应30min。
(4)加入终浓度为10mM的IAA(碘代乙酰胺),室温避光反应30min。
(5)将上述样品溶液中的尿素稀释至1M,使用Trypsin和Trypsin进行顺序酶解反应,37℃分别反应12h,酶与蛋白的质量比为1:100;使用AspN和Trypsin进行顺序酶解反应,37℃分别反应12h,酶与蛋白的质量比为1:100。
(6)将上述酶解产物使用液相色谱C18分离柱除盐:98%A相上样、除盐,80%B相洗脱得到样品;将样品冻干,重溶于0.1%FA中。(A相:98%H2O,2%ACN,0.1%TFA;B相:98%ACN,2%H2O,0.1%TFA)
(7)将上述样品分别进行质谱鉴定,并将产生的质谱数据进行交联信息汇总。
(8)将得到的交联信息使用xiNET网页版处理,得到如下图所示结果:
图1为使用Trypsin与Trypsin联合酶切的鉴定结果;
图2为使用AspN与Trypsin联合酶切的鉴定结果。
上述数据为使用pLink软件检索得到,线性蛋白质相互作用信息图由xiNET网页版处理得到。
上述数据结果表明,通过使用AspN与Trypsin的联合酶切,可以得到相比Trypsin与Trypsin的联合酶切补充的相互作用位点信息,实现基于化学交联解析蛋白质复合物相互作用位点信息的深度覆盖,为尚待全面结构解析的蛋白质提供更丰富的相互作用信息。
实施例2
对蛋白60kDa chaperonin(60kDa伴侣蛋白)进行相互作用信息鉴定
(1)化学交联反应:将经纯化的蛋白60kDa Chaperonin溶解于20mM HEPES,pH7.5,150mM NaCl溶液中,蛋白浓度为15mg/mL;加入化学交联剂DSS(溶于DMF中),至其参与反应的终浓度为2mM;室温反应1小时。
(2)加入终浓度为50mM的碳酸氢铵溶液,终止交联反应20min。
(3)冻干,将上述交联蛋白重溶于8M尿素,10mM DTT,蛋白终浓度为1mg/mL,37℃反应2h。
(4)加入终浓度为10mM的IAA,室温避光反应30min。
(5)将上述经过样品预处理的交联蛋白200μg加入截留分子量为10kDa的滤膜上,15000g离心。使用200μL 50mM碳酸氢铵清洗滤膜2次。
(6)换底管,向滤膜上加入200μL 50mM碳酸氢铵,2μg Trypsin 37℃反应12h;15000g离心,获得第一次酶解产物。
(7)换底管,向滤膜上加入200μL 50mM碳酸氢铵,2μg Trypsin 37℃反应12h;15000g离心,获得第二次酶解产物。
(8)将步骤6、7中的酶分别换为LysC与Trypsin、ArgC与Trypsin、GluC与Trypsin、AspN与Trypsin和LysN与Trypsin分别进行联合酶切获得酶解产物。
(9)将上述酶解产物使用液相色谱C18分离柱除盐:98%A相上样、除盐,80%B相洗脱得到样品;将样品冻干,重溶于0.1%FA中。(A相:98%H2O,2%ACN,0.1%TFA;B相:98%ACN,2%H2O,0.1%TFA)
(10)将上述样品分别进行质谱鉴定,并将同一顺序酶解策略鉴定得到的交联信息进行汇总。
(11)将得到的交联信息使用xiNET网页版处理,得到如下图所示结果:
图3为使用Trypsin与Trypsin联合酶切的鉴定结果;
图4为使用不同的联合酶切策略,鉴定到的蛋白质相互作用位点信息汇总结果。
图5为以Trypsin与Trypsin联合酶切鉴定到的相互作用位点信息和其他限制性内切酶与Trypsin联合酶切鉴定到的相比于Trypsin与Trypsin联合酶切得到的补充位点信息作为总体,每种联合酶切策略鉴定到的相互作用位点信息占总体鉴定结果的比例如上图5所示。
上述数据为使用pLink软件检索得到,线性蛋白质相互作用信息图由xiNET网页版处理得到。
上述数据结果表明,通过使用不同的限制性内切酶与Trypsin联合酶切策略,可以得到相比Trypsin与Trypsin的联合酶切更全面的蛋白质相互作用位点信息,实现对于化学交联蛋白质复合物交联信息的深度覆盖,为有待进行全面结构解析的蛋白质提供更丰富的相互作用信息。
Claims (7)
1.一种用于蛋白质复合物交联信息深度覆盖的分析方法,其特征在于:在化学交联质谱解析蛋白-蛋白相互作用样品预处理过程中,通过使用一种或二种以上限制性内切酶与胰蛋白酶进行联合酶切的方式,将复杂的交联蛋白样品,酶解成适合质谱鉴定的肽段长度,再进行质谱解析,提高质谱对交联肽段的鉴定效果,得到更为丰富和全面的交联信息。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:样品预处理步骤包括化学交联蛋白质、变性、还原、烷基化和酶解步骤。
3.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:用于鉴定的蛋白质复合物的来源为:细胞蛋白质提取液、胞浆蛋白质提取液、血浆蛋白质提取液、组织蛋白质提取液、单一蛋白质复合物中的一种或二种以上。
4.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:
样品预处理过程中所用的蛋白酶为下列限制性内切酶中的一种或二种以上并与胰蛋白酶联合使用;
限制性内切酶包括丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶(Trypsin)、丝氨酸蛋白酶LysC、丝氨酸蛋白酶ArgC、金属蛋白酶AspN、丝氨酸蛋白酶GluC、丝氨酸蛋白酶LysN中的一种或二种以上。
5.根据权利要求1或4所述的分析方法,其特征在于:所用的限制性内切酶,其酶解反应条件为:蛋白质复合物与每一种蛋白酶的摩尔比可从1000:1到10:1;酶解反应温度为20℃到40℃;酶解溶液的pH范围7.0到8.0;酶解反应时间为0.5小时到48小时。
6.根据权利要求5所述的分析方法,其特征在于:酶解过程为,
采用一次加入一种或二种以上限制性内切酶和胰蛋白酶同时使用的方式进行同时酶解;
或采用先后向样品中加入一种或二种以上限制性内切酶和胰蛋白酶的方式,在同一环境体系中进行分别酶解;
或通过使用超滤膜(截留分子量范围:5kDa到30kDa),采用先后向样品中加入一种或二种以上限制性内切酶和胰蛋白酶进行分别酶解,且每一种酶酶解后进行离心分离,通过离心的方式分别得到酶解产物;
酶解过程完成后,将上述得到的酶解产物进行质谱鉴定和数据检索,得到通过该酶解策略鉴定到的蛋白质复合物相互作用信息。
7.根据权利要求1-6任一所述分析方法,其特征在于:所述方法可用于化学交联质谱解析蛋白质复合物相互作用信息的深度覆盖,或用于鉴定细胞蛋白质提取液、胞浆蛋白质提取液、血浆蛋白质提取液、组织蛋白质提取液、单一蛋白质复合物中一种或二种以上的相互作用信息,为蛋白质复合体的精准解析提供具有重要意义的蛋白质相互作用位点信息。
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