CN115144509A - 一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法 - Google Patents

一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种地夸磷索四钠中间体5’‑尿苷酸二钠的质量控制方法，步骤如下：取5’‑尿苷酸二钠样品进行溶解，制成5’‑尿苷酸二钠溶液；取5’‑尿苷酸二钠溶液利用HPLC进行有关物质检查，色谱条件为：色谱柱：纯水耐受型C18色谱柱，规格为4.6×150mm，3μm；流动相：以20‑60mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱中流动相B的最高比例为40%~60%；流速为0.4ml/min~0.7ml/min；柱温为20℃~30℃；检测波长为262nm；进样量为10μl~30μl。本发明方法能够分析多种有关物质且分离度良好，可以用于5’‑尿苷酸二钠的常规分析和质量控制。

Description

一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法。
背景技术
5’-尿苷酸二钠又叫5'-尿苷一磷酸,二钠盐或尿苷磷酸二钠盐等，具有以下化学结构式。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
5’-尿苷酸二钠可用于制备保健食品和生化试剂，重要的是其可作为生产核酸类药物的重要中间体，尤其是地夸磷索四钠，在治疗多种重大的疾病方面起着重要的作用。
5’-尿苷酸二钠中可能包括来源于起始原料、中间体、工艺杂质、副产物、降解杂质等多种作为杂质的有关物质（包括7种杂质，详见有关物质中杂质汇总表），为保证5’-尿苷酸二钠的质量，有必要对产品中的有关物质进行定性和定量分析。
有关物质中杂质汇总表
Figure 508084DEST_PATH_IMAGE002
目前，用于5’-尿苷酸二钠的有关物质检查的方法，包括薄层色谱法和高效液相色谱法（等度方法）。
食品营养强化剂5’-尿苷酸二钠食品安全国家标准（GB 1886.82-2015），采用薄层色谱法对其他核酸进行检查，检测方法如下：“称取0.10g试样，加水溶解并配制成20ml，作为检测液，量取检测液1μl，不用对照液，以乙醇-乙二醇-甲醚-盐酸（1→10）的混合液（2:2:1）作为展开剂，进行薄层色谱分析。采用预先在60℃～80℃干燥20min，以薄层色谱用硅胶（掺入荧光剂）作为载体的薄层板，当展开溶剂顶端由原线上升约10cm高时停止展开，风干后在暗处，紫外线（波长约250nm）下观察，只应看出有一个斑点。”该方法对核酸类杂质检查，仅能进行限度检查，且无法针对每个杂质进行定性和定量分析。
食品添加剂5’-尿苷酸二钠标准（食品化学法典FCC 12），采用高效液相色谱法对其有关物质进行检查，采用等度方法，其中个别杂质（如腺苷酸）出峰时间很晚（保留时间约为5’-尿苷酸二钠的20倍），耗时较长。
因此，建立一种更为简单、高效的检测5’-尿苷酸二钠产品的方法，以对5’-尿苷酸二钠的质量进行更好的控制具有重要意义。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法。
本发明是采用以下技术方案得以实现的。
一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法，包括以下步骤：
S1.取5’-尿苷酸二钠样品进行溶解，制成5’-尿苷酸二钠溶液；
S2.取步骤S1的5’-尿苷酸二钠溶液利用HPLC进行有关物质检查，色谱条件为：
色谱柱：纯水耐受型C18色谱柱，规格为4 .6×150mm，3μm；
流动相：以20-60mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱中流动相B的最高比例为40%~60%；
流速为0.4ml/min ~0.7ml/min；
柱温为20℃~30℃；
检测波长为262nm；
进样量为10μl~30μl。
优选的，色谱条件为：
色谱柱：Tskgel ODS-100V C18色谱柱，规格为4 .6×150mm，3μm；
流动相：以50mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱中流动相B的最高比例为50%；
梯度洗脱程序为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
流速为0.5ml/min；
柱温为25℃；
检测波长为262nm；
进样量为20μl。
更优选的，增设鬼峰捕集柱来消除溶剂及梯度变化峰的干扰进行检测。
本申请具有以下有益效果。
本发明方法可以将5’-尿苷酸二钠与相邻的杂质、以及各个杂质达到有效分离，能准确测定杂质，且分离度高，有效地解决了5’-尿苷酸二钠及其有关物质分离和检测困难的问题，从而保证了5’-尿苷酸二钠的质量可控。相比于现有的方法，本发明的检测方法分离效果好，灵敏度高，准确度好，能更全面对样品中各个杂质进行定性定量检测。
附图说明
图1为实施例1中5’-尿苷酸二钠与7种有关物质的混合溶液色谱图；
图2为实施例2中5’-尿苷酸二钠与7种有关物质的混合溶液色谱图；
图3为实施例3中5’-尿苷酸二钠与7种有关物质的混合溶液色谱图；
图4为实施例4中5’-尿苷酸二钠与7种有关物质的混合溶液色谱图；
图5为实施例5中50mM浓度缓冲盐溶液-混合溶液色谱图（流速0.5ml/min、柱温25℃）；
图6为实施例5中10mM浓度缓冲盐溶液-混合溶液色谱图；
图7为实施例5中20mM浓度缓冲盐溶液-混合溶液色谱图；
图8为实施例5中60mM浓度缓冲盐溶液-混合溶液色谱图；
图9为实施例5中柱温(20℃)-混合溶液色谱图；
图10为实施例5中柱温(30℃)-混合溶液色谱图；
图11为实施例5中流速（0.4ml/min）-混合溶液色谱图；
图12为实施例5中流速（0.6ml/min）-混合溶液色谱图；
图13为实施例5中流速（0.7ml/min）-混合溶液色谱图；
图14为实施例5中最高有机相比例（40%）-混合溶液色谱图；
图15为实施例5中最高有机相比例（60%）-混合溶液色谱图；
图16为实施例5中更换色谱柱（AQ柱）-混合溶液色谱图；
图17为实施例5中增加捕集柱-混合溶液色谱图（最优条件）；
图18为实施例6中有关物质杂质定量限(CMP-2Na、URD)色谱图；
图19为实施例6中有关物质杂质定量限(GMP-2Na、CMP、AMP-2Na、GMP和AMP)和检测限（CMP-2Na、URD）色谱图；
图20为实施例6有关物质杂质检测限(GMP-2Na、CMP、AMP-2Na、GMP和AMP)色谱图；
图21为实施例6中5’-尿苷酸二钠50%水平加样溶液色谱图；
图22为实施例6中5’-尿苷酸二钠100%水平加样溶液色谱图；
图23为实施例6中5’-尿苷酸二钠150%水平加样溶液色谱图；
图24为对比例1中5’-尿苷酸二钠供试品溶液色谱图；
图25为对比例2中5’-尿苷酸二钠与7种有关物质的混合溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
以下实施例和对比例中，所使用的药品、试剂及仪器如下：
仪器设备：高效液相色谱仪(U3000，ThermoFisher)；二极管阵列检测器(LC-20A，日本岛津公司)；电子天平(XPR205，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、电子天平(MSX(SGEA)，赛多利斯公司)、pH计(S400-K，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；
色谱柱：GLSciences Inertsil ODS-2 C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)(GLSciences有限公司)；Capcell PakADME色谱柱(4.6×250mm，3μm) (资生堂)；TskgelODS-100V C18色谱柱(4.6×150mm，3μm) (东曹)；月旭µltimate AQ-C18色谱柱(4 .6×250mm，5μm) (月旭公司)；鬼峰捕集柱：Ghost-Sniper Column(4.0×30mm)，色谱先生；
试剂：甲醇(色谱纯，lot#213382，fisher)；磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水（超纯水，自制）；
对照品信息：
尿苷(批号：110887-202104，来源：中国食品药品检定研究院)；
胞苷5’-单磷酸二钠盐(批号：CLW445，来源：毕得医药)；
胞苷 (批号：96DRPD6R，来源：安耐吉化学)；
腺苷5’-单磷酸二钠盐（批号：91EHQRMQ，来源：安耐吉化学）；
腺苷（批号：110879-201703，来源：中国食品药品检定研究院）；
鸟苷5’-单磷酸二钠盐（批号：9NDXHRUN，来源：安耐吉化学）；
鸟苷（批号：111977-201501，来源：中国食品药品检定研究院）；
样品信息：
5’-尿苷酸二钠样品（批号：623210511，来源：杭州美亚药业海安有限公司）。
实施例1
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：Capcell PakADME色谱柱(4.6×250mm，3μm)；
流动相：50mmol/L磷酸二氢钾溶液；
波长：262nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约100mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液1ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图1。由图1中可见，采用该方法检测5’-尿苷酸二钠有关物质，杂质CMP和GMP-2Na出峰可以分离；主峰前杂质CMP-2Na与样品中的未知杂质峰也可以分离；等度洗脱下65分钟内杂质未能完全出峰，故尝试增加有机相并进行梯度洗脱。
实施例2
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：Capcell PakADME色谱柱(4.6×250mm，3μm)；
流动相A：50mmol/L磷酸二氢钾；流动相B：甲醇；
洗脱梯度如下表：
Figure 487541DEST_PATH_IMAGE004
波长：262nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约100mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液1ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，分别精密量取各杂质对照品溶液和混合溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图2。由图2中可知，采用该方法检测5’-尿苷酸二钠有关物质，各杂质和主峰间分离良好，峰型良好，7个杂质均在40min前出峰，可继续优化梯度，缩短分析时间。
各杂质及样品出峰时间如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例3
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：Capcell PakADME色谱柱(4.6×250mm，3μm)；
流动相A：50mmol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：甲醇；
洗脱梯度如下表：
Figure 532857DEST_PATH_IMAGE006
波长：262nm；
流速：0.7ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约100mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液1ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图3。由图3中可见，优化梯度后，与实施例2相比，分析时间缩短，基线更加平稳；7个杂质均能在35min前洗脱出峰，杂质和主峰间分离良好，峰型良好；考察7个杂质和5’-尿苷酸二钠全波长吸收情况，发现各杂质和5’-尿苷酸二钠最大吸收波长均在260nm附近，其中5’-尿苷酸二钠最大吸收波长是261.94nm，参照文献报道方法，故选择262nm作为检测波长。各杂质及样品出峰时间和最大吸收波长如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
因该色谱条件下，使用时色谱柱柱压较高，故尝试考察其他色谱柱的耐用性。
实施例4
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：Tskgel ODS-100V C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)
流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：甲醇；
洗脱梯度如下表：
Figure 787121DEST_PATH_IMAGE008
波长：262nm；
流速：0.7ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液0.2ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图4。由图4中可见，更换色谱柱，降低盐浓度后，基线更加平稳，主峰及7个杂质峰峰型良好，出峰时间提前，7个杂质和主峰间分离度满足要求，该色谱柱与Capcell PakADME色谱柱相比，压力较低，基线较好，分离效果良好，故适用于5’-尿苷酸二钠有关物质检测。个别未知杂质刚好达到基线分离（分离度R为1.69），为更好提高分离效果，故继续对该方法进行优化。
实施例5
1 .仪器与条件
色谱条件：色谱柱：Tskgel ODS-100V C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)
流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：甲醇；
洗脱梯度如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
波长：262nm；
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液0.2ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图5。由图5中可见，与实施例4相比，降低流速后，主峰前未知杂质分离略有改善（分离度R为1.96），可以满足分离要求。该条件下方法分离效果好，杂质检出完全，适用于5’-尿苷酸二钠有关物质检测。考察本方法的耐用性范围。
2.方法参数耐用范围考察
从流动相缓冲盐浓度、柱温、流速和最高有机相比例等条件考察该方法耐用性范围：
Figure 663810DEST_PATH_IMAGE010
缓冲盐浓度：范围：10mM-60mM。
依次考察10mM、20mM、50mM和60mM流动相A缓冲盐浓度，发现盐浓度越低，杂质和样品出峰时间越靠前，其中10mM盐浓度杂质和样品出峰时间最早，已知杂质与相邻峰的分离度最小（R为1.54），其他如20mM、50mM和60mM缓冲盐浓度分离效果更好（最小分离度均大于2），均满足检测要求。50mM和60mM盐浓度条件中分离效果基本一致，各杂质峰峰型和响应也基本一致；考虑盐浓度越高，对色谱柱损耗更大，故优选50mM缓冲盐浓度作为流动相A。见图5~图8。
柱温：范围：20℃-30℃。
依次考察20℃、25℃和30℃柱温，柱温越高，出峰时间提前，杂质间分离度变小，但分离均能满足检测要求。与25℃柱温相比，30℃柱温杂质出峰时间早，分离稍差；20℃柱温杂质间分离虽更好，但出峰时间延后，考虑外部环境因素影响，故优选25℃柱温。见图5、图9和图10。
流速：范围：0.4ml/min -0.7ml/min。
依次考察0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min和0.7ml/min流速条件，相同条件下，流速越高，出峰时间越早，杂质间分离度越小。四个流速条件下，各杂质和样品间分离均可以满足要求。优选分离较好，出峰时间适宜的0.5ml/min流速。见图5、图11~图13。
最高有机相比例：范围：40%-60%
依次考察40%、50%和60%最高有机相比例，三个有机相最高比例条件，各杂质和样品间分离均能满足要求。优选分离较好，出峰时间适宜，基线较平稳的50%有机相比例。见图5、图14和图15。
色谱柱：考察其它厂家C18色谱柱，如型号为Ultimate AQ-C18，规格为(4.6×250mm，5μm，发现该条件下，各杂质和样品间分离度良好，满足检测要求。证明更换其他类型纯水耐受性C18色谱柱，该方法仍然适用于5’-尿苷酸二钠有关物质检测。见图16。
鬼峰捕集柱：因为溶剂峰和梯度变化峰可能干扰杂质检测，故使用捕集柱减弱干扰。色谱图中基线明显干净平滑，梯度变化峰和溶剂峰等干扰有明显改善，故优选使用鬼峰捕集柱。见图17。
见图5-图17。通过考察各参数范围，确定最优方法条件：
色谱条件：色谱柱：Tskgel ODS-100V C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)
流动相A：50mmol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：甲醇；
洗脱梯度如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
波长：262nm；
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水。
实施例6
1. 定量限和检测限考察
仪器与条件
色谱条件：同实施例5确定的最优方法条件
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；逐级稀释配制各杂质定量限和检测限溶液。注入液相色谱仪中，记录色谱图。
检测结果：见图18-图20。
各杂质定量限和检测限结果如下：
Figure 551519DEST_PATH_IMAGE012
该方法检测5’-尿苷酸二钠有关物质，各杂质检测限和定量限浓度见上表，按照供试品溶液浓度为0.2mg/ml计，检测限均小于0.005%，灵敏度较高，均满足检测要求。
2. 回收率考察
仪器与条件
色谱条件：同实施例5确定的最优方法条件
操作步骤：考察50%水平、100%水平和150%水平回收率
混合对照品溶液：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品储备溶液；精密量取各杂质对照品储备溶液各2ml，于同一20ml量瓶中，水稀释至刻度，作为混合对照品储备液。再精密量取2ml混合对照品储备液，置于100ml量瓶中，水稀释至刻度，作为混合对照品溶液。
未加样供试品溶液：精密称量5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得到样品溶液。
50%水平加样溶液：精密称量5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml混合对照品储备液于该瓶，加水溶解并稀释至刻度，作为50%水平加样溶液。
100%水平加样溶液：精密称量5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置于100ml量瓶中，精密量取2ml混合对照品储备液于该瓶，加水溶解并稀释至刻度，作为100%水平加样溶液。
150%水平加样溶液：精密称量5’-尿苷酸二钠样品约20mg，置于100ml量瓶中，精密量取3ml混合对照品储备液于该瓶，加水溶解并稀释至刻度，作为150%水平加样溶液。
分别量取对照品溶液、供试品溶液和加样样品溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，计算回收率。
检测结果：见图21~图23。
各水平回收率结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
由上表可知，7个杂质各水平加样回收率均在90%-108%之间，满足要求，证明本申请方法准确度良好。
对比例1
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：GLSciences Inertsil ODS-2 C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)
流动相：0.025mol/L乙酸铵溶液(pH5.5)；
波长：254nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：0.025mol/L乙酸铵溶液(pH5.5)；
操作步骤：精密称取5’-尿苷酸二钠样品约100mg，置50ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂0.025mol/L乙酸铵溶液(pH5.5)稀释至刻度，作为样品溶液，精密20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：样品溶液色谱图见图24。由图24中可见，采用该方法检测5’-尿苷酸二钠峰型较差，峰明显拖尾，对称因子是2.73；因此该方法不适用于5’-尿苷酸二钠有关物质的检测。
对比例2
仪器与条件
色谱条件：色谱柱：GLSciences Inertsil ODS-2 C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：50mmol/L磷酸二氢钾溶液；
波长：262nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
进样量：20µl；
稀释剂：水；
操作步骤：分别精密称取各杂质对照品约2mg，置于20ml量甁中，加水溶解并稀释至刻度，得到各杂质对照品溶液；精密称取5’-尿苷酸二钠样品约100mg，置100ml量甁中，依次加入各杂质对照品溶液1ml于其中，用水稀释至刻度，作为混合溶液，分别精密量取各杂质对照品溶液和混合溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：混合溶液色谱图见图25。由图25中可知，采用该方法检测5’-尿苷酸二钠有关物质，主峰前杂质CMP-2Na与样品中的未知杂质峰出峰重合；CMP和GMP-2Na杂质出峰重合；杂质AMP在60分钟内未能洗脱，因此该方法也不适用于5’-尿苷酸二钠有关物质的检测。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.取5’-尿苷酸二钠样品进行溶解，制成5’-尿苷酸二钠溶液；
S2.取步骤S1的5’-尿苷酸二钠溶液利用HPLC进行有关物质检查，色谱条件为：
色谱柱：纯水耐受型C18色谱柱，规格为4 .6×150mm，3μm；
流动相：以20-60mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱中流动相B的最高比例为40%~60%；
流速为0.4ml/min ~0.7ml/min；
柱温为20℃~30℃；
检测波长为262nm；
进样量为10μl~30μl。
2.根据权利要求1所述的一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法，其特征在于：色谱条件为：
色谱柱：Tskgel ODS-100V C18色谱柱，规格为4 .6×150mm，3μm；
流动相：以50mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱中流动相B的最高比例为50%；
梯度洗脱程序为：
Figure 269390DEST_PATH_IMAGE001
流速为0.5ml/min；
柱温为25℃；
检测波长为262nm；
进样量为20μl。
3.根据权利要求1或2所述的一种地夸磷索四钠中间体5’-尿苷酸二钠的质量控制方法，其特征在于：增设鬼峰捕集柱。
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赵艳 等: "反相离子对高效液相色谱法测定猪肉中呈味核苷酸", 《食品工业科技》 *

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