CN111693715A - 一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用 - Google Patents

一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用，本方法使用生物素标记的UTP(Biotin‑16‑UTP)为原料，在单磷酸尿苷酸转移酶SelO作用下，先将总线粒体蛋白进行UMP化修饰反应，被UMP化修饰的蛋白同时也带有生物素标记。后续使用生物素‑链酶亲和素Pull‑down技术将发生修饰的蛋白筛选出来，最后通过质谱确定修饰蛋白及修饰位点。本发明开发出一种简单可行的实验方法，从线粒体总蛋白中筛选出可被UMP化修饰的蛋白，为SelO蛋白及线粒体内翻译后修饰介导的信号转导提供重要的研究手段。

Description

一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地说，是涉及一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。
背景技术
线粒体是真核生物特有的细胞器，其在细胞能量代谢、信号转导、细胞存亡调控中发挥重要作用，人类很多疾病都与线粒体异常有关，目前线粒体内信号转导过程还不完全被人类掌握。
SelO(Seleno O,硒蛋白O)是一种含硒蛋白，其具有线粒体定位序列，合成后存在于线粒体中。在硒缺乏的条件下，SelO蛋白的合成优先于其他硒蛋白。肿瘤组织中SelO的表达量显著低于正常组织。而且SelO高表达还是多种恶性肿瘤(如尿路上皮癌、胃癌等)较好预后的评价指标，SelO蛋白具有潜在的抑癌功能，还与软骨细胞的发育、痤疮形成等过程密切相关。SelO及同家族的蛋白均可在体外可催化自身发生单磷酸尿苷酸化修饰，说明其通过介导蛋白的单磷酸尿苷酸化修饰发挥作用。而目前真核生物中，SelO催化的单磷酸尿苷酸化修饰的底物还没有被找到，极大地限制了SelO蛋白与线粒体信号转导研究进展。因此需要一种能有效解决上述问题的线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明包括以下步骤：
A通过细胞培养线粒体总蛋白后进行提取与裂解操作后获得总线粒体蛋白；
B对所述总线粒体蛋白脱盐柱处理后进行UMP化修饰反应后得到Biotn-UMP标记蛋白；
C对所述Biotn-UMP标记蛋白进行筛选后；
D所述Biotn-UMP标记蛋白通过色谱鉴定筛选确定修饰蛋白及修饰位点。
进一步地，所述筛选方法采用使用生物素-链酶亲和素Pull-down技术，生物素与琏酶亲和磁珠反应温度为25℃-30℃时间为10-20min。洗脱前需要使用洗涤液洗涤2次，洗涤液成分为：25mM Tris pH7.5,200mM NaCl。洗脱液成分为为pH 2.5的8M尿素。
进一步地，所述质谱鉴定包括所述Biotn-UMP标记蛋白在洗脱液使用12％的SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或银染后，切胶进行质谱鉴定。
进一步地，所述反应体系如下：
SelO蛋白 10μl
线粒体总蛋白 100μl
Biotin-16-UTP 10μl(反应终浓度0.5mM/L)
10×反应缓冲液 20μl
ddH2O 60μl
反应体系总共 200μl
所述反应体系中UMP化修饰反应温度为30℃，反应时间为2h以上；反应后需要加入EDTA(0.5M)终止反应；加入上样缓冲液后，进行SDS-PAGE电泳；电泳时保持20℃-35。
进一步地，所述修饰反应用到的生物素标记的UMP供体Biotin-16-UTP的分子结构如下所示：
Figure BDA0002542870850000031
进一步地，所述电泳温度为5-10℃，电泳时间为4～6小时,所述电泳恒压180V或恒流为45mA。
进一步地，所述反应体系的反应缓冲液成分：25mM Tris-Hcl pH7.5,100mM NaCl,3mM DTT,5mM MnCl2，可以使用MgCl2.取代MnCl2.，但修饰效率有所下降。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开发出一种简单可行的实验方法，从线粒体总蛋白中筛选出可被UMP化修饰的蛋白，为SelO蛋白及线粒体内翻译后修饰介导的信号转导提供重要的研究手段。
附图说明
图1为本发明的反应流程图；
图2为实施例子中的筛选出的UMP化修饰蛋白SDS电泳结果；
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
本发明包括以下步骤：
A通过细胞培养线粒体总蛋白后进行提取与裂解操作后获得总线粒体蛋白；
B对所述总线粒体蛋白脱盐柱处理后进行UMP化修饰反应后得到Biotn-UMP标记蛋白；
C对Biotn-UMP标记蛋白进行筛选后；
D所述Biotn-UMP标记蛋白通过色谱鉴定筛选确定修饰蛋白及修饰位点。
所述质谱鉴定包括所述Biotn-UMP标记蛋白在洗脱液使用12％的SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或银染后，切胶进行质谱鉴定。
在本实施例子中选用人源SelO蛋白，采用基因工程的方法构建SelO 21aa-663aa蛋白的原核表达质粒，使用大肠杆菌Bl21菌株进行蛋白的表达和纯化。蛋白序列如下：
GRCSPSPAPRSTLSGAAMEPAPRWLAGLRFDNRALRALPVEAPPPGPEGAPSAPRPVPGACFTRVQPTPLRQPRLVALSEPALALLGLGAPPAREAEAEAALFFSGNALLPGAEPAAHCYCGHQFGQFAGQLGDGAAMYLGEVCTATGERWELQLKGAGPTPFSRQADGRKVLRSSIREFLCSEAMFHLGVPTTRAGACVTSESTVVRDVFYDGNPKYEQCTVVLRVASTFIRFGSFEIFKSADEHTGRAGPSVGRNDIRVQLLDYVISSFYPEIQAAHASDSVQRNAAFFREVTRRTARMVAEWQCVGFCHGVLNTDNMSILGLTIDYGPFGFLDRYDPDHVCNASDNTGRYAYSKQPEVCRWNLRKLAEALQPELPLELGEAILAEEFDAEFQRHYLQKMRRKLGLVQVELEEDGALVSKLLETMHLTGADFTNTFYLLSSFPVELESPGLAEFLARLMEQCASLEELRLAFRPQMDPRQLSMMLMLAQSNPQLFALMGTRAGIARELERVEQQSRLEQLSAAELQSRNQGHWADWLQAYRARLDKDLEGAGDAAAWQAEHVRVMHANNPKYVLRNYIAQNAIEAAERGDFSEVRRVLKLLETPYHCEAGAATDAEATEADGADGRQRSYSSKPPLWAAEL
选择优先选择线粒体含量丰富的肝脏来源细胞作为线粒体来源，本实验从小鼠肝脏中提取的线粒体，线粒体提取可使用商品化试剂盒，防止细胞质蛋白污染。
纯化获得线粒体后需要进行质谱鉴定，确定是否为完全的线粒体蛋白，是否含有细胞质蛋白的污染。确定线粒体纯度后，将线粒体裂解备用。
线粒体裂解后，需要使用脱盐柱处理线粒体总蛋白，去除裂解液中可能对酶活产生影响的成分。
在本实施例子中，修饰反应用到的生物素标记的UMP供体为Biotin-16-UTP，体外UMP化修饰反应缓冲液为反应缓冲液成分：25mM Tris-Hcl pH7.5,100mM NaCl,3mM DTT,5mM MnCl2.使用生物素标记的UTP(Biotin-16-UTP)为原料，如图1所示，在单磷酸尿苷酸转移酶SelO作用下，先将总线粒体蛋白进行UMP化修饰反应，被UMP化修饰的蛋白同时也带有生物素标记。后续使用生物素-链酶亲和素Pull-down技术将发生修饰的蛋白筛选出来，最后通过质谱确定修饰蛋白及修饰位点，切取清晰的电泳条带，加入胰蛋白酶进行胶内酶解。脱盐后进行LC-MS/MS质谱分析。得到的质谱数据用Mascot软件在NCBInr数据库内进行检索获得。搜索修饰设定为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸UMP化(C9H11N2O9P,306.25Da)。所有修饰位点需要经人工检索图谱确定。
反应体系如下：
SelO蛋白 10μl(约0.5μM)
线粒体总蛋白 100μl(约10μM)
Biotin-16-UTP 10μl(终浓度0.5mM/L)
10×反应缓冲液 20μl
ddH2O 60μl
总 200μl
所述反应体系中UMP化修饰反应温度为30℃，反应时间为2h以上；反应后需要加入EDTA(0.5M)终止反应；加入上样缓冲液后，进行SDS-PAGE电泳；电泳时保持20℃-35。
将SelO蛋白及线粒体蛋白与反应缓冲液混匀后，加入Biotin-16-UTP，30℃反应2小时,所述反应体系的反应缓冲液成分：25mM Tris-Hcl pH7.5,100mM NaCl,3mM DTT,5mMMnCl2。
在本实施例子中，所述筛选方法采用使用生物素-链酶亲和素Pull-down技术。洗脱条件为，8M尿素(pH 2.5)，生物素与琏酶亲和磁珠反应温度为室温(25℃)时间为10min。洗脱前需要使用洗涤液洗涤2次，洗涤液成分为：25mM Tris pH7.5,200mM NaCl。洗脱液成分为：8M尿素(pH 2.5)。
200μl反应样品加入到40μl琏酶亲和素凝胶中，混匀，室温孵育10min。未反应的100μl线粒体蛋白40μl琏酶亲和素凝胶中混匀，室温孵育10min，作为阴性对照。反应完离心去上清，用洗涤缓冲液洗涤两次，洗脱缓冲液洗脱。
洗涤缓冲液成分：25mM Tris pH7.5,200mM NaCl
洗脱缓冲液成分：8M尿素(pH2.5)
蛋白电泳及质谱鉴定，洗脱液使用12％的SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色(或银染)后，选取修饰反应样品中存在但阴性对照中不存在的中清晰的条带，切胶进行质谱鉴定。鉴定结果的即为发生UMP化修饰的蛋白。
实验结果
使用如上所述实验方法进行实验，SelO催化线粒体蛋白的UMP化修饰的体外反应后通生物素-链酶亲和素Pull-down筛选，洗脱液进行蛋白SDS电泳，结果如图2所示，结果显示线粒体中有很多蛋白能被SelO催化UMP化修饰，30kD,60kD,70kD及120kD左右有明显的蛋白条带，下表为筛选出的部分UMP化修饰的线粒体蛋白列表，通过质谱确定20余种线粒体蛋白存在UMP化修饰。说明本方法可行。
Figure BDA0002542870850000071
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
A通过细胞培养线粒体总蛋白后进行提取与裂解操作后获得总线粒体蛋白；
B对所述总线粒体蛋白脱盐柱处理后进行UMP化修饰反应后得到Biotn-UMP标记蛋白；
C对所述Biotn-UMP标记蛋白进行筛选；
D所述Biotn-UMP标记蛋白通过色谱鉴定筛选确定修饰蛋白及修饰位点。
2.根据权利要求1所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法采用使用生物素-链酶亲和素Pull-down技术，生物素与琏酶亲和磁珠反应温度为25℃-30℃时间为10-20min。洗脱前需要使用洗涤液洗涤2次，洗涤液成分为：25mM Tris pH7.5,200mM NaCl。洗脱液成分为为pH 2.5的8M尿素。
3.根据权利要求1所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于，所述质谱鉴定包括所述Biotn-UMP标记蛋白在洗脱液使用12％的SDS-PAGE凝胶电泳以及考马斯亮蓝染色或银染后，切胶进行质谱鉴定。
4.根据权利要求1所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于，所述修饰反应的反应体系如下：
SelO蛋白 10μl
线粒体总蛋白 100μl
Biotin-16-UTP 10μl
10×反应缓冲液 20μl
ddH2O 60μl
反应体系总共200μl
所述反应体系中UMP化修饰反应温度为30℃，反应时间为2h以上；反应后需要加入EDTA终止反应；加入上样缓冲液后，进行SDS-PAGE电泳；电泳时保持20℃-35。
5.根据权利要求4所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于，所述修饰反应用到的生物素标记的UMP供体Biotin-16-UTP的分子结构如下所示：
Figure FDA0002542870840000021
6.如权利要求1所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于：所述电泳温度为5-10℃，电泳时间为4～6小时,所述电泳恒压180V或恒流为45mA。
7.如权利要求4所述的一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法，其特征在于：所述反应体系的反应缓冲液成分：25mM Tris-Hcl pH7.5,100mM NaCl,3mM DTT,1-5mMMnCl2。
8.如权利要求1-7中任一项所述的线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法筛选得到的修饰蛋白及修饰位点的应用。
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