CN102766214A - 含蛋白标签的sumo融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供含蛋白标签的SUMO融合蛋白及其应用，尤其是在体外和体内系统中检测SUMO化以及筛选和检测SUMO化底物的应用。

Description

含蛋白标签的SUMO融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，涉及蛋白质的翻译后修饰，尤其是SUMO化修饰及其检测。

背景技术

1.SUMO的发现和同源性

在细胞的翻译过程中，一些靶蛋白可以被修饰物修饰。研究表明翻译后修饰可以决定靶蛋白的命运和功能[1]，其中包括泛素和SUMO。2004诺贝尔化学奖的颁发给以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰他们发现了泛素(ubiquitin)调节的蛋白质降解。翻译后修饰领域得到应有的肯定和重视。

SUMO，ISG15，NEDD8都被称作ULM(Ubiquitin like domain)，他们在三维结构以及修饰方式上与泛素高度一致[2]。SUMO是近11KDa的蛋白，在结构上类似于泛素并且同样被连接到靶蛋白的赖氨酸上。SUMO的同源物Smt3最早在酿酒酵母的遗传突变筛选中发现。在1996年，在后来1999年诺贝尔奖得主Blobel的实验室最早发现SUMO(Smt3)能够共价的结合一个小G蛋白的激活蛋白RANGAP1[3]，影响了此蛋白在细胞核与核质的运输，随后第一次将此类小蛋白命名为SUMO(Smallubiquitin-like modifiers，类泛素化小蛋白类泛素化小蛋白[4]，然后SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物中被发现[5]，得到阐释。在低等的真核生物如酿酒酵母，昆虫，线虫中只有一种SUMO基因表达，在植物中有8种之多[6]。SUMO在真核生物中有很好的保守性[1]。

在脊椎动物中，已经发现了4种SUMO的同源物SUMO1(Smt3c，PIC1，GMP1，sentrin或Ubl1)，SUMO2(Smt3a或Sentrin3)，SUMO3(Smt3b或Sentrin2)，以及通过基因组范围扫描预测得到的SUMO4[7]，现在还并不确切知道SUMO4的表达和功能。其中SUMO2和SUMO3只是在N端的三个氨基酸残基有差别，有时它们亦称为SUMO2/3，与SUMO1在序列上有50％的同源性，但已经发现了在功能上的差别[8，9]。现阶段的研究主要集中SUMO1的共价修饰作用，而在[8]推测可能SUMO2/3可能具有更大范围修饰的靶目标蛋白，而且除了RANGAP1被SUMO1特异性的修饰外[8]，更多的情况依赖于细胞环境中的SUMO1和SUMO2底物的相对数量，以及细胞所受的外界压力(stress)。现阶段，已经发现了大量的蛋白质存在SUMO化的过程，包括染色质的组装，蛋白质的转录，RNA代谢过程[10-13]。研究蛋白的SUMO化已经成为了当前研究蛋白质翻译后修饰的重要组成部分。

同泛素一样，所有的Ubls通过多个酶的级联作用实现对靶蛋白的共价修饰，包括了Ubl激活酶(E1)，Ubl转移酶(E2)和具有特异性的Ubl连接酶(E3)。SUMO具有相同的修饰机理。新翻译的SUMO蛋白在C端被剪切从而形成具有GG末端的成熟形式，这种剪切在酵母中有Ulp1(Ubiquitin-like-protein-specific proteases，泛素样蛋白特异性蛋白酶)催化，在哺乳动物中则有SENPs(sentrin-specific proteases，sentrin特异性蛋白酶)剪切完成[14]。所有的SUMO化修饰公用同样的E1活化酶和E2接合酶。这两种酶在结构和催化方式上与泛素化酶系统类似[15]。酵母的E1酶是由Aos1p(在脊椎动物中叫做SaeI)和Uba2p(在脊椎动物中叫做SaeII)组成的异质二聚体[16]。Aos1p-Uba2p催化作用下成熟形式的SUMO的C端和Uba2p形成了硫酯键从而使SUMO1得到活化，此过程消耗一个ATP[17]。

2.SUMO和疾病之间的关系

SUMO化从分子水平、细胞水平、甚至发育的个体水平影响各种生命活动过程，下面简要介绍下SUMO和疾病之间的关系[18]：

对许多蛋白来讲，被SUMO共价结合对自身的功能调节是很重要的。现在已经被证明可以被SUMO化的底物中有很多是与疾病相关的，例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生等[19]。

SUMO和癌症

一系列研究都指出SUMO化在肿瘤发生中有作用[18]。例如在许多人类癌症中都有发现UBC9水平的升高，并且过表达UBC9会促进癌细胞的生长[19]。在一些类型的癌症中SUMO E3酶PIAS3也有高的表达[20]，并且患有低生存率肝癌病人的肿瘤中SUMO E1酶的蛋白水平也有所提高[21]。另外，许多肿瘤抑制因子的活性受SUMO化的调节，比如p53、p63、p73和Mdm2[22]。另外，去SUMO化酶SENP在前列腺癌和甲状腺癌中的水平提高[23]。

SUMO和神经退行性疾病

许多在神经退行性疾病中有重要作用的蛋白都可以被SUMO化。这些神经退行性疾病及相关蛋白包括：亨廷顿症(huntingtin)，脊髓小脑性共济失调(ataxin-1)，帕金森症(tau，a-synuclein，DJ-1)，阿尔茨海默症(tau，APP)。

APP

阿尔茨海默病是最常见的老年神经性疾病，它能降低人的认知能力。现在普遍认为APP通过淀粉样蛋白水解途径产生Ab蛋白是阿尔茨海默产生的原因。而APP蛋白则在体外被证明是SUMO的靶蛋白，而其N端的b-secetase的酶切位置K587或K595可以被SUMO1和SUMO2修饰。K587和K595的缺失则增加了A-beta蛋白的聚集[24]暗示了sumo化可以降低A-beta的聚集水平。进一步的实验证明过表达SUMO E2酶UBC9可以提高APP的sumo化并降低A-beta的聚集。因此，干预APP的SUMO化反应可以提供另一种治疗阿尔茨海默病的方法。

亨廷顿症

亨廷顿症病人的蛋白huntingtin的N端有过多的多聚谷氨酸，由此导致了一些神经效应，包括运动功能的降低和认知功能的缺陷。已经证明huntingtinde在N端的Lys6、Lys9和Lys15位点可以被SUMO化。这些位点的SUMO化被认为可以降低huntingtin的聚集和提高huntingtin的稳定性，从而降低Poly-Q介导的多聚体的毒性[25]。

DJ-1

DJ-1的功能包括抗氧化，转录促进因子和分子伴侣，在早发性帕金森病中有1-2％是由DJ-1的突变引起的。DJ-1的K130位点可以被SUMO化，被SUMO修饰的DJ-1的Ras依赖的转化和细胞生长促进活性，并且能够使细胞抵抗UV引起的细胞凋亡[26]。

3.目前检测SUMO化的方法

SUMO化修饰对靶蛋白的功能起着重要的调节作用，鉴定特定的蛋白在特定的条件下是否能被SUMO修饰就变的异常重要。最直接最充分的方法是将内源的蛋白IP后用质谱分析。其次的方法是将内源蛋白IP后用SUMO抗体做WesternBlot检测。但是对于大部分的修饰靶蛋白来说只有很少比例的蛋白可以被修饰，使得上述两种方法都有困难，所以细胞过表达SUMO来增强靶蛋白的修饰是很多检测方法所采用的[27]。用过表达标签SUMO融合蛋白与质谱联用的方法是高通量检测蛋白翻译后修饰的常见思路，比如6His-SUMO的融合蛋白方法[28]，但这种方法的一个缺点是由于镍柱纯化His融合蛋白时与SUMO非共价结合的蛋白也可能纯化下来而被检测导致假阳性太多。解决的这个问题的办法是在变形条件下用镍柱来纯化，这样可有效去除和SUMO非共价结合的蛋白，例如含有SIM的蛋白等[27]。但是使用镍柱本身系统性问题还存在，镍柱的纯化原理是非共价结合，和哺乳动物细胞裂解液会有非共价结合从而导致假阳性，如果用更加严格的变形条件会使镍柱纯化效率降低而遗漏部分可能的底物。

3.1.体外SUMO化检测体系

A.用兔网织红细胞转录翻译体系表达被检测蛋白，然后用western blot来检测目的蛋白是否会有迁移条带出现[29]。

B.在体外纯化SUMO酶EI(SAEI，SAEII)、E2、Ubc9和待检测的底物，然后在缓冲液中30℃反应或者4℃过夜，western检测[30]。

3.2.细胞内检测体系

A.6His-SUMO纯化[30]

将Tag-底物和His6-SUMO的表达克隆转染进选定的细胞株内，培养36h后裂解细胞，用Ni+柱将SUMO及其SUMO结合物纯化下来，并用抗-tag的抗体western检测目的条带。

B.6His-SUMO稳定细胞株[27]

此方法是将6His-SUMO整合进目的细胞株基因组，形成稳定的表达株，然后就可以用上述A方法只用转染目的蛋白就可以，也可以不用转染直接检测生理条件下全细胞被SUMO化的蛋白，前提是要有对应蛋白的抗体。

C.PRET方法[31]

以上的方法均是以western为基础，而Calsion[31]所发展的方法则是以时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)为基础的试验方法检测的，在SUMO上连上标记FI，当底物被SUMO修饰后，抗底物上tag的抗体上的Tb激发F1从而可以被检测到，这种方法特别适合于高通量筛选底物。

4.常用蛋白标签(Tag)

目前蛋白Tag的主要作用是用来蛋白纯化和显影：

葡萄球菌蛋白A(Protein A)和LacZ是最早用来亲和纯化蛋白的两个标签，蛋白A是具有280个氨基酸的肽段，可以增强异源蛋白的稳定性和表达量，但是由于需要用IgG来亲和层析并且在pH比较低的条件下纯化，对融合蛋白的功能活性会有影响并且使用免疫方法分析蛋白复杂化。LacZ，也叫β-半乳糖苷酶，是具有蛋白水解稳定性的1024个氨基酸的肽段，可以和固定化的APTG亲和层析而得到纯化，但是由于蛋白太大会影响融合蛋白的功能活性而且在纯化条件下容易形成四聚体而现在不常用于蛋白纯化[32]。

His标签：最早在1991年His标签与被固定的金属离子被用于纯化半乳糖脱氢酶[33]。一般常用的是6His标签，它可以和二价的金属离子相互非共价结合从而将融合蛋白纯化出来，事实上2-10个His都可以用来与金属离子结合，金属离子包括Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺甚至Fe³⁺，其中以固定化的Ni²⁺最为常用，对于不同的蛋白也可根据经验来选择金属离子。His tag由于很小很少对蛋白的功能造成影响，在原核表达体系中是比较理想的纯化标签，但是在昆虫和哺乳动物表达体系中由于很多蛋白具有多His序列导致纯化的背景很强，所以不适于用于昆虫和哺乳动物表达体系。

谷胱甘肽转移酶(GST)蛋白标签：pGEX蛋白纯化系统被广泛采用，此质粒编码谷胱甘肽转移酶的N端肽段——通常所说的GST蛋白标签[34]。GST融合蛋白可以和谷胱甘肽琼脂柱相结合而得到层析纯化，但是由于细胞裂解液中的γ-谷酰基转肽酶对谷胱甘肽的影响，谷胱甘肽亲和柱使用寿命有限，只能重复使用4-20次。另外，26kDa的GST还可以在结合柱上从融合蛋白上移除，从而得到感兴趣的蛋白[32]。GST标签的缺点是表达的融合蛋白容易形成包涵体，由于GST与谷胱甘肽的结合需要三维结构，所以还要将包涵体复性才能得到纯化。另外就是GST标签比较大，而且还容意形成二聚体，会对融合蛋白的功能活性有所影响。

麦芽糖结合蛋白-MBP标签：能够编码MBP融合蛋白的E.Coli表达系统pMAL在1988年建立[35]。麦芽糖结合蛋白分子量45kDa，可以促进融合蛋白的表达量和可溶性。MBP融合蛋白一般用商业化的淀粉交联柱来亲和纯化，和谷胱甘肽柱一样，细胞裂解液也能减少淀粉交联柱的使用寿命，一般可以只使用3-5次。和GST一样，由于MBP分子量比较大，也会对融合蛋白的功能活性有影响。另外，MBP不能直接在纯化柱上切下，只能在游离的蛋白中切除，随后去除游离MBP有增加了蛋白纯化的复杂度。

几丁质内含子结合蛋白(Intem-Chitin Binding Domain，Intein-CBD)：Intein-CBD是可以自我剪切而不需要外加蛋白酶就可以得到原生蛋白的蛋白标签，来自与几丁质结合蛋白的内含子。Intein-CBD大肠杆菌表达质粒系统在1997年建立[36]。CBD融合蛋白可以通过和几丁质树脂结合而得到纯化，商业化的几丁质树脂可以至少重复利用五次，非特异性的结合可以用高盐或去垢剂洗除。几丁质内含子的剪切需要在50mM DTT条件下4摄氏度过夜。

Avi标签：AviTag蛋白是含有15个氨基酸的肽段，可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化，而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，基于这两个反应，AviTag^TM技术可以应用于蛋白的固定，纯化和显影[37，38]。固定化的AviTag标签融合蛋白的应用广泛，包括从高通量筛选到表面等离子体共振检测蛋白间相互作用等方面[39]。与抗生物素或链霉亲和素结合之后，AviTag标签融合蛋白就可以被多种方法检测，例如Western Blots和T细胞染色与分选中的MHC四聚体。

SNAP标签：SNAP蛋白标签是分子量为20kDa O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变蛋白，可以用O6-烷基鸟嘌呤来共价标记。和其他标记标签相比，SNAP在细胞内特异性标记不受细胞分区的影响，并且不需要添加额外的试剂[40]。SNAP所带的活性巯基位点可以接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤，这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的[41]。除了荧光标记，还可以事先将SNAP标签的底物——苯甲基鸟嘌呤固定在基质表面或纯化柱上，然后混合提取液中的融合蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接固定在了基质表面或纯化出蛋白[42]。

Halo标签：

标签蛋白是一种卤化烷脱卤素酶的遗传修饰衍生物，原生酶的分子量为33KDa的单体蛋白，可以切除卤代脂肪族化合物中的碳卤键，通过卤代烷烃对酶Asp106位的亲核攻击从而在Halo配体和Halo蛋白之间形成共价酯键，由于Halo蛋白在催化三联体中有一个关键突变(His272突变为Phe)从而使此酯键不会水解而得到稳定[43]。Halo蛋白标签能融合在重组蛋白的N端或C端，并在原核或真核系统中表达。Halo标签的配体由两个关键组分组成：一个通用的HaloTag反应联结子，结合HaloTag蛋白；另一个是功能基团，例如荧光染料或亲和媒介，从而使Halo标签具有蛋白定位显影标记和富集等作用[44，45]。

在文章[30]中作者将Tag-底物和His₆-SUMO的表达克隆转染进选定的细胞株内，培养36h后裂解细胞，用Ni+柱将SUMO及其SUMO结合物纯化下来，并用抗-tag或感兴趣蛋白的抗体western检测目的条带的迁移可以确定待检测蛋白是否具有被修饰的能力。由于6His标签和Ni+柱的结合是非共价结合，用此种方法拉下来的总蛋白中总会有没有被SUMO化修饰的蛋白，比如说含有SIM(SUMO-Interaction-Motif)的蛋白和与SUMO修饰蛋白相互作用的蛋白[27]。在文章[27]中，作者在变性的条件下用6His和Ni+柱纯化体系来去除非特异性结合蛋白，但是此条件下有可能降低Ni+纯化效率。这个问题的一个解决办法就是通过采用共价结合方法来富集总蛋白的标签来和SUMO融合从而在变性条件下去除非与SUMO非共价结合的杂蛋白并且不会影响被修饰总蛋白的富集效果。

发明内容

本发明提供一种如下所示的融合蛋白：

Tag-SUMO

其中，Tag表示蛋白标签，选自Avi标签，SNAP标签和Halo标签，SUMO即类泛素化小蛋白，所述融合蛋白具有SUMO化能力。

实施方式之一中，所述融合蛋白包含有柔性连接肽，如下所示：

Tag-L-SUMO

其中，L表示柔性连接肽。柔性连接肽的作用在于避免蛋白标签和SUMO之间在空间上相互干扰，是融合蛋白技术中的常用技术和常用元素，本领域技术人员可以在大量现成的柔性连接肽中进行选择，也可根据普遍原则和具体需要方便地自行设计。例如，本发明采用9个氨基酸的柔性连接肽。实施方式之一中，本发明选用了SSGLVPRGS所示的柔性连接肽。

如前所述，SUMO分子在结构上与高度一致，具有相同的修饰机理。因此，本发明SUMO可选用任一类泛素化小蛋白，尤其是其成熟形式。实施方式之一中，SUMO部分是人类SUMO1的成熟形式(NCBI登录号NP_001005781的蛋白质，登录号NM_001005781的编码核酸(mRNA)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/54792065？from＝1&to＝97&report＝gpwithparts)其编码核苷酸序列为：

atgtctgaccaggaggcaaaaccttcaactgaggacttgggggataagaaggaaggtgaatatattaaactcaaagtcattggacaggatagcagtgagattcacttcaaagtgaaaatgacaacacatctcaagaaactcaaagaatcatactgtcaaagacagggtgttccaatgaattcactcaggtttctctttgagggtcagagaattgctgataatcatactccaaaagaactgggaatggaggaagaagatgtgattgaagtttatcaggaacaaacggggggt  (SEQ ID NO：12)。

本发明还提供一种核酸分子，可以是编码本发明融合蛋白的核酸分子或其互补链。本发明还提供一种载体，加载了以上所述的核酸分子，优选表达载体，例如原核生物表达载体，即能够在原核宿主细胞内表达目标蛋白的载体，和哺乳动物表达载体，即能够在哺乳动物细胞内表达目标蛋白的载体，这些都是本领域技术人员所熟悉的。

本发明还提供一种在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，包括：在体外SUMO化修饰体系中，将被检测蛋白与本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白接触，然后检测被检测蛋白的SUMO化产物。体外SUMO化修饰体系之前已经建立，是将SUMO化修饰酶体系中的Ubl激活酶(E1)(脊椎动物中的SaeI和SaeII)与Ubl转移酶(E2)(Ubc9)分别体外纯化，最后将SUMO1和待检测的靶蛋白加入该体系进行反应[46]

检测蛋白SUMO化产物的方法也是本领域技术人员所熟悉的，例如免疫沉淀(IP)、质谱(MS)、WesternBlot检测、时间分辨荧光共振能量转移法(TR-FRET)、电泳、蛋白质或肽或其它标签法、亲和及其它层析、免疫荧光，以及它们的联用等。

本发明还提供一种体外检测SUMO化的系统，包含本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白，纯化的Ubl激活酶(E1)，Ubl转移酶(E2)和Ubc9，以及SUMO化反应缓冲液[30]。可以将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器和关于使用该试剂盒体外检测SUMO化的说明。

本发明还提供一种细胞内检测SUMO化的方法，包括用编码本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子，可选的编码Ubc9的核酸分子和/或可选的编码待检测蛋白的核酸分子共转染宿主细胞，培养宿主细胞，裂解细胞，检测被检测蛋白的SUMO化产物。生理条件下检测蛋白SUMO化是不需要共转染过表达Ubc9和待测蛋白的，如参考文献[39，Kim，2006]和[13，Tatham，2009]所述。所述宿主细胞优选动物细胞，例如Hela细胞。转染动物细胞的方法是本领域技术人员所熟悉，例如Lipo-Plus转染法。

实施方式之一中，还包括在检测蛋白SUMO化产物之前通过免疫沉淀或亲和层析步骤处理细胞裂解物。通过用免疫沉淀\亲和层析\磁珠纯化方法处理细胞裂解液可以进一步的富集待检测底物，便于后续的检测。

实施方式之一，细胞内检测SUMO化的方法包括：

(1).将被检测蛋白的ORF装载到表达载体中，优选M11，

(2).将步骤(1)制备的载体同本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白和Ubc9的表达载体一同转染到宿主细胞中，优选Hela细胞，所述融合蛋白优选SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白，

(3).培养细胞以获得各蛋白的表达，

(4).收细胞后检测被检测蛋白的SUMO化产物，例如通过电泳(例如PAGE胶)和免疫荧光方法鉴定是否有蛋白条带迁移来检测SUMO化产物。

本发明还提供一种检测细胞内SUMO化的系统，包含：编码本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白的表达质粒，可选的编码Ubc9的表达质粒和转染试剂。所述融合蛋白优选SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白。所述转染试剂指完成转染所需的各种辅剂，例如转染诱导剂、强化剂等，例如Lipo-Plus转染法中的lipo转染剂和plus转染剂。可以将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器和关于使用该试剂盒体外检测SUMO化的说明。

本发明还提供一种筛选SUMO化蛋白底物的方法，包括

提供作为SUMO化底物的候选蛋白，优选在高置信条件下用预测蛋白的被

SUMO化能力的分析软件筛选作为SUMO化底物的候选蛋白，

检测候选蛋白的SUMO化，所述检测采用本发明所述在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，或者采用本发明所述细胞内检测SUMO化的方法，或者两者的联用，

若检测到候选蛋白的SUMO化产物，表明候选蛋白是SUMO化蛋白底物。

本发明还提供一种检测细胞内可被SUMO修饰的靶蛋白的方法，包括：

在细胞内重组表达SNAP-SUMO融合蛋白，

将细胞裂解液与结合、优选共价结合所述融合蛋白中标签的载体接触，所述载体优选微载体，例如珠粒

可选性地包括在变性条件下去除非特异非共价结合的杂蛋白，所述变性条件是指在纯化过程中可以使用任何严格的条件使非共价结合的蛋白洗除得到低背景的质谱结果。这样的变形条件是本领域技术人员所知道的，例如SNAP使用中的变性条件[见前文]。His等非共价纯化则不能使用此条件。

分析与载体接触的靶蛋白信息，例如采用WesternBlot或者MS等方法。

本发明所述Tag-L-SUMO融合蛋白或编码本发明Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子可用于制造诊断SUMO化相关疾病的制剂的用途，所述疾病例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生。

本发明采用的是不同于6His纯化的标签Avi，SNAP和Halo。Avi生物素化后有非常强的亲和力，甚至强于某些共价键；SNAP和Halo是最近常用的细胞内显影蛋白标签，可以和底物形成共价键从而得以纯化和标记。用共价键纯化系统要比His变性体系方法步骤简单并且理论上有更少的假阳性。

本发明建立了SNAP标签融合SUMO蛋白的方法来检测可被SUMO修饰的靶蛋白。SNAP标签在生物学上可用于显色标记、蛋白纯化，本方法的基本原理为在细胞内表达SNAP-SUMO融合蛋白一段时间后用可与SNAP标签共价结合的珠粒(Beads)拉出所有被SNAP-SUMO修饰的靶蛋白，然后用WesternBlot或者MS进行分析可得到所有靶蛋白信息。相较于其他检测蛋白SUMO化的方法，此方法在细胞内能够高效的对蛋白进行SUMO化修饰，并能够利用成熟方法拉出(pull-down)所有被融合蛋白SUMO化修饰的靶蛋白，还能够在变性条件下有效去除非特异非共价结合的其他杂蛋白，从而得到比较准确的检测结果。同时还可以将此方法与质谱连用，能够高通量检测全细胞蛋白的SUMO化修饰。

利用建立的SNAP-SUMO融合蛋白的检测方法小规模的从14个转录因子中筛选出FOXP2和ESX1两个可以被SUMO1修饰的蛋白，并在体外进行了验证，第一次阐释了SUMO化修饰可能在这两个蛋白所参与的人类语言形成和生殖系统发育过程中发挥重要作用。由此可以预见，可以通过调控FOXP2和ESX1的SUMO化来调控人类语言形成和生殖系统发育过程。例如，可以预见，FOXP2和ESX1的SUMO化调节剂可用于制备人类语言和精子发生的药物。

本发明将Avi，SNAP和Halo标签技术应用到SUMO翻译后修饰检测体系中，并且首次在细胞内和体外阐释了这三种标签SUMO融合蛋白对靶蛋白修饰能力和效率的影响。在Hela细胞过表达体系中，用已知的靶蛋白RANGAP1和SART1作为阳性底物结果显示，成熟形式的Avi-L-SUMO1，SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1都能够对靶蛋白修饰，而且和不带蛋白标签的SUMO1相比，SNAP-L-SUMO1与Halo-L-SUMO1对底物的修饰能力更强(图3)，甚至在不用富集的条件下就可以看到修饰的迁移条带，在Hela细胞过表达体系中四种SUMO1的修饰能力关系为：SNAP-L-SUMO1＞Halo-L-SUMO1＞Avi-L-SUMO1＝SUMO1。

用在大肠杆菌中纯化的Ubl激活酶(E1)，Ubl转移酶(E2)，SUMO1s建立的体外修饰体系结果表明，不带标签(除去纯化标签6His，后同)的SUMO1对每种阳性底物都有很好的修饰活性，但是Avi-L-SUMO1，SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1的修饰依据底物不同有所改变，比如对Top1-1的修饰能力和SUMO1相当，对SART1的修饰能力弱于SUMO1，但对RANGAP1的几乎检测不到迁移的修饰条带(图2)。这和在Hela细胞过表达的情况差别很大，也决定了此三种标签融合蛋白不适合用于体外SUMO化修饰的检测，但是可以辅佐证明细胞实验的结果。

本发明在Hela细胞过表达体系中证明了SNAP/Halo-L-SUMO1可以用于SUMO化修饰检测，并且与SUMO1相比SNAP/Halo-L-SUMO1修饰效率高以至于不用富集直接用裂解液Western就可以检测到蛋白修饰迁移条带。此检测体系相比其它反应体系更加简单通用，很适合小批量的检测SUMO化底物。本发明选用效率最高的SNAP-L-SUMO1小范围的筛选SUMO化底物进一步证明该高表达体系的作用。用SUMOsp2.0根据一些原则选出了14个人转录因子(表3)，分别和SNAP-L-SUMO1和E2共转染进Hela细胞，筛选到两个转录因子FOXP2和ESX1有迁移条带，进一步用SUMO特异的Ulp1酶切和体外反应体系验证确实是被SNAP-L-SUMO1修饰(图4)。

FOXP2(Forkhead Box P2)位于人类染色体7q31，主要剪切体是具有715个氨基酸的Forkhead家族转录因子。突变的FOXP2能引起严重的遗传性说话和语言障碍[47]，而同源基因FOXP1，FOXP3，FOXP4在癌症中起作用[48]。人和黑猩猩的FOXP2在进化中有两个氨基酸的差别，目前认为正是这两个氨基酸的突变促进了人类的进化加速。马普人类进化学院的Svante Paabo通过将人FOXP2两个氨基酸位点引入到小鼠Foxp2，这些小鼠大体上健康，但是却有不同性质的超声发音[49]。相比黑猩猩FOXP2，人类FOXP2在人神经细胞中可以显著的上调了61个基因和下调55genes，这些基因可能参与人与黑猩猩言语差异的分子机制[50]。有实验证据显示Wnt信号转导通路中的Lef1可以与foxP2基因增强子结合，在CNS发育过程中Lef1对于foxP2的表达是必须的，说明FOXP2的上游受wnt信号调控[51]。Foxp2还可与Nkx2.1的homeodomain相互作用从而抑制了Nkx2.1介导的SP-C的转录[52]。现在发现了FOXP2有SUMO化修饰，进一步可以确定SUMO化修饰的具体位点，研究SUMO化可能会改变FOXP2的空间定位或与蛋白质相互作用从而控制下游基因的转录或其它行为，乃至影响到人类语言的形成。

人ESX1(Extraembrionic spermatogenesis homeobox 1gene，Xq22.2)选择性表达在睾丸、胎盘、脑和肺组织中[53，54]，基因敲除雄性小鼠在精子发生没有明显的缺陷，但是会影响雌性小鼠的胚胎发育和胎盘大小[55]。人源ESX1和鼠源的Esx1都含有谷氨酸富集的具有同源异形结构域N端和脯氨酸富集的C端。全长的ESX165kDa，可以酶水解为N端45kDa和C端20kDa的两条肽，N端蛋白定位在核中作为转录因子而C端肽端在细胞质中稳定Cyclin[56]。ESX1人和鼠之间有34％的序列差异，这些差异大部分都在C端。生物信息学分析表明在灵长类动物中ESX1C端的进化速率大于X染色体上的进化速率，属于阳性选择，这也表明了ESX1参与雄性生殖。人源ESX1在培养细胞中能够阻止有丝分裂Cyclin降解，ESX1的过表达可以使CyclinA和CyclinBI的聚集从而使细胞静息在M期[57]。ESX1作为SUMO化靶蛋白这一发现对ESX1进一步的研究提供了新的方向，暗示了SUMO可能在生殖系统调控上也发挥重要作用。

用SNAP-L-SUMO1在细胞过表达体系中检测出两个SUMO化修饰靶蛋白FOXP2和ESX1，在低通量水平上证明了SNAP-L-SUMO1可以用于SUMO化底物的检测。用SNAP纯化珠将过表达细胞体系中所有SNAP-L-SUMO修饰的蛋白富集下来并用质谱方法分析可以在高通量水平上检测整个基因组在特定条件下的SUMO化修饰靶蛋白。考虑到SNAP的共价亲和特性，这种高通量方法理论上比6His标签检测体系更为精确。

附图说明

图1：Tag-L-SUMO1s融合蛋白在Hela细胞的表达和在大肠杆菌中的表达纯化；(A)显示SUMO 1、Avi-L-SUMO 1、SNAP-L-SUMO 1和Halo-L-SUMO 1在Hela中的过表达，LacZ为阴性对照；(B)、(C)和(D)分别显示Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1体外的表达与纯化，其中，CC：对照细胞；IC：诱导表达细胞；CS：细胞上清；CP：细胞沉淀；Ft：穿出液；WS：洗脱液；10：用含浓度为10mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液；250：用含浓度为250mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液。

图2：用体外SUMO化体系检测SUMO1融合蛋白的SUMO化修饰能力。A：检测SUMO1，Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对靶蛋白Topl-1-flag的SUMO化修饰能力，S1为不带标签蛋白的SUMO1，Avi/SNAP/Halo-S1分别表示Avi-L-SUMO 1、SNAP-L-SUMO 1、Halo-L-SUMO 1；B：检测SUMO 1，Avi-L-SUMO 1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对靶蛋白Flag-SART1的SUMO化修饰能力；C：检测SUMO1，Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对靶蛋白Flag-RANGAP1的SUMO化修饰能力；D：flag-RANGAP1和Flag-SART1在体外的表达与纯化，其中，CC：对照细胞；IC：诱导表达细胞；CS：细胞上清；CP：细胞沉淀；Ft：穿出液；WS：洗脱液；10：用含浓度为10mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液；250：用含浓度为250mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液。

图3：Hela细胞过表达实验检测标签-SUMO1融合蛋白的SUMO化修饰能力。A：检测SUMO1，Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对靶蛋白Flag-SART1的SUMO化修饰能力，其中，-：LacZ质粒，S1：无标签SUMO1，Avi-S1：Avi-L-SUMO 1，SNAP-S 1：SNAP-L-SUMO 1，Halo-S 1：Halo-L-SUMO 1；B：检测SUMO 1，Avi-L-SUMO 1、SNAP-L-SUMO 1、Halo-L-SUMO 1对靶蛋白Flag-RanGAP 1的SUMO化修饰能力，其中，-：LacZ质粒，NT：无标签SUMO1，Avi：Avi-L-SUMO1，SNAP：SNAP-L-SUMO 1，Halo：Halo-L-SUMO 1。

图4：在Hela细胞系与体外SUMO化修饰体系证明FOXP2和ESX1可以被SUMO化。A：在Hela细胞过表达体系中Flag-FOXP2可以被SNAP-L-SUMO1修饰；B：体外验证Flag-FOXP2的SUMO化修饰。NT：无标签SUMO1，SNAP：SNAP-L-SUMO1；C：在Hela细胞过表达体系中Flag-ESX1可以被SNAP-L-SUMO1修饰；D：体外验证Flag-FOXP2的SUMO化修饰。SNAP-SUMO 1：SNAP-L-SUMO 1。

本发明的实施方式

除非特别说明，本发明所用术语的含义均按照相关领域公知的广义含义来理解。

1.材料与方法

1.1质粒的构建

1.1.1.材料与产物

将SUMO1成熟蛋白的编码序列以EcoR1/XhoI双酶切位点分别装载到pET28a和M02中得到质粒SUMO1-pET28a与质粒SUMO1-M02Rx。

以SUMO1-M02Rx为模板用引对P1/P2PCR得linker-SUMO1(人类SUMO1NG011679的成熟形式)的ORF，然后以限制性内切酶对ACC65I/NotI消化并分别装载到预先酶切好的M05、M24.1x和M49x载体中，从而得到linker-SUMO1-M05、linker-SUMO1-M24.1x、linker-SUMO1-M49x。“linker”或缩写“L”表示柔性连接肽Avi-linker-SUMO 1-pET28a、SNAP-linker-SUMO1-pET28a、Halo-linker-SUMO1-pET28a则是以linker-SUMO1-M05、linker-SUMO1-M24.1x、linker-SUMO1-M49x质粒为模板用引物对P3/P2、P4/P2、P5/P2PCR后限制性内切酶消化后装载到pET28a后得到。

人类基因RANGAP1(NM_002883.1)、FOXP2(NM_148899)、ESX1(AK097704.1)，SART1(BC001058.2)基因模板均从Genecopoeia公司获得，分别通过引物对P6/P7，P8/P9，P10/P11装载到M11和flag-pET28a载体中得到质粒FLAG-RANGAP1-pET28a，RANGAP1-M11，FLAG-ESX1-pET28a，FLAG-FOXP2-pET28a。FLAG-SART1-pET28a和SART1-M11则通过直接酶切亚克隆获得。

其他质粒均从Genecopoeia公司得到，包括DIDO1-M11，EPAS1-M11，MGC29891-M11，MYBL2-M11，NFIL3-M11，L3MBTL-M11，MYEF2-M11，ESRRG-M11，ERG-M11，MLXb-M11，FOXA2-M11，CREB5-M11，ATF4-M11，FOXM1-M11，LCORL-M11，ATF6-M11，FAM48A-M11。

载体信息：

pET28a：Invitrogen公司，带6His蛋白标签，用于在大肠杆菌株BL21中用IPTG诱导蛋白表达纯化。

M02Rx：Genecopoeia公司，不带标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。

M05：Genecopoeia公司，带N端Avi标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。

M11：Genecopoeia公司，带N端flag标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。

M24.1x：Genecopoeia公司，带N端SNAP标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。

M49x：Genecopoeia公司，带N端Halo标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。

引物信息：

1.1.2.方法：

A PCR

反应体系：

模板：0.2μl；

引物F/R：1/1μl；

Pfu酶：1μl；

10×Pfu缓冲液：5μl；

dNTP：1μl；

H2O：41μl；

PCR程序：

95℃，2min→〔94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，60sec〕×27→72℃，10min

B.各基因片段的PCR产物的胶回收：(QIAEX II Gel Extraction Kit 150)：

参照QIAGEN产品说明书：

(1)用Eppendorf管装含有DNA片段的凝胶，称重。

(2)若DNA片段长在100bp到4kb之间，加入3倍体积的缓冲液QX1；

若DNA片段长大于4kb，加入3倍体积的缓冲液QX1和2倍体积的水；

若DNA片段长小于100bp，加入6倍体积的缓冲液QX1；

(3)加2μl QX II Suspension，颠倒混匀；

(4)50℃温浴10min，并每2min混匀一次。观察颜色是否为黄色。

(5)10000rpm离心30sec，去上清，加500μI缓冲液QX I，混匀。

(6)10000rpm离心1min，去上清，加500μl Wash缓冲液，混匀，此步骤重复一次；

(7)10000rpm离心1min，去上清，置超净台10min至乙醇挥发完全。

(8)加入20μl缓冲液EB，于50℃洗脱10min。10000rpm离心1min后取上清18μl移入干净Eppendorf管中待用。

C.载体以及各基因片段的PCR产物的酶切

PCR回收产物酶切体系(37摄氏度水浴3h)：

回收片段：15μl；

EcoRI：0.5μl；

20μl XhoI：0.5μl；

缓冲液EcoRI：2μl；

H2O：2μl；

表达载体片段的酶切体系(37摄氏度水浴3h)：

载体：2μg

EcoRI：0.5μl；

20μl XhoI：0.5μl；

缓冲液EcoRI：2μl；

H2O：补至20μl；

D.连接和转化

酶切过的pET28a载体和酶切回收的插入片段按照1∶3分子比混合于5×连接缓冲液中，加入T4DNA连接酶，室温连接2-3小时后转化E.coli感受态细胞DH5α。

E.基因质粒的酶切鉴定及测序

(1)碱裂解法小抽用于检测的质粒

1mL裂解液配法：730μl H2O

200μl 10％SDS

50μl 2M NaOH

20μl 500mM EDTA

挑取饱满的克隆于含有合适抗生素的培养基中37℃过夜培养(12～14h)含所需质粒的菌体。

取0.8～1ml过夜菌于1.5ml的Eppendorf管中，离心7000rpm×1min，去上清。

加100μl H2O悬浮细胞。

加100μl裂解液，轻轻混匀，反应2～5分钟。

加入50μl预冷1M的MgCl2，混匀，冰上放置至少2min，离心13000rpm×2min。

加入50μl预冷5M的KAc，混匀，冰上放置2min，离心13000rpm×2min。

取上清(约300μl)至新管，加入0.6ml预冷的100％乙醇，混匀，离心13000rpm×2min。

小心去尽上清，500μl 70％乙醇室温洗涤沉淀，13000rpm×1min，真空泵吸干洗涤液体。

置超净台5～10min使乙醇挥发完全。

用20μl TE(含0.1μl RNase)溶解待用。

(2)对构建好的各基因质粒进行酶切鉴定，确认基因片段插入载体，并委托Invitrogen/美季公司进行测序确认正确插入。

1.2蛋白的表达与纯化

以下实施例中，体外反应体系中所用的融合蛋白均在大肠杆菌BL21菌株中IPTG诱导表达，使用NTA-Ni⁺柱亲和系统体外纯化。

融合蛋白在E.coli BL21菌株中表达与纯化：

(1)重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养过夜(12～14小时)；

(2)取上述培养菌液作为母液按1∶100比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8(取200μL菌液标记为CC)，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)16℃培养16-20h(或37℃4h)(取样200μL菌液标记为IC)；

(3)5000rpm*5min离心收集菌体.将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂的破菌缓冲液NTA-Ni⁺磷酸缓冲液(体积比1∶10)中4℃消化1h；

(4)冰上超声波破碎至澄清，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgS04至终浓度20mM，冰上消化至不粘(取20μl标记为WC)。4℃高速离心(13000rpm/min)20min.

(5)取上清清裂解液与相应体积的Ni-NTA树脂在4℃混合60分钟后进行装柱。同时取上清20μL标记为CS，将沉淀悬浮于与破军缓冲液等体积后同取20μL标记为CP)

(6)用10倍柱体积的含20mM咪唑的洗涤缓冲液进行洗涤。用2倍柱体的含250mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，并收集。

(7)洗脱的蛋白质在透析液(20Mm Tris-HCl，200mM NaCl，50％甘油，0.1mMDTT)中透析过夜，透析后的蛋白质于-20℃保存。

注：体外SUMO化蛋白RANGAP1时用的是未过柱前的上清，即步骤(5)中的CS。

1.3.体外蛋白SUMO化修饰体系

采用50ul反应体系，加入体外纯化好的SUMO化(SUMOylation)所需要的酶His-SAE I(2μg)，His-SAE  II(2μg)，His-UBC9(400ng)以及His-SUMO1/His-Avi-SUMO1/His-SNAP-SUMO1/His-Halo-SUMO1(SUMO1蛋白的成熟形式(400ng)和相应的检测底物flag融合蛋白(1μg)到2X反应缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，10mM MgCl2)中。反应体系中DTT和ATP其终浓度分别为1mM和10mM，最后用水补足至50μl。然后在30℃中反应1-3小时(或者4℃反应过夜)，反应结束后，加入6X上样缓冲液(loading Buffer)，100℃灭活煮样5min，用Flag抗体Western Blot检测。

1.4.细胞内过表达SUMO化修饰体系

用QiaGEN公司的QIAprep Spin Miniprep Kit 250试剂盒，抽提转染所需要的DNA质粒。将制备好的相应质粒用Invitrogen公司的Lipo-Plus转染方法转染至Hela细胞中表达和反应，最后裂解Hela细胞用western方法检测SUMO化蛋白的条带迁移。具体步骤如下：

A.转染用质粒的制备：

(1)分次取3mL过夜菌于1.5mL的离心管中，8,000rpm离心1分钟，去上清。

(2)加250μL缓冲液P1(Qiagen)，振荡器充分悬浮菌块。

(3)加250μL缓冲液P2(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，室温静置置至溶液变粘稠，不要超过5分钟。

(4)加350μL缓冲液N3(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，冰上放置10分钟。

(5)13,000rpm离心10分钟，取上清到柱中。13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

(6)加750μL缓冲液PE(Qiagen)，13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

(7)13,000rpm离心1分钟，将柱子置于一干净离心管中，室温放置10分钟。

(8)加洗脱缓冲液(Qiagen)50μl，放置2分钟。

(9)13,000rpm离心2分钟，穿出液接在离心管中，得到高纯度的质粒DNA。

(10)测量并记录质粒的浓度。

B.细胞的培养与转染(将质粒DNA转入到哺乳动物细胞中)

Hela细胞，使用MEM+10％FBS的培液在37摄氏度5％的CO₂浓度下的培养箱中培养，当细胞长到实验所需的满度时(一般为24小时)，同时细胞状态良好(在显微镜下观察后判断得到)，则可用于转染(以下实施例以24孔盘为例，其它微滴板按比例放缩)：

(1)在EP管中加入25μl不含血清的DMEM，再将所需转染质粒(总量为250ng：150ng待检测蛋白基因-M11质粒，75ng Ubc9-M02Rx质粒，25ngSUMO1-M02Rx/M05/M24.1x/M49x质粒，对照用LacZ相应的补平)加入其中，然后再加入1μl转染试剂Plus，混匀，静置15分钟；；

(2)换液：小心平稳取出培养中的细胞，用小枪头吸尽培液，再分别缓慢延壁小心加入200ml的不含血清的DMEM(尽量不将细胞吹起)，然后迅速放回37摄氏度培养箱(如本领域技术人员所知，在室温中放的时间过长会影响细胞状态)，放置20min；

(3)在25μl不含血清的DMEM中加入1μl转染试剂Lipo，混匀后加入(1)中所述EP管中，混匀，静置15分钟；

(4)将混匀含质粒试剂50μl均匀滴加到细胞培养盘的目标孔中(一般最少有一个复孔，以避免实验误差)，轻轻混匀，迅速放回培养室；

(5)转染3小时后终止，将盘取出，用小枪头快速吸尽培液，再加入500ml含10％血清的MEM进行培养；

(6)42-44小时后收细胞(如本领域技术人员所知，针对不同的细胞及实验目的，收细胞的时间不一定，如果是做RNAi实验，则转染后培养48小时后收获；如果是一般的表达实验，则24-48小时)

C.用Western Blot鉴定被检测蛋白是否被SUMO化

(1)转染42小时后取出Hela细胞，吸去上清，(以24孔盘为例)每孔先用500μl PBS缓冲液洗一遍，然后加入100μl裂解缓冲液(150mM NaCl，25mM Tris-HCl，pH 7.8，0.1％Nonidet P40和1mM EDTA(含完全蛋白酶抑制剂混合物(completeprotease inhibitor cocktail)(购自sigma公司)和0.2％SDS))裂解细胞，收样。

(2)将上述样品加入6X SDS上样缓冲液，100℃灭活煮样5min，准备SDS-PAGE电泳。

(3)转膜(湿式电转仪，Bio-Rad)：把SDS-PAGE胶浸泡在常规的电转移缓冲液中30分钟。在电转移板上依次铺两层缓冲垫片和一层滤纸，把胶铺在滤纸上，再铺上硝酸纤维素膜覆盖目的蛋白所在区域，再铺一层滤纸和两层缓冲垫片。把电转移板夹好。接通恒流电源(250mA)，转膜60分钟。

(4)将转好的膜放置于5％脱脂牛奶中摇晃封闭1小时。用洗涤缓冲液TTBS(10×缓冲液的配方是：Tris 24.2g，NaCl 87.74g，Tween 5g，pH 8.0，补水至1L)漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(5)把膜浸在与被检测蛋白相应的一抗中(此文中一般检测用anti-flag的抗体，也有直接用蛋白抗体，如anti-FOXP2的抗体)，溶液中摇晃1小时。用洗涤缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(6)再将膜浸在含二抗的溶液中摇晃0.5小时，用缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(7)用红外荧光成像仪(Odyssey)观察结果。

2.实施例与结果

2.1.构建各种Tag-Linker-SUMO1质粒，并在体外纯化蛋白底物。

本实施例选用Avi，SNAP，Halo三种蛋白标签(Tag)作为人源SUMO1的N端蛋白标签。Avi是具有15个氨基酸的肽段，可以在体内与体外被生物素连接酶生物素化，然用具有和生物素非常强的非共价结合能力的亲和素富集融合蛋白或者western检测感兴趣的蛋白，生物素与亲和素的结合能力要强于某些共价键。SNAP有181个氨基酸，可以和底物苯甲基鸟嘌呤反应以硫醚键共价结合到苯甲基的侧链上从而富集融合蛋白或者标记融合蛋白。Halo有311个氨基酸，同样具有和配体共价结合的能力。考虑到要在体外建立SUMO化修饰体系，所以融合蛋白中选用SUMO1的成熟形式。本发明提到的SUMO均为成熟形式，除非另外特别说明)。SNAP分子量20kDa，Halo更大约33kDa，为避免蛋白标签和SUMO1之间在空间上相互干扰，在融合蛋白标签和SUMO1之间加入了柔性的九个氨基酸的柔性连接肽(linker)(SSGLVPRGS)。用不带标签的SUMO1作为阳性对照。

如前文“材料与方法”部分“1.1.2方法”所述构建可以在哺乳动物细胞内表达的Tag-linker-SUMO1的质粒，本实施例选用广州复能公司(genecopoeia)的哺乳动物表达载体M05，M24.1和M49，这三种质粒分别含有N端Avi，N端SNAP和N端Halo标签。最终得到三个哺乳动物表达质粒linker-SUMO1-M05、linker-SUMO1-M24.1x、linker-SUMO1-M49x(此后“linker”即柔性连接肽简称L)。

按照前文“材料与方法”部分1.4/A和B所述，分别将25ng的LacZ，SUMO1-M02，L-SUMO1-M05、L-SUMO1-M24.1x、L-SUMO1-M49x用Lipo-Plus方法转染到24孔盘的Hela细胞中，42小时后裂解细胞电泳后用SUMO1抗体WesternBlot检测。如图1A所示，此三种质粒转染到哺乳动物细胞Hela中都能够很好的表达。其中，不带任何蛋白标签的表达SUMO1的质粒SUMO1-M02为阳性对照。

按照“材料与方法”1.4/A所述，所得质粒用Spin方法抽提并测浓度后存放于-20℃，用于以后在Hela细胞中检测SUMO化修饰。

图1(A)显示SUMO1、Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1在Hela中的过表达，LacZ为阴性对照。分别将25ng的LacZ，SUMO1-M02，L-SUMO1-M05、L-SUMO1-M24.1x、L-SUMO1-M49x用Lipo-Plus方法转染到24孔盘的Hela细胞中，42小时后裂解细胞电泳后用SUMO1抗体WesternBlot检测。图1(B)、(C)和(D)分别显示Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1体外的表达与纯化。如“材料与方法”1.2部分中所述，(B)(C)(D)均使用大肠杆菌B121菌株使用pET28a表达纯化体系纯化蛋白，在37℃用100μM IPTG诱导融合蛋白表达4h，各步骤的各样品SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色，CC：对照细胞；IC：诱导表达细胞；CS：细胞上清；CP：细胞沉淀；Ft：穿出液；WS：洗脱液；10：用含浓度为10mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液；250：用含浓度为250mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液。

如“材料与方法”1.1部分所述，以构建好的Tag-L-SUMO1的质粒L-SUMO1-M05、L-SUMO1-M24.1x、L-SUMO1-M49x为模板分别将Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1的ORF通过PCR克隆出来后装载到pET28a原核表达质粒上，得Avi-L-SUMO 1-pET28a、SNAP-L-SUMO 1-pET28a、Halo-L-SUMO1-pET28a。质粒pET28a的N端带有6His蛋白标签，可以用Ni+柱方法将融合蛋白纯化。如“材料与方法”1.2部分所述表达并纯化，结果见图1B-D。

纯化出的Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1用含有50％甘油的透析液透析后放于-20℃保存，以后用于体外SUMO化修饰实验。

2.2在体外检测分析各种Tag-SUMO1的SUMO化能力

为了鉴定我们选择的三个蛋白标签与SUMO1融合蛋白的SUMO化修饰能力是否受到影响，需要先在体外SUMO化修饰体系中验证。体外SUMO化修饰体系之前已经建立，是将SUMO化修饰酶体系中的Ubl激活酶(E1)(脊椎动物中的SaeI和SaeII)与Ubl转移酶(E2)(Ubc9)分别体外纯化，最后将SUMO1和待检测的靶蛋白加入该体系进行反应[46]。Ubc9是目前唯一知道的SUMO化修饰E2SUMO接合酶[58]，通过自身的活性部位的Cys结合被活化的SUMO。

如“材料与方法”的1.3部分所述，在体外蛋白SUMO化修饰体系中检测分析各种Tag-SUMO1的SUMO化能力：将SUMO化修饰的E1、E2酶与带flag标签的底物和SUMO1在体外SUMO化体系中30℃反应3小时(h)后SDS-PAGE、转膜，用抗Flag的一抗和对应的鼠荧光二抗Western检测扫膜。

用Top1-1肽段(SEQ ID NO：13)作为体外SUMO化修饰的一个阳性对照。Top1-1是人蛋白拓扑异构酶Top1[59]的1-200个氨基酸的片段，可以被多重SUMO化。本实验也首先用Top1-1来检测Tag-SUMO1与不带Tag的SUMO1之间SUMO化修饰能力之间的差异。如图2A所示，各种SUMO1融合蛋白包括SUMO1，Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对Top1-1的SUMO化修饰能力无差异，都能够使Top1-1发生多重SUMO化修饰从而在Top1-1-flag条带上出现多条迁移条带。另外，为了便于用Western检测，Top1-1的C端融合有Flag标签从而可以用anti-flag的抗体联合荧光二抗检测迁移条带。

SART1，又名低氧相关因子(Hypoxia-associated factor)，有位于细胞核内的800个氨基酸和在胞质中259个氨基酸两种蛋白形式，被认为在细胞的增殖中发挥作用。SART1是一个泛素化的E3连接酶，可以泛素化HIF1α并导致其氧依赖性降解[60]。据报道SART1可以被SUMO1和SUMO2修饰，修饰化发生在K94，K141，K709，K742位点[12，61]。本发明选用800氨基酸的SART1作为另一个检测标签SUMO1融合蛋白的化修饰的底物。SART1的纯化用pET28a His-Ni+柱系统，为了便于检测在His和SART1之间有Flag检测标签。按照“材料与方法”1.2部分中所述，Flag-SART1使用大肠杆菌B121菌株、使用pET28a表达纯化体系纯化蛋白，在16℃用50μM IPTG诱导融合蛋白表达20h，各步骤各样品SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色。纯化结果如图2D所示。

Flag-SART1体外SUMO化修饰检测结果如图2B所示，所有的标签SUMO1融合蛋白都可以SUMO化修饰flag-SART1，但是在同等的条件下(相同的酶浓度，相同的SUMO1融合蛋白和flag-SART1的浓度)，不带标签的SUMO1比带标签的SUMO1如Avi-SUMO1，SNAP-SUMO1的修饰效率要高。

RANGAP1作为第一个被发现可以被SUMO化修饰的蛋白[3]，一直被用来作为SUMO化修饰的阳性对照[27]。SART1的纯化用pET28a His-Ni+柱系统，为了便于检测在His和SART1之间有Flag检测标签。按照“材料与方法”1.2部分中所述，Flag-RANGAP1使用大肠杆菌B121菌株使用pET28a表达纯化体系纯化蛋白，在16℃用50μM IPTG诱导融合蛋白表达20h，各步骤各样品SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色。纯化结果如图2D所示。

用flag-RANGAP1作为被SUMO化的靶蛋白来检测带有标签的SUMO融合蛋白的SUMO修饰能力结果如图2C所示，只有不带标签的SUMO1可以在体外体系中SUMO化Flag-RANGAP1，其它三种融合蛋白都没有观测到可以使Flag-RANGAP1条带迁移。

由以上结果可见，在体外，根据底物不同，带标签的SUMO1融合蛋白的SUMO化修饰能力受到不同程度的影响，但是不带标签的SUMO1能够对所有已知的SUMO修饰靶蛋白进行修饰。

2.3.通过过表达相应蛋白分析各种Tag-SUMO1在Hela细胞中的修饰能力

在体外SUMO化修饰反应体系实验中，带标签的SUMO1与不带标签的SUMO1之间SUMO化修饰的能力根据底物的不同而有所差别，特别是在RANGAP1上只有不带标签蛋白的SUMO1表现出SUMO化修饰能力。我们通过在细胞中过表达Tag-SUMO1的方法检测不同的SUMO1融合标签蛋白在接近真实的体内生理条件下对靶蛋白的SUMO化修饰能力是否有差别。为了与体外实验统一比较，细胞实验依然选用SART1与RANGAP1作为SUMO化修饰的靶蛋白。

如“材料与方法”1.4所述检测SUMO1，Avi-L-SUMO1、SNAP-L-SUMO1、Halo-L-SUMO1对靶蛋白Flag-SART1和Flag-RANGAP1的SUMO化修饰能力。我们首先抽提了Ubc9-M02、L-SUMO1-M05/24.1/49以及SART1-M11和RANGAP1-M11质粒并测浓度。以24孔盘为例，每孔转染的质粒量如下：靶蛋白(SART1/RANGAP1)的哺乳动物表达质粒175ng，Ubc9-M0275ng，L-SUMO1-M05/24.1/49x 25ng，对照(-)转25ng的LacZ质粒。靶蛋白SART1和RANGAP1都带有N端Flag标签，可以在Hela细胞中过表达42h后用flag抗体和荧光二抗Western检测靶蛋白的迁移来检测SUMO化修饰情况。转染后42h用100ul裂解缓冲液裂解细胞，加入20ul 6X上样缓冲液煮样，跑SDS-PAGE胶后转膜用Flag一抗和鼠荧光二抗做WesternBlot。结果如图3所示。

在图3A中可以看到SNAP-L-SUMO1和Halo-L-SUMO1明显强于不带标签的SUMO1和Avi-SUMO1的修饰能力，尤其是SNAP-L-SUMO1。同样，在图3B中可以看到以Flag-RANGAP1为靶蛋白的SUMO化修饰反应体系中Halo和SNAP的SUMO1融合蛋白修饰迁移条带在同等的体系条件下更为明显。

由以上结果可以看出，不同于体外SUMO化修饰体系中已知的SUMO1靶蛋白不能够被标签融合蛋白修饰，标签SUMO1融合蛋白Avi/SNAP/Halo-L-SUMO1在Hela细胞过表达检测体系中能够很好的对靶蛋白进行修饰，而且SNAP-L-SUMO1与Halo-L-SUMO1融合表达蛋白有更高的修饰能力。所以这两种标签SUMO1融合蛋白可以用于在Hela细胞中建立新的SUMO化修饰检测体系。

2.4.运用SNAP-SUMO1在Hela细胞体系中筛选SUMO化蛋白底物

Hela细胞过表达实验证明了标签SUMO1融合蛋白同样具有SUMO化修饰能力，而且相比不带标签的SUMO1还有更强的SUMO化能力。例如在以flag-RANGAP1为靶蛋白的实验中，SUMO1修饰的Flag-RANGAP1条带几乎不可见，而SNAP-L-SUMO1修饰的RanGAP1迁移条带清晰可见，所以可以用SNAP-L-SUMO1Hela细胞反应体系来检测蛋白是否是SUMO化修饰的靶蛋白。

许多转录因子的活性都受到SUMO化修饰的调节，比如p53，c-Jun和雄激素受体[62]，而且大部分转录因子被SUMO化都抑制了转录活性[30]。由于体内的蛋白SUMO化修饰通常需要保守修饰序列和入核序列[63]，靶蛋白很大一部分都是转录因子，所以我们在转录因子数据库(Genecopoeia转录因子库)中找出未报道过能被SUMO化修饰的转录因子筛选SUMO化修饰靶蛋白。由于被SUMO化修饰的靶蛋白赖氨酸位点通常都存在于保守序列ΨKxE中(Ψ表示大的疏水氨基酸残基，x表示任何氨基酸残基)，以及还有一些新发现的序列比如PDSM[64]和NDSM，这就使用生物信息学预测蛋白的被SUMO化能力成为可能，相关的分析软件包括SUMOplot，SUMOsp和SUMOFI[65-67]。SUMOsp2.0在预测蛋白的SUMO化位点方面具有高敏感性和高专一性[66]，所以为了提高筛选靶蛋白的准确性，我们先用SUMOsp2.0软件在高置信条件下筛选出14个得分高的未报道过的被SUMO化修饰的转录因子，如表3中所示。

表3

按照“材料与方法”所述，将这十四个基因ORF装载到有N端Flag哺乳动物表达载体M11中。然后分别同SNAP-L-SUMO1和Ubc9的表达载体一同转染到Hela细胞中，收细胞后跑蛋白PAGE胶用免疫荧光方法鉴定是否有蛋白条带迁移。根据这种方法找到两个新的可以被SNAP-L-SUMO1修饰的蛋白底物FOXP2和ESX1，如图4A和C所示。裂解细胞后将100ul(24孔盘)裂解液均分为两份，其中一份加入1ul的Ulp1c酶和另一份一同放入30水浴，其余步骤如前述(见“材料与方法”1.4/C)。在图4A中，细胞裂解液用去SUMO化酶Ulp1c处理后，Flag-FOXP2迁移条带消失。我们知道Ulp1酶的切除SUMO的异肽键的特异性很高，也证明了FOXP2是通过异肽键和SNAP-L-SUMO1结合的。Ulp1c(泛素样蛋白特异性蛋白酶，Ubiquitin-like-protein-specific proteases)是去SUMO化酶的C段，可以高效的切除异肽键从而使SUMO与靶蛋白分离。

用SUMOsp 2.0初步筛选出的SUMO化修饰靶蛋白的候选蛋白。为了便于检测，候选蛋白的筛选条件包括：1.未报道过可以被SUMO化(pubmed中和SUMO作为共同关键词无返回结果)；2.蛋白氨基酸个数在240-900之间；3.用SUMOsp 2.0预测至少有两个位点可以SUMO修饰；4.在高置信条件下得分＞2.5。

为了进一步验证FOXP2与ESX1这两个蛋白可以被SUMO化修饰，我们又按照“材料与方法”所述，在大肠杆菌纯化体系将flag-FOXP2和Flag-ESX1表达并纯化出来，在体外进行SUMO化修饰。结果如图4B和D中所示，在体外SUMO化修饰体系中FOXP2与ESX1同样可以被SNAP-L-SUMO1修饰.

以上，结合具体实施例对本发明进行了详尽的说明。本领域技术人员不难理解，本发明的实施方式决不限于或以上任何具体实施例、具体步骤、具体设备和具体数值或数值范围，根据在此公开的本发明要旨所进行的各种等同修改和替换都术语本申请权利要求所限定的范围之内。此外，本申请提及的所有文献都以引用并参考的方式纳入作为本发明及本说明书的内容。

参考文献

1.Lee，J.Y.，et al.，Molecular cloning and expression analysis of the pig small ubiquitin-like modifier(SUMO)gene family.Int J Immunogenet，2009.36(1)：p.59-64.

2.Herrmann，J.，L.O.Lerman，and A.Lerman，Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in protein regulation.CircRes，2007.100(9)：p.1276-91.

3.Matunis，M.J.，E.Coutavas，and G. Blobel，A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning ofthe Ran-GTPase-activating protein RanGAPl between the cytosol and the nuclear pore complex.J Cell Biol，1996.135(6Pt 1)：p.1457-70.

4.Mahajan，R.，et al.，Asmall ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAP1 to nuclear porecomplex protein RanBP2.Cell，1997.88(1)：p.97-107.

5.Hayashi，T.，et al.，Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells.Exp Cell Res，2002.280(2)：p.212-21.

6.Kurepa，J.，et al.，The small ubiquitin-like modifier(SUMO)protein modification system in Arabidopsis.Accumulation of SUMO1and-2conjugates is increasedby siress.J Biol Chem，2003.278(9)：p.6862-72.

7.Su，H.L.and S.S.Li，Molecular features of human ubiquitin-like SUMO genes and their encoded proteins.Gene，2002.296(1-2)：p.65-73.

8.Saitoh，H.and J.Hinchey，Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein rmodifiers SUMO-1versus SUMO-2/3.J Biol Chem，2000.275(9)：p.6252-8.

9.Tatham，M.H.，et al.，Polymeric chains of SUMO-2and SUMO-3 are conjugated to protein substrates bySAE1/SAE2 and Ubc9.J Biol Chem，2001.276(38)：p.35368-74.

10.Li，T.，et al.，Sumoylation of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，zinc finger proteins，and nuclear porecomplex proteins：a proteomic analysis.Proc Natl Acad Sci U S A，2004.101(23)：p.8551-6.

11.Vassileva，M.T.and M.J.Matunis，SUMO modification of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins.MolCell Biol，2004.24(9)：p.3623-32.

12.Vertegaal，A.C.，et al.，A proteomic study of SUMO-2 target proteins.J Biol Chem，2004.279(32)：p.33791-8.

13.Zhao，Y.，et al.，Broad spectrum identification of cellular small ubiquitin-related modifier(SUMO)substrateproteins.J Biol Chem，2004.279(20)：p.20999-1002.

14.Mukhopadhyay，D.and M. Dasso，Modification in reverse：the SUMO proteases.Trends Biochem Sci，2007.32(6)：p.286-95.

15.Wang，Y.G. and M. Dasso，SUMOylation and deSUMOylation at a glance.Journal of Cell Science，2009.122(23)：p.4249-4252.

16.Johnson，E.S.，et al.，The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by anAos1p/Uba2p heterodimer.Embo Journal，1997.16(18)：p.5509-5519.

17.Lois，L.M.and C.D.Lima，Structures of the SUMO E1 provide mechanistic insights into SUMO activationandE2 recruitment to E1.Embo Journal，2005.24(3)：p.439-451.

18.Sarge，K.D.and O.K.Park-Sarge，Sumoylation and human disease pathogenesis.Trends Biochem Sci，2009.34(4)：p.200-5.

19.Niedenthal，R.，Enhanced detection of in vivo SUMO conjugation by Ubc9 fusion-dependent sumoylation(UFDS).Methods Mol Biol，2009.497：p.63-79.

20.Wang，L.and S.Banerjee，Differential PLAS3 expression in human malignancy.Oncol Rep，2004.11(6)：p.1319-24.

21.Lee，J.S.and S.S.Thorgeirsson，Genome-scale profiling of gene expression in hepatocellular carcinoma：classification，survival prediction，and identification of therapeutic targets.Gastroenterology，2004.127(5Suppl1)：p.S51-5.

22.Seele r，J.S.，et al.，SUMO，the three Rs and cancer.Curr Top Microbiol Immunol，2007.313：p.49-71.

23.Cheng，J.，et al.，Role of desumlylation in the development of prostate cancer. Neoplasia，2006.8(8)：p.667-76.

24.Zhang，Y.Q.and K.D.Sarge，Sumoylation of amnyloid precursor protein negatively regulates Abeta aggregatelevels.Biochem Biophys Res Commun，2008.374(4)：p.673-8.

25.Steffan，J.S.，et al.，SUMO modification of Huntingtin and Huntington′s disease pathology.Science，2004.304(5667)：p.100-4.

26.Shinbo，Y.，et al.，Proper SUMO-1 conjugation is essential to DJ-1 to exert its full activities.Cell Death andDifferentiation，2006.13(1)：p.96-108.

27.Tatham，M.H.，et al.，Detection of protein SUMOylation in vivo.Nat Protoc，2009.4(9)：p.1363-71.

28.Li，T.，et al.，Ageneral approach for invesrigating enzymatic pathways and substrates for ubiquitin-likemodifiers.Arch Biochem Biophys，2006.453(1)：p.70-4.

29.Matunis，M.J.，J.Wu，and  G.  Blobel.SUMO-1 modification  and its role in targeting the RanGTPase-activating protein，RanGAP1，to the nuclear pore complex.J Cell Biol，1998.140(3)：p.499-509.

30.Kim，J.H.，et al.，Roles of sumoylation of a reptin chromatin-remodelling complex in cancer metastasis.NatCell Biol.2006.8(6)：p.631-9.

31.Carlson，C.B.，R.A.Horton，and K.W. Vogel，A toolbox approach to high-throughput TR-FRET-basedSUMOylation and DeSUMOylation assays.Assay Drug Dev Technol.2009.7(4)：p.348-55.

32.Kimple，M.E.and J.Sondek，Overview of affinity tags for protein purification.Curr Protoc Protein Sci，2004.Chapter9：p.Unit 99.

33.Lilius，G.，et al.，Metald affinity precipitation of proteins carrying gennetically attached polyhistidine affinitytails.Eur J Biochem，1991.198(2)：p.499-504.

34.Smith，D.B.，Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.Methods Enzymol.2000.326：p.254-70.

35.Maina，C.V.，et al.，An Escherichia coli vector to express and purify foreign proteins by fusion to andseparationf from maltose-bindinng protein.Gene，1988.74(2)：p.365-73.

36.Chong，S.R.，et al.，Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tagderived from a protein splicing element. Gene，1997.192(2)：p.271-281.

37.Beckett，D.，E.Kovaleva，and  P.J.Schatz，A  mimmal  peptide  substrate in biotin  holoenzymesynthetase-catalyzed biotinylation.Protein Science，1999.8(4)：p.921-929.

38.Barat，B.and A.M.Wu，Metabolic biotinylation of recombinant antibody by biotin ligase retained in theendoplasmic reticulum.Biomol Eng，2007.24(3)：p.283-91.

39.Ashraf，S.S.，et al.，A novel multi-affinity tag system to produce high levels of soluble and biotinylatedproteins in Escherichia coli.Protein Expression and Purification，2004.33(2)：p.238-245.

40.Gautier，A.，et al.，An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.Chem Biol，2008.15(2)：p.128-36.

41.Keppler，A.，et al.，Labeling of fusion proteins of O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase with small moleculesin vivo and in vitro.Methods，2004.32(4)：p.437-44.

42.Hinner， M.J.and K.Johnsson，How to obtain labeled proteins and what  to do with them.Current Opinion inBiotechnology，2010.21(6)：p.766-776.

43.Zhang，Y.，et al.，HaloTag protein-mediated site-specific conjugation of bioluminescent proteins to quantumdots.Angew Chem Int Ed Engl.2006.45(30)：p.4936-40.

44.Los，G.V. and K.Wood，The Halo Tag.：a novel technology for cell imaging and protein analysis.MethodsMol Biol.2007.356：p.195-208.

45.Los，G.V.，et al.，HaloTag：a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.ACSChem Biol.2008.3(6)：p.373-82.

46.Okuma，T.，et al.，In vitro SUMO-1 modification requires two enzymatic steps，E1 and E2.Biochemical andBiophysical Research Communications，1999.254(3)：p.693-698.

47.Lai，C.S.L.，et al.，A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature，2001.413(6855)：p.519-523.

48.Campbell，A.J.，et al.，Aberrant expression of the neuronal transcription factorFOXP2 in neoplastic plasmacells.Br J Haematol.2010.149(2)：p.221-30.

49.Enard，W.，et al.，Ahumamzed version of Foxp2 affects cortico-basal ganglia circuits in mice.Cell，2009.137(5)：p.961-71.

50.Konopka，G.，et al.，Human-specific transcriptional regulation of CNS development genes by FOXP2.Nature，2009.462(7270)：p.213-7.

51.Bonkowsky，J.L.，et al.，Domain-specific regulation of foxP2CNS expression by lef1.BMC Dev Biol，2008.8：p.103.

52.Zhou，B.，et al.，Foxp2 inhibits Nkx2.1-mediated transcription of SP-C via interactions with the Nkx2.1homeodomain.Am J Respir Cell Mol Biol.2008.38(6)：p.750-8.

53.Li，Y. and R.R.Behringer， Esx1 is an X-chromosome-imprinted regulator of placental development and fetalgrowth.Nat Genet，1998.20(3)：p.309-11.

54.Branford，W.W.，et al.，Spx1，a novel X-linked homeobox gene expressed during spermatogenesis.Mech Dev，1997.65(1-2)：p.87-98.

55.MacLean，J.A.，2nd and M.F.Wilkinson，The Rhox genes.Reproduction，2010.140(2)：p.195-213.

56.Ozawa，H.，et al.，Paired-like homeodomain protein ESXR1 possesses a cleavable C-terminal region thatinhibits cyclin degradation.Oncogene，2004.23(39)：p.6590-602.

57.Bonaparte，E.，et al.，ESXl gene expression as a robust marker of residual spermatogenesis in azoospermicmen.Hum Reprod，2010.25(6)：p.1398-403.

58.Hayashi，T.，et al.，Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells.Experimental Cell Research，2002.280(2)：p.212-221.

59.Wege r，S.，E.Hamme r，and M.Engstler，The DNA topoisomerase I binding protein topors as a novel cellulartarget for SUMO-1 modification：characterization of domains necessary for subcelluldr localization andsumolation.Experimental Cell Research，2003.290(1)：p.13-27.

60.Koh，M.Y.，B.G. Darnay，and G. Powis，Hypoxia-associated facto，a novel E3-ubiquitin ligase，binds andubiquitinates hypoxia-inducible factor lalpha，leading to its oxygen-independent degradation.Mol Cell Biol，2008.28(23)：p.7081-95.

61.Schimmel.J.，et al.，Positively charged amino acids flanking a sumoylation consensus tetramer on the110kDa tri-snRNP component SART1 enhance sumoylation efficiency. J Proteomics，2010.73(8)：p.1523-34.

62.Hong，Y.，et al.，Regulation of heat shock transcription factor 1 by stress-induced SUMO-1 modification.JBiol Chem，2001.276(43)：p.40263-7.

63.Rodriguez，M.S.，C.Dargemont，and R.T. Hay，SUMO-1 conjugation in vivo requires both a consensusmodification motifand nuclear targeting.J Biol Chem，2001.276(16)：p.12654-9.

64.Hietakangas，V.，et al.，PDSM，a motif for phosphorylation-dependent SUMO modification.Proc Natl AcadSci U S A，2006.103(1)：p.45-50.

65.Xue，Y.，et al.，SUMOsp：a web server for sumoylation site prediction.Nucleic Acids Res，2006.34(WebServer issue)：p.W254-7.

66.Ren，J.，et al.，Systematic study of protein sumoylation：Development of a site-specific predictor of SUMOsp2.0.Proteomics，2009.9(12)：p.3409-3412.

67.Blomster，H.A.，et al.，Novel Proteomics Strategy Brings Insight into the Prevalence of SUMO-2 Target Sites.Molecular&Cellular Proteomics，2009.8(6)：p.1382-1390.

Claims (21)

1.一种如下所示的融合蛋白：

Tag-SUMO

其中，Tag表示蛋白标签，选自Avi标签、SNAP标签和Halo标签，

SUMO即类泛素化小蛋白；

所述融合蛋白具有SUMO化能力。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，如下所示：

Tag-L-SUMO

其中，L表示柔性连接肽。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，L是9个氨基酸的柔性连接肽，例如SSGLVPRGS所示的柔性连接肽。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，所述SUMO是人类SUMO1的成熟形式。

5.一种核酸分子，选自编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子或其互补链。

6.一种载体，加载了权利要求5所述的核酸分子，优选表达载体，例如原核生物载体和哺乳动物表达载体。

7.一种在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，包括：

在体外SUMO化修饰体系中，将被检测蛋白与权利要求1-4中任一项所述的

融合蛋白接触，

检测被检测蛋白的SUMO化产物。

8.一种体外检测SUMO化的系统，包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，纯化的Ub1激活酶(E1)，Ub1转移酶(E2)和Ubc9，以及SUMO化反应缓冲液，所述系统优选试剂盒形式。

9.一种细胞内检测SUMO化的方法，包括：

(1)用编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子转染宿主细胞；

(2)培养宿主细胞，获得蛋白表达；

(3)裂解细胞；

(4)检测被检测蛋白的SUMO化产物。

10.如权利要求9所述的方法，其中，步骤1)还包括用编码Ubc9的核酸分子转染宿主细胞。

11.如权利要求9所述的方法，其中，步骤1)还包括用编码待检测蛋白的核酸分子转染宿主细胞。

12.如权利要求9所述的方法，其中，还包括在步骤4)之前通过免疫沉淀或亲和层析步骤处理步骤3)所得细胞裂解物。

13.如权利要求9所述的方法，包括：

(1).将被检测蛋白的ORF装载到表达载体中，所述载体优选M11，

(2).将步骤(1)制备的载体、权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达载体和Ubc9的表达载体一同转染到宿主细胞中，优选Hela细胞，所述融合蛋白优选SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白，

(3).培养细胞，获得各蛋白的表达，

(4).收细胞后检测被检测蛋白的SUMO化产物，例如用WesternBlot法、电泳、免疫荧光或其组合来检测。

14.一种细胞内检测SUMO化的系统，包含：编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达质粒，和转染试剂，，优选试剂盒形式。

15.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，还包含编码Ubc9的表达质粒。

16.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，所述融合蛋白是SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白。

17.一种筛选SUMO化蛋白底物的方法，

提供作为SUMO化底物的候选蛋白，例如在高置信条件下用预测蛋白的被SUMO化能力的分析软件筛选作为SUMO化底物的候选蛋白，

检测候选蛋白的SUMO化，所述检测采用权利要求7所述体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，或者采用权利要求9至13中任一项所述细胞内检测SUMO化的方法，或者两者的联用，

若检测到候选蛋白的SUMO化产物，表明候选蛋白是SUMO化蛋白底物。

18.一种检测细胞内SUMO修饰的靶蛋白的方法，包括：

(1)在细胞内重组表达权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白；

(2)将细胞裂解液与结合、优选共价结合所述融合蛋白中标签的载体接触，所述载体例如微载体，例如珠粒；

(3)分析与载体接触的靶蛋白信息，例如WesternBlot或者MS分析。

19.如权利要求18所述的方法，步骤(3)之前还包括在变性条件下去除非特异非共价结合的杂蛋白。

20.权利要求1-4中任一项所述融合蛋白或权利要求5所述核酸分子用于制造诊断SUMO化相关疾病的制剂的用途，所述疾病例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生。

21.FOXP2和ESX1的SUMO化调节剂用于制备人类语言和精子发生的药物的用途。

Images