CN108218996A - 重组蛋白及其纯化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了包含麦芽糖结合蛋白标签、目的蛋白和组氨酸标签的融合蛋白及其制备方法及用途。

Description

重组蛋白及其纯化制备方法
发明领域
本申请大体涉及生物技术领域，具体而言，本申请涉及含有组氨酸(6×His)标签和麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组蛋白以及蛋白制备方法。
发明背景
在现有技术中，利用常用的蛋白制备技术纯化目的蛋白时，目的蛋白经常以包涵体的形式表达，后期需进一步地变性和复性以得到具有天然活性的目标蛋白。但是蛋白的变性和复性过程较为复杂，也较为困难，即使复性，得到的目标蛋白的构象也容易发生变化，从而影响目标蛋白的后续应用。因此探索制备可溶的且高纯度的目的蛋白的方法具有重要意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含麦芽糖结合蛋白(MBP)标签(例如，核苷酸序列可以如SEQ ID NO:1所示或氨基酸序列可以如SEQ ID NO:2所示)、目的蛋白和组氨酸(6×His)标签，按照由N端至C端的顺序。
第二方面，本申请提供了编码第一方面所述融合蛋白的核酸分子。
第三方面，本申请提供了包含第二方面所述核酸分子的载体。
第四方面，本申请提供了包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的细胞。
第五方面，本申请提供了一种蛋白制备方法，包括：
重组表达融合蛋白，所述融合蛋白包含MBP标签、目的蛋白和组氨酸标签，按照由N端至C端的顺序；和
利用组氨酸标签纯化所述融合蛋白；
任选地，纯化之后切除所述两种标签中的至少一种。
在一些实施方案中，在纯化之后，利用Factor Xa蛋白酶切除融合蛋白的MBP标签。
第六方面，本申请提供了第一方面的融合蛋白、或利用第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体或第四方面所述的细胞制备得到的融合蛋白或利用第五方面的方法制备的蛋白在制备针对所述目的蛋白的抗体中的用途。
在一些实施方案中，前述任一方面所述的目的蛋白为胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)(例如，核苷酸序列可以如SEQ ID NO:3所示或氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4所示)。
第七方面，本申请提供了目的蛋白为TSLP的所述融合蛋白(MBP-TSLP-His)或利用第五方面的方法制备的TSLP蛋白在制备用于变应性炎症或肿瘤的早期诊断、治疗追踪和/或预后检查的产品中的用途。
在一些实施方案中，变应性炎症包括但不限于：特应性皮炎、哮喘和变态反应性鼻炎。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌和/或胃癌。
附图简要说明
图1为构建的TSLP-His表达载体的质粒图谱。
图2为显示TSLP-His融合蛋白在宿主菌中小量诱导表达情况的图。
图3为显示TSLP-His融合蛋白在宿主菌中的表达形式的图。
图4为显示SDS-PAGE检测TSLP-His包涵体蛋白的纯化结果的图。
图5为显示Western印迹检测TSLP-His包涵体蛋白的纯化结果的图。
图6为构建的TSLP-MBP表达载体的质粒图谱。
图7为显示TSLP-MBP融合蛋白在宿主菌中小量诱导表达情况的图。
图8为显示TSLP-MBP融合蛋白在宿主菌中的表达形式的图。
图9为显示SDS-PAGE检测TSLP-MBP融合蛋白的纯化结果的图。
图10为显示Western印迹检测TSLP-MPB融合蛋白的纯化结果的图。
图11为构建的MBP-TSLP-His表达载体的质粒图谱。
图12为显示MBP-TSLP-His融合蛋白在宿主菌中小量诱导表达情况的图。
图13为显示MBP-TSLP-His融合蛋白在宿主菌中的表达形式的图。
图14为显示SDS-PAGE检测MBP-TSLP-His融合蛋白的纯化结果的图。
图15为显示Western印迹检测MBP-TSLP-His融合蛋白的纯化结果的图。
图16为显示SDS-PAGE检测TSLP-His、TSLP-MBP、MBP-TSLP-His融合蛋白的纯化结果比较图。
图17为显示Western印迹检测TSLP-His、TSLP-MBP、MBP-TSLP-His融合蛋白的纯化结果比较图。
发明详述
本申请的发明人通过对蛋白纯化的深入研究，开发出了目的蛋白纯化的新方法，对目的蛋白的高纯度、大量表达具有重要意义。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、目的蛋白和组氨酸(6×His)标签，按照由N端至C端的顺序。
本申请所用的术语“目的蛋白”指希望表达或获得的蛋白。
在为纯化目的大量表达蛋白时，由于很多目的蛋白通常以包涵体的形式表达，使得后期的纯化需要进一步的变性和复性，不仅影响纯化的蛋白的纯度，还可能影响得到的蛋白的生物学性质。因而需要尽量使目的蛋白以可溶的形式表达。尽管本领域已知可以通过选用特定的表达菌株、与分子伴侣共表达、降低目的蛋白诱导表达的温度、调整诱导剂浓度等一系列方法提高重组蛋白的可溶性，却并不总是有效。通过本申请发明人的大量研究，选择将目的蛋白与MBP标签连接构建融合蛋白，以实现目的蛋白的可溶性表达。
MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性。MBP标签融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱，对重组蛋白进行分离纯化。但是由于在蛋白表达过程中，MBP空标签蛋白的大量表达，使得利用交联淀粉亲和层析时纯化得到的是MBP蛋白和MBP与目的蛋白的融合蛋白的混合物，而难以将MBP蛋白和MBP蛋白与目的蛋白的融合蛋白分离，因此本申请进一步将MBP-目的蛋白的融合蛋白添加组氨酸标签以利于融合蛋白的纯化，所述融合蛋白中双标签与目的蛋白的排列顺序由N端至C端依次为MBP标签、目的蛋白和组氨酸标签，从而使得副产物MBP和MBP-目的蛋白均不与金属离子亲和层析树脂结合。
第二方面，本申请提供了编码第一方面所述融合蛋白的核酸分子。
第三方面，本申请提供了包含第二方面所述核酸分子的载体。
第四方面，本申请提供了包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的细胞。
第五方面，本申请提供了一种蛋白制备方法，包括：
重组表达融合蛋白，所述融合蛋白包含MBP标签、目的蛋白和组氨酸标签，按照由N端至C端的顺序；和
利用组氨酸标签纯化所述融合蛋白；
任选地，纯化之后切除所述两种标签中的至少一种。
融合蛋白的构建和重组表达是本领域中已知的技术。简单而言，可以包括重组表达载体的构建和选择、目标序列(包含目的蛋白的序列)的克隆和插入、向宿主细胞的转化、阳性转化株的筛选以及融合蛋白的表达和分离等。组氨酸标签和/或MBP标签可以为目标序列的一部分，即，与目标序列共同连入表达载体。或者，组氨酸标签和/或MBP标签可以存在于原始的表达载体中。
在一些实施方案中，将编码目的蛋白的核酸分子连接至含有MBP标签和组氨酸标签序列的载体，形成融合核酸分子MBP-目的蛋白-His。在一些实施方案中，将编码His-目的蛋白的融合核酸分子连接至含有MBP标签编码序列的载体，形成融合核酸分子MBP-目的蛋白-His。在一些实施方案中，将编码MBP-目的蛋白-His的融合核酸分子连接至克隆载体，形成融合核酸分子MBP-目的蛋白-His。
利用组氨酸标签纯化蛋白的技术在本领域众所周知。
在一些实施方案中，利用组氨酸标签对融合蛋白进行纯化。此步骤中仅MBP-目的蛋白-His的融合蛋白可与固定化金属离子亲和层析柱结合，而其余副产物(包括MBP、MBP-目的蛋白等)均不与亲和树脂结合。
在一些实施方案中，可使用Factor Xa、麦芽糖酶和肠激酶等切除MBP标签。
第六方面，本申请提供了第一方面的融合蛋白、或利用第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体或第四方面所述的细胞制备得到的融合蛋白或利用第五方面的方法制备的蛋白在制备针对所述目的蛋白的抗体中的用途。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述目的蛋白为TSLP。
第七方面，本申请提供了目的蛋白为TSLP的所述融合蛋白(MBP-TSLP-His)或利用第五方面的方法制备的TSLP蛋白在制备用于变应性炎症或肿瘤的早期诊断、治疗追踪和/或预后检查的产品中的用途。
在一些实施方案中，编码融合蛋白MBP-TSLP-His的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其中TSLP序列的GenBank登录号为BC040592.1。
TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)是由上皮细胞衍生的细胞因子。其最初被鉴定为由胸腺基质分泌的分子，在T细胞和B细胞发育中发挥作用。而近年来TSLP在胸腺外的一些作用也被鉴定出。已有研究证明TSLP介导癌细胞和免疫系统之间的交叉对话。肿瘤细胞或癌症相关成纤维细胞产生了TSLP，而TSLP又促进了未成熟树突状细胞(iDC)的成熟，并通过单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)促进了CCL17、CCL22及OX40配体的产生。因此TDLP在免疫调节中发挥重要作用，可将其用于TSLP免疫系统相关疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查中。
在一些实施方案中，变应性炎症包括但不限于：特应性皮炎、哮喘和变态反应性鼻炎。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌和/或胃癌。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。
实施例1：TSLP-His原核表达载体的构建和蛋白纯化
TSLP-His原核表达载体的构建
利用如下扩增体系和PCR程序来扩增TSLP-His片段。
PCR扩增体系：PrimerStar(TAKARA)，25μL；TSLP-His-F，1μL；TSLP-His-R，1μL，PBMC cDNA 2μL；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足至50μL，其中PBMC cDNA由人外周血分离的PBMC提取的RNA反转录获得，外周血样品由本公司健康志愿者提供。
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。
所用的引物序列为：
TSLP-His-F：5’-CACCATGGACATGTACGACTTCACTAACTG-3’(NcoI酶切位点)，
TSLP-His-R：5’-CACTCGAGCTGTTGTTTCAGTAAAGGTCG-3’(XhoI酶切位点)
将得到的PCR产物凝胶电泳回收。然后采用下述酶切体系对PCR产物和表达载体pET28a(此载体由本实验室保存)进行酶切：Smartcut缓冲液(NEB)5μL，NcoI(NEB)1μL，XhoI(NEB)1μL，PCR产物或表达载体10μL，加入灭菌蒸馏水补足至50μL。将PCR产物和表达载体pET28a酶切过夜。凝胶电泳回收酶切后的PCR产物和表达载体。随后按下述连接体系将PCR产物与表达载体连接：T4DNA连接酶缓冲液2μL(NEB)，T4DNA连接酶1μL(NEB)，PCR酶切产物5μL，pET28a载体酶切产物12μL，16℃过夜连接。
将连接产物转化BL21感受态细胞(购买自索莱宝生物公司)：将连接产物加至100μL BL21感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物冰上放置30min。将混合物置于42℃水浴中热激90s；迅速置于冰浴，持续3min。在超净工作台中向混合物加入600μL LB培养液，37℃150rpm振荡培养45min。5,000g离心4min，收集菌体。弃掉500μL上清液，用移液器将剩余约200μL液体吹打均匀以悬浮菌体。将受体菌涂于LB(含50μg/mL Amp)固体培养基表面，于37℃烘箱中培养12～16h。
将获得的重组克隆进行PCR验证和酶切验证。
挑取平板上的单菌落于LB(Amp 50mg/L)液体培养基中过夜摇瓶培养(转速200rpm,温度37℃)。取培养后的菌液进行PCR验证。PCR体系为：PrimerStar，10μL；TSLP-His-F，1μL；TSLP-His-R，1μL；菌液2μL；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足到20μL。采用的PCR程序为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环，之后72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
将得到的菌液提取重组质粒，并利用下述酶切体系将重组质粒酶切过夜：Smartcut缓冲液(NEB)3μL，NcoI(NEB)1μL，XhoI(NEB)1μL，重组质粒5μL，加入灭菌蒸馏水补足至30μL。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
TSLP-His融合蛋白的纯化
TSLP-His融合蛋白的小量诱导表达：
将构建好的载体转化原核表达菌株BL21，挑取划线平板上的单菌落，于LB(100μg/mL，Kan)液体培养基中过夜摇菌。取过夜菌液按1:100的比例接种于新的20ml液体LB(100μg/mL，Kan)中。待菌液OD600达到0.6时，加入20μl 1M IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，诱导条件为37℃，250rpm。诱导3h之后取1mL菌液样品。将菌液13000rpm离心1min，收集菌体。弃上清后加入100μl 1×上样缓冲液，剧烈震荡重悬菌体后，沸水10min，冰浴5min，4℃，13000rpm离心1min。取未诱导的对照和诱导后的菌体电泳检测是否表达目的蛋白。结果如图2所示，结果显示加入终浓度为1mM IPTG后能够诱导目的蛋白TSLP-His的表达。
TSLP-His融合蛋白的大量诱导表达：
将鉴定为阳性的菌株划线于LB(100mg/L，Kan)平板上，挑取单克隆于10mL LB液体培养基中过夜培养，第二天以1：100的比例转接至330mL新的培养基中，培养至OD600nm为0.6时，加入330μL 1M IPTG(终浓度为1mM)，16℃诱导20h。收集菌体，其中每330mL菌液收集为1管。4℃，4700rpm离心8min，以收集菌体。-80℃冻存菌体。取冻存于-80℃的菌体，每330mL菌液用50mL A缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.0)，10％(V/V)甘油，500mM NaCl)置于冰上溶解，重悬。超声破碎细胞：设置为超声5s，间隔5s，超声功率为200W，持续20min。
将破碎液20,000g,4℃离心20min，并将离心后的上清和沉淀进行电泳，检测TSLP蛋白的表达情况。结果如图3所示，结果显示TSLP-His融合蛋白以包涵体的形式表达。
包涵体形式的TSLP-His融合蛋白的纯化
纯化步骤如下：
取冻存于-80℃的菌体，每330mL菌液用50mL A缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.9)，2mMEDTA，100mM NaCl)置于冰上溶解，重悬，超声破碎细胞：设置为超声5s，间隔5s，超声功率为200W，持续20min。加入终浓度为0.2％DOC(脱氧胆酸钠)，混匀，室温静置10min。13,000rpm，4℃离心10min，留取沉淀。向沉淀中加入18mL A缓冲液和2mL20％DOC，充分重悬沉淀。室温静置30min。将悬液于13,000rpm,4℃离心10min，留取沉淀；在沉淀中加入18mL A缓冲液和2mL 20％DOC，充分重悬沉淀。室温静置30min。将悬液于13,000rpm,4℃离心10min，留取沉淀。向沉淀中加入19.7mL A缓冲液和0.3mL 20％SKL(N-十二烷基肌氨酸钠)，剧烈搅动，使沉淀缓慢溶解。室温静置30min。13,000rpm,4℃离心10min，取上清。对纯化结果进行SDS-PAGE和Western印迹检测。
SDS-PAGE和Western印迹检测步骤如下：
取50μL样品加入2×上样缓冲液，充分振荡混匀后，沸水中煮沸变性10min，冰浴5min。12,000rpm，4℃离心1min，准备上样。
灌制分离胶(制胶装备安装方法见《Mini ProteanⅢ电泳槽安装使用指南》)，根据目标蛋白的大小配制分离胶的浓度:
配制10mL SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(mL/10mL)
灌胶完毕后，在上层覆盖一层ddH2O，静置30min至分离胶与水层出现明显界限，尽可能用吸水纸吸尽残留液体。在已聚合的分离胶上直接灌注5％浓缩胶，立即插入梳子。
配制5mL和10mL 5％SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(mL)
待胶凝固后，装配好胶槽，加入电泳缓冲液，取适量处理好的样品上样。80V电压至溴酚蓝前沿跑入分离胶中，再以120V电压至溴酚蓝前沿刚刚跑出胶下沿。
电转移：将SDS-PAGE凝胶切去多余胶边，放在转移缓冲液中，剪4张与胶相同大小Whatman 3M滤纸和1张相同大小硝酸纤维素膜。将剪好的滤纸、硝酸纤维素膜、海绵在电转缓冲液中浸泡。将塑料支架平放，在黑色塑料板(阴极)上放一块海绵。将2张滤纸对齐放在海绵上，依次放置凝胶、纤维素膜、2张滤纸、海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡。最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意纤维素膜一侧靠阳极(红色)，胶一侧靠阴极(黑色)。接通电源，200mA恒流转移2h，转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，膜正面(接触凝胶面)朝上放置在适当的容器中。
封闭：转移完毕的NC膜在TBST缓冲液中漂洗1次，转入10mL封闭液中，37℃封闭1h。
一抗反应：封闭完成后，换新封闭液，并按1:5000稀释倍数加入His标签特异性抗体，室温震荡1.5h。TBST洗膜3次，每次10min。
二抗反应：加入用封闭液1:3000稀释的HRP标记的抗鼠IgG二抗，反应1h。再用TBST洗膜3次，每次10min。
显色：避光条件下，将NC膜置于显色液中显色，至条带清晰，用蒸馏水冲洗以终止反应。
结果如图4和5所示，结果显示采用包涵体蛋白纯化的方法可以获得目的蛋白，但是无法保证目的蛋白的活性。
实施例2：TSLP-MBP原核表达载体的构建和蛋白纯化
TSLP-MBP原核表达载体的构建
利用如下扩增体系和PCR程序来扩增MBP-TSLP片段。
PCR扩增体系：PrimerStar，25μL；TSLP-MBP-F，1μL；TSLP-MBP-R，1μL；PBMC cDNA 2μL；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足至50μL，其中PBMC cDNA由人外周血分离的PBMC提取的RNA反转录获得，外周血样品由本公司健康志愿者提供。
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。
所用的引物序列为：
TSLP-MBP-F：5’-CGCGGATCCATGTACGACTTCACTAAC-3’(BamHI酶切位点)
TSLP-MBP-R：5’-CGAAGCTTTTACTGTTGTTTCAGTAAAGGTCG-3’(HindIII酶切位点)
将得到的PCR产物凝胶电泳回收。然后采用下述酶切体系将PCR产物和表达载体pMAL-C2X(本载体由本实验室保存)酶切过夜：Smartcut缓冲液(NEB)5μL，BamHI(NEB)1μL，HindIII(NEB)1μL，PCR产物或表达载体10μL，加入灭菌蒸馏水将体系补足至50μL。凝胶电泳回收酶切后的PCR产物和表达载体。随后按下述连接体系将PCR产物与表达载体连接：T4DNA连接酶缓冲液2μL(NEB)，T4DNA连接酶1μL(NEB)，PCR酶切产物5μL，pMAL-C2X载体酶切产物12μL，16℃过夜连接。
将连接产物转化DH5α感受态细胞(购买自索莱宝生物公司)：将连接产物加至100μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物冰上放置30min。将混合物置于42℃水浴中热激90s，迅速置于冰浴，持续3min。在超净工作台中向混合物加入600μL LB培养液，37℃150rpm振荡培养45min。5,000g离心4min，收集菌体。弃掉500μL上清液后，用移液器将剩余约200μL液体吸打均匀以悬浮菌体。将受体菌涂于LB(含50μg/mLAmp)固体培养基表面，于37℃烘箱中培养12～16h。
将获得的重组克隆进行PCR验证和酶切验证。
挑取平板上的单菌落于LB(Amp 50mg/L)液体培养基中过夜摇瓶培养(转速200rpm,温度37℃)。取培养后的菌液进行PCR验证。PCR体系为：PrimerStar，10μL；TSLP-MBP-F，1μL；TSLP-MBP-R，1μL；菌液2μL；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足至20μL。采用的PCR程序为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
将得到的菌液提取重组质粒，并利用下述体系将重组质粒酶切过夜：Smartcut缓冲液(NEB)3μL,BamHI(NEB)1μL,HindIII(NEB)1μL,重组质粒5μL，加入灭菌蒸馏水将体系补足至30μL。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
获得的阳性克隆的质粒图谱如图6所示。
TSLP-MBP融合蛋白的纯化
TSLP-MBP融合蛋白的小量诱导表达：
将构建好的载体转化原核表达菌株E.Coli DH5α，挑取划线平板上的单菌落于LB(100mg/L，Amp)液体培养基中，过夜摇菌。取过夜菌液按1:100的比例接种于新的20mL液体LB(100mg/L，Amp)中。待菌液OD600达到0.6时加入100μL葡萄糖(40％)和6μL 1M IPTG(终浓度为0.3mM)进行诱导，诱导条件为37℃，250rpm，诱导3h。取1mL菌液样品。将样品以13000rpm离心1min，以收集菌体。弃上清后加入100μL 1×上样缓冲液，剧烈震荡重悬菌体后,沸水10min，冰浴5min，4℃13000rpm离心1min。取未诱导的对照和诱导后的菌体电泳检测是否表达目的蛋白。结果如图7所示，结果显示加入终浓度为0.3mM IPTG后能够诱导目的蛋白TSLP-MBP的表达。
TSLP-MBP融合蛋白的大量诱导表达：
挑取划线平板上的单菌落于LB(含100mg/L，Amp)液体培养基中，过夜摇菌。取过夜菌液按1:100的比例接种于新的330mL液体LB(100mg/L，Amp)中，待菌液摇至OD600为0.6时，加入1.65mL 40％葡萄糖溶液和99μL 1M IPTG(终浓度为0.3mM)进行诱导。诱导条件为16℃，150rpm，诱导20h。4700rpm离心8min收集菌体，将其冻存于-80℃。
取冻于-80℃的菌体，每330mL菌液用30mL CB缓冲液(Tris·HCl(pH 7.4)，20mM；NaCl，200mM；EDTA，1mM)重悬，置于冰上溶解。溶解后的菌液倒入小烧杯中，1:100比例加入10％Triton X-100和0.1MPMSF。超声破碎细胞：设置为超声5s，间隔5s，超声功率为200W，共20min。取破碎的菌液以20000×g离心20min，并将离心后的上清和沉淀分别进行电泳，检测TSLP-MBP蛋白的表达情况。结果如图8所示，结果显示TSLP-MBP融合蛋白主要以可溶的形式表达。
TSLP-MBP蛋白纯化：
取超声后的上清于50mL注射器中，以0.22μm滤膜过滤除菌，按1：6的比例用CB缓冲液稀释上清液，用Mini-Q水20～30mL清洗蠕动泵，同时再生Amylose Resin层析柱。
Amylose Resin层析柱的再生：
层析柱用CB缓冲液平衡后即可连接蠕动泵进行上样。上样结束后关闭蠕动泵，用4～6mL CB缓冲液清洗柱子。用6～8mL洗脱液(100mM麦芽糖，CB缓冲液溶解)进行洗脱。收集样品。向纯化后的蛋白样品中添加10％甘油，并将其冻存于-80℃。对纯化结果进行SDS-PAGE和Western印迹检测。Western印迹检测所用一抗为抗人TSLP单克隆抗体，按照1:2500稀释，二抗为兔抗羊HRP标记的IgG二抗，按照1:3000稀释。
结果如图9和图10所示。结果显示TSLP-MBP融合蛋白在宿主菌中表达，此外还有MBP空标签蛋白大量表达，如果采用该系统，则利用MBP标签纯化TSLP-MBP融合蛋白时难以将TSLP-MBP蛋白与MBP空标签蛋白区分开。
实施例3：MBP-TSLP-His原核表达载体的构建和蛋白纯化
MBP-TSLP-His原核表达载体的构建
利用如下扩增体系和PCR程序来扩增MBP-TSLP-His片段。
PCR扩增体系：PrimerStar，25μL；MBP-TSLP-His-F，1μL；MBP-TSLP-His-R，1μL；PBMC cDNA，2μL；将扩增体系补足至50μL。其中PBMC cDNA由人外周血分离的PBMC提取的RNA反转录获得，外周血样品由本公司健康志愿者提供。
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。
所用的引物序列为：
MBP-TSLP-His-F：5’-CGCGGATCCATGTACGACTTCACTAAC-3’(BamHI酶切位点)
MBP-TSLP-His-R：5’-CGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTTGTTTCAGTAAAGGTCG-3’(HindIII酶切位点)
将得到的PCR产物凝胶电泳回收。然后采用下述酶切体系将PCR产物和表达载体pMAL-C2X(本载体由本实验室保存)酶切过夜：smartcut缓冲液，5μL；BamHI-HF，1μL；HindIII-HF，1μL；PCR产物/pMAL-C2X，25μL；ddH2O，18μL。凝胶电泳回收酶切后的PCR产物和表达载体。随后按下述连接体系将PCR产物与表达载体16℃连接3h：T4DNA连接酶缓冲液，2μL；T4DNA连接酶，1μL；PCR酶切产物，12μL；pMAL-C2X酶切产物，5μL。
将连接产物转化DH5α宿主菌(本菌株由本实验室保存)。
将获得的重组克隆进行PCR验证和酶切验证。
挑取平板上的单菌落于LB(Amp 50mg/L)液体培养基中过夜摇瓶培养(转速200rpm，温度37℃)。取培养后的菌液进行PCR验证。PCR体系为：PrimerStar，10μL；MBP-TSLP-His-F，1μL；MBP-TSLP-His-R，1μL；菌液，1μL；将反应体系补足至20μL。采用的PCR程序为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s，共30个循环。之后72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
将得到的菌液提取重组质粒，并利用下述体系将重组质粒酶切过夜：smartcut缓冲液，5μL；BamHI-HF，1μL；HindIII-HF，1μL；质粒，8μL；ddH2O，35μL。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性PCR条带确定阳性克隆。
获得的阳性克隆的质粒图谱如图11所示。
MBP-TSLP-His融合蛋白的纯化
MBP-TSLP-His融合蛋白的小量诱导表达：
将构建好的载体转化原核表达菌株DH5α，挑取划线平板上的单菌落于LB(100mg/L，Amp)液体培养基中，过夜摇菌。取过夜菌液按1:100的比例接种于新的20mL液体LB(100mg/L，Amp)中。待菌液OD600达到0.6时，加入100μL葡萄糖(40％)和6μL 1M IPTG(IPTG终浓度为0.3mM)进行诱导，诱导条件为37℃，250rpm，诱导3h。取1mL菌液样品。将菌液样品13000rpm离心1min以收集菌体，弃上清后加入100mL 1×上样缓冲液。剧烈震荡重悬菌体后，沸水10min，冰浴5min，4℃13000rpm离心1min，取未诱导的对照和诱导后的菌体电泳检测是否表达目的蛋白。结果如图12所示，结果显示加入终浓度为0.3mM的IPTG后能够诱导目的蛋白MBP-TSLP-His的表达。
MBP-TSLP-His融合蛋白的大量诱导表达
将鉴定好的菌株划线于LB(100mg/L，Amp)平板上，挑取单克隆于10mL LB(100mg/L，Amp)液体培养基中过夜培养，第二天以1:100的比例转接至330mL新的LB(100mg/L，Amp)培养基中，培养至OD600nm为0.6时，加入1.65mL葡萄糖(40％)和99μL(终浓度0.3mM)1MIPTG，16℃诱导20h。每330mL菌液收集为1管，4℃，4700rpm离心8min收集菌体，-80℃冻存。
用50mL MCAC-0缓冲液(Tris·HCl(pH 8.0)，20mM；NaCl，500mM；甘油10％(V/V))充分悬浮，依次加入1/100体积的10％Triton X-100和0.1M PMSF，超声5s，间隔5s，共超声20min，直至液体澄清。20,000g，4℃离心20min后取上清，用0.45μm滤膜过滤除菌作为样品。将离心后的上清和沉淀进行电泳，检测MBP-TSLP-His融合蛋白的表达情况。结果如图13所示，结果显示MBP-TSLP-His融合蛋白主要以可溶的形式表达。
MBP-TSLP-His蛋白纯化
用50mL MCAC-0缓冲液(Tris·HCl(pH 8.0)，20mM；NaCl，500mM；甘油10％(V/V))充分悬浮菌体，依次加入1/100体积的10％Triton X-100和0.1M PMSF，超声5s，间隔5s，共超声20min，直至液体澄清。20,000g，4℃离心20min后取上清用0.45μm滤膜过滤除菌作为样品。
按下述方法对层析柱进行使用前处理：用10X柱床体积的去离子水清洗Ni2+亲和层析柱；用4X柱床体积的0.1M NiSO4过柱；用10X柱床体积的去离子水清洗；用10X柱床体积的MCAC-0缓冲液平衡柱子。以10～15mL/h流速将样品上柱，持续约2.5～3h。MCAC-50缓冲液清洗柱子，MCAC-250缓冲液洗脱目的蛋白，对收集的目的蛋白等进行SDS-PAGE和Western印迹检测。Western印迹检测所用一抗为鼠源His单克隆抗体，按照1:3000稀释，二抗为羊抗鼠HRP标记的IgG二抗，按照1:3000稀释。如图14和15所示，通过Ni2+亲和层析柱可以获得纯度和浓度比较高的MBP-TSLP-His融合蛋白。
对通过三种不同的标签纯化的融合蛋白(TSLP-His、TSLP-MBP、TSLP-MBP-His)进行SDS-PAGE和Western印迹检测。其中三种融合蛋白纯化前的起始菌量相同，蛋白纯化后的终体积也相同，因此可通过上样相同体积的蛋白样品，进行SDS-PAGE和Western印迹检测来比较三种蛋白的纯化效率。
Western印迹检测所用一抗为抗人TSLP单克隆抗体，按照1:2500稀释，二抗为兔抗羊HRP标记的IgG二抗，按照1:3000稀释。如图16和17所示，TSLP-His主要以包涵体形式表达，Amylose Resin层析柱纯化的TSLP-MBP融合蛋白中含有大量的MBP空标签蛋白，而Ni2+亲和层析柱纯化的TSLP-MBP-His融合蛋白纯度和浓度比较高，说明该方法可以有效去除MBP杂蛋白。通过上述比较可以直观地看出，通过本申请的方法制备的TSLP蛋白相对于利用TSLP-MBP构建体得到的TSLP蛋白具有更高的纯度，而且其以可溶蛋白的形式表达，保证了蛋白的活性。
在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和使用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。
序列表
<110> 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司
<120> 重组蛋白及其纯化制备方法
<130> 16C11774CN
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatcc 1179
<210> 2
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser
385 390
<210> 3
<211> 396
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
atgtacgact tcactaactg tgactttgag aagattaaag cagcctatct cagtactatt 60
tctaaagacc tgattacata tatgagtggg accaaaagta ccgagttcaa caacaccgtc 120
tcttgtagca atcggccaca ttgccttact gaaatccaga gcctaacctt caatcccacc 180
gccggctgcg cgtcgctcgc caaagaaatg ttcgccatga aaactaaggc tgccttagct 240
atctggtgcc caggctattc ggaaactcag ataaatgcta ctcaggcaat gaagaagagg 300
agaaaaagga aagtcacaac caataaatgt ctggaacaag tgtcacaatt acaaggattg 360
tggcgtcgct tcaatcgacc tttactgaaa caacag 396
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys
20 25 30
Ser Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys
35 40 45
Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala
50 55 60
Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala
85 90 95
Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu
100 105 110
Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu
115 120 125
Leu Lys Gln Gln
130
<210> 5
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatcca tgtacgactt cactaactgt 1200
gactttgaga agattaaagc agcctatctc agtactattt ctaaagacct gattacatat 1260
atgagtggga ccaaaagtac cgagttcaac aacaccgtct cttgtagcaa tcggccacat 1320
tgccttactg aaatccagag cctaaccttc aatcccaccg ccggctgcgc gtcgctcgcc 1380
aaagaaatgt tcgccatgaa aactaaggct gccttagcta tctggtgccc aggctattcg 1440
gaaactcaga taaatgctac tcaggcaatg aagaagagga gaaaaaggaa agtcacaacc 1500
aataaatgtc tggaacaagt gtcacaatta caaggattgt ggcgtcgctt caatcgacct 1560
ttactgaaac aacagcacca ccaccaccac cactaa 1596
<210> 6
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Met Tyr Asp Phe Thr Asn Cys
385 390 395 400
Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp
405 410 415
Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn Asn Thr
420 425 430
Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu
435 440 445
Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe
450 455 460
Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser
465 470 475 480
Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg
485 490 495
Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly
500 505 510
Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln His His His
515 520 525
His His His
530

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其包含麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、目的蛋白和组氨酸(6×His)标签，按照由N端至C端的顺序。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子。
3.包含权利要求2所述核酸分子的载体。
4.包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体的细胞。
5.蛋白制备方法，包括：
重组表达融合蛋白，所述融合蛋白包含MBP标签、目的蛋白和组氨酸标签(6×His)，按照由N端至C端的顺序；和
利用组氨酸标签纯化所述融合蛋白；
任选地，在纯化之后切除所述两种标签中的至少一种。
6.如权利要求5所述的方法，其中在纯化之后，利用Factor Xa蛋白酶切除融合蛋白的MBP标签。
7.权利要求1所述的融合蛋白、或利用权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的细胞制备得到的融合蛋白或者利用权利要求5或6所述的方法制备的蛋白在制备针对所述目的蛋白的抗体中的用途。
8.如前述任一项权利要求所述的融合蛋白、核酸分子、载体、细胞、方法或用途，其中所述目的蛋白为胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。
9.权利要求8所述的融合蛋白或者利用权利要求8所述的方法制备的TSLP蛋白在制备用于变应性炎症或肿瘤的早期诊断、治疗追踪和/或预后检查的产品中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述变应性炎症选自特应性皮炎、哮喘和变态反应性鼻炎；所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、胃癌。
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