CN115851686A - Sirt6 h133y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用 - Google Patents

Sirt6 h133y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SIRT6H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用，蛋白制备方法包括：以SIRT6‑FLAG为模板得到SIRT6‑FLAG片段，以pET28a质粒为模板得到质粒片段，两片段拼接得到表达质粒pET28TEV‑SIRT6，以其为模板进行PCR定点突变技术，得到过表达质粒pET28TEV‑SIRT6H133Y，转入大肠杆菌内纯化蛋白；本发明基于SIRT6H133Y蛋白对豆蔻酰基的结合力，并通过SIRT6H133Y蛋白上的His‑tag和Flag‑tag标签对豆蔻酰化修饰肽段进行免疫共沉淀，富集得到豆蔻酰化修饰肽段，质谱检测分析得到豆蔻酰化修饰靶蛋白和修饰位点。

Description

SIRT6 H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白富集技术领域，具体涉及一种SIRT6 H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用。
背景技术
SIRT6是Sirtuins家族的一员，目前研究发现其具有去乙酰化、单ADP-核糖基化、去豆蔻酰化活力。SIRT6在生理病理过程中扮演着重要角色，如维持端粒和基因组稳定、DNA修复、基因表达，慢性炎症、糖/脂代谢以及心脏肥厚和重构。SIRT6虽涉及多种生物学功能，但每种功能所需的具体生化活性仍相当模糊。因此，鉴定哪些活性调控哪种生物学过程，对于理解SIRT6的分子功能以及精准开发针对SIRT6的效应因子或药物来说至关重要。
近年来，研究者发现SIRT6具有去赖氨酸豆蔻酰化功能，发现SIRT6的去豆蔻酰化活力比其去乙酰化活力几乎高300倍，并可以非氨基酸序列依赖的结合豆蔻酰基。然而目前对于SIRT6去豆蔻酰化修饰的功能解析非常少。由于检测技术限制，目前并没有很好的方法用于高通量鉴定赖氨酸豆蔻酰化修饰蛋白，这导致SIRT6主要酶活(去豆蔻酰化酶活力)被忽视，赖氨酸豆蔻酰化修饰的功能研究停滞不前。
目前鉴定蛋白翻译后修饰主要通过修饰肽段富集质谱的方法进行，即将检测样品中的蛋白质酶解为肽段，通过一定方法富集得到修饰的肽段，最后通过质谱检测得到修饰蛋白质的名称及修饰位点。对于修饰蛋白的鉴定，高效的修饰肽段富集策略最为关键。例如通过泛乙酰化抗体富集策略，目前赖氨酸乙酰化修饰已被证实为一种广泛存在的修饰类型；通过ADP-核糖结合蛋白Af1521 macro domain富集策略，大量的赖氨酸ADP核糖基化修饰蛋白被发现，并发现这类修饰的出现可能与氧化应激相关。然而，目前并没有高效的赖氨酸豆蔻酰化修饰肽段的富集方法。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种SIRT6 H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用。由于SIRT6自身可以结合豆蔻酰基，因此建立了以SIRT6H133Y突变蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，并提出赖氨酸豆蔻酰化修饰蛋白组学的质谱鉴定。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
第一方面，本发明提供了一种SIRT6 H133Y蛋白的制备方法，其包括：
化学合成SIRT6-FLAG片段：以化学合成的SIRT6-FLAG(SIRT6-FLAG基因由擎科生物(中国)的基因合成得到)为模板通过SIRT6引物得到SIRT6-FLAG片段，
合成质粒片段：以pET28a质粒为模板通过pET28a引物扩增得到质粒片段，
SIRT6-FLAG片段和质粒片段通过同源拼接得到表达质粒pET28TEV-SIRT6；以pET28TEV-SIRT6为模板，通过H133Y引物进行PCR定点突变技术(即通过PCR定点突变技术对pET28TEV-SIRT6中的SIRT6基因进行H133Y点突变)，扩增得到过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y，将过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y转化大肠杆菌内，2-3天内能够通过大肠杆菌蛋白质表达系统和His标签纯化得到足够的SIRT6 H133Y蛋白。
其中，SIRT6-FLAG片段的碱基序列(SEQ ID NO.1)为：
Atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgccgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
HIS tag、Flag tag双标签SIRT6 H133Y蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)(下换线突出为H133Y突变位点)：MSSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFMSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGIPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELYGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLPRPPTPKLEPKEESPTRINGSIPAGPKQEPCAQHNGSEPASPKRERPTSPAPHRPPKRVKAKAVPSDYKDDDDK。
进一步地，pET28a引物分别为：
pET28a-F:gcggccgctttcgaatctagagc(SEQ ID NO.3)；
pET28a-R:gaattccggatccatggcgccctg(SEQ ID NO.4)；
SIRT6引物分别为：
SIRT6-F:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(SEQ ID NO.5)；
SIRT6-R:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(SEQ ID NO.6)。
进一步地，得到过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y时，PCR定点突变扩增的引物分别为：
H133Y-F:cagaactgTATggtaatatgtttgttgaag(SEQ ID NO.7)；
H133Y-R:catattaccATAcagttctgccagtttatc(SEQ ID NO.8)。
第二方面，本发明提供了一种SIRT6 H133Y蛋白，其由上述的制备方法得到。
第三方面，本发明提供了一种利用上述的SIRT6 H133Y蛋白进行SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，其包括如下步骤：
(1)、细胞样品：细胞可以在DMEM低糖培养基内添加抑制剂和脂质、或在DMEM低糖培养基添加豆蔻酸类似物进行细胞培养，用于提高细胞内蛋白质豆蔻酰化修饰水平，收集细胞并消化裂解提取全蛋白；组织样本：组织可直接消化裂解提取全蛋白。提取的蛋白加入胰蛋白酶进行酶切，得到酶解肽段，冷干备用；
(2)、将酶解肽段溶于缓冲液中，加入SIRT6 H133Y蛋白和乙腈混合，得到第一混合液；再将Anti-Flag磁珠加入缓冲液内，然后加入第一混合液进行富集反应，孵育，得到第二混合液；
(3)、将第二混合液磁力沉淀，弃去液体，加入缓冲液洗涤，磁力沉淀，反复洗涤后，彻底弃去液体；
(4)、洗涤后的Anti-Flag磁珠加入洗脱缓冲液，孵育，洗脱，得到肽段洗脱液；
(5)、在肽段洗脱液中加入三氟乙酸进行孵育，离心，取上清液冻干，获得豆蔻酰化修饰肽段。
进一步地，步骤(1)中，抑制剂为肉碱棕榈酰转移酶1a抑制剂(CPT1αinhibitor,Aladdin公司，CAS number:124083-20-1)，脂质为化学成分明确的脂质浓缩液(化学成分明确的脂质浓缩液来源于Thermo公司，详见:Thermo官网www.thermofisher.cn/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.249.html)，豆蔻酸类似物为棕榈酸炔(ALK14)(Click Chemistry Tools公司，CAS number:99208-90-9)。
进一步地，步骤(1)中，细胞培养的温度为37℃，时间为6-12h。
进一步地，步骤(1)中，组织样品泛指组织样品，包括人的各种组织和动物的各种组织。
进一步地，步骤(1)中，酶切的温度为37℃，时间为16-18h。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中，缓冲液为Myr-IP缓冲液，其包括磷酸缓冲盐溶液、0.2％吐温-20和20％乙腈。
进一步地，步骤(2)中，孵育的温度为4℃，时间为16-18h；或室温2-4h。
进一步地，步骤(4)中，洗脱缓冲液包括0.2mol/L甘氨酸和20％乙腈。
进一步地，步骤(5)中，孵育的温度为室温或37℃，时间为5-10min。
进一步地，步骤(5)中，离心的转速为12000rpm，时间为15-30min。
第四方面，本发明提供了豆蔻酰化修饰肽段，其由上述的方法得到。
第五方面，本发明提供了一种上述的豆蔻酰化修饰肽段的应用，该豆蔻酰化修饰肽段在质谱鉴定中得以应用，鉴定豆蔻酰化修饰蛋白及修饰位点。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明基于SIRT6 H133Y对豆蔻酰基的结合能力，并通过SIRT6 H133Y蛋白上的His tag纯化蛋白和Flag tag标签对豆蔻酰化修饰肽段进行免疫共沉淀，从而富集得到豆蔻酰化修饰肽段；对豆蔻酰化修饰肽段进行质谱检测，分析得到豆蔻酰化修饰靶蛋白和修饰位点，故本发明为寻找生物体内潜在的豆蔻酰化修饰靶蛋白，鉴定修饰位点，为解析赖氨酸豆蔻酰化修饰的生理意义提供方法学支撑。同时本发明的方法不仅能够鉴定赖氨酸豆蔻酰化修饰，还可以通过不同的质量迁移鉴定其他长链脂肪酰化修饰位点(例如棕榈酰化和软脂酰化)。
第二、相比修饰基团泛抗体富集质谱策略，本发明的富集方法成本低，耗时短，且富集材料SIRT6 H133Y可以通过常规大肠杆菌蛋白表达系统短时间大量制备，富集所用Anti-Flag磁珠容易获得。
附图说明
图1为本发明的肽段富集质谱鉴定豆蔻酰化修饰蛋白质组学分析的工作流程示意图。
图2为本发明的实施例1中HIS tag、Flag tag双标签SIRT6 H133Y纯化蛋白流程质检图。
图3为本发明的实施例2中SIRT6敲低293T细胞验证图。
图4为本发明的实施例3中DMEM低糖培养基添加肉碱棕榈酰转移酶1a抑制剂和化学成分明确的脂质浓缩液培养细胞后全蛋白豆蔻酰化水平图。
图5为本发明的实施例3中SIRT6敲低293T细胞蛋白质提取质检图。
图6为本发明的实施例5中添加ALK14培养的293T细胞样本液相色谱肽段分离图。
图7为本发明的实施例5中赖氨酸豆蔻酰化修饰肽段质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种SIRT6 H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用。
如图1所示，细胞样本经过蛋白提取，蛋白酶解后通过dSIRT6富集豆蔻酰化修饰肽段，上机质谱分析，得到豆蔻酰化修饰蛋白质组谱。即保护利用带有His tag、Flag tag双标签的SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段并进行质谱鉴定豆蔻酰化修饰蛋白的方法。具体描述如下：
富集材料SIRT6 H133Y的制备：
通过分子生物学方法设计蛋白突变体SIRT6 H133Y的表达载体。以SIRT6-FLAG为模板通过SIRT6引物得到SIRT6-FLAG片段，以pET28a质粒为模板通过pET28a引物扩增得到质粒片段，通过无缝克隆技术将SIRT6-FLAG片段和质粒片段通过同源拼接得到表达质粒pET28TEV-SIRT6；SIRT6的N端带His tag，C端带Flag tag。以pET28TEV-SIRT6为模板通过H133Y引物进行PCR定点突变技术，构建带有His tag、Flag tag双标签的SIRT6 H133Y的过表达质粒(pET28TEV-SIRT6H133Y)。在大肠杆菌蛋白质表达系统表达N端His tag和C端Flagtag双标签的SIRT6 H133Y蛋白。利用His标签通过镍离子交换柱纯化SIRT6 H133Y蛋白，通过SDS-PAGE电泳确认纯化成功且纯度合格。蛋白经过透析后，蛋白保存于-80℃。
其中，SIRT6-FLAG片段的碱基序列(SEQ ID NO.1)为：
Atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgccgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
HIS tag、Flag tag双标签SIRT6 H133Y蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)(下换线突出为H133Y突变位点)：MSSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFMSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGIPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELYGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLPRPPTPKLEPKEESPTRINGSIPAGPKQEPCAQHNGSEPASPKRERPTSPAPHRPPKRVKAKAVPSDYKDDDDK。
具体地，pET28a引物分别为：
pET28a-F:gcggccgctttcgaatctagagc(SEQ ID NO.3)；
pET28a-R:gaattccggatccatggcgccctg(SEQ ID NO.4)。
SIRT6引物分别为：
SIRT6-F:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(SEQ ID NO.5)；
SIRT6-R:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(SEQ ID NO.6)。
PCR定点突变扩增的引物分别为：
H133Y-F:cagaactgTATggtaatatgtttgttgaag(SEQ ID NO.7)；
H133Y-R:catattaccATAcagttctgccagtttatc(SEQ ID NO.8)。
酶解肽段的制备：
由于豆蔻酰化修饰的丰度很低，可以通过动物注射或者培养基添加Etomoxir(CPT1α抑制剂)抑制肉碱脂酰转移酶1，从而提高细胞质的长链脂酰辅酶A含量，有利于提高豆蔻酰化修饰丰度。同样敲除SIRT6基因也有利于豆蔻酰化修饰丰度的提高。
Western Blotting证明细胞通过低糖(1g/mL)的DMEM培养基，加入50μmol/L的Etomoxir、1％的化学成分明确的脂质浓缩液(美国gibco)能够较好地提高豆蔻酰化修饰丰度。还可以通过培养基添加豆蔻酸类似物ALK14(棕榈酸炔)，提高模拟豆蔻酰化修饰的丰度。
收集的组织或细胞进行消化裂解后，加入8mol/L的UA裂解液，冰上超声裂解(100W，工作10s，间歇10s，循环10次)，14000rpm离心30min后取上清得到蛋白裂解液测量浓度。取样品蛋白质20μg，加入5X上样缓冲液，沸水浴5min，进行12.5％SDS-PAGE电泳(120V，75min)，考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质提取质量。取2mg蛋白样品加入10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)在37℃孵育2h以破坏蛋白质二硫键，后冷却至室温，加入IAA至终浓度50mmol/L，避光孵育30min用来修饰蛋白质SH基团。加入5倍体积水，将UA裂解液浓度稀释至1.5mol/L，按照50:1比例加入Trypsin，37℃酶切18h左右。通过SPE C18柱脱盐，冻干，得到酶解肽段，存放于-80℃备用。
豆蔻酰化修饰肽段的富集：
(1)酶解肽段(1mg)复溶于400μL预冷Myr-IP缓冲液中，随后加入80μL的SIRT6H133Y蛋白(1mg/mL)和20μL乙腈，混匀，30℃反应4h，使SIRT6结合修饰肽段；
(2)取50μL的Anti-Flag磁珠于1.5mL的EP管中，加入500μL的Myr-IP缓冲液洗涤，混匀后将EP管放在磁力架上分离beads和液体，弃去液体，洗涤3次；
(3)将步骤(1)中的反应液与预处理好的Anti-Flag磁珠(该磁珠可以从国内Beenbio公司(货号PR002)和国外Thermo Scientific公司(货号A36797)购买得到)混匀进行富集反应，4℃孵育16-18h；
(4)将上述反应液从4℃取出，放在磁力架上分离，弃去液体；
(5)加入500μL的Myr-IP缓冲液洗涤，混匀后将EP管放在磁力架上分离beads和液体，弃去液体，重复洗涤3次；
(6)加入150μL洗脱缓冲液混匀，室温摇床孵育15min，放在磁力架上，将液体转入干净的1.5mL的EP管中，洗脱3次，混合；
(7)在洗脱产物中加入4％的TFA，37℃孵育10min后，12000rpm离心15min沉淀SIRT6蛋白，上清保留，可以直接作为质谱样品进行质谱鉴定或冷冻干燥保存。如果是冻干肽段用0.1％甲酸20％乙腈水溶液复溶作为质谱样品。
Myr-IP缓冲液：1X PBS(不含Ca2+、Mg2+，pH值为7.4)，0.2％Tween-20，20％乙腈；洗脱缓冲液：0.2mol/L甘氨酸，20％乙腈，pH值为2.2。
质谱鉴定：
质谱样品采用纳升流速的高效液相系统EASY-nLC 1200进行分离。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。首先色谱柱以100％的流动相A进行平衡，随后样品的酶解肽段由自动进样器输送到上样柱(2cm，ID100μm，3μm，C18)，之后再经过分析柱(15cm，ID150μm，1.9μm，C18)进行分离，流速为600nL/min。相关液相梯度如下：75min梯度:0-5min，液线性梯度从4-20％；5-65min，B液线性梯度从20-50％；66-75min，B液维持在100％。肽段样品经分析色谱柱分离，并通过HPLC肽段分离图证明肽段分离效果良好且丰度良好，后用Q Exactive HF-X质谱仪进行质谱检测。检测方式为正离子模式，母离子扫描范围300-1400m/z，一级质谱分辨率为120,000at 200m/z，AGC(Automaticgain control)target为3e6，Maximum IT为30ms，动态排除时间(Dynamic exclusion)为12.0s。多肽和多肽碎片的质荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集60个碎片图谱(MS2 scan)，使用HCD碎裂模式，Normalized Collision Energy为27％，Isolation window为1.6m/z，二级质谱分辨率7,500at 200m/z。
质谱分析采集的原始数据(RAW文件)，通过Thermo Proteome Discoverer软件进行数据库检索，最终获得蛋白质样品的鉴定信息。其中搜库参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；非ALK14添加样品，动态修饰设定Oxidation(M)和Myr-(K)和Myr-(G)(质量迁移210.356Da；ALK14添加样品，动态修饰设定Oxidation(M)和ALK14-(K)和ALK14-(G)(质量迁移234.377Da)。数据库检索鉴定到的蛋白质必须通过设定的过滤参数FDR≤0.01。最终获得豆蔻酰化修饰肽段质谱图和赖氨酸豆蔻酰化修饰蛋白。
下面结合附图和实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
大肠杆菌表达纯化SIRT6 H133Y蛋白
(1)构建带有HIS tag、Flag tag双标签的SIRT6 H133Y的过表达质粒(pET28TEV-SIRT6H133Y)：
以SIRT6-FLAG为模板通过SIRT6-F/R引物合成得到SIRT6-FLAG片段，以pET28a质粒为模板通过pET28a-F/R引物扩增得到质粒片段，通过无缝克隆技术将SIRT6-FLAG片段和质粒片段通过同源拼接得到表达质粒pET28TEV-SIRT6，其N端带His tag，C端带Flag tag。以pET28TEV-SIRT6为模板通过引物H133Y-F/R进行PCR定点突变，构建带有HIS tag、Flagtag双标签的SIRT6 H133Y的过表达质粒(pET28TEV-SIRT6H133Y)。
其中，SIRT6-FLAG片段的碱基序列(SEQ ID NO.1)为：
Atgagcgttaactatgcagcgggtctgagcccgtatgcagataaaggtaaatgtggtctgccggaaatttttgatccgccggaagaactggaacgtaaagtgtgggaactggcgcgtctggtttggcagagcagtagtgttgtttttcataccggtgcaggtattagcaccgcaagcggtattccggattttcgtggtccgcatggtgtatggaccatggaagaacgtggtctggcaccgaaatttgataccacctttgaatctgcacgcccgacacagacccatatggcactggttcagctggaacgcgttggtctgctgcgttttctggttagccagaatgttgatggcctgcatgtgcgtagcggctttccgcgtgataaactggcagaactgcatggtaatatgtttgttgaagaatgtgcaaaatgcaaaactcagtatgttcgtgataccgtggtgggtacgatgggtctgaaagcaaccggtcgtctgtgtacagttgcaaaagcacgtggtctgcgtgcctgtcgtggtgaactgcgcgataccattctggattgggaagatagcctgccggatcgcgatctggcactggcagatgaagcatctcgtaatgctgatctgagtattacactgggtacctctctgcagattcgtcctagcggcaacctgccgctggcaacaaaacgtcgtggtggtcgtctggttattgtgaatctgcagccgaccaaacatgatcgtcatgcagatctgcgtattcatggttatgttgatgaagttatgacccgtctgatgaaacatctgggtctggaaattcctgcttgggatggtccgcgtgttctggaacgtgcactgcctcctctgccgcgtcctcctaccccgaaactggaaccgaaagaagaaagtcctacgcgtattaatggtagcattccggcaggtccgaaacaggaaccttgtgcccagcataatggttctgaacctgcaagtcctaaacgcgaacgcccgaccagcccggcaccgcatcgtcctcctaaacgcgtgaaagcaaaagcagttccaagcgattataaagatgatgatgataaataa。
质粒构建使用引物：
pET28a-F:gcggccgctttcgaatctagagc(SEQ ID NO.3)；
pET28a-R:gaattccggatccatggcgccctg(SEQ ID NO.4)；
SIRT6-F:gcgccatggatccggaattcatgagcgttaactatg(SEQ ID NO.5)；
SIRT6-R:ctagattcgaaagcggccgcttatttatcatcatcatc(SEQ ID NO.6)；
H133Y-F:cagaactgTATggtaatatgtttgttgaag(SEQ ID NO.7)；
H133Y-R:catattaccATAcagttctgccagtttatc(SEQ ID NO.8)。
(2)pET28TEV-SIRT6H133Y转化进大肠杆菌ArcticExpress(ED3)，转化子在2X YT培养基中(kanamycin 50μg/mL，gentamicin 40μg/mL)生长，OD600达到0.8时，加入0.2mmol/L的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。
(3)收集细菌菌液，8000rpm离心5min，弃上清，加入1mmol/L的PMSF裂解液(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，2％glycerol，pH值为7.2)悬浮，用高压破碎仪进行细胞破碎，12000rpm离心30min，取上清装入镍离子交换柱(GE Healthcare)，根据
Figure BDA0003772562890000091
FPLCTMSystem进行纯化。加入10柱体积的wash buffer(20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，2％glycerol和20mmol/L Imidazole，pH值为7.2)洗涤，用elution buffer(20mmol/LTris-HCl，500mmol/L NaCl，2％glycerol和500mmol/L imidazole，pH值为7.2)洗脱蛋白。SDS-PAGE电泳结果确认SIRT6 H133Y蛋白表达纯化成功(图2)。用透析buffer(50mmol/LTris-HCl，250mmol/L NaCl and 10％glycerol，pH值为7.2)进行蛋白透析，去除咪唑，得到的蛋白保存于-80℃。
其中，SIRT6 H133Y蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)(下换线突出为H133Y突变位点)：MSSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFMSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGIPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELYGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLPRPPTPKLEPKEESPTRINGSIPAGPKQEPCAQHNGSEPASPKRERPTSPAPHRPPKRVKAKAVPSDYKDDDDK。
实施例2：
SIRT6敲低293T细胞株构建
用SIRT6 shRNA病毒转染293T细胞，同时加入Polybrene增加感染效率，转染6h后换液(使用高糖DMEM培养基)。转染48h后用Puromycin进行阳性筛选，得到稳定表达SIRT6shRNA的细胞株。western blotting结果证明293T SIRT6敲低效率良好(图3)。
实施例3：
细胞培养及样品处理
(1)SIRT6敲低的293T细胞，用含有10％FBS的高糖DMEM培养基培养，待细胞汇合率达80％左右后，换低糖(1g/mL)的DMEM培养，其中加入Etomoxir(cpt1a抑制剂，中国aladdin公司)50μmol/L，1％的化学成分明确的脂质浓缩液，培养12h后收样，western blotting结果证明上述培养方法能够提高豆蔻酰化修饰丰度(图4)。细胞还可以通过培养基添加10μg/mL ALK14(豆蔻酸类似物)，培养12h后收样。
(2)细胞样品加入8mol/L的UA裂解液，冰上超声裂解(100W，工作10s，间歇10s，循环10次)，14000rpm离心30min后取上清得到蛋白裂解液测量浓度。取样品蛋白质20μg，加入5X上样缓冲液，沸水浴5min，进行12.5％SDS-PAGE电泳(120V，75min)，考马斯亮蓝染色证明蛋白质提取质量良好(图5)。取2mg蛋白样品加入10mmol/L的DTT在37℃孵育2h以破坏蛋白质二硫键，后冷却至室温，加入IAA至终浓度50mmol/L，避光孵育30min用来修饰蛋白质SH基团。加入5倍体积水，将UA裂解液浓度稀释至1.5mol/L，按照50：1比例加入Trypsin，37℃酶切18h左右。通过SPE C18柱脱盐，冻干，得到酶解肽段，存放于-80℃备用。
实施例4：
豆蔻酰化修饰肽段富集
(1)酶解肽段(1mg)复溶于400μL预冷Myr-IP缓冲液中，随后加入80μL的SIRT6H133Y蛋白(1mg/mL)和20μL乙腈，混匀，30℃反应4h，使SIRT6结合修饰肽段；
(2)取50μL的Anti-Flag磁珠于1.5mL的EP管中，加入500μL的Myr-IP缓冲液洗涤，混匀后将EP管放在磁力架上分离磁珠和液体，弃去液体，洗涤3次；
(3)将步骤(1)中的反应液与预处理好的Anti-Flag磁珠混匀进行富集反应，4℃孵育18h；
(4)将上述反应液从4℃取出，放在磁力架上分离，弃去液体；
(5)加入500μL的Myr-IP缓冲液洗涤，混匀后将EP管放在磁力架上分离磁珠和液体，弃去液体，重复洗涤3次；
(6)加入150μL洗脱缓冲液混匀，室温摇床孵育15min，放在磁力架上，将液体转入干净的1.5mL的EP管中，洗脱3次，混合；
(7)在洗脱产物中加入4％的TFA，37℃孵育10min后，12000rpm离心15min沉淀SIRT6蛋白，上清保留，可以直接作为质谱样品进行质谱鉴定或冷冻干燥保存。如果是冻干肽段用0.1％甲酸20％乙腈水溶液复溶作为质谱样品；
(8)真空干燥上清液，浓缩肽段。
Myr-IP缓冲液：1X PBS(不含Ca2+、Mg2+，pH 7.4)，0.2％Tween-20，20％乙腈。洗脱缓冲液：0.2mol/L甘氨酸，20％乙腈，pH值为2.2。
实施例5：
质谱鉴定
样品采用纳升流速的高效液相系统EASY-nLC 1200进行分离。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。首先色谱柱以100％的流动相A进行平衡，随后样品的酶解肽段由自动进样器输送到上样柱(2cm，ID100μm，3μm，C18)，之后再经过分析柱(15cm，ID150μm，1.9μm，C18)进行分离，流速为600nL/min。肽段样品经分析色谱柱分离，HPLC肽段分离图说明肽段分离效果良好且丰度良好(图6)，后用Q Exactive HF-X质谱仪进行检测。检测方式为正离子模式，母离子扫描为700m/z，一级质谱分辨率为120,000at 200m/z，AGC(Automatic gain control)target为3e6，Maximum IT为30ms，动态排除时间(Dynamic exclusion)为12.0s。多肽和多肽碎片的质荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集60个碎片图谱(MS2 scan)，使用HCD碎裂模式，NormalizedCollision Energy为27％，Isolation window为1.6m/z，二级质谱分辨率7,500at 200m/z。
质谱分析采集的原始数据(RAW文件)，通过Thermo Proteome Discoverer软件进行数据库检索，最终获得蛋白质样品的鉴定信息。其中搜库参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；非ALK14添加样品，动态修饰设定Oxidation(M)和Myr-(K)和Myr-(G)(质量迁移210.356Da)；ALK14添加样品，动态修饰设定Oxidation(M)和ALK14-(K)和ALK14-(G)(质量迁移234.377Da)。质谱数据分析后得到赖氨酸豆蔻酰化修饰靶蛋白及其修饰位点，DUX4L3和GLIS2为鉴定得到修饰蛋白中2个豆蔻酰化修饰蛋白(图7)。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种SIRT6 H133Y蛋白的制备方法，其特征在于：其包括：
以SIRT6-FLAG为模板通过SIRT6引物扩增得到SIRT6-FLAG片段，以pET28a质粒为模板通过pET28a引物扩增得到质粒片段，所述SIRT6-FLAG片段和质粒片段通过同源拼接得到表达质粒pET28TEV-SIRT6；以pET28TEV-SIRT6为模板，通过H133Y引物进行PCR定点突变技术，扩增得到过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y；将所述过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y转化大肠杆菌内，利用大肠杆菌蛋白质表达系统表达HIS tag、Flag tag双标签SIRT6H133Y蛋白，通过His标签纯化得到SIRT6 H133Y蛋白。
2.根据权利要求1所述的SIRT6 H133Y蛋白的制备方法，其特征在于：SIRT6-FLAG片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；
所述pET28a引物分别为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述SIRT6引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的SIRT6 H133Y蛋白的制备方法，其特征在于：所述得到过表达质粒pET28TEV-SIRT6H133Y时，PCR定点突变的扩增引物分别为如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；
所述SIRT6 H133Y蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种SIRT6 H133Y蛋白，其特征在于：其由权利要求1-3任一项所述的制备方法得到。
5.一种利用权利要求4所述的SIRT6 H133Y蛋白进行SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、细胞样品或组织样品经过消化裂解提取全蛋白质，然后加入胰蛋白酶进行酶切，得到酶解肽段，冷干备用；
(2)、将所述酶解肽段溶于缓冲液中，加入SIRT6 H133Y蛋白和乙腈混合，得到第一混合液；再将Anti-Flag磁珠加入缓冲液内，然后加入所述第一混合液进行富集反应，孵育，得到第二混合液；
(3)、将所述第二混合液磁力沉淀，弃去液体，加入缓冲液洗涤，磁力沉淀，反复洗涤后，彻底弃去液体；
(4)、洗涤后的Anti-Flag磁珠加入洗脱缓冲液，孵育，洗脱，得到肽段洗脱液；
(5)、在所述肽段洗脱液中加入三氟乙酸进行孵育，离心，取上清液冻干，获得豆蔻酰化修饰肽段。
6.根据权利要求5所述的SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞样品，在DMEM低糖培养基内添加抑制剂和脂质、或在DMEM低糖培养基内添加豆蔻酸类似物在37℃培养6-12h后得到；和/或，
所述抑制剂为肉碱棕榈酰转移酶1a抑制剂，所述脂质为脂质浓缩液，所述豆蔻酸类似物为棕榈酸炔；和/或，
步骤(1)中，所述组织样品包括人的各种组织和动物的各种组织。
7.根据权利要求5所述的SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述酶切的温度为37℃，时间为16-18h。
8.根据权利要求5所述的SIRT6 H133Y蛋白富集豆蔻酰化修饰肽段的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中，所述缓冲液为Myr-IP缓冲液，其包括磷酸缓冲盐溶液、吐温-20和乙腈；和/或，
步骤(2)中，所述孵育的温度为4℃，时间为16-18h或室温2-4h；和/或，
步骤(4)中，所述洗脱缓冲液包括甘氨酸和乙腈；和/或，
步骤(5)中，所述孵育的温度为室温或者37℃，时间为5-10min；和/或，
步骤(5)中，所述离心的转速为12000rpm，时间为15-30min。
9.豆蔻酰化修饰肽段，其特征在于：其由权利要求5-8任一项所述的方法得到。
10.一种如权利要求9所述的豆蔻酰化修饰肽段的应用，该豆蔻酰化修饰肽段在质谱鉴定中的应用。
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