CN110423731A - Jo-1蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Jo‑1蛋白的制备方法及其应用，涉及蛋白质工程技术领域。该Jo‑1蛋白的制备方法包括采用pET‑28a表达带有MBP标签的Jo‑1融合蛋白，然后在纯化蛋白的过程中切除所述标签，得到所述Jo‑1蛋白。该制备方法生产效率高，制备得到的Jo‑1蛋白接近天然蛋白，因此可以作为Jo‑1抗原，以用于制备Jo‑1抗体，或者用于制备诊断Jo‑1相关疾病的产品。

Description

Jo-1蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，尤其是涉及一种Jo-1蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
氨酞-tRNA合成酶是胞内酶，由“管家”基因编码，在所有组织中表达，氨酞-tRNA合成酶主要催化包括蛋白质合成过程中的氨基酸活化和氨酞-tRNA复合物的形成。
人类的组氨酞-tRNA合成酶(CHSHRS)还是一类结缔组织病(自身免疫疾病)中的多发性肌炎(polymyositis)和皮肌炎(dermatomyositis)(简称PM/DM)的标志性自身抗体的抗原，临床上将引起PM/DM疾病的作为抗原的组氨酞-tRNA合成酶称为Jo-1。在PM/DM疾病中，Jo-1抗体的阳性率最高，约为18～20％，抗Jo-1抗体多见于10～40％多发性肌炎、2～10％皮肌炎和3～8％重叠综合征患者。因此，为了研究氨酞-tRNA合成酶以及和Jo-1抗原和抗体的相关疾病，一种高效制备Jo-1蛋白的方法是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种Jo-1蛋白的制备方法，该制备方法生产效率高，制备得到的Jo-1蛋白接近天然蛋白。
本发明的第二目的在于提供上述Jo-1蛋白的制备方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种Jo-1蛋白的制备方法，包括：采用pET-28a表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白，然后在纯化蛋白的过程中切除所述MBP标签，得到所述Jo-1蛋白。
优选地，所述Jo-1蛋白含有如SEQ ID NO.1所示序列。
优选地，所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白中，MBP标签和Jo-1之间含有蛋白酶的酶切位点；
优选地，所述蛋白酶包括Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶或TEV酶；
优选地，所述蛋白酶包括TEV酶。
优选地，将含有蛋白酶的酶切位点的MBP标签序列整合至pET-28a的NcoⅠ和BamHⅠ之间；将Jo-1蛋白序列整合至pET-28a的BamHⅠ和HindⅢ之间，得到表达所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白的pET-28a载体。
优选地，所述纯化蛋白包括先对表达Jo-1融合蛋白的菌体进行亲和层析，然后切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签。
优选地，所述纯化蛋白还包括在切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签后进行离子交换层析。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(a)使用含有BamHⅠ序列的上游引物和含有HindⅢ序列的下游引物扩增Jo-1基因，其中Jo-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(b)在pET-28a的NcoⅠ和BamHⅠ间插入MBP序列，其中MBP序列含有编码TEV酶的酶切位点的序列；
(c)将步骤(a)的扩增产物整合至步骤(b)得到的pET-28a；
(d)将(c)获得的pET-28a转化至E.coli DH5α中培养，筛选出阳性克隆并经测序验证后扩大培养，获取阳性克隆pET-28a；
(e)将阳性克隆pET-28a转化至E.coli Rosseta(DE3)，经诱导处理获得表达Jo-1融合蛋白的菌体；
(f)收集表达Jo-1融合蛋白的菌体，破碎后用Dextrin Resin亲和层析，收集洗脱液后加入TEV酶酶切MBP标签，再用Q HiTrap纯化，得到纯化后的Jo-1蛋白；
优选地，步骤(d)中，将转化了pET-28a的E.coli DH5α涂布于含有卡那霉素的固体培养基中，然后再将阳性克隆接种至含有卡那霉素的液体培养基中培养，然后进行菌落PCR验证和测序验证；卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL；
优选地，步骤(e)中，将阳性克隆pET-28a转化至E.coli Rosseta(DE3)，然后接种至含有卡那霉素和氯霉素的液体培养基中，培养至OD600为0.6～0.8时加入IPTG进行诱导表达，诱导培养温度为20～25℃；卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL；氯霉素的浓度优选为35～45μg/mL。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述Jo-1蛋白的制备方法的应用，包括(x1)～(x3)中的至少一种：
(x1)制备Jo-1抗体；
(x2)制备以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒；
(x3)制备包含Jo-1抗体的试剂盒。
优选地，所述以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒包括用于肌炎诊断的试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的Jo-1蛋白的制备方法，先采用pET-28a表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白，以利用pET-28a上的T7启动子高效表达带有标签的Jo-1融合蛋白，能够在较短的时间内获得大量的Jo-1蛋白，并通过MBP标签促进蛋白正确折叠和增加蛋白溶解性，以及便于后续蛋白的纯化；同时本发明提供的Jo-1蛋白的制备方法还包括在纯化蛋白的过程中切除所述标签，以使制备得到的Jo-1蛋白更接近天然蛋白。
本发明提供的Jo-1蛋白的制备方法，表达效率高，且制备得到的Jo-1蛋白更接近天然蛋白，因此其可以作为以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒中的抗原，可以有效的替代天然Jo-1蛋白作为反应抗原，用于制备Jo-1抗体，制备以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒，以及制备包含Jo-1抗体的试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3制备得到的Jo-1蛋白的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种Jo-1蛋白的制备方法，包括：采用pET-28a表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白，然后在纯化蛋白的过程中切除所述MBP标签，得到所述Jo-1蛋白。
表达载体pET-28a属于大肠杆菌蛋白表达载体，以卡那霉素为抗原抗性。pET-28a以T7为启动子，T7启动子专一受控于T7RNA聚合酶，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，因此含有表达载体pET-28a的宿主的几乎所有资源都用于表达pET-28a上的外源蛋白，诱导表达后仅几个小时，T7调控的外源蛋白的含量就可以占到宿主细胞总蛋白的50％以上，因此本发明以pET-28a表达Jo-1蛋白可以使Jo-1蛋白在宿主中高效表达，在较短的时间内获得大量的Jo-1蛋白。
为了在表达蛋白后纯化Jo-1蛋白，表达载体pET-28a表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白。MBP为麦芽糖结合蛋白，MBP标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP标签具有增加蛋白可溶性，促进蛋白正确折叠的作用，尤其适用于真核蛋白的表达；以MBP作为标签的Jo-1融合蛋白方便验证和纯化，能够提高蛋白的制备效率。MBP标签可以融合在蛋白的N端或C端，优选将MBP标签融合于Jo-1蛋白的N端，起到促进蛋白正确折叠和增加蛋白溶解性的作用。由于Jo-1融合蛋白中的MBP标签会在一定程度上影响Jo-1蛋白本身的天然结构，因此本发明提供的制备方法，还在纯化的过程中切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签，以使制备得到的Jo-1蛋白更接近天然蛋白。
本发明提供的Jo-1蛋白的制备方法，表达效率高，且制备得到的Jo-1蛋白更接近天然蛋白，因此可以作为Jo-1抗原，以用于制备Jo-1抗体，或者用于制备诊断Jo-1相关疾病的产品，例如诊断多发性肌炎和皮肌炎的试剂盒。
在一些优选的实施方式中，所述Jo-1蛋白含有如SEQ ID NO.1所示序列。
在一些优选的实施方式中，所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白中，MBP标签和Jo-1之间含有蛋白酶的酶切位点，以用于在纯化蛋白的过程中，采用酶切的方法切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签。
在一些可选的实施方式中，可以先合成含有MBP标签序列、蛋白酶的酶切位点的序列和Jo-1基因序列的融合基因，然后将该融合基因整合至表达载体中，以表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白；在另一些可选的实施方式中，也可以分别将编码MBP标签序列、蛋白酶的酶切位点的序列和Jo-1基因序列分别整合至表达载体pET-28a中。在一些优选的实施方式中，将含有蛋白酶的酶切位点的MBP标签序列整合至pET-28a的NcoⅠ和BamHⅠ之间；将Jo-1蛋白序列整合至pET-28a的BamHⅠ和HindⅢ之间，得到表达所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白的pET-28a载体。
在一些优选的实施方式中，先将添加了编码DNA蛋白酶的酶切位点序列的MBP标签序列整合至表达载体pET-28a中，然后再将Jo-1基因序列整合至表达载体pET-28a中，使表达载体pET-28a表达含有Jo-1蛋白、MBP标签以及Jo-1蛋白和MBP标签之间酶切位点的融合蛋白。
在一些可选的实施方式中，所述蛋白酶包括Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶或烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)。在一些优选的实施方式中，使用TEV酶酶切Jo-1融合蛋白中的MBP标签，TEV酶特异性切割位点为：Gln-Gly；优秀识别位点为：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly七氨基酸。TEV酶pH工作范围从6.0到8.5都具有酶切活性，更为重要的是TEV可以在低温条件进行酶切反应，对于那些温度敏感型的目标蛋白，可以通过在4℃条件下延长酶切反应时间的方法达到理想的效果。
在一些优选的实施方式中，所述纯化蛋白包括先对表达Jo-1融合蛋白的菌体进行亲和层析，然后切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签。亲和层析是根据生物分子与配体(能与生物高分子进行专一性可逆性结合的物质)之间形成专一的可借力的络合物的能力来达到分离目的一种技术。亲和层析具有选择性好、收率高和纯度高的优点，同时还能保持生物大分子的活性。在一些优选的实施方式中，使用和MBP标签具有亲和性的Dextrin Resin亲和层析介质纯化Jo-1融合蛋白。
在一些优选的实施方式中，所述纯化蛋白还包括在切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签后进行离子交换层析，以进一步提高产物中Jo-1蛋白的纯度。离子交换层析是基于特定pH下的净电荷差异分离生物分子。蛋白电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。每个蛋白具有等电点(pI)，即负电荷和正电荷的总数为零的pH。在低于蛋白pI的缓冲溶液中，蛋白带正电并将结合阳离子交换树脂的带负电荷的官能团；在高于蛋白pI的缓冲液中，蛋白是带负电荷的，并且将结合阴离子交换树脂的带正电荷的官能团；未结合的蛋白将直接穿出，再通过改变流动相或盐浓度来洗脱吸附的蛋白，从而达到分离的目的。
在一些优选的实施方式中，采用如下制备方法制备Jo-1蛋白的效果更佳，采用该实施方式制备Jo-1蛋白，纯化后的Jo-1样品经SDS-PAGE分析表明其纯度为95％以上，分子量约58kDa，包括如下步骤：
(a)使用含有BamHⅠ序列的上游引物和含有HindⅢ序列的下游引物扩增Jo-1基因，使Jo-1基因的编码序列上游带有BamHⅠ酶切位点，下游带有HindⅢ酶切位点；其中Jo-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(b)在pET-28a的NcoⅠ酶切位点和BamHⅠ酶切位点间插入MBP序列，其中MBP序列含有编码TEV酶的酶切位点的序列。
(c)使用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对步骤(b)得到的表达载体pET-28a进行酶切，然后和步骤(a)得到的扩增产物连接。
(d)将步骤(c)得到的连接产物转化至E.coli DH5α中培养，筛选出阳性克隆并经测序验证后扩大培养，获取阳性克隆pET-28a。
(e)将阳性克隆pET-28a转化至E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，并于LB液体培养基中诱导培养，获得表达Jo-1融合蛋白的菌体。
(f)收集表达Jo-1融合蛋白的菌体并破碎后用Dextrin Resin亲和层析，收集洗脱液后加入TEV酶，酶切MBP标签，再用Q HiTrap进行纯化得到纯化后的Jo-1蛋白。
在一些优选的实施方式中，步骤(d)中将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中是通过热激法实现的。
在一些优选的实施方式中，步骤(d)中，将转化了pET-28a的E.coli DH5α涂布于含有卡那霉素的固体培养基中，然后再将阳性克隆接种至含有卡那霉素的液体培养基中培养，然后进行菌落PCR验证和测序验证；卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL，例如可以为但不限于为35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL或45μg/mL，优选为40μg/mL。
在一些优选的实施方式中，步骤(e)中，将阳性克隆pET-28a转化至E.coliRosseta(DE3)接种至含有卡那霉素和氯霉素的液体培养基中，至OD600为0.6～0.8时加入IPTG进行诱导表达，诱导培养温度为20～25℃。
其中将菌体培养至OD600为0.6～0.8，例如可以为但不限于为0.6、0.65、0.7、0.75或0.8时，加入IPTG进行诱导表达。
诱导培养温度为20～25℃，例如可以为但不限于为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，优选为25℃。
卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL，例如可以为但不限于为35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL或45μg/mL，优选为40μg/mL。
氯霉素的浓度优选为35～45μg/mL，例如可以为但不限于为35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL或45μg/mL，优选为40μg/mL。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述Jo-1蛋白的制备方法的应用。由于上述Jo-1蛋白的制备方法制备Jo-1蛋白效率高，并且制备得到的Jo-1蛋白更接近天然蛋白，因此其可以作为以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒中的抗原，可以有效的替代天然Jo-1蛋白作为反应抗原，以用于制备Jo-1抗体。进一步的，该Jo-1蛋白的制备方法还可以用于制备以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒，以检测样本中的Jo-1抗体，例如用于检测样本中的Jo-1抗体的ELISA试剂盒。该Jo-1蛋白的制备方法还可以用于制备包含Jo-1抗体的试剂盒，例如用于Western Blot试剂盒或ELISA试剂盒等，以检测待测样品中的Jo-1蛋白。
在一些优选的实施方式中，所述以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒包括用于肌炎诊断的试剂盒。由于上述制备方法制备得到的Jo-1蛋白与天然Jo-1蛋白更相似，因此其与Jo-1抗体的亲和性更佳，能够提高肌炎诊断的灵敏度和准确度。同时上述制备方法制备Jo-1蛋白的生产效率高，这也进一步降低了用于肌炎诊断的试剂盒的生产成本。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1获取表达MBP-Jo-1融合蛋白的表达载体pET-28a
(1)对Jo-1基因进行PCR扩增得到PCR产物，上游引物包括BamHⅠ序列，下游引物包括HindⅢ序列。
(2)对表达载体pET-28a进行改造，将含有TEV酶酶切位点的MBP整合至表达载体pET-28a的NcoⅠ酶切位点和BamHⅠ酶切位点之间。
(3)对改造后的pET28a-MBP载体进行酶切，使用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ，酶切插入MBP标签的表达载体pET-28a，然后将PCR扩增产物与线性化的表达载体pET-28a-MBP连接。
(4)采用热激法，将步骤(3)的连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞中，然后涂布于含40μg/mL卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，挑取阳性克隆菌落接种至含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，进行菌落PCR验证和测序，测序正确后扩大培养并提取质粒。
实施例2 MBP-Jo-1融合蛋白的表达
(1)将实施例1提取得到的阳性克隆质粒转化入E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，然后接种到30mL含有40μg/mL卡那霉素和40μg/mL氯霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，培养14～16hours(过夜培养)。
(2)扩大培养：将过夜培养的单克隆大肠杆菌在A2生物安全柜中按照1％的比例接种到新鲜的LB培养基中，加入卡那霉素和氯霉素至各抗性的终浓度分别为40μg/mL。
(3)37℃，250rpm，培养至OD600为0.6～0.8时加入IPTG进行诱导表达。
(4)25℃，200rpm，诱导培养4小时。
(5)用离心杯收菌，4500rpm离心15min，做好标记，暂时储存于-20℃。
实施例3 MBP-Jo-1融合蛋白的纯化
(1)取一定量实施例2获得的表达MBP-Jo-1融合蛋白的大肠杆菌重悬并超声裂解。
(2)超声结束后，于4℃，12000rpm，离心15min，分离上清(S)与沉淀(P)。
(3)取上清(S)进行亲和层析：
①加入3ml Dextrin Resin填料，孵育30min；
②用30mL PBS溶液wash填料；
③用5mL含10mM Amylose的PBS溶液洗脱。
(4)酶切：先将蛋白脱盐，然后按照质量比1：20加入TEV酶，4℃过夜酶切。
(5)离子交换层析：上样已平衡好的Q HiTrap柱子，低盐buffer冲洗10个CV，然后高盐洗脱收集，SDS-PAGE验证蛋白纯度，检测结果如图1所示。
(6)分装，测蛋白浓度，保存于-80℃。
效果例抗原验证
采用免疫荧光法验证抗原，其原理是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)反应后，利用荧光判读仪测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
在本验证中，将待验证抗原包被Elisa板，然后加入已知阴性或阳性的血清样本反应，封闭洗涤后，用带有荧光素枣红蛋白(PE)的二抗孵育，洗涤后在荧光判读仪下检测对应的荧光值，重组MBP-Jo-1蛋白和重组Jo-1蛋白的验证数据如表1所示，从表1可以看出，在检测阴性样本时，重组MBP-Jo-1融合蛋白的荧光值显著高于天然Jo-1蛋白和本发明实施例3制备得到的重组Jo-1蛋白；在所有样本中，实施例3制备得到的重组Jo-1蛋白和天然Jo-1蛋白的荧光值均较接近，证明实施例3制备得到的重组Jo-1蛋白与天然Jo-1蛋白的性质基本相同，优于带标签的MBP-Jo-1。
表1
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司
<120> Jo-1蛋白的制备方法及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 508
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 1
Ala Glu Arg Ala Ala Leu Glu Glu Leu Val Lys Leu Gln Gly Glu Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Lys Gln Gln Lys Ala Ser Ala Glu Leu Ile Glu Glu
20 25 30
Glu Val Ala Lys Leu Leu Lys Leu Lys Ala Gln Leu Gly Pro Asp Glu
35 40 45
Ser Lys Gln Lys Phe Val Leu Lys Thr Pro Lys Gly Thr Arg Asp Tyr
50 55 60
Ser Pro Arg Gln Met Ala Val Arg Glu Lys Val Phe Asp Val Ile Ile
65 70 75 80
Arg Cys Phe Lys Arg His Gly Ala Glu Val Ile Asp Thr Pro Val Phe
85 90 95
Glu Leu Lys Glu Thr Leu Met Gly Lys Tyr Gly Glu Asp Ser Lys Leu
100 105 110
Ile Tyr Asp Leu Lys Asp Gln Gly Gly Glu Leu Leu Ser Leu Arg Tyr
115 120 125
Asp Leu Thr Val Pro Phe Ala Arg Tyr Leu Ala Met Asn Lys Leu Thr
130 135 140
Asn Ile Lys Arg Tyr His Ile Ala Lys Val Tyr Arg Arg Asp Asn Pro
145 150 155 160
Ala Met Thr Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Phe Tyr Gln Cys Asp Phe Asp
165 170 175
Ile Ala Gly Asn Phe Asp Pro Met Ile Pro Asp Ala Glu Cys Leu Lys
180 185 190
Ile Met Cys Glu Ile Leu Ser Ser Leu Gln Ile Gly Asp Phe Leu Val
195 200 205
Lys Val Asn Asp Arg Arg Ile Leu Asp Gly Met Phe Ala Ile Cys Gly
210 215 220
Val Ser Asp Ser Lys Phe Arg Thr Ile Cys Ser Ser Val Asp Lys Leu
225 230 235 240
Asp Lys Val Ser Trp Glu Glu Val Lys Asn Glu Met Val Gly Glu Lys
245 250 255
Gly Leu Ala Pro Glu Val Ala Asp Arg Ile Gly Asp Tyr Val Gln Gln
260 265 270
His Gly Gly Val Ser Leu Val Glu Gln Leu Leu Gln Asp Pro Lys Leu
275 280 285
Ser Gln Asn Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Gly Asp Leu Lys Leu Leu
290 295 300
Phe Glu Tyr Leu Thr Leu Phe Gly Ile Asp Asp Lys Ile Ser Phe Asp
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Ile Tyr Glu
325 330 335
Ala Val Leu Leu Gln Thr Pro Ala Gln Ala Gly Glu Glu Pro Leu Gly
340 345 350
Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Gly Arg Tyr Asp Gly Leu Val Gly Met
355 360 365
Phe Asp Pro Lys Gly Arg Lys Val Pro Cys Val Gly Leu Ser Ile Gly
370 375 380
Val Glu Arg Ile Phe Ser Ile Val Glu Gln Arg Leu Glu Ala Leu Glu
385 390 395 400
Glu Lys Ile Arg Thr Thr Glu Thr Gln Val Leu Val Ala Ser Ala Gln
405 410 415
Lys Lys Leu Leu Glu Glu Arg Leu Lys Leu Val Ser Glu Leu Trp Asp
420 425 430
Ala Gly Ile Lys Ala Glu Leu Leu Tyr Lys Lys Asn Pro Lys Leu Leu
435 440 445
Asn Gln Leu Gln Tyr Cys Glu Glu Ala Gly Ile Pro Leu Val Ala Ile
450 455 460
Ile Gly Glu Gln Glu Leu Lys Asp Gly Val Ile Lys Leu Arg Ser Val
465 470 475 480
Thr Ser Arg Glu Glu Val Asp Val Arg Arg Glu Asp Leu Val Glu Glu
485 490 495
Ile Lys Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Cys Ile Cys
500 505

Claims (10)

1.一种Jo-1蛋白的制备方法，其特征在于，包括：采用pET-28a表达带有MBP标签的Jo-1融合蛋白，然后在纯化蛋白的过程中切除所述MBP标签，得到所述Jo-1蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Jo-1蛋白含有如SEQ ID NO.1所示序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白中，MBP标签和Jo-1之间含有蛋白酶的酶切位点。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶包括Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶或TEV酶；
优选地，所述蛋白酶包括TEV酶。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将含有蛋白酶的酶切位点的MBP标签序列整合至pET-28a的NcoⅠ和BamHⅠ之间；将Jo-1蛋白序列整合至pET-28a的BamHⅠ和HindⅢ之间，得到表达所述带有MBP标签的Jo-1融合蛋白的pET-28a载体。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化蛋白包括先对表达Jo-1融合蛋白的菌体进行亲和层析，然后切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化蛋白还包括在切除Jo-1融合蛋白中的MBP标签后进行离子交换层析。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(a)使用含有BamHⅠ序列的上游引物和含有HindⅢ序列的下游引物扩增Jo-1基因，其中Jo-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(b)在pET-28a的NcoⅠ和BamHⅠ间插入MBP序列，其中MBP序列含有编码TEV酶的酶切位点的序列；
(c)将步骤(a)的扩增产物整合至步骤(b)得到的pET-28a；
(d)将(c)获得的pET-28a转化至E.coliDH5α中培养，筛选出阳性克隆并经测序验证后扩大培养，获取阳性克隆pET-28a；
(e)将阳性克隆pET-28a转化至E.coliRosseta(DE3)，经诱导处理获得表达Jo-1融合蛋白的菌体；
(f)收集表达Jo-1融合蛋白的菌体，破碎后用Dextrin Resin亲和层析，收集洗脱液后加入TEV酶酶切MBP标签，再用Q HiTrap纯化，得到纯化后的Jo-1蛋白；
优选地，步骤(d)中，将转化了pET-28a的E.coli DH5α涂布于含有卡那霉素的固体培养基中，然后再将阳性克隆接种至含有卡那霉素的液体培养基中培养，然后进行菌落PCR验证和测序验证；卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL；
优选地，步骤(e)中，将阳性克隆pET-28a转化至E.coli Rosseta(DE3)，然后接种至含有卡那霉素和氯霉素的液体培养基中，培养至OD600为0.6～0.8时加入IPTG进行诱导表达，诱导培养温度为20～25℃；卡那霉素的浓度优选为35～45μg/mL；氯霉素的浓度优选为35～45μg/mL。
9.权利要求1-8任一项所述的Jo-1蛋白的制备方法的应用，包括(x1)～(x3)中的至少一种：
(x1)制备Jo-1抗体；
(x2)制备以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒；
(x3)制备包含Jo-1抗体的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述以Jo-1蛋白为反应抗原的试剂盒包括用于肌炎诊断的试剂盒。
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