CN117741022A - 一种硼替佐米中间体中残留杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用气相色谱同时检测硼替佐米关键中间体PPNa中挥发性降解杂质（三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷）与非挥发性降解杂质（乙酰胺）含量的方法。该方法采用固定相为聚乙二醇的毛细管色谱柱，柱温采用特定的梯度升温程序进行气相色谱分析，采用混合溶剂即体积百分含量为50~97%的N,N‑二甲基甲酰胺的水溶液作为溶剂。本发明的检测方法专属性高，空白溶液对测定无干扰，对照品主峰之间最小分离度44.24，远大于1.5。检测灵敏度高，三个降解杂质的检测限均小于供试品限度的0.01%，定量限均小于供试品限度的0.05%。本发明的方法检测准确可靠，三个降解杂质回收率均在90%～108%之间，符合2020版中国药典的规定。本发明解决了硼替佐米关键中间体PPNa中挥发性杂质三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷和非挥发性杂质乙酰胺同时分离及定量测定问题，从而保证了硼替佐米关键中间体PPNa及后续制备的硼替佐米原料药质量可控，保证药品的安全性。

Description

一种硼替佐米中间体中残留杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及合成硼替佐米原料药的中间体中的三种杂质包括乙酰胺、六甲基二硅氧烷和三甲基硅醇的检测方法。

背景技术

硼替佐米是一种癌症治疗药物，是全球第一个合成的蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitor)，可延缓、停止及治疗多发性骨髓瘤和被套细胞淋巴瘤恶化的情况，属于标靶治疗的新型抗癌药，2003年经FDA批准上市，并于2008年6月被美国FDA批准作为多发性骨髓瘤的一线治疗用药。该药物的发现曾获得医药界广泛关注，其作用机理获得2004年度诺贝尔化学奖，2006年获制药界最高荣誉—国际盖伦奖，被誉为“肿瘤治疗的革命，多发性骨髓瘤治疗的重大进步”。

硼替佐米化学名为[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(呲嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，结构式如下：

WO2009004350A1公开了硼替佐米的合成路线：

该合成路线中PPNa是合成硼替佐米的一个重要中间体，PPNa化学名为N-(2-吡嗪基羰基)-L-苯丙氨酸钠盐，结构式如下：

在PPNa的合成过程中使用了N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(BSA)保护剂，BSA不稳定，极易降解生成乙酰胺、三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷，这三种杂质的存在会进一步影响制备得到的硼替佐米原料药的质量，影响用药安全，因此需要建立相应分析方法，应用在硼替佐米中间体的检测中，对原料药及相关制剂的质量进行有效控制具有重要的意义。

上述三种杂质中，三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷为液体形态，易挥发，乙酰胺为颗粒状固体，不易挥发，结构式分别如下：

目前未检索到在同时对硼替佐米中间体PPNa中三种杂质乙酰胺、三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷进行检测的相关专利。发明专利(公开号：CN115248266A)公布了一种测定伏立康唑中间产品中可挥发杂质六甲基二硅氧烷和三甲基硅醇的检测方法，采用以100％-二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管色谱柱用气相色谱法测定，该法仅适用于非极性杂质的测定，对乙酰胺这种极性物质检测不适用，无法获得乙酰胺的正常色谱峰，无法同时检测乙酰胺、三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷这三种杂质。

发明内容

本发明提供了一种硼替佐米中间体N-(2-吡嗪基羰基)-L-苯丙氨酸钠盐(PPNa)中乙酰胺、三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷杂质的检测方法，该方法采用气相色谱法能同时检测三种杂质，准确快速，能够有效用于该中间体的质量控制。

本发明提供的硼替佐米中间体N-(2-吡嗪基羰基)-L-苯丙氨酸钠盐(PPNa)中杂质的检测方法，其特征在于，采用气相色谱法测定，其中色谱柱采用以聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱；采用的溶剂为体积百分含量为50～97％的N,N-二甲基甲酰胺的水溶液；柱温采用程序生温的方式，升温程序为37～43℃维持4～10min后升温，升温速度5～20℃/min，升温至220～280℃，维持1～10min。

现有技术分析三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷杂质这两个非极性杂质采用100％-二甲基聚硅氧烷为固定相的DB-1毛细管柱，但采用该色谱柱在分析硼替佐米中间体PPNa中三种杂质乙酰胺、三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷这三种杂质时发现，无法得到乙酰胺的正常峰，因此发明人对色谱柱进行了筛选研究。尝试采用适用性广的，极可能能同时分析非极性和极性杂质的DB-624弱极性色谱柱，即以6％氰丙基苯、94％二甲基硅氧烷为固定相的色谱柱，但仍无法得到正常的乙酰胺色谱峰，出峰拖尾严重。研究中意外发现采用极性的以聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱，代表型号为Agilent公司的DB-WAX色谱柱能够同时获得三个杂质的较好峰形，因此采用该色谱柱进行本发明检测分析方法的研究。

本发明在研究PPNa中乙酰胺、三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷这三种杂质的气相色谱检测方法过程中，发现选用常用的溶剂包括常用的乙腈、甲醇或二甲基亚砜作为溶剂时，检测结果发现溶剂峰对目标杂质峰存在干扰，因此不能选择上述三种常用溶剂作为溶剂。另外由于PPNa是一种盐，与三种杂质无法都同时完全溶解于有机溶剂中，而单用水溶解，则会导致非极性杂质三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷回收率不合格。因此选用合适的溶剂进行PPNa中乙酰胺、三甲基硅醇和六甲基二硅氧烷这三种杂质检测遇到了困难。经实验发现，采用混合溶剂即体积百分含量为50～97％的N,N-二甲基甲酰胺的水溶液作为溶剂，能够使中间体PPNa和三种杂质都能够溶解并达到测试浓度的要求，得到准确的检测结果。优选体积百分含量95％的N,N-二甲基甲酰胺水溶液。

本发明提供的检测方法，硼替佐米中间体PPNa的测定浓度为1mg/ml～20mg/ml，根据PPNa在溶剂中的溶解性以及杂质检测的灵敏度，当PPNa浓度在1～20mg/ml满足测定要求，优选10mg/ml。

本发明提供的检测方法，其中用于进行气相色谱法测试的乙酰胺对照品溶液是如下方式配制的：取乙酰胺加溶剂溶解并定量稀释制成5μg～500μg/ml的溶液，杂质定位溶液优选500μg/ml，配制混合对照品溶液时，乙酰胺的浓度优选50μg/ml。

本发明提供的检测方法，其中用于进行气相色谱法测试的三甲基硅醇对照品溶液是如下方式配制的：取三甲基硅醇加溶剂溶解并定量稀释制成5μg～500μg/ml的溶液，杂质定位溶液优选500μg/ml，配制混合对照品溶液时，三甲基硅醇的浓度优选50μg/ml。

本发明提供的检测方法，其中用于进行气相色谱法测试的六甲基二硅氧烷对照品溶液是如下方式配制的：取六甲基二硅氧烷加溶剂溶解并定量稀释制成5μg～500μg/ml的溶液，杂质定位溶液优选500μg/ml，配制混合对照品溶液时，六甲基二硅氧烷的浓度优选50μg/ml。

本发明所述气相色谱法使用的色谱柱内径为0.18～0.53毫米，优选色谱柱的内径0.32毫米；色谱柱柱长为30～60m，优选色谱柱的柱长为30m；色谱柱中固定相液膜厚度为0.18μm～0.3μm，优选液膜厚度为0.25μm。

本发明提供的检测方法，进样方式为直接进样，进样体积为1.0μl。

本发明提供的检测方法，其中所述气相色谱法检测时，载气为氮气等惰性气体，载气流速为0.9～1.1ml/min，优选载气流速为1.0ml/min。

本发明提供的检测方法，所述气相色谱法分流比为1:1～10:1，优选2:1；检测器温度为245℃～255℃，优选250℃；进样口温度为245℃～255℃，优选250℃。

本发明提供的检测方法，所述气相色谱法色谱柱柱温采用程序升温的方式，优选的升温程序为40℃维持5分钟，然后升温，升温速率10℃/分钟，升温至230℃，维持1分钟。

本发明的检测方法具体包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取硼替佐米中间体PPNa样品，加溶剂N,N-二甲基甲酰胺水溶液溶解并稀释制成10mg/ml的供试品溶液；

2)混合对照品溶液：取六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺各适量，精密称定，分别加空白溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为杂质定位溶液，取相同体积的三种杂质定位溶液混合，稀释10倍，摇匀，即得混合对照品溶液；

3)进样检测：取步骤1)、步骤2)所得的溶液，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

本发明提供了一种采用气相色谱同时检测硼替佐米关键中间体PPNa中挥发性降解杂质(三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷)与非挥发性降解杂质(乙酰胺)含量的方法。该方法采用固定相为聚乙二醇的毛细管色谱柱，柱温采用特定的梯度升温程序进行气相色谱分析，能够有效地分离硼替佐米中间体PPNa、乙酰胺、三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷，得到良好峰形和分离度。采用混合溶剂即体积百分含量为50～97％的N,N-二甲基甲酰胺的水溶液作为溶剂，能够保证样品及杂质均能有效的溶解，并消除样品引起的基质效应，保证回收率。本发明的检测方法专属性高，空白溶液对测定无干扰，对照品主峰之间最小分离度44.24，远大于1.5。检测灵敏度高，三个降解杂质的检测限均小于供试品限度的0.01％，定量限均小于供试品限度的0.05％。本发明的方法检测准确可靠，三个降解杂质回收率均在90％～108％之间，符合2020版中国药典的规定。本发明解决了硼替佐米关键中间体PPNa中挥发性杂质三甲基硅醇、六甲基二硅氧烷和非挥发性杂质乙酰胺同时分离及定量测定问题，从而保证了硼替佐米关键中间体PPNa及后续制备的硼替佐米原料药质量可控，保证药品的安全性。

下面结合具体实施方式的实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。

说明书附图

附图1实施例1中批次1供试品溶液图谱

附图2实施例2中专属性试验空白溶剂图谱

附图3实施例2中专属性试验乙酰胺定位溶液的图谱

附图4实施例2中专属性试验三甲基硅醇定位溶液图谱

附图5实施例2中专属性试验六甲基二硅氧烷定位溶液图谱

附图6实施例2中专属性试验混合对照品溶液图谱

附图7实施例2中准确度试验100％回收率溶液图谱

具体实施方式

实施例1硼替佐米中间体PPNa样品中三种降解杂质的检测

仪器：Agilent 7890A气相色谱仪

试剂：N,N-二甲基甲酰胺(色谱纯)

样品：PPNa(杭州凯名庞德生物科技有限公司)，乙酰胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度99.609％)、三甲基硅醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度98.834％)、六甲基二硅氧烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度99.863％)。

色谱条件：

以聚乙二醇为固定液的毛细管柱(Agilent DB-WAX柱，320μm×30m，0.25μm或等效柱)为色谱柱；流速为每分钟1ml；分流比为2:1；起始温度为40℃，维持5分钟，以每分钟10℃的速率升温至230℃，维持1分钟；检测器为氢火焰离子化检测器；检测器温度为250℃，进样口温度为250℃，进样体积1μl。

空白溶剂：95％(ml/ml)N,N-二甲基甲酰胺溶液。

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加空白溶剂适量超声振摇使溶解并定量稀释制成每1ml约含10mg的溶液，作为供试品溶液。

混合对照品溶液：取六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺各适量，精密称定，分别加空白溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为杂质定位溶液，取相同体积的三种杂质定位溶液混合，稀释10倍，摇匀，即得混合对照品溶液。

含量测定：

采用上述条件对空白溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液分别进样检测分析。三批次PPNa样品经检测均未检出六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺。批次1样品检测图谱见附图1。

三批PPNa样品六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺测定结果。

实施例2方法学验证实验

仪器：Agilent 7890A气相色谱仪

试剂：N,N-二甲基甲酰胺(色谱纯)

样品：PPNa(杭州凯名庞德生物科技有限公司)，乙酰胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度99.609％)、三甲基硅醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度98.834％)、六甲基二硅氧烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，标准品，纯度99.863％)。

色谱条件：

以聚乙二醇为固定液的毛细管柱(Agilent DB-WAX柱，320μm×30m，0.25μm或等效柱)为色谱柱；流速为每分钟1ml；分流比为2:1；起始温度为40℃，维持5分钟，以每分钟10℃的速率升温至230℃，维持1分钟；检测器为氢火焰离子化检测器；检测器温度为250℃，进样口温度为250℃，进样体积1μl。

空白溶剂：95％(ml/ml)N,N-二甲基甲酰胺溶液。

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加空白溶剂适量超声振摇使溶解并定量稀释制成每1ml约含10mg的溶液，作为供试品溶液。

混合对照品溶液：取六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺各适量，精密称定，分别加空白溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为杂质定位溶液，取相同体积的三种杂质定位溶液混合，稀释10倍，摇匀，即得混合对照品溶液。

(1)专属性

取空白溶剂、供试品溶液、杂质定位溶液、混合对照品溶液分别进样，考察空白溶液对测定的干扰，杂质之间的分离情况。实验结果显示空白溶剂无干扰，各杂质之间分离度大于1.5，符合测定要求。图谱见附图2～附图6。

专属性试验结果如下：

杂质定位溶液试验结果

混合对照品溶液分离试验结果

(2)系统精密度

取混合对照品溶液重复进样5针，考察峰面积及保留时间精密度。试验结果显示对照品溶液重复进样5针，保留时间RSD＜1％，峰面积RSD＜10％，表明本方法系统精密度良好。

系统精密度试验结果

(3)检测限与定量限

取专属性项下六甲基二硅氧烷定位溶液、三甲基硅醇定位溶液、乙酰胺定位溶液适量，分别逐级稀释，把信噪比S/N约为10或以上时的浓度作为定量限，重复进样6次，把信噪比S/N约为3或以上时的浓度作为检测限，进样1次。试验结果显示六甲基二硅氧烷的检测限为0.47μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.005％，定量限为1.41μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.014％。三甲基硅醇的检测限为1.02μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.010％，定量限为3.06μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.031％。乙酰胺的检测限为0.22μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.002％，定量限为0.66μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.007％。六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺的检测限及定量限均远低于限度浓度(0.5％)，表明本方法检测限低，灵敏度高。

检测限试验结果

定量限试验结果

(4)线性

取专属性下杂质定位溶液，逐级稀释配制成0.05％、0.10％、0.125％、0.25％、0.50％、1.00％六个浓度，每个浓度进样一次，以浓度对峰面积进行线性回归，考察线性相关系数。试验结果显示六甲基二硅氧烷在5.23μg/ml～104.54μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝1.5667x+0.7051，相关系数R²为0.9996。三甲基硅醇在4.85μg/ml～97.07μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝0.9952x-1.3842，相关系数R²为0.9997。乙酰胺在5.09μg/ml～101.88μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝1.9172x+0.1920，相关系数R²为0.9999。综上，六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺的线性相关系数R²大于0.99，表明本法的线性关系良好。线性试验结果如下：

六甲基二硅氧烷线性试验结果

三甲基硅醇线性试验结果

乙酰胺线性试验结果

(5)准确度

0.4％对照品溶液配制：精密量取专属性下六甲基二硅氧烷定位溶液、三甲基硅醇定位溶液、乙酰胺定位溶液各4ml，置50ml量瓶中，加空白溶剂定容至刻度，摇匀，作为0.4％对照品溶液。

0.5％对照品溶液配制：精密量取专属性下六甲基二硅氧烷定位溶液、三甲基硅醇定位溶液、乙酰胺定位溶液各5ml，置50ml量瓶中，加空白溶剂定容至刻度，摇匀，作为0.5％对照品溶液。

0.6％对照品溶液配制：精密量取专属性下六甲基二硅氧烷定位溶液、三甲基硅醇定位溶液、乙酰胺定位溶液各6ml，置50ml量瓶中，加空白溶剂定容至刻度，摇匀，作为0.6％对照品溶液。

80％回收率溶液配制：取PPNa约100mg，置10ml量瓶中，加0.4％对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。

100％回收率溶液配制：取PPNa约100mg，置10ml量瓶中，加0.5％对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。

120％回收率溶液配制：取PPNa约100mg，置10ml量瓶中，加0.6％对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。

取0.5％对照品溶液重复进样5次，另取80％、100％、120％回收率溶液分别进样一次，比较峰面积，考察回收率，回收率要求在90％～108％范围。试验结果显示，六甲基二硅氧烷的回收率范围为90.3％～106.1％，回收率平均值为99.7％，RSD为5.3％；三甲基硅醇的回收率范围为96.7％～107.6％，回收率平均值为101.0％，RSD为3.8％；乙酰胺的回收率范围为98.5％～106.4％，回收率平均值为101.6％，RSD为2.4％。六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇及乙酰胺均符合可接受标准，表明本方法准确度高。图谱见附图7。

六甲基二硅氧烷回收率测定结果

三甲基硅醇回收率测定结果

乙酰胺回收率测定结果

(6)耐用性

通过单因素变动现有色谱条件，考察分析方法的耐用性。流速设定为0.9ml/min(其他条件均不变)、1.1ml/min(其他条件均不变)；起始柱温设定为37℃(其他条件均不变)、43℃(其他条件均不变)；进样口温度设定为245℃(其他条件均不变)、255℃(其他条件均不变)；检测器温度设定为245℃(其他条件均不变)、255℃(其他条件均不变)。在设定的色谱条件下，分别进样空白溶剂、供试品溶液、混合对照品溶液，考察方法耐用性。试验结果显示当流速在0.9ml/min～1.1ml/min范围内、起始柱温在37℃～43℃范围内、进样口温度在245℃～255℃范围内、检测器温度在245℃～255℃变化时，空白溶液均无干扰，对照品溶液各色谱峰能有效分离，测定结果一致，均未检出，说明本法的耐用性良好。

耐用性测定结果

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Claims (10)

1.硼替佐米中间体N-(2-吡嗪基羰基)-L-苯丙氨酸钠盐中三种杂质包括乙酰胺、六甲基二硅氧烷和三甲基硅醇的检测方法，其特征在于，采用气相色谱法测定，其中色谱柱采用以聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱；采用的溶剂为体积百分含量为50～97％的N,N-二甲基甲酰胺的水溶液；柱温采用程序生温的方式，升温程序为37～43℃维持4～10min后升温，升温速度5～20℃/min，升温至220～280℃，维持1～10min。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述气相色谱法的色谱柱的型号为DB-WAX。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述溶剂为体积百分含量95％的N,N-二甲基甲酰胺水溶液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述升温程序为40℃维持5分钟，然后升温，升温速率10℃/分钟，升温至230℃，维持1分钟。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述气相色谱法的色谱条件还包括载气为氮气；载气流速为0.9～1.1ml/min；分流比为1:1～10:1；检测器温度为245℃～255℃；进样口温度为245℃～255℃。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述载气流速为1ml/min；分流比为1:1～10:1；检测器温度为250℃；进样口温度为250℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述气相色谱法进样方式为直接进样，进样体积为1.0μl。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于硼替佐米中间体PPNa的测定浓度为1mg/ml～20mg/ml。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于硼替佐米中间体PPNa的测定浓度为10mg/ml。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取硼替佐米中间体PPNa样品，加溶剂N,N-二甲基甲酰胺水溶液溶解并稀释制成10mg/ml的供试品溶液；

2)混合对照品溶液：取六甲基二硅氧烷、三甲基硅醇、乙酰胺各适量，精密称定，分别加空白溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为杂质定位溶液，

取相同体积的三种杂质定位溶液混合，稀释10倍，摇匀，即得混合对照品溶液；

3)进样检测：取步骤1)、步骤2)所得的溶液，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。