CN117554524A - 一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，采用牛磺酸水溶液和2，3‑萘二醛水溶液为衍生化试剂，采用高效液相色谱仪、十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为色谱柱，并配合DAD检测器进行检测。本方法能够有效检出注射液中的氰化物，谱图基线平稳，不发生漂移；本方法的样品处理过程简单便捷，灵敏度高，衍生化反应温和、快速、完全。本方法仪器设备条件易获取，方法检出灵敏度高，避免了复杂的衍生化试剂对检测带来的干扰，提高了检测专属性，精密度和准确度；本发明的方法用于注射液中氰化物的残留测定，具有良好的线性关系、精密度、准确度和灵敏度，在注射液质量研究以及杂质分析与控制研究等方面具有重要研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法。
背景技术
药物杂质是活性药物成分(API，原料药)或药物制剂中不希望存在的化学成分。注射液物中的杂质可能源于合成过程或起始物料、中间体、溶剂、催化剂、反应副产物、注射液成分不稳定、与辅料不兼容，或者是与包装材料发生反应等等。药物中各种杂质对于最终药物的安全性有很大的影响。其中基因毒性杂质(Genotoxic Impurity,GTI)是指化合物本身直接伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。其特点是在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生，因其毒性较强对用药的安全性产生了强烈的威胁。
氰化物被广泛应用于医药、农药、造纸、纺织等行业中，但作为剧毒物质，非常少量的氰化物就可以抑制金属酶和非金属酶，引起血管、胃肠道、视觉、内分泌、中枢神经系统和新陈代谢系统疾病。氰化物的毒性主要由在体内解离出的CN-与呼吸链的终端酶(细胞色素氧化酶aa3)中的Fe3+结合使酶丧失活性，导致细胞内呼吸中断,阻断电子传递和氧化磷酸化,从根本上抑制三磷腺苷的合成,从而抑制了细胞内氧的利用，造成内缺氧，引起急性中毒。因此在药物生产过程中，必须严格控制药物和医药中间体中氰化物的含量。
氰化物一般可通过分光光度计法、气相色谱-电子捕获检测器法、离子色谱法方法、荧光法进行检测。异烟酸-吡唑啉酮分光光度计法在实际应用中易受到污染，操作方式复杂限制等局限，不利于对注射液中氰化物残留检测；衍生气相色谱-电子捕获检测器法和离子色谱法方法操作便捷，但在实际应用中达不到较高的灵敏度，无法满足注射液中氰化物检测限度要求；荧光法在碱性条件下向硼酸盐缓冲液中加入一定量的铜离子，荧光强度于氰化物的浓度成正比，但当复杂的制剂产品中含有可能会与铜络合化合物，会产生假阳性，专属性不强。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，采用水作为溶剂，以牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液为衍生化试剂，氰化物和牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液在常温下进行反应，所述液相色谱检测方法包括以下步骤：
S01、制备对照品溶液及样品溶液；
S02、HPLC检测：色谱条件如下：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱；以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相；采用DAD检测器；进行梯度洗脱；
S03、结果计算：将多个对照品溶液以及注射液样品溶液按步骤S02中的色谱条件依次进样，记录DAD谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据绘制线性相关工作曲线，将注射液样品的图谱数据带入并计算得出样品中残留对照品浓度，从而完成注射液中氰化物的残留测定。
作为本发明进一步的技术方案，所述氰化物为四氰基锌酸钾，使用水作为溶剂，以牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液作为衍生化试剂：
对照品溶液及样品溶液的制备：精密移取四氰基锌酸钾对照品，加入牛磺酸水溶液后加入2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，制成具有浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取注射液样品，加入牛磺酸水溶液后加入2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容混匀得到样品溶液。
作为本发明进一步的技术方案，所述对照品溶液的浓度依次为0.6、6、21、30、150ng/mL。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，所述色谱柱型号为Poroshell120EC-C182.7μm 4.6*100mm。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，梯度洗脱1，初始乙腈比例为30％，保持1.5分钟，后6.5分钟内升至80％保持3分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，梯度洗脱2，初始乙腈比例为30％，保持3分钟，后5分钟内升至80％保持7分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，进样量为5～100μL。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，检测波长：235-255nm。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，柱温30℃-45℃。
作为本发明进一步的技术方案，在步骤S02中，柱温40℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的方法能够有效检出氰化物在注射液中的残留，定量限达到0.6ng/mL。
2.本发明相对于现有的直接进样及衍生化方法，制样过程简单，操作安全简易，处理方便快捷，提高了检测效率。
3.本发明的方法设备易获得，测定色谱基线平稳，不发生漂移。DAD检测器干扰少，提高了方法的精密度和准确度。
4.本发明的方法用于氰化物的残留测定，具有良好的灵敏度、线性关系、精密度、准确度和稳定性，在注射液质量研究以及杂质分析与控制研究等方面具有重要研究价值。
附图说明
图1为本发明实施例中氰化物溶液的专属性色谱图。
图2为本发明实施例中空白溶液、对照品溶液和注射液准确度100％溶液的液相色谱图。
图3本发明实施例中线性测试的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
本发明提供的氰化物的检测方法，采用水作为溶剂，以牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液作为衍生化试剂。发明人发现氰化物和牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液在常温下反应温和、快速、完全，无需复杂的衍生化试剂和萃取，溶液配制后可直接检测。该方法适用于所有水中溶解的注射液。本发明以四氰基锌酸钾为例。其他氰化物类，都可应用于本发明描述的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液及样品溶液的制备：精密移取适量四氰基锌酸钾对照品，加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，制成具有浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取适量注射液样品，加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容混匀得到样品溶液；
(2)HPLC方法条件：
色谱柱采用Poroshell 120EC-C182.7μm 4.6*100mm；
采用梯度洗脱1，初始乙腈比例为30％，保持1.5分钟，后6.5分钟内升至80％保持3分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min，进样量为5μL，柱温40℃，采用DAD检测器，检测波长为250nm。
采用梯度洗脱2，初始乙腈比例为30％，保持3分钟，后5分钟内升至80％保持7分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min，进样量为20μL，柱温40℃，采用DAD检测器，检测波长为250nm。
(3)结果计算：
将所述多个对照品溶液以及样品溶液按步骤(2)的色谱条件依次进样，记录色谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据制备线性相关工作曲线，代入样品的图谱数据计算并得出样品溶液浓度，完成氰化物残留的测定。
为了便于本领域技术人员更好地理解本发明技术方案，给出本发明具体实施例如下：
实施例1
注射液中氰化物残留测定的专属性研究：
精密移取含200ng/ml氰根的四氰基锌酸钾水溶液1mL，加入1mL 5mmol/L牛磺酸水溶液后加入1mL 1mmol/L2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容至10mL，标记为氰化物反应溶液。
对氰化物反应溶液进行HPLC分析，方法条件：
色谱柱采用Poroshell 120EC-C182.7μm 4.6*100mm；
梯度洗脱，初始乙腈比例为30％，保持1.5分钟，后6.5分钟内升至80％保持3分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min，进样量为5μL，柱温40℃，采用DAD检测器，检测波长为250nm；
氰化物-反应溶液的DAD谱图如图1所示，氰化物在1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液中已完全转化，此衍生化反应温和、快速、完全。
实施例2
注射液中氰化物残留测定的灵敏度和线性研究：
精密移取3μg/mL氰化物溶液1mL至10mL容量瓶中，用水溶液定容到刻度后摇匀，标记为对照品储备溶液1。
HPLC分析方法条件：
色谱柱采用Poroshell 120EC-C182.7μm 4.6*100mm；
采用梯度洗脱2，初始乙腈比例为30％，保持3分钟，后5分钟内升至80％保持7分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min，进样量为20μL，柱温40℃，采用DAD检测器，检测波长为250nm。
灵敏度测试：
精密移取0.02mL对照品储备溶液1到10mL容量瓶中，加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，标记为灵敏度溶液(0.6ng/mL)。
灵敏度溶液测试的DAD色谱图中，目标峰氰化物的信噪比为12，完全达到中国药典中对于定量限的要求(S/N≥10)。
线性测试：
分别精密移取0.02mL，0.2mL，0.7mL，1.0mL，5mL对照品储备溶液1到5个10mL容量瓶中，加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，所得到的线性测试溶液的浓度依次为0.6、6、21、30、150ng/mL。
线性测试的DAD色谱图中，5个浓度的测试溶液峰面积的线性相关系数r＝0.9993。由此可见，该方法对于氰化物的测试在0.6ng/mL-150ng/mL的范围内，有良好的线性(图3)。
实施例3
注射液中氰化物残留测定的精密度、准确度和稳定性研究：
精密移取2μg/mL氰化物溶液1mL至10mL容量瓶中，用水溶液定容到刻度后摇匀，标记为对照品储备溶液2。
HPLC分析方法条件：
色谱柱采用Poroshell 120EC-C182.7μm 4.6*100mm；
采用梯度洗脱1，初始乙腈比例为30％，保持1.5分钟，后6.5分钟内升至80％保持3分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min，进样量为5μL，柱温40℃，采用DAD检测器，检测波长为250nm。
精密度测试：
精密移取1.0mL对照品储备溶液到10mL容量瓶中，加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，标记为对照品溶液(20ng/mL)。
连续进样6次对照品溶液，DAD色谱图中，6针对照品溶液氰化物的保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为0.04％，6针对照品溶液氰化物的峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.5％。由此可见，该方法的精密度很好。
准确度测试：
分别精密移取1mL已知氰化物残留量的注射液样品9份于5mL容量瓶中，分别移取0.25mL 1000％(200ng/mL)，0.50mL 1000％(200ng/mL)，0.75mL 1000％(200ng/mL)的对照品储备溶液2后加入1mL牛磺酸水溶液后加入1mL 2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，分别标记为50％，100％，150。各配制3份回收率溶液进行测试。对照品溶液和准确度溶液叠图见图2，9份溶液的回收率统计如下表1。由此可见，该方法的准确度良好。
表1
稳定性测试：
取同一对照品溶液(10ng/mL)，分别于0h，40h进样，测定。结果40h测定的氰化物峰面积相对于0h氰化物峰面积的比值为108％。表明对照品溶液在40小时内稳定。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，采用水作为溶剂，以牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液为衍生化试剂，氰化物和牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液在常温下进行反应，所述液相色谱检测方法包括以下步骤：
S01、制备对照品溶液及样品溶液；
S02、HPLC检测：色谱条件如下：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱；以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相；采用DAD检测器；进行梯度洗脱；
S03、结果计算：将多个对照品溶液以及注射液样品溶液按步骤S02中的色谱条件依次进样，记录DAD谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据绘制线性相关工作曲线，将注射液样品的图谱数据带入并计算得出样品中残留对照品浓度，从而完成注射液中氰化物的残留测定。
2.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，所述氰化物为四氰基锌酸钾，使用水作为溶剂，以牛磺酸水溶液和2，3-萘二醛水溶液作为衍生化试剂：
对照品溶液及样品溶液的制备：精密移取四氰基锌酸钾对照品，加入牛磺酸水溶液后加入2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容，制成具有浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取注射液样品，加入牛磺酸水溶液后加2，3-萘二醛水溶液用水稀释并定容混匀得到样品溶液。
3.根据权利要求2所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的浓度依次为0.6、6、21、30、150ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，所述色谱柱型号为Poroshell 120EC-C182.7μm 4.6*100mm。
5.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，梯度洗脱1，初始乙腈比例为30％，保持1.5分钟，后6.5分钟内升至80％保持3分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，梯度洗脱2，初始乙腈比例为30％，保持3分钟，后5分钟内升至80％保持7分钟，后降回30％保持5分钟，流速为0.3mL/min。
7.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，进样量为5～100μL。
8.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，检测波长：235-255nm。
9.根据权利要求1所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，柱温30oC-45oC。
10.根据权利要求9所述的一种注射液中氰化物残留的液相色谱检测方法，其特征在于，在步骤S02中，柱温40oC。
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