CN105087619B

CN105087619B - 一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法

Info

Publication number: CN105087619B
Application number: CN201510288478.3A
Authority: CN
Inventors: 朱莹; 许国强
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN105087619A

Abstract

本发明涉及一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法，该方法首先构建带有亲和标签的类泛素修饰结合酶与类泛素修饰蛋白融合基因表达质粒，然后将所述融合基因表达质粒转染到真核细胞中，48或72小时后收集细胞并裂解，获得全蛋白裂解液，通过亲和标签分离纯化类泛素修饰蛋白底物，进一步通过胰蛋白酶酶解类泛素修饰蛋白底物，提取纯化多肽，利用质谱分析鉴定修饰底物多肽，搜索数据库获得多肽序列，比对对照样品和修饰底物的分子量变化最终确证类泛素修饰蛋白底物，本发明通过表达类泛素修饰结合酶和类泛素修饰蛋白的融合蛋白来提高类泛素修饰蛋白对底物蛋白的修饰程度，并通过亲和层析提高对底物蛋白的分离效率，可更可靠地确证类泛素修饰蛋白的底物。

Description

一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种翻译后修饰蛋白底物鉴定方法，具体而言本发明涉及一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法。

背景技术

类泛素化修饰蛋白是一类与泛素(ubiquitin)有类似氨基酸序列和三级空间结构的分子量较小的蛋白，现在已知的类泛素修饰蛋白有十多个，如SUMO1/2/3、NEDD8、ISG15、Ufm1、Urm1、FAT10、Atg8、Atg12等，这些类泛素修饰蛋白通过类似于蛋白质泛素化过程一样的酶促级联反应修饰其底物。在类泛素化修饰过程中，类泛素蛋白的前体在特异性水解酶的作用下形成一个成熟蛋白，该成熟蛋白首先被类泛素激活酶(E1)激活并形成一个高能硫酯键，然后通过另一个高能硫酯键被转移到类泛素结合酶(E2)上，最后通过类泛素连接酶(E3)把类泛素修饰蛋白转移到底物蛋白上。类泛素修饰蛋白的羧基端与底物蛋白被修饰的赖氨酸上的氨基通过异肽键连接，形成稳定的共价键，该类修饰可以影响底物蛋白的稳定性、亚细胞定位、与其它蛋白的相互作用等功能。

虽然这些类泛素蛋白在正常细胞中的丰度不一，但它们在疾病的发生发展、信号转导过程中起着极其重要的作用。然而到现在为止，许多类泛素修饰蛋白的底物还知之甚少，这限制了我们对这些蛋白的生物学功能的深入研究。其原因是由于缺乏对这些修饰的有效的鉴定方法，目前，用来鉴定类泛素修饰蛋白底物的方法主要分成以下三种：

第一种是通过免疫沉淀和免疫印迹来实现的。在该方法中，将可能发生类泛素修饰的底物蛋白在细胞内过表达后，用亲和层析或免疫沉淀的方法把它从全蛋白裂解液中分离富集，再用能识别该类类泛素化修饰蛋白的抗体做免疫印迹实验来检测该底物是否发生了该类类泛素修饰。

缺点在于首先要推测某个蛋白是否有可能发生类泛素修饰，然后还要做免疫沉淀和免疫印迹实验来验证。另外，如果所要研究的蛋白没有适用于免疫沉淀的抗体，需要在目标蛋白中加入亲和标签构建表达质粒，在细胞内转染后再对该可能的底物进行表达、纯化和免疫印迹验证。

该方法需要表达、纯化蛋白、跑胶、转膜、蛋白质印迹等实验，耗时长，而且一般只能同时研究一个或少数几个可能的底物蛋白。且最关键的问题是在开始实验之前，要对可能修饰的底物蛋白做出一个判断，如果该判断有偏差，将会直接影响后面的实验结果。

第二种是采用在细胞系中表达一个带有标签(如His标签)的类泛素修饰蛋白，然后利用TALON或Ni-NTA树脂对组氨酸序列的亲和作用，通过亲和层析方法来分离富集修饰的底物蛋白，并通过胰蛋白酶酶解纯化蛋白后获得多肽片段，并用质谱分析获得其底物蛋白。

缺点在于现在只能用于修饰程度较高的类泛素修饰蛋白的底物鉴定，如对NEDD8、小泛素样蛋白(SUMO，small ubiquitin-like modifiers)等类泛素化修饰蛋白。另外，由于亲和层析纯化后的产物中会有一定程度的非特异性结合蛋白的存在，这类方法很难把特异性的底物蛋白从非特异性结合的蛋白中甄别出来，从而使得所获得的蛋白的假阳性率较高。其次，这一方法对丰度较小的类泛素修饰蛋白底物的鉴定有很大的困难，其原因是分离出来的修饰底物蛋白丰度很低，大大地影响了其鉴定的效率。

第三种是利用新近发展起来的蛋白质组学方法鉴定类泛素修饰蛋白底物被修饰的位点，该方法在类泛素化修饰蛋白的羧基端的第三个氨基酸位置引入一个精氨酸或赖氨酸，从而使得到的底物经胰蛋白酶或胞内蛋白酶赖氨酸-C(Lys-C)水解后在修饰位点产生一个类似于泛素残基修饰的结构，即两个甘氨酸通过异肽键连接在修饰底物的赖氨酸侧链氨基上的GG-ε-K结构。然后通过可以与GG-ε-K结构特异性结合的单克隆抗体把从修饰部位获得的多肽进行分离富集和质谱鉴定，从而获得所修饰的底物蛋白片段的序列、蛋白名称和修饰位点。

该方法的缺点在于不能把所要研究的类泛素修饰与可能的泛素(ubiquitin)修饰、ISG15修饰、NEDD8修饰区分开来，因为这些修饰也可以在修饰的赖氨酸位置产生GG-ε-K的结构。其次，并不是所有的类泛素修饰蛋白的羧基端都有两个甘氨酸，羧基端突变后是否还能利用该类泛素化修饰系统的E2和E3，是否影响对底物蛋白的选择性这些问题还不得而知。再次，由该方法所得到的含修饰位点的多肽的氨基酸序列长短不一，一些多肽并不一定适合质谱鉴定，从而不能对这些底物蛋白进行有效的鉴定。另外，如果含修饰位点的多肽有其他的翻译后修饰存在，鉴定到该修饰位点的难度将大大增加。

由此可见，建立一种新的灵敏的鉴定类泛素修饰蛋白底物的高通量方法是很有必要的。本发明将在一定程度上弥补现有方法的不足，提高鉴定类泛素修饰蛋白底物的效率和准确性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高通量类泛素修饰蛋白底物鉴定方法，所述方法依次包括：

1.选择目标类泛素修饰体系，通过已有资料找到特定的类泛素修饰结合酶E2与类泛素修饰蛋白。

2.在所要研究的物种中，如人源或鼠源基因中找到相应的类泛素修饰结合酶E2和类泛素修饰蛋白的mRNA序列。

3.从相应来源的细胞(如人胚胎肾细胞HEK293T、宫颈癌HeLa细胞或小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a等细胞)中提取总RNA。

具体实验过程如下：用含10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和DMEM高糖完全培养基在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养细胞。在一个10cm皿细胞中加入1mLTRIzol试剂，用吸头反复抽吸充分裂解细胞，移至1.5mL离心管中，室温孵育5分钟。每1mLTRIzol试剂加入0.2mL氯仿，激烈摇动试管15秒，室温孵育2-3分钟，12,000g 4℃离心15分钟。离心后，将上层水相转移到新的离心管中，每1mL的TRIzol试剂加入0.5mL异丙醇，室温孵育10分钟，12,000g 4℃离心10分钟。弃去上清后，用1mL 75％乙醇洗涤RNA一次，涡旋混合，7,500g 4℃离心5分钟，弃去上清。室温干燥RNA沉淀5分钟，加入DEPC水溶解RNA，在NanoDrop上测定RNA浓度和260/280比值，以确定纯化后RNA的质量，-80℃保存或进行下一步实验。

4.使用第一链合成试剂盒从总RNA中合成第一链cDNA。

所述的第一链合成步骤可参见第一链合成试剂盒说明书(RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒，Thermo)。也可以使用其他第一链合成试剂盒如IIIFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen)、Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(Roche)。

5.设计聚合酶链式反应(PCR)扩增类泛素修饰结合酶E2和类泛素修饰蛋白Ubl基因片段。

通过类泛素修饰结合酶E2和类泛素修饰蛋白的编码区序列设计扩增两种基因的引物，PCR扩增结合酶和类泛素修饰蛋白基因片段，双酶切PCR产物和质粒载体并纯化后，通过T4DNA连接酶或同源重组的方式获得带亲和标签的融合基因表达质粒，在融合基因的5’端引入一个带亲和标签的核苷酸序列，用于后续修饰底物蛋白鉴定中的实验样品。

6.在相应的实验细胞系(如HEK293T、HeLa细胞、Neuro2a细胞等)中转染融合基因表达质粒。

该实验根据不同细胞转染的难易程度可用磷酸钙、聚乙烯亚胺(polyethylenimine)、脂质体(lipofectamine)、FuGene等转染试剂进行转染。每种质粒转染10～20个10-cm皿贴壁细胞。

转染48或72小时后收集细胞，用细胞裂解液裂解细胞，获得全蛋白裂解液。

7.用亲和树脂纯化带有亲和标签的E2-Ubl修饰的底物蛋白。

分别对对照样品(表达对照质粒)和实验样品(表达带标签的融合蛋白)进行纯化，富集类泛素修饰底物蛋白。

这一纯化富集过程可以用不同的标签来实现。

8.胰蛋白酶酶解纯化富集后的修饰底物蛋白。

把在对照样品和实验样品中纯化富集的类泛素修饰底物蛋白用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，用银染对对照样品和实验样品中蛋白染色，把E2-Ubl分子量以上的蛋白条带用手术刀按分子量大小分多个条带依次切下并记录条带位置分子量，用胶内酶解的方法把蛋白胶条分别脱色、还原烷基化、胰蛋白酶酶切，并从胶中提取多肽，用C18树脂纯化。

9.质谱鉴定修饰底物多肽和蛋白。

把从上述步骤中获得的各个样品用液质联用仪分析，并用数据库搜索软件(如Proteome Discoverer、MaxQuant、Mascot、Phenyx、OMSSA等)针对相应的蛋白数据库UniProt进行搜索获得多肽和蛋白序列，并按蛋白理论分子量及其在胶中的位置排列。

10.类泛素修饰蛋白底物的确证。

把从质谱获得的实验样品中的蛋白与对照样品中获得的蛋白进行比对，获得实验样品中不同的蛋白，这些蛋白为可能的类泛素修饰底物。

根据这些蛋白的理论分子量和在实验样品中与E2-Ubl共价结合后的分子量差异情况确定是否是类泛素修饰蛋白的底物。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过表达类泛素修饰结合酶和类泛素修饰蛋白(E2-Ubl)的融合蛋白来提高类泛素修饰蛋白对底物蛋白的修饰程度，并通过亲和层析提高对底物蛋白的分离效率，对比修饰底物被修饰后分子量增加可更可靠地确证类泛素修饰蛋白的底物。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。

附图说明

图1为本发明实验技术路线流程图。

图2为FLAG-Ufc1-Ufm1融合基因表达质粒示意图。

图3为FLAG抗体免疫印迹实验结果。

图4为亲和纯化对照(表达对照质粒)和实验样品(表达FLAG-Ufc1-Ufm1质粒)后获得的样品的银染实验结果。

图5为对照和实验样品中获得的蛋白质分布图(维恩图)。

图6为代表性Ufm1修饰底物氨基酸序列和代表性二级质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例：鉴定人源类泛素修饰蛋白Ufm1的修饰底物，具体过程见技术流程图(图1)。

1.通过文献获得Ufm1的E2结合酶为Ufc1。

在NCBI核酸数据库中找到人源Ufm1和Ufc1的编码翻译区序列。

NCBI登录号：Ufm1：NM_016617；Ufc1：NM_016406。

2.从人胚胎肾细胞HEK293T中用TRIzol试剂提取RNA。

具体实验过程如下：

用含10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和DMEM高糖完全培养基在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养HEK293T细胞。

在一个10-cm皿HEK293T细胞中加入1mL TRIzol试剂，用吸头反复抽吸充分裂解细胞，移至1.5mL离心管，室温孵育5分钟。

每1mL TRIzol试剂加入0.2mL氯仿，激烈摇动试管15秒，室温孵育2-3分钟，12,000g 4℃离心15分钟。

离心后，将上层水相转移到新的离心管中，每1mL的TRIzol试剂加入0.5mL异丙醇，室温孵育10分钟，12,000g 4℃离心10分钟。

弃去上清后，用1mL 75％乙醇洗涤RNA一次，涡旋混合，7,500g 4℃离心5分钟，弃去上清。

室温干燥RNA沉淀5分钟，加入DEPC水溶解RNA，在NanoDrop上测定RNA浓度和260/280比值，以确定纯化后RNA的质量，-80℃保存或进行下一步实验。

实验步骤也可参见TRIzol提取试剂盒说明书。

3.从总RNA中合成第一链cDNA。

用第一链合成试剂盒(RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒，Thermo)，也可以使用其他第一链合成试剂盒如III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)。

具体实验过程如下：

用1.5μg上述获得的RNA模板、1μLOligo(dT)₁₈引物，加DEPC水到12μL。

将上述混合物混匀后，在65℃静置5分钟，冰上冷却后离心，再置于冰上，依次加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RibLock^TM RNA酶抑制剂(20U/μL)、2μL 10mM dNTP Mix、1μLRevertAid^TM M-MuLV逆转录酶(200U/μL)。

轻轻混匀，离心，42℃孵育60分钟；70℃孵育5分钟，终止反应，反应产物可直接用于PCR反应或置于-80℃保存。

实验步骤也可参见第一链合成试剂盒说明书。

4.通过Ufm1和Ufc1的编码区序列设计扩增两种基因的引物。

从引物合成公司(金唯智生物科技有限公司)订购Ufm1和Ufc1的扩增引物。

Ufm1扩增引物序列为：

正向引物

5’AACTCGAGATGTCGAAGGTTTCCTTTAAGATC 3’；(SEQ ID:1)

逆向引物

5’TCGGATCCTTAACAACTTCCAACACGATCTC 3’。(SEQ ID:2)

Ufc1扩增引物序列为：

正向引物

5’CTTGCGGCCGCGAATTCAATGGCGGATGAAGCCAC 3’；(SEQ ID:3)逆向引物

5’AGTTTTTGTTCGGATCCTCATTGGTTGCATTTCTCTTTG 3’。(SEQ ID:4)

5.用聚合酶链式反应扩增Ufc1和Ufm1基因片段。

PCR反应体系如下：

1μL cDNA文库，1μL正向引物(10μM)，1μL反向引物(10μM)，1μL dNTP(10mM)，聚合酶链反应缓冲液5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，加双蒸水到50μL。

PCR反应在60℃退火30秒、72℃延伸2分钟/kb。循环35次。

或参照所用PCR试剂盒说明书。

6.在融合基因的5’端引入带FLAG亲和标签的序列。

载体双酶切后与PCR扩增产物通过同源重组方式获得融合基因表达质粒，具体实验步骤参见试剂盒(无缝拼接基因克隆试剂盒，全式金生物技术有限公司)。

质粒示意图见图2。

转化后摇菌、提取质粒、酶切验证、测序获得正确质粒。

7.在HEK293T细胞中用聚乙烯亚胺(Sigma)方法转染对照质粒和带FLAG标签的融合基因表达质粒。

每种质粒转染前一天传代的20个10cm皿的HEK293T细胞，每个皿转染10μg质粒。

转染6小时后换液，48小时后，用冰PBS清洗细胞两次后分别收集转染不同质粒的细胞，用细胞裂解缓冲液裂解细胞，获得全裂解液。

细胞裂解缓冲液组成为：150mM Tris-HCl pH 7.2,150mM NaCl,1％Triton X-100,0.1％SDS,1mM EDTA)并含有新加入的蛋白酶抑制剂(Roche)。

8.用FLAG M2Affi-gel树脂(Sigma)亲和纯化富集有FLAG-Ufc1-Ufm1修饰的底物蛋白。

分别对对照样品(表达对照质粒)和实验样品(表达带标签的融合蛋白)进行纯化、富集类泛素修饰蛋白底物。

纯化步骤为：

用pH 2.5的0.1M甘氨酸快速洗涤200μL FLAG M2树脂以除去非共价结合的FLAG抗体

用细胞裂解液洗涤FLAG M2树脂使其pH回复到7.2。

加入全蛋白裂解液后在4℃孵育6小时，用含0.3M NaCl的细胞裂解缓冲液洗涤FLAG树脂6次，每次在四维旋转仪上旋转混合7分钟，500g低速离心后弃去上清液。

最后用200μg/mL的FLAG多肽(DYKDDDDK，上海强耀生物科技有限公司)室温洗脱FLAG融合蛋白和Ufm1修饰的底物，重复洗脱一次后合并洗脱液。

9.用少量样品(5μL)跑十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转膜后，用FLAG抗体做蛋白质免疫印迹实验，图3为验证纯化结果：

样品1和2分别为对照样品和实验样品。

各个组分为蛋白纯化前、纯化过程中和纯化后得到的细胞裂解液、上清液、第六次洗涤后的洗涤液、蛋白洗脱液。黑色实心五角星是FLAG-Ufc1-Ufm1融合蛋白条带，红色空心五角星为特异性修饰底物条带。

结果显示对照样品中没有检测到任何修饰蛋白，而实验样品中同时检测到了FLAG-Ufc1-Ufm1融合蛋白和多个高分子量的修饰蛋白修饰后的底物。

10.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离类泛素修饰蛋白底物和胰蛋白酶酶解纯化的底物蛋白。

把在对照样品和实验样品中纯化富集后的蛋白跑SDS-PAGE分离，用银染显色(图4)，具体步骤依次为：

把FLAG-Ufc1-Ufm1分子量(35kDa)以上的蛋白条带用手术刀按分子量大小分多个条带依次切下，并记录条带分子量范围；

把胶条切成1mm×1mm胶块，把蛋白胶块用30mM K₃Fe(CN)₆和100mM Na₂S₂O₃的1:1混合液脱色、洗涤真空脱水；

用10mM二硫苏糖醇在50℃还原30分钟；

用50mM的氯乙酰胺烷基化半胱氨酸，洗涤脱水；

用12.5μg/μL的胰蛋白酶(溶解在50mM的碳酸氢铵溶液中)在37℃酶切16小时；

用50％乙腈(含1％甲酸)从胶中提取多肽，真空旋转浓缩；

用C18树脂纯化。

结果显示：

黑色实心五角星是FLAG-Ufc1-Ufm1融合蛋白条带，黑色空心五角星为特异性修饰底物条带。结果显示实验样品中得到了多条在对照样品中没有的条带，这些条带为Ufm1修饰的蛋白。

11.质谱鉴定。

把从上一步获得的多肽样品分别用液质联用质谱仪进行检测。

液相多肽分离溶剂A含0.1％的甲酸，溶剂B含80％乙腈和0.1％甲酸，在120分钟内从6％的溶剂B到44％的溶剂B对多肽混合物进行分析。

我们使用的是Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)，其他类型的液质联用质谱仪也可以使用。

最后检测到的多肽和蛋白的数量与质谱仪的灵敏度和实验参数设置密切相关。

12.用数据库搜索软件Proteome Discoverer 1.4(Thermo Scientific)搜索人源蛋白数据库；

搜索参数设置为：半胱氨酸烷基化为固定修饰，甲硫氨酸氧化为可变修饰，多肽母离子最大容忍误差为10ppm，多肽碎片离子最大容忍误差为0.6Da。

搜索后获得多肽和蛋白序列及名称，并按蛋白分子量及其在胶中的位置排列。

13.Ufm1修饰蛋白底物的确证。

把从由质谱获得的实验样品中与对照样品中不同的蛋白列表，并根据数据中与FLAG-Ufc1-Ufm1共价结合后的分子量差异确证类泛素修饰蛋白。

由对照和实验样品中获得的蛋白质分布见图5，把图4中的两条胶按分子量大小切成多个胶条，胰蛋白酶酶切、提取和纯化多肽后，用质谱分析样品后鉴定到的蛋白在对照样品和实验样品中的分布图。

结果发现有97个蛋白是在实验样品中所特有的。

图6为通过以上方法鉴定到的一个Ufm1修饰蛋白底物氨基酸序列覆盖图和典型二级质谱图。

底物氨基酸序列覆盖图中绿色标记的多肽为质谱中鉴定到的底物蛋白的多肽。在实验中总共鉴定到了13个多肽(其中两个多肽前后连在一起)。图6是其中一个多肽的二级质谱图，检测到的碎片离子的m/z和离子归属均显示在图中。

表1为用本发明鉴定的Ufm1修饰蛋白底物列表。

根据检测后对照样品中特有的蛋白的分子量大小获得Ufm1修饰的底物。表中给出了鉴定到的蛋白的UniProt登陆号、蛋白名称、氨基酸序列覆盖率、检测到的多肽及其次数、理论分子量、理论等电点和在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中位置的分子量范围。

表1为鉴定获得的蛋白列表

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种类泛素修饰蛋白Ufm1底物鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建类泛素修饰蛋白Ufm1的E2结合酶Ufc1与类泛素修饰蛋白Ufm1融合基因表达质粒，所述融合基因表达质粒5’端引入一个带亲和标签的核苷酸序列；

（2）转染融合基因表达质粒到真核细胞，收集该真核细胞并用细胞裂解缓冲液裂解，获得全蛋白裂解液；每种质粒转染10~20个10-cm皿贴壁细胞，每个皿转染10 μg质粒；

（3）采用亲和树脂从上述全蛋白裂解液中纯化富集类泛素修饰蛋白Ufm1底物：

首先用pH 2.5的0.1 M甘氨酸溶液快速洗涤200 μL亲和树脂以除去非共价结合的亲和标签抗体，并用细胞裂解液洗涤亲和树脂使其pH回复到7.2，然后加入全蛋白裂解液后在4℃孵育6小时；再用200 μg/mL的亲和标签抗体多肽室温洗脱带亲和标签的融合蛋白和类泛素修饰蛋白Ufm1底物，重复洗脱一次后合并洗脱液；

（4）采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对经上述纯化富集所得的类泛素修饰蛋白Ufm1底物进行分离，并对分离所得不同分子量的蛋白条带进行酶切反应，并提取纯化底物多肽；

（5）质谱分析修饰蛋白底物多肽；

（6）搜索蛋白数据库获得多肽与蛋白序列，根据对照样品和修饰底物的分子量差异确证类泛素修饰蛋白Ufm1底物。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（1）所述的融合基因表达质粒构建步骤依次为：

（a）用TRIzol试剂从目标细胞中提取总RNA；

（b）从总RNA中合成第一链cDNA；

（c）通过类泛素修饰结合酶Ufc1和类泛素修饰蛋白Ufm1的编码区序列设计类泛素修饰结合酶Ufc1与类泛素修饰蛋白Ufm1基因的引物序列，并通过PCR扩增该类泛素结合酶Ufc1和类泛素修饰蛋白Ufm1的基因片段；

（d）双酶切PCR产物和质粒载体并纯化后，通过T4 DNA连接酶或同源重组的方式获得带亲和标签的融合基因表达质粒。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（3）采用亲和树脂从上述全蛋白裂解液中纯化富集类泛素修饰蛋白Ufm1底物步骤还包括

在孵育后用含0.3 M NaCl的细胞裂解缓冲液洗涤亲和树脂6次，每次在四维旋转仪上旋转混合7分钟，500 g低速离心后弃去上清液的步骤。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中根据不同细胞转染的难易程度, 所用转染试剂为磷酸钙、聚乙烯亚胺、脂质体或FuGene染试剂之一。

5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中转染6小时后换液，48小时后，用冰PBS清洗细胞两次后分别收集转染带亲和标签的融合基因表达质粒和对照质粒的细胞。

6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述细胞裂解缓冲液的成分包含，150mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100，0.1% SDS，1 mM EDTA，蛋白酶抑制剂。

7.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（4）利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳把在对照样品和实验样品中纯化富集的类泛素修饰蛋白Ufm1底物分离，用银染对对照样品和实验样品中蛋白染色，把Ufc1-Ufm1分子量以上的蛋白条带用手术刀按分子量大小分多个条带依次切下并记录条带位置分子量，用胶内酶解的方法把蛋白胶条分别脱色、还原烷基化、胰蛋白酶酶切，并从胶中提取多肽，用C18树脂纯化。

8.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤（5）采用液质联用质谱仪进行检测，液相多肽分离溶剂A含0.1%的甲酸，溶剂B含80%乙腈和0.1%甲酸，在120分钟内从6%的溶剂B到44%的溶剂B对多肽混合物进行分析。

9.根据权利要求1所述的鉴定方法, 其特征在于：步骤（6）用数据库搜索软件针对相应的数据库进行搜索获得多肽和蛋白序列，并按蛋白理论分子量及其在电泳胶中的位置进行排列。

10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于：用数据库搜索软件搜索蛋白数据库，搜索参数设置为：半胱氨酸烷基化为固定修饰，甲硫氨酸氧化为可变修饰，多肽母离子最大容忍误差为10 ppm，多肽碎片离子最大容忍误差为0.6 Da，搜索后获得多肽和蛋白序列及名称，并按蛋白分子量及其在胶中的位置排列。

11.根据权利要求1-10任一所述的鉴定方法，其特征在于：所述的亲和标签是FLAG标签、Strep标签、His标签、HA标签、Myc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签中的一种。

12.根据权利要求1-10任一所述的鉴定方法, 其特征在于：所述对照样品为带有亲和标签的质粒载体。